L'environnement des organismes vivants est par définition fluctuant, toutes variations aléatoires du milieu de vie constituent un stress pour les cellules. Au fil de l'évolution, une forte pression de sélection a façonné le fonctionnement cellulaire jusqu'aux réponses complexes élaborées par les organismes vivants. Mes travaux s'inscrivent autour des mécanismes moléculaires de la réponse au stress et plus particulièrement les stress génotoxiques. La première partie de l'étude décrit finement la réplication de l'ADN en condition de stress réplicatif. Ainsi, nous avons montré que les pools de dNTPs sont limitants pour la progression des fourches de réplication en phase S normale et en stress, et que leurs niveaux conditionnent le programme temporel de réplication. De plus, nous avons mis en évidence un mécanisme d'adaptation au stress réplicatif et aux dommages constitutifs dans des mutants caractérisés par de l'instabilité génétique (CIN) via l'activation du checkpoint de dommage conduisant à l'expansion des pools de dNTPs. Pour finir, nous montrons que l'augmentation des niveaux de dNTPs facilite la réplication en présence de lésions de l'ADN, d'une manière indépendante des ADN polymérases translésionnelles. Le second projet apporte de nouveaux éléments sur le rôle de Crt10 in vivo, préalablement identifié comme un régulateur transcriptionnel des gènes de la Ribonucléotide Réductase (RNR). Nos données indiquent que les mutants crt10Δ ont des niveaux de dNTP similaires à ceux des cellules sauvages, et que cette mutation a un très faible impact sur l'expression des gènes RNR, malgré un phénotype de vitesse de progression des fourches accrue. Nous montrons que le mutant crt10Δ est caractérisé par un défaut d'entrée en phase S et d'initiation des origines de réplication. L'origine de ce défaut pourrait résider dans les fonctions de Crt10 impliquant la régulation de la biosynthèse des ribosomes au sein du complexe Rtt101-Mms1. Le troisième projet identifie MRX (Mre11-Rad50-Xrs2) comme un acteur de la voie de terminaison des ARN non codants. MRX s'associe à des loci recrutant également le complexe de terminaison Nrd1-Nab3-Sen1 à l'échelle du génome entier. L'inactivation de RAD50 se traduit par une perte d'efficacité de terminaison et l'accumulation de transcrits bicistroniques, ainsi qu'une dérégulation du niveau d'ARNs non codants instables (CUT) et de leurs gènes associés. Tout comme Sen1, MRX pourrait intervenir dans la résolution des collisions entre les machineries de transcription et de réplication. / A fluctuating environment is a powerful mean of selection for living organisms, which evolved complex signaling networks to integrate these variations and direct swift and efficient cellular responses. The aim of my work is the identification and characterization of molecular mechanisms involved in the tolerance of replicative stress and DNA damage. First, we show that changes in dNTP pools affect several aspects of replication dynamics in budding yeast. dNTP levels are limiting for normal S-phase progression and determine the temporal program of replication during a replicative stress. Interestingly, we also observed that chromosomal instability (CIN) mutants display expanded dNTP pools due to the constitutive activation of the DNA damage checkpoint. Since increased dNTP levels promote forks progression in the presence of DNA lesions, we propose that CIN mutants adapt to chronic replicative stress by upregulating dNTP pools. Secondly, we bring new lights on the role of Crt10 in vivo, which has been initially identified as a negative regulator of Ribonucleotide Reductase (RNR) genes expression. Deletion of CRT10 neither leads to expanded dNTP pools, nor to a massive deregulation of RNR genes, although crt10Δ cells exhibit faster fork progression. The crt10Δ mutant accumulates at the G1/S transition and exhibits a strong defect of origin firing that could account for its replication phenotype. Moreover, we observed a global decrease in ribosome biogenesis in crt10Δ. The physical interaction of Crt10 with several members of the ribosome biogenesis pathway and its role in the Rtt101-Mms1 complex suggest that Crt10 may regulate ribosome levels in vivo. At last, we identified MRX (Mre11-Rad50-Xrs2) as a bona fide member of the transcription termination of non-coding RNA (ncRNA). ChIP-seq reveals that MRX localized at the same loci than the Nrd1-Nab3-Sen1 complex in vegetative growth. rad50Δ cells exhibit transcriptional read-through and upregulation of unstable cryptic transcripts (CUTs) leading to a misregulation of their associated gene. Finally, MRX seems to be involved in the resolution of branched structures emanating from collision between transcription and replication machineries, as it is the case for Sen1.

L’ubiquitylation est une modification post-transcriptionelle qui est nécessaire pour la dégradation des protéines mais aussi pour la régulation et la localisation de nombreux facteurs. Un grand nombre de protéines impliquées dans la réplication de l’ADN et dans la réponse aux lésions de l’ADN sont ubiquitylées. L’ubiquitylation durant la réponse aux dommages de l’ADN dépend de l’enzyme d’activation de l’ubiquitine UBA1 qui est située au sommet de la cascade d’ubiquitination. Durant ma thèse, j’ai mis à jour le mécanisme de recrutement d’UBA1 au niveau de l’ADN endommagé ainsi qu’un rôle majeur de l’ubiquitylation dans la voie de signalisation ATR.A l’aide d’une approche in vitro qui mime la voie de signalisation ATR, j’ai montré qu’UBA1 est recrutée au niveau de molécules d’ADN linéaire et qu’elle est nécessaire à l’ubiquitylation des protéines recrutées sur ce substrat. J’ai également découvert que l’ubiquitylation et le recrutement d’UBA1 in vitro sont dépendants de la kinase DNA-PKcs et de la poly(ADP-ribose) polymérase PARP1, deux senseurs majeurs des lésions de l’ADN. Il apparait que PARP1 régule le recrutement d’UBA1 via la formation de chaines de poly(ADP)-ribose (PAR). De plus, j’ai montré qu’UBA1 est capable de se lier aux chaines PAR. J’ai identifié la région d’UBA1 capable d’interagir avec les chaines PAR : il apparait que cette région est désorganisée et riche en acide aminés hydrophobes. La comparaison de la protéine UBA1 de levure et la protéine UBA6 humaine qui ne lient pas PAR nous a permis d’identifier les acides aminées hydrophobes nécessaires pour la lésion à PAR.J’ai aussi démontré qu’UBA1 est nécessaire pour la réponse aux lésions de l’ADN. En effet, l’inhibition ou la déplétion d’UBA1 conduit à une perte de la phosphorylation de Chk1 dans notre système in vitro. De même, le traitement avec des molécules induisant des lésions de l’ADN telles que le CPT, le MMS et la bléocine conduit à une phosphorylation moindre de Chk1 lorsqu’UBA1 est inhibée. Afin de démontrer que la liaison d’UBA1 aux chaines PAR est cruciale pour la réponse aux dommages, j’ai mis en place un système in vivo permettant d’exprimer des mutants d’UBA1 incapable de lier les chaines PAR.Globalement mes résultats indiquent qu’UBA1 est recrutée au niveau de l’ADN endommagé à l’aide de PARP1 et DNA-PKcs. Plus précisément, il apparait que la liaison avec les chaines PAR et l’ubiquitylation de protéines spécifiques est nécessaire pour la mise en place de la voie de signalisation ATR. L’importance d’UBA1 dans le processus est soulignée par le fait que son inhibition ou son inactivation conduit à une phosphorylation moindre de Chk1. Il est raisonnable de penser que des inhibiteurs d’UBA1 puissent être utilisés pour cibler la voie ATR dans les cellules cancéreuses. Finalement, cette étude devrait permettre de mieux comprendre comment les interactions entre les processus d’ubiquitylation et de PARylation permettent de réguler la réponse aux dommages. / Ubiquitylation is an important posttranslational modification that is necessary for protein degradation as well as for the regulation and the localization of many cellular factors. A number of proteins implicated in DNA replication and DNA damage response are ubiquitylated. Ubiquitylation during the DNA damage response is selectively dependent on the ubiquitin-activating enzyme UBA1, which functions at the apex of the ubiquitylation cascade. In this thesis, I describe the mechanism of UBA1 recruited at damaged sites and uncover the role of ubiquitylation in ATR signaling.Using a cell free system developed in the lab that recapitulates ATR kinase-signaling pathway, I present evidence that, UBA1 is recruited to linear DNA substrates and mediate ubiquitylation of DNA-bound proteins. I found that protein ubiquitylation and the recruitment of UBA1 to DNA in cell-free extracts was dependent on the kinase DNA-PKcs and on the poly ADP-ribose polymerase PARP1, two sensors of DNA lesions. PARP1 regulates UBA1 recruitment in large part through poly (ADP)-ribose (PAR) chain formation. UBA1 exhibited affinity for PARP1 and for PAR chains. Furthermore, we have identified minimal region on UBA1 which is prominently hydrophobic and disordered region of UBA1 which are required for its PAR binding activity. Through comparison with yeast UBA1 and human UBA6 which failed to bind with PAR chains, we identified hydrophobic amino acid residues which are critical for PAR binding.I also show evidence that UBA1 is required for efficient DNA damage signaling. In a cell free system, chemical inhibition or siRNA depletion of UBA1 led to the loss of ChK1 phosphorylation, suggesting that UBA1 activity is required for efficient DNA damage response. Consistent with these observations, when cells were treated with DNA lesion inducing drugs like CPT, MMS and Bleocin, we observed less efficient Chk1 phosphorylation. I have developed UBA1 replacement system to demonstrate functional significance of mutation in PAR binding residues of UBA in DNA damage response.Collectively, these results indicate that UBA1 is recruited to DNA damaged sites in a DNA-PKcs and PARP1 dependent-manner, in a larger part through its interaction with PAR chains and that protein ubiquitylation on DNA damages is necessary for the assembly of a productive ATR signaling complex. The importance of role of UBA1 in DNA damage response is underscored by the finding that UBA1 inhibition leads to inefficient Chk1 phosphorylation which is required for efficient DNA damage response. Thus, UBA1 inhibitors could be used to target ATR signaling in cancer cells. This study should eventually lead us to provide more insights on how cell maintains genome integrity through crosstalk between posttranslational modifications including ubiquitylation and PARylation.

Nous avons récemment développé un prototype lentivecteur ADN non intégratif vaccinal contre VIH-1/SIDA que nous avons testé chez des modèles animaux. L'immunisation avec une dose unique de ce vaccin (CAL-SHIV-IN-) a permis la mise en place rapide de réponses immunes spécifiques contre tous les antigènes exprimés par le vaccin chez tous les animaux vaccinés. Les analyses longitudinales ont démontré la mise en place de réponses cellulaires et humorales spécifiques et persistantes sur une durée de plus de 74 semaines en absence de réintroduction d'antigènes chez tous les macaques vaccinés. La caractérisation de ces réponses a révélé la présence de cellules T CD4+ et CD8+ polyfonctionnelles composées de fractions de cellules effectrices mémoires à fonction immédiate (EM), de cellules centrales mémoires (CM) et de cellules précurseurs mémoires ayant une haute capacité de prolifération (PHPC). Ces réponses corrèlent, chez tous les macaques vaccinés (6/6), avec un contrôle du virus d'épreuve hautement hétérologue et pathogénique (SIVmac251) inoculé à petites doses répétées par la voie mucosale rectale. Cette protection est maintenue durant toute la période d'un an de suivi après l'infection avec une différence statistiquement significative de la charge virale plasmatique des groupes contrôles et vaccinés au moins jusqu'à 18 semaines post-infection. Par ailleurs, le contrôle du virus d'épreuve est maintenu plus de 10 mois (correspondant au temps d'arrêt de l'étude) après l'infection. Parmi les corrélats immunologiques de protection nous avons identifié la présence de cellules de type PHPC spécifiques des antigènes du vaccin et qui sont dotées d'une capacité importante de prolifération ex vivo en présence des signaux antigéniques et homéostatiques. Nous avons démontré que ces PHPC contiennent une fraction de cellules T souches mémoires « TSCM » spécifiques du vaccin. Ces TSCM récemment identifiées constitueraient un atout majeur en faveur de notre vecteur et notre stratégie vaccinale du fait de leur haute capacité d'auto-régénération/maintien en absence d'antigène et leur capacité à se différencier en d'autres cellules mémoires TCM et TEM. / We recently developed an innovative prototype non-integrative lentivector DNA vaccine against HIV-1 /AIDS that we tested in pilot studies using animal models of HIV vaccine. We found that a single immunization with our prototype vaccine (CAL-SHIV-IN-) allowed the implementation of potent humoral and cellular responses in all immunized macaques. In addition, both types of responses persisted over a period of 74 weeks post-immunization in absence of antigenic boost. The characterization of the above revealed that vaccine specific T cell responses included polyfunctional CD4+ and CD8+ T cells against all antigens expressed by the vaccine. Detailed phenotypic and functional examinations of these cells showed that they were composed of effector (EM) and central memory (CM) T cells. More importantly they also contained a fraction of precursor memory T cells with high proliferative capacity (PHPC). Immune responses primed by our vaccine regiment correlated with protection in all vaccinated macaques (6/6). As expected our vaccine-induced immune responses did not prevent from infection acquisition but controlled the replication of the highly pathogenic and heterologous SIVmac251 challenge given as repeated low dose by the intrarectal mucosal route. All vaccinated animals (6/6) controlled their viremia to undetectable level using conventional PCR during at least 10 months post infection (end of the experiment). We further focused on PHPC responses associated with viral control and found that these cells vigorously proliferate upon ex vivo stimulation with specific antigens in presence of the homeostatic IL-7 and IL-15 cytokines. Proliferating antigen specific cells contained a type of stem cell-like memory T cells (TSCM). These latter (TSCM) might be a major asset in favor of our lentivector and vaccination strategy due to their high capacity for self-regeneration/maintenance in absence of antigen source.

Les mitochondries sont impliquées dans de nombreuses voies métaboliques, et des mutations au sein de leur génome (ADNmt) conduisent à l’apparition de nombreuses pathologies. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement contre ces affections mais différentes pistes thérapeutiques sont envisagées. L’objectif de ce travail a consisté en la mise au point d’une telle stratégie, dite anti-réplicative via l’exploitation de la voie d’import naturelle des ARN dans les mitochondries. De petits ARN artificiels importables dans les mitochondries humaines ont ainsi été utilisés comme vecteurs pour y importer une séquence capable de s’hybrider spécifiquement à l’ADNmt mutant et d’en stopper sa réplication. Les résultats obtenus ont permis de prouver la validité de cette stratégie vis-à-vis d’une large délétion et de mutations ponctuelles liées à divers cas pathologiques et de caractériser l’effet de modifications chimiques sur la stabilité, l’import et l’efficacité de ces ARN recombinants. / Mitochondria are involved in many metabolic pathways, and mutations in their genome (mtDNA) can cause a wide range of human disorders. No efficient treatment against these pathologies is currently available. The objective of this work consisted in the development of a therapeutic approach, called anti-replicative, based on the use of the natural pathway of RNA import into mitochondria. Small artificial RNA molecules able to be imported into human mitochondria have been used as vectors to address oligoribonucleotides capable to hybridize specifically to mutant mtDNA and to stop its replication. The effect of various chemical modifications on the stability, import and efficiency of these recombinant RNA has been characterized. All the data obtained prove the validity of the anti-replicative strategy for mtDNA containing a large deletion or pathogenic point mutations and can be considered as an important step to further develop an efficient therapy of mitochondrial diseases.

Les télomères sont des séquences d’ADN, généralement répétées en tandem, localisées à l’extrémité des chromosomes linéaires. Une des fonctions principales des télomères est de différencier l’extrémité des chromosomes des cassures double-brin, et ainsi de prévenir l’activation des voies de réparation de l’ADN. Chez les mammifères, cette fonction est plus spécifiquement assurée par le complexe shelterin. Il s’agit d’un complexe hétérogène composé de six protéines distinctes : TRF1, TRF2, POT1, RAP1, TPP1 et TIN2, qui interagit spécifiquement avec l’ADN télomérique. Au sein de ce complexe, les protéines RAP1 et TRF2 coopèrent afin d’empêcher l’extrémité des chromosomes d’être perçue comme un dommage de l’ADN, ce qui autrement aboutirait à des fusions inter-chromosomiques suite au processus de réparation. La protéine TRF2 se lie directement à la molécule d’ADN dans laquelle elle s’enroule de façon spécifique. Cette propriété est primordiale pour générer une structure d’ADN en forme de boucle, appelée t-loop, et dont le bon fonctionnement des télomères dépend. Les travaux effectués au cours de cette thèse ont mis en évidence deux scenarii indépendants dans lesquels la protéine RAP1 assure un rôle critique dans la stabilité des télomères. Premièrement, RAP1 peut prévenir les fusions inter-chromosomiques dans des cellules exprimant une forme altérée de TRF2 incapable de former des t-loops. Deuxièmement, l’inhibition de RAP1 dans des cellules en sénescence réplicative conduit à l’activation des voies de réparation de l’ADN et à la formation de fusions inter-chromosomiques. Ces observations font écho à des résultats précédents obtenus dans des cellules HeLa traitées avec l’inhibiteur de la télomérase BIBR1532, et dont l’expression de la protéine RAP1 était abolie par shRNA. De plus, j’ai montré que les fusions interchromosomiques engendrées par la perte de RAP1 sont dépendantes de la ligase IV, qui est un acteur principal de la voie de réparation de l’ADN par recombinaison non-homologue (NHEJ). Dans l’ensemble, ces travaux démontrent l’importance de la protéine RAP1 dans la stabilité des télomères lorsque la protéine TRF2 est non fonctionnelle, mais aussi dans des situations physiologiques telles que la sénescence réplicative. / In mammals, the shelterin complex is the guardian of telomere stability. It operates through a set of six proteins (TRF1, TRF2, POT1, RAP1, TPP1 and TIN2) that binds telomeric DNA and protects it from being recognized as DNA double-strand breaks and therefore control DNA repair and DNA damage response pathways. Among them, RAP1 and TRF2 cooperate and together protect chromosome extremities from end-to-end fusions. TRF2 is seen as a major factor to control telomere DNA topology by wrapping DNA around itself in a right handed manner. This property of TRF2 is required to promote the formation of t-loops, special DNA structures at telomeres that are considered as protective barriers to DNA damage response and fusion. Here we demonstrate two independent situations where RAP1 dysfunction is critical for telomere protection. First, in cells expressing a wrapping-deficient TRF2 allele that cannot form t-loops, RAP1 appears as a backup anti-fusion mechanism. Second, RAP1 downregulation in replicative senescent cells leads to telomere fusions and DNA damage response activation. This is consistent with similar observations in HeLa cells treated with the telomerase inhibitor BIBR1532, and in which RAP1 expression was abolished by an inducible shRNA system. In addition, we show that fusions triggered by RAP1 loss are dependent upon ligase IV, which is a key player of the classical non-homologous end-joining (c-NHEJ) repair pathway. Altogether, these results indicate that RAP1 takes over telomere protection when TRF2 cannot properly function or in the normal physiological situation, such as replicative senescence.

Les cancers papillaires de la thyroïde (PTC) sont les tumeurs endocrines les plus courantes et représentent 2-3% de tous les cancers humains. Les altérations génétiques les plus pertinentes trouvées dans ces tumeurs sont des mutations dans les gènes BRAF et RAS, et des translocations du gène RET. Ces translocations oncogéniques, connues sous le nom de RET/PTC, résultent de la fusion de RET avec des gènes partenaires non-apparentés. L’exposition aux radiations ionisantes est le facteur de risque le plus important pour la formation de RET/PTC. Durant ces dernières années, notre groupe a mis en évidence un rôle crucial des espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans la formation de RET/PTC dans des cellules thyroïdiennes in vitro et a notamment montré que l'irradiation (IR) induit l’établissement d’un stress oxydatif persistant du aux ROS produites par la NADPH Oxydase DUOX1, laquelle est induite à post-IR. Cela conduit à des dommages à l'ADN. Les enfants présentent un risque significativement plus élevé de développer des cancers radio-induits de la thyroïde exprimant RET/PTC, probablement en raison du taux de prolifération élevé des cellules. Ceci suggère que la dynamique de réplication pourrait être impliquée dans la formation de la translocation RET/PTC1. En effet, il a été montré que l'induction pharmacologique d’un stress réplicatif peut favoriser la formation de RET/PTC in vitro dans les cellules thyroïdiennes. Ainsi, pour déterminer si un stress réplicatif peut contribuer aux effets à long terme de l'irradiation: à savoir une persistance des lésions de l'ADN et la formation de RET/PTC1, nous avons analysé les effets à post-IR dans les cellules NTHY-ori3.1. Nos résultats confirment qu’une irradiation des cellules aux rayons X à la dose de 5 Gy induit deux vagues de stress oxydatif: une première vague forte mais transitoire qui se produit dans les minutes qui suivent l'irradiation et une deuxième vague dont l’ augmentation débute 2 jours après l'irradiation pour persister ensuite. Ces deux pics de stress oxydatif conduisent à deux pics de dommages à l'ADN. L'irradiation des cellules à cette dose n’a aucun effet sur la prolifération et sur la progression du cycle cellulaire. Cependant, plusieurs marqueurs de stress réplicatif sont exprimés trois jours après l'irradiation. Par ailleurs, l'analyse de la dynamique de réplication révèle une diminution de la vitesse de réplication à post-IR qui est contrecarrée par les antioxydants, suggérant qu’un stress oxydatif peut contribuer à un stress réplicatif. Enfin, par ChIP-QPCR, nous observons que les gènes impliqués dans RET/PTC1 présentent plus de cassures double brin que des gènes endogènes, et ce, trois jours après l'irradiation. Ainsi, nous proposons qu’un stress réplicatif induit par un stress oxydatif pourrait être potentiellement impliqué dans l'étiologie des tumeurs RET/PTC-positives. / Papillary thyroid cancers (PTC) are the most common endocrine tumors and account for 2-3% of all human cancers. The most relevant genetic alterations found in these tumors are mutations in the genes BRAF and RAS, and chromosomal translocations in RET, a proto-oncogene activated in 15-20% of PTCs. These oncogenic translocations, known as RET/PTCs, result from the fusion of RET with unrelated partner genes. Ionizing radiation is a major risk factor for RET/PTC formation, however, the molecular mechanisms involved in these radioinduced translocations just begun to be unveiled. In the past few years, our group has reported a critical role for reactive oxygen species (ROS) in the formation of RET/PTC in thyroid cells in vitro and has also shown that irradiation can elicit a persistent oxidative stress caused by the upregulation of the NADPH Oxidase DUOX1 that leads to DNA damage, mediating at least part of the effects of radiation. However, how could ROS lead to the formation of RET/PTC is not fully understood. Children are at significantly higher risk of developing radio-induced thyroid tumors, specially RET/PTC positive, probably due to the intense proliferation rate of their follicular thyroid cells. This epidemiological observation prompts the assumption that replication dynamics may be involved in RET/PTC formation. Indeed, it has been shown that the pharmacological induction of replicative stress can stimulate the in vitro formation of RET/PTC in thyroid cells. Thus, to investigate whether replicative stress might contribute for the long-term effects of irradiation on DNA damage and RET/PTC formation, we analyzed the effects of radiation in NTHY-ori3.1 thyroid cell lineage in terms of oxidative and replicative stress and replication dynamics. Our results confirm that irradiation triggers two waves of oxidative stress: first, a strong but transient oxidative burst takes place minutes after irradiation and next, a persistently increased oxidative stress that starts only 2 days after irradiation. These two peaks of oxidative stress lead to two peaks of DNA damage. Irradiation caused little or no effect on proliferation nor on cell cycle progression. However, several protein markers of replicative stress, such as pATR, pATM, pChk1 and pRPA are induced three days after irradiation. Moreover, replication dynamics analysis revealed a diminished replication speed that has been reversed by antioxidants, suggesting that oxidative stress may contribute to replication defects. Finally, using ChIP-qPCR, we observed that the genes involved in RET/PTC1 translocation present more double-stranded breaks than RET/PTC-unrelated genes 3 days after irradiation. Hence, we propose that replicative stress is potentially involved in the etiology of RET/PTC-positive tumors. / HECHT, Fabio. The role of reactive oxygen species in thyroid radio-carcinogenesis. Rio de Janeiro, 2018. Doctoral thesis - Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil and Université Paris-Saclay, Orsay, France, 2018.O câncer papilífero de tireoide é o tumor endócrino mais comum e corresponde a 2-3% de todos os cânceres humanos. As alterações genéticas mais relevantes relacionadas a esse tumor são mutações nos genes BRAF e RAS e translocações do gene RET, um proto-oncogene ativado em 15-20% dos tumores papilíferos. Essas translocações, conhecidas como RET/PTC, resultam da fusão de RET com diversos outros genes. A radiação ionizante é um importante fator de risco para a formação de RET/PTC, no entanto, o mecanismo molecular responsável por essa translocação radioinduzida ainda não foi elucidado. Nos últimos anos, nosso grupo demonstrou um papel crítico exercido pelas espécies reativas de oxigênio na formação de RET/PTC em células tireoidianas in vitro e também mostrou que a irradiação promove um estresse oxidativo persistente causado pelo aumento de expressão da NADPH Oxidase DUOX1, levando à dano ao DNA, mediando assim parte dos efeitos da radiação. No entanto, como o ROS leva à formação de RET/PTC ainda não é compreendido. Crianças possuem um risco significativamente mais alto de desenvolver tumores tireodianos após a irradiação, especialmente RET/PTC positivos, provavelmente em função da intensa proliferação das células tireodianas. Essa associação sugere que a replicação esteja envolvida na formação de RET/PTC. De fato, foi observado que a indução farmacológica de estresse replicativo pode estimular a formação in vitro de RET/PTC em células tireodianas. Portanto, para investigar se o estresse replicativo contribui com os efeitos da irradiação no longo prazo sobre o dano ao DNA e formação de RET/PTC, nós investigamos o papel da radiação sobre o estresse oxidativo e replicativo, além da dinâmica de replicação de linhagem de células tireodianas NTHY-ori 3.1. Nossos resultados confirmam que a irradiação desencadeia duas ondas de estresse oxidativo: primeiramente, um forte, mas transitório pico de espécies reativas de oxigênio é observado minutos após a irradiação, seguido por um novo e persistente pico que só é observado a partir de dois dias após a irradiação. Esses dois picos de estresse oxidativo resultam em dois picos de dano ao DNA. A irradiação causou pouco ou nenhum efeito na proliferação ou na progressão do ciclo celular. No entanto, vários marcadores de estresse replicativo foram observados três dias após a irradiação, como pATR, pATM, pChk1 e pRPA. Além disso, a análise da dinâmica de replicação mostrou uma diminuição na velocidade da replicação que foi revertida por antioxidantes, sugerindo que o estresse oxidativo contribui para distúrbios dos mecanismos replicativos. Por fim, utilizando ChIP-qPCR, nós observamos que os genes envolvidos na translocação RET/PTC possuem mais quebras duplas do que genes endógenos, dias após a irradiação. Portanto, propomos que o estresse replicativo está potencialmente envolvido na etiologia dos tumores RET/PTC positivos.

La surexpression de la lamine B1, un composant majeur de l'enveloppe nucléaire, a été rapportée dans diverses tumeurs. Cependant, les causes et les conséquences de cette augmentation sur la stabilité du génome n'ont pas été étudiées à ce jour. En effet, l'instabilité du génome est considérée comme une caractéristique majeure des cellules cancéreuses. Pour assurer le maintien de la stabilité du génome, les cellules ont développé de multiples et complexes mécanismes parmi lesquels les voies de réparation de l'ADN et la gestion du stress réplicatif sont essentielles. Au cours de ma thèse, l'impact de l'augmentation de niveau de lamine B1 sur la stabilité du génome, en particulier sur la réparation de cassure double-brin (CDB) et sur le contrôle du stress réplicatif a été étudié. En effet, nous montrons qu'une augmentation de la lamine B1 entraîne une accumulation de CDB et leur persistance en réponse à l'irradiation (foyers γH2AX), en plus d'une sensibilité accrue à l'irradiation (formation de colonies et cassures chromosomiques). Les cellules surexprimant la lamine B1 montrent également des défauts de recrutement de 53BP1 aux sites de dommages d’ADN, couplés à une diminution de l'efficacité de la réparation de CDB par NHEJ (Non-Homologous End-Joining). De plus, nous avons identifié une interaction directe entre la lamine B1 et 53BP1 régulant le recrutement de ce dernier aux CDB. Nos résultats supportent un modèle dans lequel l'augmentation de la lamine B1 conduit à la séquestration de 53BP1, modifiant ainsi son recrutement aux CDBs. En parallèle, nous montrons que les cellules surexprimant la lamine B1 présentent des signes accrus de stress réplicatif tels que l'accumulation de foyers spontanés de p-RPA, l'augmentation des figures radiales lors du traitement par mitomycine C, et une sensibilité accrue au traitement par camptothécine. Nous avons en outre cherché à identifier les causes de l'augmentation du stress réplicatif dans ces cellules, et les conséquences potentielles, en particulier sur l'induction de phénotypes inflammatoires. En fait, nous montrons que la surexpression de la lamine B1 conduit à une diminution de l'efficacité de la réparation de CDB par la recombinaison homologue, couplée à un défaut de formation de foyers BRCA1 après irradiation. De plus, nous avons obtenu des données préliminaires suggérant une induction de l'inflammation lors de la surexpression de la lamine B1. En résumé, ce travail de Thèse a permis d’identifier un nouveau mécanisme régulant le recrutement de 53BP1 aux CDB par son interaction avec la lamine B1, et souligne le rôle de l'augmentation de la lamine B1 dans la promotion de l'instabilité génomique au moins partiellement par des défauts de réparation de CDB et une augmentation de stress réplicatif. Après confirmation de l'induction de phénotypes inflammatoires, nous aurions identifié des rôles de l'augmentation de la lamine B1 dans la promotion de deux caractéristiques majeures du cancer - l'instabilité génomique et l'inflammation - favorisant ainsi le rôle de la lamine B1 dans le développement tumoral et proposant cette dernière comme une cible thérapeutique antitumorale potentielle. / The overexpression of lamin B1, a major component of nuclear envelope, has been reported in various tumors. However, the causes and consequences of this increase on the genome stability have not been studied to date. Indeed, genome instability is considered a major hallmark of cancer cells. To ensure the maintenance of genome stability, cells have developed multiple complex mechanisms among which pathways of DNA repair and replication stress management are essential. Therefore, during my thesis the impact of an increased lamin B1 level on genome stability, in particular on double-strand break (DSB) repair and on the control of replication stress was studied. Indeed, we show that increased lamin B1 leads to an accumulation of DSBs and their persistence in response to irradiation (γH2AX foci), in addition to an increased sensitivity to irradiation (colony formation and chromosomal breaks). Lamin B1 overexpressing cells also show defects in the recruitment of 53BP1 to damage sites, coupled to a decreased efficiency of DSB repair by Non-Homologous End-Joining. Moreover, we identified a direct interaction between lamin B1 and 53BP1 regulating the latter’s recruitment to DSBs. Our results support a model where increased lamin B1 leads to the sequestration of 53BP1, thereby altering its recruitment to DSBs. In parallel, we show that cells overexpressing lamin B1 display increased signs of replication stress such as accumulation of spontaneous p-RPA foci, increased radial chromosomes upon mitomycin C treatment, and enhanced sensitivity to treatment with camptothecin. We further aimed to identify the causes of the increased replication stress in these cells, in addition to the potential consequences, in particular on the induction of inflammatory phenotypes. In fact, we show that lamin B1 overexpression leads to a decreased efficiency of DSB repair by Homologous Recombination, coupled to a defect in irradiation-induced BRCA1 foci formation. In addition, we obtained preliminary data suggesting a possible induction of inflammation upon lamin B1 overexpression. Altogether, this work identifies a novel mechanism regulating the recruitment of 53BP1 to damage sites through its interaction with lamin B1, and highlights the role of increased lamin B1 in promoting genome instability at least partially through defective DSB repair and increased replication stress. Upon confirming the induction of inflammatory phenotypes, we would have identified roles of increased lamin B1 in promoting two major hallmarks of cancer – genomic instability and inflammation - thereby favorizing a role for lamin B1 in tumor development and proposing the latter as a potential anti-tumor therapeutic target.

Proteins in Escherichia coli were compared in terms of essentiality, centrality, and conservation. The hypotheses of this study are: for proteins in Escherichia coli, (1) there is a positive, measureable correlation between protein conservation and essentiality, (2) there is a positive relationship between conservation and degree centrality, and (3) essentiality and centrality also have a positive correlation. The third hypothesis was supported by a moderate correlation, the first with a weak correlation, and the second hypotheis was not supported. When proteins that did not map to orthologous groups and proteins that had no interactions were removed, the relationship between essentality and conservation increased to a strong relationship. This was due to the effect of proteins that did not map to orthologus groups and suggests that protein orthology represented by clusters of orthologus groups does not accurately dipict protein conservation among the species studied.

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Le cycle cellulaire est l'ensemble des étapes qui conduisent une cellule mère à se diviser en deux cellules filles. La protéine Checkpoint kinase 1 (Chk1) est importante pour sa progression. Nous avons d'une part cherché à savoir si Chk1 intervenait lors des mécanismes de production des plaquettes, car ces cellules permettant la coagulation du sang sont issues d'un cycle cellulaire particulier. Par ailleurs, nous avons étudié le rôle de Chk1 dans la Leucémie Aiguë Myéloïde (LAM), cancer des cellules sanguines. Les patients atteints de LAM sont traités par une chimiothérapie visant à endommager l'ADN afin d'entrainer la mort des cellules cancéreuses. Chk1 est garante du contrôle de la réparation des dommages de l'ADN, ce qui contrecarre l'effet de la chimiothérapie. Elle pourrait donc favoriser l'apparition de résistance. Son rôle dans les LAM étant peu connu, l'objectif de ce projet est donc de vérifier si Chk1 favorise la résistance des cellules leucémiques aux chimiothérapies. / The cell cycle is a series of events that takes place in a mother cell, leading to its division into two daughter cells. The protein Checkpoint kinase 1 (Chk1) is mandatory for its coordinated progression. In this PhD projet, we wondered on the one hand whether Chk1 could be involved in the platelets production process, because these componants of blood that enables coagulation are produced due to a particular cell cycle dedicated to this end. On the other hand, we studied the role of Chk1 in Acute Myeloid Leukemia (LAM) physiopathology. LAM is a cancer of blood cells, in which patients are treated with drugs that create DNA damages, causing the death of tumoral cells. The role of Chk1 in the drug response in LAM is not well studied, but, as it enables DNA repair, it may render theses medicines less efficient, leading to relapses to therapies. So the goal of this project is to check wether Chk1 favors the resistance of some LAM cells to chemotherapeutic treatments.