A reprogramação nuclear de uma célula somática a um estado embrionário tem diversas aplicações, como pesquisas básicas na biologia do desenvolvimento, terapia celular, melhoramento genético em animais de produção e conservação de espécies. As principais técnicas utilizadas para a reprogramação nuclear são a transferência nuclear de células somáticas (TNCS) e a geração de células tronco pluripotente induzidas (iPS). Muitos trabalhos têm mostrado uma baixa eficiência no processo de reprogramação nuclear nas duas técnicas, além disso, modificações epigenéticas tem sido apontada como a principal barreira para uma reprogramação nuclear eficiente. Por esse motivo, medidas como a utilização de células menos diferenciadas e/ou alteração do perfil epigenético das células somáticas podem aumentar a eficiência destas técnicas. Por isso, o objetivo deste trabalho foi investigar a influência de marcas epigenéticas em células bovinas utilizadas na reprogramação nuclear mediada por TNCS ou superexpressão de genes relacionados a pluripotêcia (iPS). Para isso, utilizamos 3 abordagens. Primeiro, analisamos marcações epigenéticas relacionadas ao desenvolvimento embrionário e pluripotência (H3K9me2, H3K9me3, H3K9ac, 5mC e 5hmC) em diferentes tipos celulares, analisamos a expressão gênica de genes responsáveis por essas marcações em células de diferentes tecidos (ex. células tronco mesenquimais (MSC) e fibroblastos) e as utilizamos como doadoras de núcleo na TNCS. Na segunda e a terceira abordagem, utilizamos células com menores níveis de H3K9me2 para a geração de iPS e na TNCS, respectivamente. Além disso, por se mostrar eficiente na TNCS, analisamos o efeito da sincronização do ciclo celular por privação de soro fetal bovino (SFB) na geração de células iPS. Com o intuito de diminuir os níveis de H3K9me2, as células foram tratadas com UNC0638, um inibidor especifico das metiltransferases de histona G9a/GLP. Nossos resultados do primeiro experimento mostraram que as MSC podem ser utilizadas como doadoras de núcleo na TNCS, no entanto, mesmo com algumas diferenças na expressão gênica em relação aos fibroblastos, a produção de blastocistos não foi diferente entre as duas células. No segundo experimento, as células privadas de SFB geraram mais colônias que as células controle, enquanto que as células tratadas não apresentaram diferença. Por último, as células tratadas com o UNC0638 apresentaram um menor nível de metilação no DNA em zigotos em relação às células controle. Os resultados encontrados neste trabalho podem contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos epigenéticos envolvidos na reprogramação nuclear de bovinos / Nuclear reprogramming of somatic cells to embryonic state has several aplications, such as basic research on developmental biology, cell therapy, genetic improvement in livestock animals and preservation of endangered species. The principal techniques utilized to achieve nuclear reprogramming are Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) and induced pluripotency. Several works has reported low efficiency rates of nuclear reprogramming when these techniques are used to reprogram somatic cells. Moreover, epigenetic modifications acquired during development act as epigenetic barrier to the complete reprogramming process. For this reason, strategies such as use of less differentiated cells and/or modification of epigenetic profile of somatic cells might increase the efficiency these techniques. The objective of this work was investigate the influence of epigenetic marks in bovine cells utilized on nuclear reprogramming experiments mediated by SCNT or induced pluripotency. To investigate it, we used three approaches. First, we analyzed the epigenetic marks related to the embryonic development and pluripotency (e.g H3K9me2, H3K9me3, H3K9ac, 5mC and 5hmC), gene expression of genes involved in these epigenetic marks in different tissues (i.e. mesenchymal stem cells (MSC) and fibroblasts) and their use as nuclear donor cells on SCNT procedure. Regarding the second and the third approach, we utilized cells with reduced levels of H3K9me2 to generate iPS cells and cloned embryos, respectively. Furthermore, since serum starvation has been demonstrated increase SCNT developmental rates, we assessed the effect of cell cycle synchronization mediated by serum starvation on nuclear reprogramming using iPS cells. Aiming decrease the levels of H3K9me2, cells were treated with UNC0638, a chemical probe that works as a specific inhibitor of the histone methyltransferases G9a and its counterpartner GLP. Our results showed that MSC are suitable to be used as nuclear donors on SCNT procedures, however, in spite of differences on gene expression comparing with fibroblasts, the embryonic developmental rates were not improved. On the second experiment, cells privated of fetal calf serum produced more iPS cells colonies than control cells, whereas cells treated with UNC did not show differences when compared with untreated cells. Lastly, UNC treated donor cells treated produced cloned zygotes with lower levels of DNA methylation compared to zygotes derivated from untreated cells. The results presented here will contribute to the better understanding of the epigenetic mechanisms involved on bovine nuclear reprogramming

Introdução:A história natural da Síndrome dos Ovários Policísticos (SOP) tem início durante a fase do crescimento fetal, que é umperíodo em que ocorre a diferenciação e a maturação funcional dos órgãos e tecidos. Quando surgem condições adversas durante a vida fetal, existe predomínio do processo catabólico, que promove a restriçãode crescimento intra-útero e o nascimento de recém-nascidos (RN) pequenos para a idade gestacional (PIG). Durante esta fase de hipoxemia fetal crônica, surgem alterações na expressão gênica de proteínas nucleares (reprogramação fetal) que poderão codificar manifestações fenotípicas na vida adulta, a depender das células que foram acometidas. Este processo, associado à predisposição genética e aos fatores ambientais, pode favorecer o surgimento da SOP. Objetivo:Avaliar se os RN de termo PIG (femininos) têm maior prevalência de SOP na idade adulta quando comparados aos RN Adequados para Idade Gestacional (AIG) na população da coorte de indivíduos nascidos em Ribeirão Preto durante o período de 31.05.1978 e 01.06.1979. Casuística e Métodos:Foram convocadas 440 mulheres de novembro/2007 à outubro/2008 para avaliação de repercussões reprodutivase metabólicas no menacme. Deste total, concordaram em participar da pesquisa 355 pacientes (268 AIG e 87 PIG), sendo que 138 AIGs e 37 PIGs foram excluídas devido ao uso de anticoncepcional hormonal (97) e pela presença de gestação ou amamentação (78). Todas as mulheres foram submetidas à anamnese (com avaliação da idade, das características do ciclo menstrual, dos sinais/sintomas do hiperandrogenismo, do peso, da altura e do índice de massa corpórea). Realizamos a dosagem hormonal (FSH, LH, prolactina, testosterona, DHEAS, 17-OH progesterona, insulina), a avaliação bioquímica (lipidograma, glicemia e teste de tolerância oral com 75 gramas de glicose), a SHBG e a ultra-sonografia pélvica para definição do diagnóstico de SOP. Também avaliamos o índice de androgênios livres (FAI),a resistência insulínica (RI) (através do HOMA) e a prevalência da síndrome metabólica (SMET). A coleta foi realizada entre o terceiro e o quinto dia do ciclo menstrual, após jejum de 12 horas. Resultados:a prevalência de SOP foi mais elevada no grupo PIG (32%) do que em mulheres do grupo AIG (13,8%), com risco relativo de 2,02 (IC95%: 1,27 - 3,21, p=0,0097) . Em relação aos critérios de SOP,a irregularidade menstrual (PIG: 51% vs AIG: 25,4%, p=0,0012) e o hiperandrogenismo (PIG: 41,2% vs AIG:22,3%, p=0,01) foram mais elevados nas pacientes PIG. Já a ultrassonografia, os exames bioquímicos, o FAI, e a avaliação hormonal não apresentaram diferenças significativas entre os grupos. Também não houve diferenças entre os grupos em relação às prevalências de SMET e RI. Conclusão: Mulheres PIG ao nascimento representam um grupo de risco para o desenvolvimento da SOP durante o menacme. Estudos de seguimento destas mulheres devem ser realizados para avaliar a relação do pesoao nascer com a prevalência de doenças cardiovasculares e metabólicas ao longo da vida. / Introduction:The natural history of Polycystic Ovary Syndrome (POS) starts during fetal growth, a period during which the differentiation and functional maturation of organs and tissues occurs. When adverse conditions arise during fetal life there is a predominance of the catabolic process, which promotes intrauterine growth restriction and the birth of small for gestational age (SGA) newborns (NB). During this phase of chronic fetal hypoxemia, changes in the gene expression of nuclearproteins arise (fetal reprogramming) that might code for phenotypic manifestations during adult life depending on the affected cells. This process, together with genetic predisposition and environmental factors, may favor the onset of POS. Objective:To determine whether term female SGA NB have a higher prevalence of POS during adult age compared to women adequate for gestational age (AGA) at birth in the population of the cohort of individuals born in Ribeirão Preto during the period from 31.05.1978 to 01.06.1979. Cases and Methods:From November 2007 to October 2008, 440 women have been convoked for the assessment of reproductive and metabolic repercussions during menacme. Among them, 355 appeared (268 AGA and 87 SGA), with 137 AGAs and 38 SGAs being excluded from the study due to the use of a hormonal contraceptive (98) and to the presence of pregnancy or breast-feeding (77). The medical history of all women was taken, including age, characteristics of the menstrual cycle and of signs and symptoms of hyperandrogenism, height, and body mass index. We performed hormone determination (FSH, LH, prolactin, testosterone, DHEAS, 17-OH progesterone), biochemical evaluation (lipid profile, glycemia and 75 g oral glucose tolerance test), and pelvic ultrasound for the definition of the diagnosis of POS. Blood was collected between the third and fourth day ofthe menstrual cycle after a 12 hour fast. Results:The prevalence of POS was higher in the SGA group (32%) than in the AGA group (13.8%), with relative risk of 2,02 (IC 95%: 1,27- 3,21, p=0,0097). Regarding the criteria for a diagnosis of POS, chronic anovulation (SGA:51% vs AGA: 25,4%, p = 0.0012) and clinical hyperandrogenism (SGA: 41.2% vs AGA: 22.3%, p = 0.01) were more elevated in SGA patients. In contrast, ulrasonography and the biochemical and hormonal exams did not show significant differences between groups. Conclusion:Women who were SGA at birth represent a risk group for the development of POS during menacme. Following studies this women should be performed to assess the relation to birth weight with the prevalence of cardiovascular and metabolic diseases during of life.

A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma patologia neuromuscular causada pela mutação ou deleção do gene da distrofina, localizado no cromossomo X, levando a degeneração muscular ao longo da vida do paciente. A doença também tem sido associada a déficit cognitivo e falta de habilidade comportamental. Pesquisas com células neurais de pacientes com DMD poderiam ajudar a elucidar os sintomas neurológicos associados. Neste trabalho, através de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) derivadas da polpa de dente decíduo esfoliado (SHED) de pacientes com DMD modelamos a DMD produzindo células neurais vivas in vitro. A expressão da distrofina foi verificada durante e após a diferenciação neuronal e nos ensaios de imunofluorescência, mostrando que essa proteína está presente em células do SNC. Na análise gênica através do qPCR, a Dp71 e a Dp140, isoformas da distrofina, apresentavam uma expressão menor do que os controles. Além disso, as análises das sinapses baseada na colocalização de marcadores pré e pós-sinápticos (Sinapsina1 e Homer 1) revelaram que os neurônios dos pacientes com DMD tinham menor quantidade de sinapses que os controles, reforçando o papel da distrofina no SNC. Logo, a expressão de genes relacionados a plasticidade sináptica revelou 10 genes alterados nos neurônios dos pacientes DMD, sugerindo que a mutação no gene da distrofina possivelmente altera a plasticidade sináptica e pode estar envolvida na habilidade cognitiva destes pacientes. Desta forma, com base nos nossos achados, a modelagem neuronal de DMD é factível e pode auxiliar a elucidar os mecanismos da fisiopatologia da doença / The Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a neuromuscular disorder caused by a mutation or deletion of the dystrophin gene located on the X chromosome, leading to muscle degeneration throughout the patient\'s life. The disease has also been associated with cognitive impairment and lack of behavioral skill. Research on neural cells from patients with DMD could help to elucidate the neurological symptoms associated. In this work, through induced pluripotent stem cells (iPSC) derived from dental pulp exfoliated (SHED) of patients with DMD model the DMD producing living neural cells in vitro. The dystrophin expression was observed during and after neuronal differentiation and immunofluorescence assays, showing that this protein is present in CNS cells. In gene analysis by qPCR, the Dp71 and Dp140, isoforms of dystrophin, had a lower expression than controls. Furthermore, based on analysis of synapses colocalization pre and postsynaptic markers (Synapsin1 and Homer 1) showed that neurons of DMD patients had lower number of synapses controls, supporting a role for dystrophin in the CNS. Finally, the expression of synaptic plasticity related genes wasfound in 10 genes altered in neurons of DMD patients, suggesting that the mutation of the dystrophin gene possibly alters synaptic plasticity and may be involved in cognitive ability of these patients. Finally, based on our findings, neuronal modeling DMD is feasible and may help elucidate the mechanisms of pathophysiology of the disease

O estudo de mutações genéticas como causa das cardiomiopatias teve início com a descoberta de mutações em proteínas sarcoméricas que levavam à Cardiomiopatia Hipertrófica, desde então, alterações em diversos genes, de proteínas contráteis ou não, foram descobertas e listadas como a responsável pelo desenvolvimento de diferentes cardiomiopatias. Estudar o efeito destas mutações nos cardiomiócitos destes pacientes permanecia um desafio devido ao difícil acesso às células cardíacas. Em 2007, a técnica de reprogramação de células somáticas em células-tronco pluripotentes foi descoberta. Pelo fato das células-tronco pluripotentes serem capazes de ser diferenciadas em cardiomiócitos, surgiu-se a possibilidade de se estudar essas células de indivíduos portadores das mutações genéticas. Esta tese teve como objetivo a criação de um modelo celular para estudar a Cardiomiopatia Hipertrófica causada por mutações genéticas. Inicialmente foi estabelecido um protocolo de reprogramação celular para se estabelecer linhagens celulares das células-tronco induzidas de um paciente com mutação no gene MYH7. Tendo as células caracterizadas, elas foram diferenciadas em cardiomiócitos através de um protocolo adaptado de protocolos de diferenciação direta em cardiomiócitos. Os cardiomiócitos gerados apresentaram características moleculares e funcionais semelhantes à cardiomiócitos primários humanos e foi visualizado, através de microscopia eletrônica de transmissão, que os cardiomiócitos do paciente com alteração genética possuíam grande proporção de sarcômeros desorganizados em comparação a cardiomiócitos de indivíduos saudáveis. Em conclusão, o modelo celular desenvolvido sugere ser possível o estudo do efeito de mutações genéticas em Cardiomiopatia Hipertrófica. / The study of genetic mutations as the cause of cardiomyopathies initiates with the discovery of mutations in sarcomeric proteins genes that lead to Hypertrophic Cardiomyopathy. Since then, mutations in several genes, coding to sarcomeric proteins or not, were discovered and listed as the reason to the cardiomyopathies. To study the effect of these mutations was a challenge due the difficulty to accesses cardiac cells. In 2007, the technique of reprogramming somatic cells into pluripotent stem cells was discovered. The fact that the pluripotent stem cells are capable of differentiating into cardiomyocytes opened the opportunity to study these cells from individuals with genetic mutations. This thesis aimed to create a cellular model to study Hypertrophic Cardiomyopathy caused by genetic mutations. Initially we established a cell reprogramming protocol to establish induced stem cells lines from a patient with mutation in MYH7 gene. Having characterized the cells, they were differentiated into cardiomyocytes using an adapted protocol from direct differentiation protocols. Cardiomyocytes generated showed molecular and functional characteristics similar to human primary cardiomyocytes and were visualized by means of transmission electron microscopy. The patient\'s cardiomyocytes had a large proportion of disorganized sarcomeres compared to cardiomyocytes from healthy individuals. In conclusion, the cell model developed suggests that it is possible to study the effect of genetic mutation in Hypertrophic Cardiomyopathy using induced pluripotent stem cells derived cardiomyocytes.

Os vírus são eficazes na transferência de genes em células devido aos seus mecanismos especializados. No entanto, vírus como veículos de entrega de genes podem acarretar em problemas, particularmente quando proposto para reprogramar células somáticas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) visando utilização terapêutica. No presente estudo, procurou-se desenvolver um sistema alternativo para entregar diretamente proteínas nucleares (Oct4, Sox2, KLF4, e c-Myc) fusionadas com o domínio de transdução de proteína TAT, para promover a reprogramação de fibroblastos embrionários de camundongos (MEF) ou células mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano (hASC) em células iPS. Primeiramente o PTD TAT ou TAT- foi fundido a proteína verde fluorescente (GFP) como modelo para prova de princípio e padronização detalhada. Inesperadamente, TAT-GFP produzido e secretado pelas células NIH-3T3 produtora não foi capaz de ser detectado no meio de cultura por verificação quantitativa fluorimétrica, nem foi capaz de ser detectada em células-alvo, por citometria de fluxo, depois de co-cultura em transwells. Essa observação pode ser explicada por: (1) ineficiência desse tipo de célula em secretar proteínas e (2) falta de resistência à clivagem por endoproteases furinas. Para contornar esses fatores limitantes usou-se citometria de fluxo para avaliar as melhores condições para a transfecção por seis diferentes tipos de células (CHO, NIH-3T3, HT1080, HEK-293A, HEK-293t e COS-7) com TAT (modificada para ser resistente à furinas) fundido a GFP. Células 293t-TAT-GFP exibiram a maior eficiência de transfecção e também de secreção. O mesmo pôde ser observado para as seis linhagens celulares expressando fatores de transcrição nucleares TAT, determinados por ELISA. Em seguida, diferentes estratégias de entrega foram testadas. A primeira foi baseada na co-cultura de uma mistura de células produtoras com MEF ou hASC. No entanto, não foi possível observar a reprogramação devido à morte celular. A segunda foi baseada na concentração de meio condicionado de cultura de células por centrifugação usando colunas Amicon, trocando o meio a cada 24h, em quatro ciclos. No entanto, apesar da presença de algumas colônias após 20-30 dias, nenhuma colônia verdadeira iPS foi obtida. Na sequência, as células foram tratadas com cada proteína de forma independente, e as demais foram substituídas pelo retrovírus correspondente, trocando meio a cada 72h, em quatro ciclos. Essa estratégia, apesar de permitir verificar a função de cada proteína, também não resultou em reprogramação. Este achado pode ser explicado pela diferenciação celular induzida por BCS, que também é concentrado no processo. Assim, passou-se a adaptação de \"células produtoras\" em condições de cultura livre de soro, para enriquecer a produção dos fatores nucleares individuais, necessários para a reprogramação. A otimização sistematizada deste processo está sendo realizada em parceria com o IPT e deve resultar em quantidades de proteína de fusão suficientes para o teste final da hipótese proposta. Em conjunto, são apresentados os dados da geração de linhagens celulares expressando estavelmente os vários fatores de transcrição e estratégias para melhorar a eficiência necessária para a produção iPS. Esta nova estratégia garante uma produção eficiente de TAT fundida a fatores nucleares de reprogramação e sua eficácia para promover a reprogramação de células somáticas de maneira livre de vírus merece ser investigado futuramente / Viruses are effective at transferring genes into cells by its specialized mechanisms. However, viruses as gene delivery vehicles entail problems, particularly when proposed to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem cells (iPS) for therapeutic uses. In the present study, we aimed to develop an alternative system for directly delivering nuclear proteins (Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc) fused with TAT protein transduction domain to promote reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEF) or human adipose tissue derived mesenchymal cells (hASC) into iPS cells. First TAT- or TAT- PTD was fused to green fluorescent protein (GFP) as a proof of principle model and for detailed standardization. Unexpectedly, TAT-GFP produced and secreted by NIH-3T3 producer cells was not detected in the culture medium by quantitative fluorimetric verification, nor detected on target cells, by flow cytometry, after being co-cultured using transwells. This observation maybe explained by: (1) inefficiency of this cell type to be transfected and to secrete proteins and (2) lack of resistance to furin endoproteases cleavage on Golgi of TAT sequence. To circumvent these limiting factors we used flow cytometer to assess the best conditions for transfection in six different cell types (CHO, NIH-3T3, HT1080, HEK-293A, HEK-293t and COS-7) with TAT- (a modified PTD to be resistant to furin endoproteases) fused to GFP. 293t-TAT-GFP cells displayed the highest transfection efficiency and secretion levels. The same could be observed for the six cell lineages expressing TAT- nuclear transcription factors, determined by ELISA.Next, different delivery strategies were tested for TAT- nuclear transcription factor system. Co-culturing a mix of producer cells with MEF or hASC resulted in not reprogramming and this was associated with cell death. The second was based on the use of microconcentrated conditioned cell culture medium, changed every 24h, in four cycles. However, despite the presence of some emerging colonies after 20-30 days, no true iPS colonies were obtained. Then, cells were treated with each protein independently, and the others were replaced by the corresponding retrovirus, changing cell medium every 72h, in four cycles. We verified the reprogramming potential of each protein, but no true colonies were obtained.One possibility for this finding is that BCS is also concentrated by centrifugation and may induce cell differentiation. To circumvent these problems, we have started the adaptation of producer cells in a serum-free culture condition to enrich the production of the individual factors required for reprogramming. This optimization process is taking place in collaboration with the IPT and shall result in large amounts of the fusion protein to finally test the proposed hypothesis. Altogether, we presented the generation of several cell lines stably expressing the transcription factors and strategies to improve the efficiency required for iPS production. This novel strategy guarantees efficient production of TAT-fused reprogramming nuclear factors and its efficacy to promote somatic cells reprogramming in a virus-free manner deserves to be further investigated

Estratégias como a transferência nuclear e a reprogramação induzida vêm sendo empregadas com o objetivo de induzir células somáticas a um estado pluripotente similar ao embrionário. O processo de reprogramação nuclear e extremamente desejável e possui importantes contribuições tanto no estudo da ciência básica como aplicada, como por exemplo, no aumento da eficiência das biotécnicas de produção animal ou na medicina, com a possibilidade de terapia celular autóloga. Uma série de estudos, porem, ainda são necessários para que tais aplicações sejam viáveis, uma vez que os mecanismos fundamentais das técnicas empregadas ainda não estão totalmente elucidados. Esta proposta teve como objetivo gerar células bovinas pluripotentes através da reprogramação direta e utilizá-las na transferência de núcleo para a produção animal visando o aumento da eficiência da reprogramação celular. Para tal, foi analisada a capacidade de indução e manutenção da pluripotência em células somáticas bovinas comparando-as com células humanas e equinas (células pluripotentes induzidas - iPSC), assim como a capacidade de desenvolvimento de embriões produzidos através da combinação das técnicas em bovinos. As células iPS derivadas neste estudo foram produzidas mediante transdução lentiviral de fatores de transcrição (OSKM) murinos, caracterizadas e utilizadas como doadoras de núcleo na clonagem. Resumidamente, oócitos bovinos obtidos de ovários provenientes de abatedouros foram maturados in vitro por 18h, enucleados e reconstruídos com células iPS (n=203 ou fibroblastos fetais bovinos (bFF, n=153), em cinco repetições. Após reconstrução os embriões foram ativados com ionomicina e 6-DMAP e cultivados in vitro até o estágio de blastocisto. Foram avaliadas as taxas de fusão, clivagem (48h após ativação) e desenvolvimento a blastocisto (192h após ativação) e os resultados foram submetidos ao teste de Qui-quadrado a 5% de significância. Foi possível a produção de embriões a partir de biPS, entretanto, este estudo evidenciou a necessidade de otimização da sincronização do ciclo celular em células iPS. Não foram encontradas diferenças entre os grupos quanto à capacidade de produção a blastocisto ou clivagem, porém o grupo reconstruído com células iPS apresentou uma menor taxa de fusão. Com a finalidade de entender a influência de fatores de transcrição específicos na reprogramação nuclear, bFF expressando OCT4 humano (hOCT4) e hSOX2 combinados com as proteínas repórteres fluorescentes vexGFP e mCitrine, respectivamente, foram submetidas à separação celular por citometria de fluxo e utilizados como doadores de núcleo. Foram utilizados bFF expressando OCT4-vexGFP (n=182, quadruplicata), SOX2-mCitrine (n=203, quadruplicata) ou células controle (não transduzidas, n=178 e n=149, em quadruplicata para grupos OCT4 e SOX2, respectivamente). Não foram encontradas diferenças entre os grupos nas características de capacidade de desenvolvimento in vitro estudadas. Em conclusão, este estudo relata a possibilidade de produção de células bovinas reprogramadas, além de também mostrar que a transferência de núcleo utilizando células expressando hSOX2 ou hOCT4, ou já reprogramadas, resulta em taxas similares de produção embrionária quando comparadas à utilização de células controle. O conhecimento da contribuição de cada fator utilizado na reprogramação induzida, aliado a estudos de comparação com a capacidade de desenvolvimento in vitro de organismos derivados de células reprogramadas deverá contribuir para o aumento da eficiência da clonagem e produção animal in vitro como para a medicina regenerativa. / Nuclear transfer and induced reprogramming are technologies usually used for the induction of somatic cells into an embryonic-like pluripotent status. The knowledgment of nuclear reprogramming process is highly desirable, leading to important contributions for both basic and applied sciences; for example, resulting in the increase in the efficiency of several animal biotechnologies, or else enabling autologous cellular therapy for medical purposes. However, basic studies are still needed in order to enable such applications, once the mechanisms controlling in vitro reprogramming are yet to be unraveled. This study aims to generate induced pluripotent bovine stem cells through direct reprogramming and its use in nuclear transfer in order to enhance the cellular reprogramming efficiency, For that, the potential of pluripotency induction and maintenance was analyzed in bovine somatic cells, comparing those with human and equine cells, as well as the potential of embryonic development after combining direct and nuclear reprogramming. iPS cells derived in this study were produced trought lentivirus transduction of mouse transcription factors (OSKM), further characterized and used as nuclei donors for cloning. In summary, bovine oocytes were obtained from slaughterhouse ovaries, in vitro matured for 18h, enucleated and reconstructed with iPS cells (n=203) or fetal fibroblasts (bFF, n=153), in five replicates. Embryos were reconstructed, chemically activated with ionomycin and 6-DMAP and cultured in vitro until blastocyst stage. Fusion, cleavage (48h post activation) and blastocyst developmental rates (192h post activation) were analyzed and result submitted to Chi-square test at 5% significance. biPS enabled embryo production, however further optimization on cell cycle synchronization still needs to be accomplished. No difference was observed between groups regarding cleavage or blastocyst developmental rates, however iPS group presented a reduced fusion rate when compared to control. For a better understanding on how reprogramming associated transcription factors could influence on nuclear reprogramming, bFF expressing human OCT4 (hOCT4) or hSOX2 combined with the fluorescent protein reporters vexGFP and mCitrine, respectively, were submitted to flow citometry cell sorting and used as nuclei donors. bFF expressing OCT4-vexGFP (n=182, quadruplicate), SOX2-mCitrine (n=203, quadruplicate) or control cells (non transduced, n=178 and n=149, in quadruplicate for OCT4 and SOX2, respectively) were used. No difference was observed between groups regarding the in vitro developmental potential rates. In conclusion, the present study reports the generation of reprogrammed bovine cells, and its use the nuclear transfer. Donor cells expressing hOCT4, hSOX2 or reprogrammed cells resulted in similar developmental in vitro rates when compared to controls. The knowledge of each reprogramming factor influence on in vitro reprogramming, together with comparison studies on in vitro developmental potential of organisms derived from reprogrammed cells should help enhancing not only the cloning efficiency and in vitro animal production, but also the regenerative medicine.

Estratégias como a transferência nuclear e a reprogramação induzida vêm sendo empregadas com o objetivo de induzir células somáticas a um estado pluripotente similar ao embrionário. O processo de reprogramação nuclear e extremamente desejável e possui importantes contribuições tanto no estudo da ciência básica como aplicada, como por exemplo, no aumento da eficiência das biotécnicas de produção animal ou na medicina, com a possibilidade de terapia celular autóloga. Uma série de estudos, porem, ainda são necessários para que tais aplicações sejam viáveis, uma vez que os mecanismos fundamentais das técnicas empregadas ainda não estão totalmente elucidados. Esta proposta teve como objetivo gerar células bovinas pluripotentes através da reprogramação direta e utilizá-las na transferência de núcleo para a produção animal visando o aumento da eficiência da reprogramação celular. Para tal, foi analisada a capacidade de indução e manutenção da pluripotência em células somáticas bovinas comparando-as com células humanas e equinas (células pluripotentes induzidas - iPSC), assim como a capacidade de desenvolvimento de embriões produzidos através da combinação das técnicas em bovinos. As células iPS derivadas neste estudo foram produzidas mediante transdução lentiviral de fatores de transcrição (OSKM) murinos, caracterizadas e utilizadas como doadoras de núcleo na clonagem. Resumidamente, oócitos bovinos obtidos de ovários provenientes de abatedouros foram maturados in vitro por 18h, enucleados e reconstruídos com células iPS (n=203 ou fibroblastos fetais bovinos (bFF, n=153), em cinco repetições. Após reconstrução os embriões foram ativados com ionomicina e 6-DMAP e cultivados in vitro até o estágio de blastocisto. Foram avaliadas as taxas de fusão, clivagem (48h após ativação) e desenvolvimento a blastocisto (192h após ativação) e os resultados foram submetidos ao teste de Qui-quadrado a 5% de significância. Foi possível a produção de embriões a partir de biPS, entretanto, este estudo evidenciou a necessidade de otimização da sincronização do ciclo celular em células iPS. Não foram encontradas diferenças entre os grupos quanto à capacidade de produção a blastocisto ou clivagem, porém o grupo reconstruído com células iPS apresentou uma menor taxa de fusão. Com a finalidade de entender a influência de fatores de transcrição específicos na reprogramação nuclear, bFF expressando OCT4 humano (hOCT4) e hSOX2 combinados com as proteínas repórteres fluorescentes vexGFP e mCitrine, respectivamente, foram submetidas à separação celular por citometria de fluxo e utilizados como doadores de núcleo. Foram utilizados bFF expressando OCT4-vexGFP (n=182, quadruplicata), SOX2-mCitrine (n=203, quadruplicata) ou células controle (não transduzidas, n=178 e n=149, em quadruplicata para grupos OCT4 e SOX2, respectivamente). Não foram encontradas diferenças entre os grupos nas características de capacidade de desenvolvimento in vitro estudadas. Em conclusão, este estudo relata a possibilidade de produção de células bovinas reprogramadas, além de também mostrar que a transferência de núcleo utilizando células expressando hSOX2 ou hOCT4, ou já reprogramadas, resulta em taxas similares de produção embrionária quando comparadas à utilização de células controle. O conhecimento da contribuição de cada fator utilizado na reprogramação induzida, aliado a estudos de comparação com a capacidade de desenvolvimento in vitro de organismos derivados de células reprogramadas deverá contribuir para o aumento da eficiência da clonagem e produção animal in vitro como para a medicina regenerativa. / Nuclear transfer and induced reprogramming are technologies usually used for the induction of somatic cells into an embryonic-like pluripotent status. The knowledgment of nuclear reprogramming process is highly desirable, leading to important contributions for both basic and applied sciences; for example, resulting in the increase in the efficiency of several animal biotechnologies, or else enabling autologous cellular therapy for medical purposes. However, basic studies are still needed in order to enable such applications, once the mechanisms controlling in vitro reprogramming are yet to be unraveled. This study aims to generate induced pluripotent bovine stem cells through direct reprogramming and its use in nuclear transfer in order to enhance the cellular reprogramming efficiency, For that, the potential of pluripotency induction and maintenance was analyzed in bovine somatic cells, comparing those with human and equine cells, as well as the potential of embryonic development after combining direct and nuclear reprogramming. iPS cells derived in this study were produced trought lentivirus transduction of mouse transcription factors (OSKM), further characterized and used as nuclei donors for cloning. In summary, bovine oocytes were obtained from slaughterhouse ovaries, in vitro matured for 18h, enucleated and reconstructed with iPS cells (n=203) or fetal fibroblasts (bFF, n=153), in five replicates. Embryos were reconstructed, chemically activated with ionomycin and 6-DMAP and cultured in vitro until blastocyst stage. Fusion, cleavage (48h post activation) and blastocyst developmental rates (192h post activation) were analyzed and result submitted to Chi-square test at 5% significance. biPS enabled embryo production, however further optimization on cell cycle synchronization still needs to be accomplished. No difference was observed between groups regarding cleavage or blastocyst developmental rates, however iPS group presented a reduced fusion rate when compared to control. For a better understanding on how reprogramming associated transcription factors could influence on nuclear reprogramming, bFF expressing human OCT4 (hOCT4) or hSOX2 combined with the fluorescent protein reporters vexGFP and mCitrine, respectively, were submitted to flow citometry cell sorting and used as nuclei donors. bFF expressing OCT4-vexGFP (n=182, quadruplicate), SOX2-mCitrine (n=203, quadruplicate) or control cells (non transduced, n=178 and n=149, in quadruplicate for OCT4 and SOX2, respectively) were used. No difference was observed between groups regarding the in vitro developmental potential rates. In conclusion, the present study reports the generation of reprogrammed bovine cells, and its use the nuclear transfer. Donor cells expressing hOCT4, hSOX2 or reprogrammed cells resulted in similar developmental in vitro rates when compared to controls. The knowledge of each reprogramming factor influence on in vitro reprogramming, together with comparison studies on in vitro developmental potential of organisms derived from reprogrammed cells should help enhancing not only the cloning efficiency and in vitro animal production, but also the regenerative medicine.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) exist in multiple states of pluripotency, broadly categorised as naïve and primed states. These provide an important model to investigate the earliest stages of human embryonic development. Naïve cells can be obtained through primed-to-naïve reprogramming; however, there are no reliable methods to prospectively isolate unmodified naïve cells during this process. Moreover, the current isolation strategies are incompatible for enrichment of naïve hPSCs early during reprogramming. Consequently, we know very little about the temporal dynamics of transcriptional changes and remodelling of the epigenetic landscape that occurs during the reprogramming process. To address this knowledge gap, I sought to develop an isolation strategy capable of identifying nascent naïve hPSCs early during reprogramming. Comprehensive profiling of cell-surface markers by flow cytometry in naïve and primed hPSCs revealed pluripotent state-specific antibodies. By compiling the identified state-specific markers into a multiplexed antibody panel, I was able to distinguish naïve and primed hPSCs. Moreover, the antibody panel was able to track the dynamics of primed-to-naïve reprogramming, as the state-specific surface markers collectively reflect the change in pluripotent states. Through using the newly identified surface markers, I found that naïve cells are formed at a much earlier time point than previously realised, and could be subsequently isolated from a heterogeneous cell population early during reprogramming. This allowed me to perform the first molecular characterisation of nascent naïve hPSCs, which revealed distinct transcriptional changes associated with early and late stage naïve cell formation. Analysis of the DNA methylation landscape showed that nascent naïve cells are globally hypomethylated, whilst imprint methylation is largely preserved. Moreover, the loss of DNA methylation precedes X-chromosome reactivation, which occurs primarily during the late-stage of primed-to-naïve reprogramming, and is therefore a hallmark of mature naïve cells. Using the antibody panel at discrete time points throughout reprogramming has allowed an unprecedented insight into the early molecular events leading to naïve cell formation, and permits the direct comparison between different naïve reprogramming methods. Taken together, the identified state-specific surface markers provide a robust and straightforward method to unambiguously define human PSC states, and reveal for the first time the order of transcriptional and epigenetic changes associated with primed to naïve reprogramming.

Apparues il y a environ trois milliards d'années, les cyanobactéries ont façonné notre planète, en produisant l’atmosphère oxygénique. De nos jours, les cyanobactéries sont les organismes photosynthétiques les plus abondants dans notre environnement, elles assurent environ 30 à 40% de la production d'O2, et de la consommation du CO2 par les océans et constituent le premier maillon de la chaîne alimentaire. A part la photosynthèse, leur métabolisme est encore très mal connu. Ainsi, pour mieux comprendre le métabolisme cyanobactérien et proposer des stratégies de reprogrammation, il est primordial de développer des méthodes analytiques permettant l’étude globale de leur métabolisme en réponse à des variations de conditions environnementales et de stress. La cyanobactérie modèle Synechocystis PCC6803 convient parfaitement à ce type d’analyse. En effet, Synechocystis est un unicellulaire, hétérotrophe facultative capable de se développer en eau douce ou saumâtre et à un pH alcalin. Synechocystis possède un petit génome d’environ 4.0 Mb entièrement séquencé et facilement manipulable grâce aux outils développés au laboratoire. Son génome prédit l'existence d'un métabolisme carboné complexe mais encore peu étudié. Mon travail de thèse est centré sur cette analyse par la combinaison de deux approches, la génomique fonctionnelle et la métabolomique. Durant ma thèse en collaboration avec le LEMM dirigé par Christophe Junot iBiTec-S/SPI, j’ai développé un protocole d’extraction des métabolites de Synechocystis, ainsi qu’une méthode d’analyse métabolomique par couplage de la chromatographie liquide à la spectrométrie de masse LTQ-Orbitrap à haute résolution. L’application de cette nouvelle méthode analytique m’a permis d’étudier l’influence de la lumière et du glucose sur le métabolisme de Synechocystis. Ainsi, j’ai montré que Synechocystis cultivée en présence du glucose reprogramme fortement son métabolisme. Parmi les résultats très intéressants, j’ai montré que le glucose engendre un stress oxydant. Chez tous les organismes, une forte activité du métabolisme carboné entraîne la production de métabolites toxiques tels que le méthyglyoxal (MG). Le MG modifie irréversiblement de nombreuses bio-molécules. Dans le cadre de ma thèse, j’ai commencé à m’intéresser à l'effet du MG sur la physiologie et le métabolisme de Synechocystis. J'ai construit 25 mutants KO pour les gènes de la glycolyse et du métabolisme du glycérol permettant de moduler la concentration intracellulaire de MG et également les gènes impliqués dans les voies de détoxication du MG dont celle dépendante de la synthèse du GSH (la voie des glyoxalases). J’ai pu montrer que les gènes responsables de la synthèse du GSH sont essentiels à la viabilité cellulaire. Je suis parvenu toutefois à obtenir un mutant déplété de gshB et ne produisant plus de GSH à un niveau détectable. En faisant une analyse métabolomique approfondie, j’ai mis en évidence pour la première fois que Synechocystis était capable produire deux tripeptides non-thiolés analogues structuraux du GSH; l’acide ophthalmique et l’acide norophthalmique identifiés jusqu’à présent uniquement chez les mammifères. La comparaison des métabolomes de culture de souches sauvage, ou dépletées en gshA, gshB ou ggt, a permis de montré que ces analogues sont synthétisés par les mêmes enzymes que le GSH à savoir GshA et GshB. Par ailleurs, une autre molécule anti-oxydante dont la synthèse est connue chez quelques champignons et qui s’accumule chez l’Homme par l’apport alimentaire a également été observée. / Cyanobacteria are fascinating microorganisms. They are among the oldest life forms, regarded as the progenitors of the oxygenic photosynthesis and plant chloroplast. Furthermore, cyanobacteria have evolved as the largest and most diverse groups of bacteria in colonizing most marine and fresh waters, as well as soils. An important reason for the hardness of cyanobacteria is their successful combination of effective metabolic pathways driven by their efficient photosynthesis that uses nature's most abundant resources, solar energy, water and CO2, to produce a large part of the Planet's oxygenic atmosphere and organic assimilates for the food chain. Hence, cyanobacteria are receiving a growing attention because of their potential for the carbon-neutral production of biofuels and bioplastics. To better understand cyanobacteria and turn their biotechnological potentials into an industrial reality, we need to develop robust protocols for global analysis of their metabolism and its responses to environmental stresses. The model cyanobacterium Synechocystis PCC6803 is well suited for this purpose. Synechocystis is a basic organism, i.e. unicellular, which grows well (i) in fresh- and marine-waters; (ii) in the presence of glucose that can compensate for the absence of light; and (iii) at high pH that prevents microbial contaminations. Furthermore, Synechocystis harbors a small sequenced genome (about 4.0 Mb), which can be easily manipulated. In the present work, we developed a robust protocol for metabolome analyses of Synechocystis, using liquid chromatography (LC) for metabolite separation, coupled to a LTQ-Orbitrap mass spectrometer that provides high sensitivity and resolution, accurate mass measurements, and structural informations with MS/MS or sequential MSn experiments that facilitate metabolite identification. Consequently, we applied the PFPP-LC/MS method to analyze the metabolome of Synechocystis growing under various conditions of light and glucose, which strongly influence cell growth. We found that glucose increases glucose storage and catabolism, while it decreases the Calvin-Benson cycle that consumes photosynthetic electrons for CO2 assimilation. Depending on light and glucose availabilities, this global metabolic reprogramming can generate an oxidative stress, likely through the recombination of the glucose-spared electrons with the photosynthetic oxygen thereby producing toxic reactive oxygen species. Furthermore, we studied the metabolism of an endogenous toxic the méthylglyoxal and its main catabolic pathway going through the glyoxalases system glutathione dependent.

Le virus Nipah (NiV) est un virus hautement pathogène responsable d’encéphalites et de syndromes respiratoires sévères chez l’humain. Les chauves-souris appartenant au genre Pteropus sont le réservoir naturel du NiV et ne développent pas de symptômes cliniques d’infection. Comprendre les relations entre l’hôte réservoir et le pathogène requiert la disponibilité de modèles pertinents pour l’étude des interactions. Les études portent à la fois sur le virus et son hôte. Ainsi, nous avons caractérisé phylogénétiquement la souche cambodgienne du NiV isolée de chauves-souris Pteropus et nous l’avons comparée avec les souches isolées chez l’homme. De plus, en absence du génome de référence pour l’espèce de chauve-souris Pteropus giganteus, nous avons séquencé et assemblé le génome de cette espèce, hôte réservoir de la souche NiV-Bangladesh, qui est en circulation actuellement. Enfin, afin d’obtenir des phénotypes cellulaires plus pertinents que des cellules immortalisées pour l’étude des interactions entre le NiV et les chauves-souris du genre Pteropus – les seules disponibles actuellement - nous avons utilisé la reprogrammation somatique sur des cellules primaires de chauve-souris Pteropus. Cette technique permet d’obtenir des cellules souches présentant la capacité d’autorenouvellement et de différenciation. En utilisant une combinaison originale de trois facteurs de transcription, nous avons généré les premières cellules reprogrammées de chauves-souris Pteropus exprimant des caractéristiques de cellules souches. Nous avons démontré que ces cellules sont très susceptibles à l’infection par le NiV mais incapables de produire de l’interféron et d’activer les cascades de signalisations antivirales en réponse à une stimulation avec de l’ARN double brin, contrairement aux cellules primaires. Le développement de ce modèle original ouvre de nouvelles perspectives pour l’étude des interactions entre l’hôte réservoir et le pathogène et pour l’identification de facteurs contrôlant la susceptibilité à l’infection par le NiV, et potentiellement par d’autres virus hébergés par des chauves-souris. / Nipah virus (NiV) is a highly pathogenic virus that causes encephalitis and severe respiratory syndromes in humans. Pteropus bats are the reservoir of NiV and do not show any clinical symptoms. In order to understand the host reservoir - pathogen interactions, the relevant models are needed. Such studies focus on both the virus and its host. A phylogenetically characterization of the NiV Cambodian strain obtained from Pteropus bats was performed and this virus was compared with human ones. In addition, we sequenced and assembled the genome of Pteropus giganteus bat, the natural host of the NiV-Bangladesh strain, which is currently circulating. Up to date, most studies have used immortalized primary cells that are not natural target of the virus. In order to get reprogrammed stem cells, a somatic reprogramming approach was applied to various Pteropus primary cells. The reprogrammed cells are capable of self-renew and differente in different cell lineages. Using an original mix of transcription factors, we derived reprogrammed cells exhibiting stem cells features. We demonstrated the high susceptibly of these cells to henipavirus infections compared with the very low level of infection of the initial primary cells. Generated bat reprogrammed cells do not induce interferon production and signalisation in response to dsRNA. The development of this original model opens new perspectives on virus-host interaction studies, especially that of cellular anti-viral response by identifying factors controlling either susceptibility or restriction to the NiV infection, and possibly other viruses hosted by bats.