Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 270809 bytes, checksum: 2ca0830f4e6318653c848e9cda88dae8 (MD5) Previous issue date: 2002-11-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Penicillium expansum is a filamentous fungus that produces extracelular xylanase. An extracellular xylanase was found to be the major protein in the filtrated culture of P. expansum when grown on 0,3 % wheat bran. In contrast to other microorganism no xilanase multiplicity was found in P. expansum under the conditions used. The used partial purification estrategy was ammonium sulfate fractioning, molecular exclusion cromatography, ultrafiltration and anion exchange chromatography. The proteins eluation profile showed only one form of xylanase that was partially characterized. The optimum pH and temperature were 5,5 and 40 0C, respectively. The enzyme kept stable when preincubed for 1 h under pH between 5.5 and 6.5. It also kept stable when preincubed for 1h under temperature between 20-40 0C. The enzime showed km of 3,03 mg mL-1 and Vmax of 0,027 mmol min-1 μg –1 of protein. The enzymatic activity was increased by 34 % by Mg3(PO4)2 (1 mM); 31 % by MgSO4 (1 mM).and 28 % by Al2(SO4)3 (1 mM). / O Penicillium expansum é um fungo filamentoso produtor de xilanase extracelular. Uma xilanase extracelular foi encontrada como a principal proteína na cultura filtrada de P. expansum quando cultivado em farelo de trigo 0,3 %. Em contraste com outros microrganismos, não foi encontrada multiplicidade de xilanase de P. expansum sob as condições usadas. Como estratégia de purificação parcial da enzima, foram realizados fracionamento com sulfato de amônia, cromatografia de exclusão molecular, ultrafiltração e cromatografia de troca iônica. O perfil de eluição das proteínas mostrou uma única forma de xilanase, sendo esta parcialmente caracterizada. O pH ótimo e a temperatura ótima foram 5,5 e 40 0C, respectivamente. A enzima se manteve estável quando pré-incubada por 1 h em pH entre 5,5 e 6,5. Também manteve a estabilidade quando pré-incubada por 1 h em temperatura entre 20-40 0C. A enzima apresentou Km de 3,03 mg mL-1 e Vmax de 0,027 mmol min-1 μg-1 de proteína. A atividade enzimática foi aumentada 34 % por Mg3(PO4)2 (1 mM); 31 % por MgSO4 (1 mM) e 28 % por Al2(SO4)3 (1 mM).

Several microorganisms are able of producing enzymes responsible for the conversion of biomass to ethanol, such as cellulases. However, studies about diversity and biotechnological application of microorganisms from Pampa biome are still scarce. To try to reduce this knowledge lack, the Gelatoporia subvermispora fungus was isolated from the Pampa biome, resulting in the first occurrence of this specie in Latin America. Commercially, cellulases are produced by submerged fermentation. However, filamentous fungi that are considered good producers of cellulases show better results in solid-state fermentation, mainly by the similarity between the solid medium and the natural habitat of these microorganisms. In order to evaluate the biotechnological potential of the fungi G. subvermispora for cellulases production, rice straw, sewage sludge and sugar cane bagasse were used as substrate. The highest values for the total cellulolytic activity by the method of filter paper (FP) were obtained using sugarcane bagasse as substrate, reaching the value of 3.82 FPU.g-1. The sewage sludge was an excellent medium for the production of xylanase and exo-cellulases, reaching peak activity of 227.97 U.g-1 and 134.25 U.g-1, respectively. The endo-cellulase activity was similar in almost whole substrates tested, as showed in the runs 11 for rice straw (40.75 U.g-1) and 14 for sewage sludge (35.32 U.g-1). Subsequently, cellulolytic enzymes from fungal Gelatoporia subvermispora produced by solid-state fermentation using different substrates were applied to hydrolyze non-treated sugarcane bagasse using indirect sonication. The best results were obtained using sewage sludge as substrate for enzyme production. The mean yields obtained with enzymes produced using sewage sludge, sugarcane bagasse and rice straw as substrates were 72.8, 58.7 and 51.2 g.kg-1, respectively. Regarding the use of ultrasound to carry out enzymatic reactions, the oscillation amplitude presented a negative effect on yield, whereas pulse factor showed to be benefic for the reactions. / Diversos microrganismos são capazes de produzir enzimas responsáveis pela conversão da biomassa em etanol, tais como as celulases, porém, estudos sobre a diversidade e aplicação biotecnológica dos microrganismos do bioma Pampa ainda são escassos. Para tentar reduzir essa lacuna de conhecimento, o fungo Gelatoporia subvermispora foi isolado do bioma Pampa, resultando na primeira ocorrência dessa espécie para a América Latina. Comercialmente, as celulases são produzidas através de fermentação submersa. Entretanto, fungos filamentosos que são considerados bons produtores de celulases apresentam melhores resultados em fermentação em estado sólido. Para avaliar o potencial biotecnológico do fungo G. subvermispora de produzir celulases os resíduos palha de arroz, lodo de esgoto e bagaço de cana foram utilizados como substrato. Os maiores valores de atividade celulolítica total determinados pelo método de papel filtro (PF) foram obtidos utilizando bagaço de cana como substrato, apresentando 3.82 FPU.g-1. O lodo de esgoto foi um excelente meio para a produção de xilanases e exo-celulases, atingindo valores máximos de 227.97 U.g-1 e 134.25 U.g-1, respectivamente. A atividade da endo-celulase foi similar nos substratos testados, como verificado na condição 11 para a palha de arroz (40.75 U.g-1) e 14 para o lodo de esgoto (35.32 U.g-1). As enzimas celulolíticas produzidas pelo fungo Gelatoporia subvermispora foram aplicadas na hidrólise do bagaço de cana por meio de sonicação indireta. Os melhores resultados foram obtidos utilizando o lodo de esgoto como substrato para a produção das enzimas. Os rendimentos médios de hidrólise obtidos através da produção de enzimas utilizando lodo de esgoto, bagaço de cana e palha de arroz como substrato foram 72.8, 58.7 e 51.2 g.kg-1, respectivamente. Com relação à utilização do ultrassom para as reações enzimáticas, a amplitude apresentou um efeito negativo no rendimento, enquanto o fator pulso foi benéfico para as reações.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO DE MESTRADO FINAL.pdf: 1117246 bytes, checksum: 91bcbcfc247218ffb970c121596f7b0c (MD5) Previous issue date: 2010-08-30 / The vegetal biomass consists mainly of cellulose, hemicellulose and lignin. Cellulose is the most abundant polymer and xylan is the main component of hemicellulose. The conversion of cellulose and xylan to glucose and xylose can be realized by an enzymatic complex found in secretions of microorganisms such as fungi and bacteria. Enzymatic hydrolysis is an important step to the bioconversion of cellulosic and hemicellulosic fraction from lignocellulosic wastes. The thermophilic fungus Humicola grisea var thermoidea produces an efficient complex of cellulolytic enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases and β-glucosidase) and xylanolytic (endoxylanase and β-xylosidase) with high thermostability when grown on different lignocellulosic substrates. The aim of this study was to analyze the kinetics of production of cellulases and xylanase by the fungus H. grisea cultivated on medium containing rice straw (RS), corncob (CC), crushed cane sugar bagasse (CSB) and wheat bran (WB) as carbon source and subsequently analyze the profile of proteins with cellulolytic and xylanolytic activity secreted by the fungus when grown in minimal medium, by liquid fermentation, containing the substrates at concentrations of 1, 2 and 3% and maintained at 42 ° C, 120 rpm for different times. The best results were obtained when the fungus was grown in 3% BCA and FT, the peaks of FPase (0.17 U / mL) and CMCase (3.54 U / mL) were observed after 192 h of growth with 3% BCA , peak avicelase (0,195 U / mL) after 48 h with 3% FT and peak xylanase (23.75 U / mL) after 216 h with 3% FT. The results showed that the best inducer of enzyme production with FPase and CMCase activity was the CSB and the best inducer of enzymes production with xylanase and avicelase activity was the WB. In profile analysis of proteins secreted by H. grisea by SDS-PAGE (216 h) and zymogram (144 h), no band was seen when the fungus was grown in the presence of glucose, suggesting catabolite repression. However, two very strong protein bands corresponding to HXYN2 (23 kDa) and CBH1.2 (47 kDa) were visualized in the gels containing CSB (2 to 3%) and WB (2 and 3%). These enzymes are the main xylanolytic and cellulolytic systems of the fungus, respectively. Were monitored by recombinant enzymes from H. grisea (in gels), an endoxylanase HXYN2r (23 kDa), an cellobiohydrolase CBH1.2r (47 kDa). The masses full profile of H. grisea can be seen in Figures 13, 14, 15, 16, 18 and 19. / A biomassa vegetal é constituída principalmente de celulose, hemicelulose e lignina. A celulose é o polímero mais abundante e a xilana o principal componente hemicelulósico. A conversão da celulose e da xilana à glicose e xilose pode ser realizada por um complexo enzimático encontrado nas secreções de microrganismos tais como fungos e bactérias. A hidrólise enzimática é um importante passo para a bioconversão da fração celulósica e hemicelulósica de resíduos lignocelulósicos. O fungo termofílico Humicola grisea var thermoidea produz um eficiente complexo de enzimas celulolíticas (endoglicanases, celobiohidrolases e β-glicosidases) e xilanolíticas (endoxilanases e β-xilosidase) com alta termoestabilidade quando cultivado em diferentes substratos lignocelulósicos. O objetivo desse trabalho foi analisar a cinética de produção de celulases e xilanases pelo fungo H. grisea cultivado em meio contendo palha de arroz (PA), sabugo de milho (SM), bagaço de cana-de-açúcar (BCA) e farelo de trigo (FT) como fonte de carbono e posteriormente analisar o perfil de proteínas com atividade celulolítica e xilanolítica secretadas pelo fungo quando cultivado em meio mínimo, por fermentação líquida, contendo os substratos nas concentrações de 1, 2 e 3%, e mantidos a 42 °C, 120 rpm por diferentes tempos. Os melhores resultados foram obtidos quando o fungo foi cultivado em 3% de BCA e FT, sendo que os picos de FPase (0.17 U/mL) e CMCase (3.54 U/mL) foram observados após 192 e 240 h respectivamente de crescimento com 3% de BCA, o pico de Avicelase (0.195 U/mL) após 48 h com 3% de FT e o pico de xilanase (23.75 U/mL) após 216 h com 3% de FT. Os resultados demonstraram que o melhor indutor da produção de enzimas com atividade de FPAse e CMCase foi o BCA e o melhor indutor da produção de enzimas com atividade de Avicelase e xilanase foi o FT. Na análise do perfil de proteínas secretadas pelo H. grisea por SDS-PAGE (216 h) e zimograma (144 h), nenhuma banda foi visualizada quando o fungo foi cultivado na presença de glicose, sugerindo repressão catabólica. Entretanto, duas bandas protéicas muito fortes, correspondentes à HXYN2 (23 kDa) e CBH1.2 (47 kDa) foram visualizadas nos géis contendo BCA (2 e 3%) e FT (2 e 3%); e representam as principais enzimas dos sistemas xilanolítico e celulolítico do fungo, respectivamente. Estas foram monitoradas pelas enzimas recombinantes do H. grisea (nos geis): uma endoxilanase HXYN2r (23 kDa) e uma celobiohidrolase CBH1.2r (47 kDa). As massas do perfil completo do H. grisea podem ser vistas nas Figuras 13-19.

Made available in DSpace on 2017-07-10T18:08:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caroline Mariana de Aguiar.pdf: 5014872 bytes, checksum: 64beb98ea03bbb601831a3ce234b8c31 (MD5) Previous issue date: 2010-02-11 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Lignocellulosic materials are the most abundant residues in the world and there is a worldwide concern to use them as raw material for bioethanol production. This is possible because these materials are rich in cellulose. Cellulose is a biopolymer composed of glucose molecules linked by ß-1-4 glycosidic bonds. Glucose can be converted into ethanol by fermentation and can be obtained from cellulose by enzymatic hydrolysis using cellulases. The cellulases can be produced by several microorganisms under appropriate environmental conditions. Amongst these microorganisms is the fungus Aspergillus niger. In this work, cellulases were obtained by fermentation cultivating A. niger in broth containing pretreated lignocellulosic materials such as sugarcane bagasse, corn straw or wheat straw as the only carbon source. The fermentation kinetic was observed when the pretreated sugarcane bagasse was used as the carbon source. Several variables that affect the enzymatic hydrolysis were analyzed using the three pretreated lignocellulosic materials as hydrolysis substrate. The variables analyzed were: pH, temperature, time of the hydrolysis, mass fraction of the substrate and dilution of the enzymatic broth. The pretreatment of the lignocellulosic materials is paramount for exposing the cellulose chain. Pretreatment consisted of using 4%w/w NaOH solution or 1%w/w H2O2 and their efficiency for removing the lignin from the residues were evaluated. The enzymatic activity also was evaluated by submeting the lignocellulosic materials to successive enzymatic hydrolysis. The enzyme deactivation was evaluated by cooling or freezing the enzymatic broth. It was concluded that Aspergillus niger produces cellulases when grown on medium with pretreated lignocellulosic materials as carbon source. Considering the fermentation kinetic, the ideal time to collect the enzymatic broth with maximum productivity was about 7 days. The cellulase complex does not suffer considerable deactivation when stored at -18°C (freezer) for 43 days, however, the broth activity drops by 43% after 48 hours when stored at 4°C (fridge). The corn straw showed better results as carbon source in fermentation and as substrate hydrolysis, compared with the other materials, with enzymatic activity of 0.895 U/ml. The ideal pH to conduct the enzymatic hydrolysis was 4.8 at 50°C for 50 minutes. The mass fraction of the substrate and enzyme concentration affects the enzymatic activity by a linear dependence. The pretreated materials provided higher enzymatic activity results than the untreated materials. The highest activity enzymatic results were obtained with H2O2 treated substrates, with enzymatic activity of 0.655 U/ml for the sugarcane bagasse, 0.892 U/ml for the corn straw and 0.801 U/ml for the wheat straw. Also, the results show that the H2O2 pretreated materials can be submitted up to, at least, four successive hydrolysis with the second one yielding the highest enzymatic activity for all pretreated residues. / Os resíduos lignocelulósicos são os mais abundantes no mundo e atualmente há uma preocupação mundial em aproveitá-los como matéria-prima na produção de bioetanol. Isto é possível visto que tais resíduos são ricos em celulose. A celulose é um biopolímero composto por moléculas de glicose unidas por ligações glicosídicas ß-1-4. A glicose pode ser transformada em etanol por via fermentativa e pode ser obtida da celulose via hidrólise enzimática utilizando as enzimas celulases. As celulases podem ser produzidas por diversos micro-organismos sob condições adequadas. Dentre esses micro-organismos, destaca-se o fungo Aspergillus niger. Neste trabalho, celulases foram obtidas cultivando-se A. niger em meio de cultura com os resíduos lignocelulósicos bagaço de cana-de-açúcar, palha de milho e palha de trigo pré-tratados com NaOH 4% como única fonte de carbono. Observou-se a cinética da fermentação com bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com NaOH 4% como fonte de carbono. Foram analisadas diversas variáveis que afetam a hidrólise enzimática utilizando os três resíduos lignocelulósicos pré-tratados com NaOH 4% como substrato. As variáveis analisadas foram: pH, temperatura, tempo de hidrólise enzimática, fração mássica de substrato e diluição do caldo enzimático. Avaliou-se a eficiência dos pré-tratamentos dos resíduos com NaOH 4% e com H2O2 1%. Avaliou-se o comportamento da atividade enzimática submetendo os resíduos lignocelulósicos a hidrólises enzimáticas sucessivas. A desativação enzimática foi avaliada nas condições de resfriamento e congelamento do caldo enzimático. Nas condições estudadas, foi concluído que o Aspergillus niger produz celulases quando cultivado em meio com resíduos lignocelulósicos pré-tratados como fonte de carbono. O tempo ideal para coleta do caldo enzimático, com produtividade máxima, foi de aproximadamente 7 dias. O complexo celulásico não sofre desativação se armazenado a temperatura de -18°C (freezer) por 43 dias, mas perde sua atividade em 43% após 48 h se armazenado a 4°C (geladeira). A palha de milho apresentou melhores resultados como fonte de carbono na fermentação e como substrato na hidrólise, comparada com os outros resíduos, com atividade enzimática de 0,895 U/mL. O pH ideal para se conduzir a hidrólise foi 4,8 na temperatura de 50ºC por 50 minutos. A fração de substrato e a concentração das enzimas afetam linearmente a atividade enzimática. Os resíduos pré-tratados proporcionaram melhores resultados de atividade enzimática do que os resíduos não tratados. Os melhores resultados de atividade foram obtidos com os resíduos tratados com solução de H2O2 1%, com atividade de 0,655 U/mL para o bagaço de cana, 0,892 U/mL para a palha de milho e 0,801 U/mL para a palha de trigo. Além disso, os resíduos tratados com H2O2 podem sofrer quatro processos de hidrólise sucessivos, com o segundo processo rendendo a maior atividade enzimática para todos os resíduos pré-tratados.

Made available in DSpace on 2017-07-10T18:08:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fabiano Bisinella Scheufele.pdf: 1716907 bytes, checksum: fee6288858ac3d92f0d2e7f9f8d02ba2 (MD5) Previous issue date: 2012-02-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Lignocellulosic biomass has high yields of cellulose which can be hydrolyzed to fermentable carbohydrates. Global generation of agro-industrial wastes grows simultaneously with the sector development resulting at the accumulation of lignocellulosic residues leading environmental pollution and loss of potential materials for the bioconversion to a wide range of high added value products, such as biofuels. Recently, the search of renewable sources of energy has grown, due to the depleting of fossil fuels, increasing the possibility at the conversion of the lignocellulosic biomass via hydrolytic enzymes. The aim of this work was evaluate cellulases production by lignocellulolytic fungi from the Amazonic biome aiming at the bioconversion of the agro-industrial residues. Submerged and solid-state fermentations were performed to select the microorganism with superior cellulase productive capacity. The influence of parameters such as pH, surfactant induction (Tween 80), aeration and agitation, besides the alkaline oxidative treatment of the sugarcane bagasse. Statistical design were carried out to estimate the influence of the moisture and the initial pH at cellulases production by solid-state fermentation. Trichoderma sp. and Aspergillus niger performed the best production of enzymes, where the highest yields of total cellulase were obtained by agitated submerged fermentation with sugarcane bagasse pretreated with H2O2 (1%) reaching 0.265 U.mL-1 (12.915 U.g-1) by Trichoderma sp. at the sugarcane bagasse, and 0.155 U.mL-1 (7.549 U.g-1) by Aspergillus niger. Through solid state fermentations with the pretreated sugarcane bagasse the influence of initial pH and the moisture were evaluated by statistical design. In the case of the Trichoderma sp. both parameters were significant at the cellulase production, as well as the synergistic interaction, within the confidence interval of 95%, yielding 0.167 U.mL-1 (2.695 U.g-1), at the pH 7.0 and 1:9 solid-liquid ratio. For Aspergillus niger only pH was significant and the cellulase content obtained was 0.098 U.mL-1 (1.695 U.g-1) at pH 7.0. Finally, a cellulase produced by Trichoderma sp. at solid state fermentation and a commercial enzyme were used at enzymatic hydrolysis tests. The parameters hydrolysis time, enzyme dilution, concentration of Tween 80 and solid-liquid ratio of sugarcane bagasse were evaluated. The significant variables were then optimized by a central composite rotational design. The strain of Trichoderma sp. from the Amazon biome showed potential at the cellulase production and the treated sugarcane bagasse was a fine substrate for the enzymatic production. / A biomassa lignocelulósica contêm altos teores de celulose e outros polissacarídeos em sua constituição química, podendo ser hidrolisados em açúcares fermentescíveis. A geração de resíduos agroindustriais anual tem crescido resultando no acúmulo de resíduos que contribuem para a poluição do meio ambiente e na perda de materiais que possuem potencial na bioconversão a produtos de alto valor agregado, como por exemplo, biocombustíveis. Recentemente, há a necessidade de fontes energéticas de origem renovável, devido à diminuição dos combustíveis fósseis, viabilizando a conversão das biomassas lignocelulósicas via enzimas hidrolíticas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de enzimas celulases por fungos lignocelulolíticos provenientes do bioma amazônico visando a bioconversão de resíduos agroindustriais. Diferentes fermentações foram realizadas, tanto em meio submerso quanto em estado sólido, através das quais selecionou-se os micro-organismos com melhor capacidade produtiva de celulases. Estudou-se a influência de parâmetros como pH, utilização de surfactante como indutor (Tween 80), aeração e agitação, além do tratamento alcalino oxidativo do bagaço de cana. Os micro-organismos que apresentaram melhor desempenho na produção das enzimas foram o Trichoderma sp. e o Aspergillus niger, sendo que os maiores níveis de celulase total foram obtidos por fermentação submersa nos ensaios agitados com bagaço de cana pré-tratado com H2O2 (1%), com 0,265 U.mL-1 (12,915 U.g-1) pelo Trichoderma sp., e 0,155 U.mL-1 (7,549 U.g-1) com Aspergillus niger. A partir de fermentações em estado sólido com o bagaço de cana pré-tratado avaliou-se a influência dos parâmetros pH inicial e umidade por planejamentos experimentais, verificando-se que para o Trichoderma sp. ambos os parâmetros, bem como a interação sinergética entre si, foram significativos dentro do intervalo de confiança de 95%, obtendo-se 0,167 U.mL-1 (2,695 U.g-1) no pH 7,0 e relação sólido-líquido 1:9. No caso do Aspergillus niger apenas o pH foi significativo e o teor de celulase obtido foi de 0,098 U.mL-1 (1,695 U.g-1) para um pH 7,0. Finalmente, a partir de uma celulase produzida por fermentação em estado sólido do Trichoderma sp. e uma enzima comercial foi realizada a avaliação da influência dos parâmetros tempo de hidrólise, diluição da enzima, concentração de Tween 80 e razão sólido-líquido do bagaço de cana sobre a hidrólise do mesmo. As variáveis significativas foram, posteriormente, otimizadas por um delineamento composto central rotacional. A cepa Trichoderma sp. proveniente do bioma amazônico apresentou potencial na produção de celulases e o o bagaço de cana submetido ao tratamento alcalino oxidativo apresentou-se como um bom substrato para a produção enzimática.