Acinetobacter baumannii é um patógeno nosocomial que está envolvido em um amplo espectro de infeções hospitalares. A maior preocupação atual é devido a sua alta capacidade de adquirir mecanismos de resistência, principalmente aos carbapenêmicos, fármacos utilizados normalmente para o tratamento dessas infecções. Desta forma, as opções terapêuticas tornam-se restritas e por isso, as polimixinas (polimixina B e colistina) voltaram a serem utilizadas na prática clínica. A heterorresistência a colistina já foi descrita em estudos recentes com isolados de A. baumannii e outros estudos detectaram a presença de resistência adaptativa as polimixinas. O objetivo deste estudo foi investigar a presença do fenômeno de heterorresistência e resistência adaptativa a polimixina B, e avaliar sua estabilidade. A pesquisa foi feita em isolados pertencentes a 15 clones diferentes de A. baumannii resistentes aos carbapenênicos e sensíveis a polimixina B. A avaliação da heterorresistência foi feita através da análise do perfil da população (PAP) para 29 isolados, selecionados aleatoriamente (pelo menos um de cada clone). A indução da resistência foi avaliada para 22 isolados, selecionados aleatoriamente (pelo menos um de cada clone), submetendo os isolados ao cultivo em concentrações crescentes de polimixina B. A determinação da estabilidade das subpopulações e da indução da resistência foi feita através de passagens, em dias consecutivos, em meio livre de antibiótico. Foram consideradas subpopulações heterogêneas aquele isolado que possuía colônias com uma CIM maior do que a população original para polimixina B. A CIM foi reavaliada após 75 e 60 dias de estocagem em -80ºC para os isolados que apresentaram subpopulação heterogênea ou indução da resistência para a polimixina B, respectivamente. Dos 29 isolados, submetidos a avaliação da heterorresistência, 26 (90%) apresentaram subpopulações heterogêneas para polimixina B. Nenhum isolado apresentou subpopulação superior a 2 μg/mL para polimixina B, ou seja, não foi encontrado neste estudo subpopulações heterorresistentes. As CIMs das subpopulações heterogêneas permaneceram iguais após os subcultivos em meio livre de antibiótico, mas quando a CIM foi reavaliada depois da estocagem, os valores obtidos foram os mesmos da população original. Dos 22 isolados submetidos a indução de resistência, 12 (55%) apresentaram algum crescimento até a concentração de 64 μg/mL de polimixina B. Após as passagens em meio livre de antibiótico a CIM diminuiu, voltando a CIM original na reavaliação após a estocagem a -80ºC. Este estudo mostra pela primeira vez a avaliação da heterorresistência e indução da resistência para polimixina B em isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenêmicos. O fenômeno de heterorresistência não foi encontrado neste estudo, no entanto, subpopulações com uma CIM maior do que a original foram identificadas em 90% dos isolados. As CIMs das subpopulações permaneceram estáveis após 4 dias de passagens em meio livre de antibiótico, mas retornaram a CIM original após estocagem, o que sugere o envolvimento de mecanismos moleculares neste fenômeno. A presença da resistência induzida a polimixina B foi detectada em 55% dos isolados, sugerindo que este fenômeno pode ser comum entre os isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenêmicos, frente a polimixina B. Embora a presença de subpopulações heterogêneas e a indução da resistência a polimixina B tenha sido comum neste estudo, mais estudos são necessários para um melhor entendimento do significado clínico e das implicações terapêuticas destes dois fenômenos.

Glioblastoma é um tumor cerebral que apresenta uma alta taxa de invasão, sendo que os pacientes portadores do mesmo possuem uma baixa sobrevida. Um dos maiores desafios encontrados é a resistência do tumor ao principal agente quimioterápico utilizado, a temozolomida, além de apresentar um fenótipo de resistência cruzada a outros quimioterápicos tradicionais como a doxorrubicina. Diversos estudos tem mostrado uma ativação contínua do fator de transcrição Transdutor de sinais e ativador de transcrição 3 (STAT3) em glioblastomas resistentes a quimioterapia. Neste trabalho nós examinamos se células de glioma de rato da linhagem C6 que se tornaram resistentes aos quimioterápicos doxorrubicina e/ou temozolamida, apresentam um conteúdo elevado de STAT3 fosforilada (p-STAT3) e se a inibição deste fenômeno pelo inibidor específico de JAK2/STAT3 AG490, poderia sensibilizar novamente estas células a quimioterápicos. Nós observamos que nossas linhagens resistentes apresentaram um IC50 para temozolamida 11 vezes maior do que a linhagem paterna e 33 vezes maior para doxorrubicina em comparação com a linhagem paterna. Além disto, ambas as linhagens resistentes apresentaram um imunoconteúdo elevado de STAT3. A inibição de STAT3 pelo inibidor de JAK2, AG490, apresentou um decréscimo no imunoconteúdo de p-STAT3, uma parada no ciclo celular na fase G2/M e uma consequente ressensibilização das linhagens resistentes aos seus quimioterápicos. Em suma, os dados aqui apresentados nos levam a acreditar que a inibição de STAT3 poderia ser uma interessante terapia adjuvante a ser estudada para a ressensibilização de pacientes com glioblastoma à quimioterapia. / Glioblastoma is a brain tumor whit high invasiveness and low survival. One of the main characteristics of the tumor is the resistance to the standard chemotherapy to the alkylating agent temozolomide, and the multidrug resistance to other traditional chemotherapeutics like doxorubicin. Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (STAT3) has been shown to be constitutive active in glioblastomas resistant to chemotherapy. In this work we examined if C6 cells that became resistant to temozolomide and/or doxorubicin have increased STAT3 phosphorylation (p-STAT3) and if the inhibition of this phosphorylation could re-sensitize these cells. We observed that our two resistant lineages showed higher IC50 for TMZ and DOX in order of 11 and 33 fold higher respectively, and elevated p-STAT3 immunocontent when compared to their parental C6 lineage. The inhibition of p-STAT3 by AG490 50 μM decreased the p-STAT3 immunocontent, induced a G2/M arrest in cell cycle and re-sensitizes the resistant C6-TR and C6-DR to their chemotherapeutics showing a synergetic effect with both chemotherapeutics used in this work. In summary, data present here suggest that the inhibition of STAT3 could be an interesting adjuvant therapy for glioblastoma cells that became resistant to the traditional chemotherapy.

Acinetobacter baumannii é um dos principais patógenos associados a infecções nosocomiais, incluindo pneumonias, meningites secundárias, infecções urinárias e bacteremias. Esse microrganismo apresenta uma grande capacidade de se disseminar, além de adquirir novos mecanismos de resistência. Devido a essas propriedades, numerosos surtos de Acinetobacter baumannii multirresistente têm sido relatados em diversos países, inclusive no Brasil. O objetivo deste estudo foi analisar mecanismos envolvidos na resistência em Acinetobacter baumannii, avaliando a relação de elementos promotores com o aumento da resistência aos carbapenêmicos, além de analisar a presença de integrons envolvidos na disseminação de genes de resistência. Este foi um estudo transversal experimental no qual foram incluídas amostras provenientes de cinco hospitais da cidade de Porto Alegre obtidas no período de julho de 2007 a junho de 2008. Foram selecionados 41 isolados resistentes aos carbapenêmicos representantes de diferentes clones determinados por pulsed field gel eletrophoresis (PFGE) além de 17 amostras sensíveis aos carbapenêmicos, totalizando 58 isolados no estudo. Todos os isolados analisados apresentaram o gene blaOXA-51-like, caracterizando a espécie A. baumannii. Integrons de classe 2 foram os mais prevalentes (50; 86.2%) nos isolados testados, entretanto, integrons de classe 1 (15; 25.9%) também foram detectados. O elemento de inserção ISAba1 foi evidenciado em associação com o gene blaOXA-23-like em 36 isolados resistentes, e demonstrou uma significativa relação (p<0,001) com o aumento das concentrações inibitórias mínimas (MICs) dos carbapenêmicos imipenem e meropenem. A associação de ISAba1 com blaOXA-51-like não apresentou relação com aumento das MICs para os carbapenêmicos. A partir dos dados mostrados nesse trabalho, demonstramos a importância do elemento ISAba1, quando associado ao gene blaOXA-23-like, no aumento dos níveis de resistência aos carbapenêmicos meropenem e imipenem. A presença de integrons em todos os isolados resistentes aos carbapenêmicos reitera a importância desses elementos na disseminação de determinantes da resistência entre isolados de A. baumannii.

Glioblastoma é um tumor cerebral que apresenta uma alta taxa de invasão, sendo que os pacientes portadores do mesmo possuem uma baixa sobrevida. Um dos maiores desafios encontrados é a resistência do tumor ao principal agente quimioterápico utilizado, a temozolomida, além de apresentar um fenótipo de resistência cruzada a outros quimioterápicos tradicionais como a doxorrubicina. Diversos estudos tem mostrado uma ativação contínua do fator de transcrição Transdutor de sinais e ativador de transcrição 3 (STAT3) em glioblastomas resistentes a quimioterapia. Neste trabalho nós examinamos se células de glioma de rato da linhagem C6 que se tornaram resistentes aos quimioterápicos doxorrubicina e/ou temozolamida, apresentam um conteúdo elevado de STAT3 fosforilada (p-STAT3) e se a inibição deste fenômeno pelo inibidor específico de JAK2/STAT3 AG490, poderia sensibilizar novamente estas células a quimioterápicos. Nós observamos que nossas linhagens resistentes apresentaram um IC50 para temozolamida 11 vezes maior do que a linhagem paterna e 33 vezes maior para doxorrubicina em comparação com a linhagem paterna. Além disto, ambas as linhagens resistentes apresentaram um imunoconteúdo elevado de STAT3. A inibição de STAT3 pelo inibidor de JAK2, AG490, apresentou um decréscimo no imunoconteúdo de p-STAT3, uma parada no ciclo celular na fase G2/M e uma consequente ressensibilização das linhagens resistentes aos seus quimioterápicos. Em suma, os dados aqui apresentados nos levam a acreditar que a inibição de STAT3 poderia ser uma interessante terapia adjuvante a ser estudada para a ressensibilização de pacientes com glioblastoma à quimioterapia. / Glioblastoma is a brain tumor whit high invasiveness and low survival. One of the main characteristics of the tumor is the resistance to the standard chemotherapy to the alkylating agent temozolomide, and the multidrug resistance to other traditional chemotherapeutics like doxorubicin. Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (STAT3) has been shown to be constitutive active in glioblastomas resistant to chemotherapy. In this work we examined if C6 cells that became resistant to temozolomide and/or doxorubicin have increased STAT3 phosphorylation (p-STAT3) and if the inhibition of this phosphorylation could re-sensitize these cells. We observed that our two resistant lineages showed higher IC50 for TMZ and DOX in order of 11 and 33 fold higher respectively, and elevated p-STAT3 immunocontent when compared to their parental C6 lineage. The inhibition of p-STAT3 by AG490 50 μM decreased the p-STAT3 immunocontent, induced a G2/M arrest in cell cycle and re-sensitizes the resistant C6-TR and C6-DR to their chemotherapeutics showing a synergetic effect with both chemotherapeutics used in this work. In summary, data present here suggest that the inhibition of STAT3 could be an interesting adjuvant therapy for glioblastoma cells that became resistant to the traditional chemotherapy.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-05-24T14:53:34Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Lucas Fonseca Rodrigues.pdf: 1491783 bytes, checksum: 4c381c126501225055166afa8882ba08 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-24T14:53:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Lucas Fonseca Rodrigues.pdf: 1491783 bytes, checksum: 4c381c126501225055166afa8882ba08 (MD5) Previous issue date: 2012 / Apesar da busca por tratamentos alternativos para a Leishmaniose Cutânea (LC), os antimoniais pentavalentes (SbV) ainda permanecem como os fármacos mais amplamente usados no tratamento dessa doença. Eles podem ser eficazes e relativamente bem tolerados; entretanto, reações adversas graves e falha terapêutica ocorrem frequentemente. A possibilidade de a falha terapêutica estar associada a diferenças na sensibilidade ao SbV dos parasitos foi investigada utilizando-se, principalmente, análise de sensibilidade in vitro. Os resultados, até o momento, porém, são contraditórios. Portanto, faz-se necessária a busca por novos modelos de avaliação de sensibilidade a fármacos em Leishmania e por tratamentos alternativos que sejam menos tóxicos, como por exemplo, o desenvolvimento de formulações de uso tópico. Por isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a sensibilidade in vivo de Leishmania (Viannia) braziliensis isoladas de pacientes portadores de LC ao antimoniato de meglumina, bem como a atividade da combinação de uma baixa dose de SbV, considerando-se o modelo de hamsters dourados (Mesocricetus auratus), com aplicação tópica de uma formulação hidrofílica de paromomicina (PA). Para a análise de sensibilidade in vivo, hamsters foram infectados com 13 diferentes isolados e tratados com 50mg SbV/Kg/dia, durante 20 dias. Em comparação à resposta observada para a cepa de referência de L. (V.) braziliensis MHOM/BR/1975/M2903, todos os isolados mostraram-se sensíveis ao antimoniato de meglumina. Para a avaliação da combinação SbV + PA, hamsters foram infectados com três dos 13 isolados utilizados na análise de sensibilidade e com a cepa M2903 e separados em grupos que receberam esquemas terapêuticos de 25mg Sb V /Kg/dia, 25mg SbV/Kg/dia + PA e apenas PA, todos por 20 dias. Para esses isolados, a dose de 25mg SbV/Kg/dia, por 20 dias, por si só, foi eficaz na cicatrização dos animais, o que prejudicou a avaliação da eficácia da associação dessa dose com a aplicação tópica de PA, considerando o parâmetro tamanho de lesão. Porém, por outro lado, também evidenciou maior sensibilidade dos isolados ao antimoniato de meglumina. Considerando-se o parâmetro carga parasitária, a combinação dos fármacos foi eficiente para redução do parasitismo no sítio de lesão apenas em um dos isolados, quando comparada à ação dos fármacos isoladamente. Para a cepa M2903, a combinação SbV + PA mostrou-se eficaz na a redução do tamanho da lesão nos animais, mas não na redução da carga parasitária. / Despite the search for alternative treatments for cutaneous leishmaniasis (CL), the pentavalent antimonials (SbV) still remain the most widely used drugs in the treatment of this disease. They can be effective and well tolerated, but serious adverse reactions and therapeutic failure occur frequently. The relation between therapeutic failure and differences in sensitivity to SbV of parasites was investigated using in vitro sensitivity analysis mainly. The results until now, however, are inconclusive. Therefore, it is necessary to search for new models for evaluating drug susceptibility in Leishmania and for alternative treatments which are less toxic, such as the development of formulations for topical use. Therefore, the objective of this study was to evaluate the in vivo sensitivity of Leishmania (Viannia) braziliensis isolated from patients with CL to meglumine antimoniate, as well as the activity of the combination of low doses of SbV, considering the model of gold hamsters (Mesocricetus auratus), with a topical paromomycin (PA) hydrophilic formulation. For in vivo sensitivity analysis, 13 hamsters were infected with different isolates and treated with 50mg SbV /kg/day for 20 days. In comparison to response observed for the reference strain of L. (V.) braziliensis MHOM/BR/1975/M2903, all isolates were susceptible to meglumine antimoniate. To evaluate the combination SbV + PA, hamsters were infected with three of the 13 isolates used in the sensitivity analysis and the strain M2903 and separated into groups that received 25 mg SbV/kg/day, 25 mg/kg/day + PA and only PA, all for 20 days. For these isolates, the dose of 25 mg SbV /kg/day for 20 days, by itself, was effective for the lesion healing, which hampered the evaluation of the efficacy of this dose associated with the topical application of PA, considering the lesion size parameter. How ever, on the other hand, this result also showed increased sensitivity of the isolates to meglumine antimoniate. Considering the parasitic load parameter, the combination of the drugs was effective in reducing the parasitism at lesion site in only one of the isolates compared to the action of the drugs alone. For M2903 strain, the PA + SbV combination was effective in reducing lesion size but not in the reducing the local parasitic burden.

A malária é uma doença infecciosa que afeta principalmente populações de países pobres vivendo em áreas tropicais. É transmitida pela picada de insetos do gênero Anopheles. Seu agente infeccioso é um protozoário do gênero Plasmodium, quatro espécies infectam o ser humano, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae e Plasmodium ovale, sendo a primeira a espécie mais letal. Não existe uma vacina para a doença e o tratamento é quimioterápico, fármacos como quinina, cloroquina, pirimetamina, sulfadoxina, atovaquona e artemisina são empregados. Entretanto, o uso prolongado desses fármacos, a monoterapia e a interrupção precoce do tratamento tem favorecido o surgimento e estabelecimento de plasmócitos resistentes, que sobrevivem apesar da administração do fármaco. Muitos dos mecanismos de resistência são resultantes de mutações pontuais, que podem alterar um ou mais resíduos de aminoácidos presentes na cadeia proteica, de forma que a afinidade de ligação entre fármaco e a proteína fica comprometida e a inibição não mais ocorre. Torna-se então necessário a pesquisa por novas moléculas que possam atuar como fármacos capazes de combater plasmócitos mutantes. A enzima dihidrofolato redutase de Plasmodium falciparum pertence à via do ácido fólico e é inibida pelos fármacos pirimetamina e cicloguanil. Mutações A16V/S108T tornam o parasita resistente ao cicloguanil e N51I/C59R/S108N/I164L à pirimetamina. Por meio de modelagem por homologia, geraram-se novas estruturas tridimensionais dessa enzima, com mutações sítio-dirigida em outros resíduos de aminoácidos presentes no sítio ativo. Realizou-se então estudo de docking utilizando-se essas estruturas modelo, procurando-se sugerir outros mutantes que também teriam baixa afinidade com os fármacos, podendo então originar possíveis plasmócitos resistentes. Selecionaram-se algumas das enzimas mutantes e se realizou um virtual screening com novas moléculas obtidas da base de dados NCI Diversity Set II para se procurar protótipos para novos fármacos. A enzima dihidrofolato redutase existe como uma molécula bifuncional ligada com a enzima timidilato sintase por meio de uma região de junção de 89 aminoácidos, realizou-se também virtual screening visando moléculas que interagissem com a região de junção que, segundo alguns autores, pode ser alvo para a ação de fármacos não competitivos. / Malaria is an infectious disease that affects mostly poor populations living in tropical areas. It is transmitted by bite of insects of genus Anopheles. Infectious agent is a protozoan of the genus Plasmodium, four species infect humans, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae and Plasmodium ovale, the first is the most lethal. There is no vaccine for the disease and the treatment is chemotherapy, drugs like quinine, chloroquine, pyrimethamine, sulfadoxine, atovaquone and artemisinin are employed. However, prolonged use of these drugs, monotherapy and early discontinuation of treatment has favored the emergence and establishment of resistant strains, which survive despite the administration of the drug. Many of resistance mechanisms are due to mutations that may alter one or more amino acid residues present in the protein chain, such that the binding affinity between the drug and the protein is compromised and not inhibition occurs. It then becomes necessary to search for new molecules that can act as drugs capable of fighting mutant strains. The Plasmodium falciparum’s dihydrofolate reductase enzyme belongs to the path of folic acid and is inhibited by drugs pyrimethamine and cycloguanil. A16V/S108T mutation becomes the parasite resistant to cycloguanil and N51I/C59R/S108N/I164L mutation to pyrimethamine. Through homology modeling, were generated new three-dimensional structures of this enzyme, with site-directed mutations in other amino acid residues present in the active site. Then docking study using these model structures was conducted, seeking to suggest other mutants that also have low affinity for inhibitors, which may then lead to possible strains resistant. We selected some of the mutant enzymes and conducted a virtual screening with new molecules obtained from the database NCI Diversity Set II to search prototypes for new drugs. The enzyme dihydrofolate reductase exists as a bifunctional molecule bound to the enzyme thymidylate synthase through a junction region of 89 amino acids, we also perform virtual screening targeting molecules that interact with the junction region, according to some authors, can be targeted for action of noncompetitive drugs. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

As taxas de mortalidade causadas por Candida não-albicans (CNA) aumentaram nas últimas décadas e a resistência aos fármacos é um desafio para tratamento dessas infecções, representando um problema de saúde pública. O uso indiscriminado de antifúngicos, principalmente fluconazol (FLZ) resulta no surgimento de cepas resistentes aos medicamentos entre populações anteriormente suscetíveis. Dessa forma mostra-se importante a realização de testes de aquisição de resistência in vitro na prospecção de um novo medicamento. Própolis é uma mistura resinosa complexa feita pelas abelhas e sua atividade antifúngica já foi intensamente investigada, entretanto, sua capacidade de indução de resistência em fungos ainda não havia sido avaliada. O objetivo principal desse estudo foi averiguar a capacidade de C. parapsilosis e C. glabrata desenvolverem resistência fenotípica à fração enriquecida em benzofenonas da própolis vermelha brasileira e comparar ao FLZ, bem como investigar possível sinergismo quando esta fração é associada com FLZ e anidulafungina (AND). Para analisar o desenvolvimento de resistência, isolados suscetíveis foram cultivados em concentrações crescentes de FLZ e a fração de própolis. O aumento da concentração inibitória mínima (CIM) do FLZ foi evidenciado para todos isolados e a maioria desenvolveu resistência, enquanto que nenhum isolado tornou-se menos suscetível à própolis após a exposição O sinergismo foi investigado pelo método checkerboard. Própolis e FLZ demonstraram sinergia para a maioria dos isolados com resistência induzida ao FLZ, e própolis e AND apresentaram aditividade ou indiferença para a maioria dos isolados. Em conclusão, a própolis demonstrou ser um produto não indutor de resistência, uma vez que não provocou o desenvolvimento de resistência in vitro, ao contrário do FLZ. Além disso, própolis mostrou importante efeito sinérgico com FLZ, apontando uma possível estratégia terapêutica para o tratamento de infecções relacionadas a Candida spp. resistentes ao FLZ. / Mortality rates caused by non-albicans Candida (CNA) have increased in recent decades and drug resistance is a challenge to treat these infections, representing a public health problem. The indiscriminate use of antifungals, especially fluconazole (FLZ), results in the emergence of drug-resistant strains among previously susceptible populations. Thus it is important to develop tests of acquisition of resistance in vitro in prospecting of a new drug. Propolis is a complex resinous mixture made by bees and its antifungal activity has been intensively investigated, however, its ability to induce resistance in fungi has not yet been evaluated. The main aim of this study was to evaluate the ability of C. parapsilosis and C. glabrata develop phenotypic resistance to benzophenones enriched fraction of the Brazilian red propolis and compare to the FLZ, as well as investigate possible synergy when this fraction is associated with FLZ and anidulafungin (AND). To analyze the development of resistance, isolates susceptible to these antifungals were cultured in increasing concentrations of FLZ and propolis. The increase in FLZ Minimum inhibitory concentration (MIC) for all isolates was evident and the majority has developed resistance, whereas none isolated has become less susceptible to propolis after exposure. Synergism was investigated by checkerboard method. Propolis and FLZ demonstrated synergy for most isolates with induced resistance to the FLZ, and propolis and AND showed additivity or indifference to the majority of the isolates. In conclusion, propolis has demonstrated to be a product does not inductor resistance, since it has not caused the development of resistance in vitro, unlike the FLZ. In addition, propolis showed an important synergistic effect with FLZ, indicating a possible therapeutic strategy for the treatment of infections related to FLZ-resistant Candida spp.

Introdução. Pseudomonas aeruginosa é um patógeno clinicamente importante. Existem diversos mecanismos de resistência aos antimicrobianos em P. aeruginosa, dentre eles a produção de enzimas (β-lactamases) e sistemas de efluxo se destacam, uma vez que são capazes de conferir resistência aos carbapenêmicos. Objetivo. Avaliar os sistemas de efluxo MexAB-OprM e MexXY em isolados clínicos de P.aeruginosa de pacientes atendidos no Hospital de Clínicas de Porto Alegre-RS e relacionar a expressão destes sistemas com a CIM de meropenem em isolados produtores e não produtores de metalo-beta-lactamases (MBL). Metodologia. Um total de 86 isolados de P. aeruginosa com suscetibilidade reduzida aos carbapenêmicos foram avaliados. A hiperexpressão dos sistemas MexAB e MexXY foi determinada fenotipicamente utilizando inibidor seletivo da bomba (PAβN). MBLs foi determinada por PCR utilizando primers específicos. Resultados. O fenótipo de hiperexpressão dos sistemas de efluxo estudados foi observado em 34 (47,8%) dos 71 isolados negativos para a produção de MBL e em 14 (93.3%) dos 15 isolados MBL positivos. Na presença de PaβN, todos os isolados não produtores de MBL apresentaram uma redução da CIM para meropenem para valores na faixa de suscetibilidade. Entretanto, das 13 P. aeruginosa produtoras de MBL que diminuíram a CIM, essa redução não foi para valores dentro da faixa de sensibilidade. Conclusão. Os isolados de P. aeruginosa não produtores de MBL apresentam resistência ao meropenem devido a hiperexpressão de MexAB-OprM. Na presença de PaβN, independente de apresentarem produção de MBL, o CIM de meropenem reduziu para valores ≤ 8 mg/L. Contudo, quando isolados não apresentavam MBL, a CIM de meropenem reduziu para níveis de sensibilidade. / Introduction. Bacterial efflux pump systems are resistance mechanisms which may lead to therapeutic failure of antibiotic treatment since many antimicrobial agents are substrate for these mechanisms. The aim of the study was to evaluate the expression of the MexAB, MexXY pump efflux and to determine its influence on meropenem MIC in carbapenemase producing and non-producing P. aeruginosa. Methods. A total of 86 non-repetitive clinical isolates of P. aeruginosa with reduced susceptibility to carbapenems were evaluated. Overexperession of MexAB and MexXY efflux systems were evaluated phenotypically using the PAβN selective inhibitor. Metallo-β-lactamases (MBL) were detected by PCR using specific primers. Results. The efflux pump-overexpressed phenotype was observed in 34 (47.8%) MBL-negative and in 14 (93.3%) MBL-positive isolates. In the presence of the PaβN, all non-producers of MBL presented a reduction of meropenem MICs to the range of susceptibility. In contrast, the 13 P. aeruginosa MBL-producing isolates decreased meropenem MICs at least 16-fold but this reduction did not reach the range of susceptibility. Conclusion. P. aeruginosa non-MBL-producing showed resistance to meropenem due to overexpression of MexAB-OprM. In the presence of PaβN, the isolates harboring or not MBL genes, the meropenem MICs were reduced to values ≤8 mg/L. However, when the isolates harbor MBL genes, the meropenem MIC values were reduced to the susceptibility.

Candida glabrata, geralmente comensal, surgiu como uma causa comum de infecções fúngicas graves com risco de morte. Dada a resistência crescente aos azóis, a orientação recente é utilizar as equinocandinas como a primeira escolha para o tratamento de infecções sistêmicas por C. glabrata. No entanto, esta é a primeira espécie de Candida que foi detectada com resistência significativa às equinocandinas. Esta levedura é capaz de colonizar tecidos do hospedeiro, bem como superfícies abióticas (catéteres, próteses) onde desenvolve um crescimento em multicamadas caracterizado como biofilme. A natureza da estrutura do biofilme e os atributos fisiológicos a ele conferidos resultam em uma resistência inerente a agentes antimicrobianos, impactando negativamente na saúde do paciente. Este estudo teve como objetivo a indução in vitro de resistência à anidulafungina em células planctônicas e sésseis de sete cepas sensíveis de C. glabrata, além da verificação do desenvolvimento de resistência cruzada com fluconazol. A indução de resistência foi realizada submetendo as cepas a concentrações sub-inibitórias do antifúngico. A determinação de concentração inibitória mínima através de microdiluição em caldo foi realizada previamente e posteriormente à indução de resistência e, também, para a verificação de resistência cruzada com fluconazol. O método de indução de resistência resultou em cepas fortemente resistentes à anidulafungina, com concentrações inibitórias mínimas variando de 1 a 2 μg/mL. Antes da indução da resistência, as formas planctônica e séssil das cepas eram todas sensíveis ou sensíveis dose-dependente ao fluconazol. Após a indução de resistência à anidulafungina esta sensibilidade ao fluconazol não foi mantida, tornando as cepas resistentes a este antifúngico. Clinicamente, esta resistência cruzada poderia implicar em falha terapêutica ao utilizar o fluconazol em pacientes previamente expostos a concentrações sub-inibitórias de anidulafungina por longos períodos. / Candida glabrata, usually commensal, has emerged as a common cause of serious life threatening fungal infections. Given the increasing resistance to azoles, the recent guidance is to use echinocandins as the first choice for the treatment of systemic infections by C. glabrata. However, C. glabrata is the first species of Candida that has been detected with significant resistance to echinocandins. This yeast is able to colonize host tissues as well as abiotic surfaces (catheters, prostheses) where it develops a multi-layer growth characterized as biofilm. The nature of the biofilm structure and the physiological attributes conferred on it, result in an inherent resistance to antimicrobial agents, negatively impacting the patient's health. This study aimed to induce in vitro resistance to anidulafungin in planktonic and sessile cells of seven sensitive C. glabrata strains, as well as to verify the development of cross-resistance with fluconazole. The induction of resistance was performed by subjecting the isolates to sub-inhibitory concentrations of the antifungal. The determination of minimum inhibitory concentration by broth microdilution was performed before and after induction of resistance and also for fluconazole cross-resistance verification. The resistance induction test resulted in strains strongly resistant to anidulafungin, with minimum inibitory concentrations ranging from 1 to 2 μg mL-1. Prior to induction of resistance, the planktonic and sessile forms of the strains were all sensitive or sensitive dose-dependent to fluconazole. However, after the induction of resistance to anidulafungin, this sensitivity to fluconazole was not maintained, making the strains resistant to this antifungal. Clinically, this cross-resistance could lead to therapeutic failure when using fluconazole in patients previously exposed to sub-inhibitory concentrations of anidulafungin for long periods.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-08-06T17:36:07Z No. of bitstreams: 1 DissertaçãoNayaraFINALmaio2013.pdf: 3684656 bytes, checksum: 44cf55a7da171d43dbf42153f6237225 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-06T17:36:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissertaçãoNayaraFINALmaio2013.pdf: 3684656 bytes, checksum: 44cf55a7da171d43dbf42153f6237225 (MD5) Previous issue date: 2013 / Em nosso estudo caracterizamos a enzima ferro superóxido dismutase-A (FeSOD-A)e a proteína de membrana dos kinetoplastídeos-11 (KMP-11) em linhagens de Leishmania spp. do Novo Mundo selvagens e resistentes aos antimoniais. Ambas proteínas apresentam grande relevância no metabolismo do parasito, visto que a enzima FeSOD-A está envolvida na defesa antioxidante e KMP-11, presente na superfície da membrana dos kinetoplastídeos, pode estar relacionada ao fenótipo de resistência do parasito ao antimonial. Análise de Southern blot mostrou a presença de polimorfismos na sequência do gene FeSOD-A entre as linhagens de Leishmania avaliadas. A expressão de FeSOD-A foi analisada utilizando anticorpo policlonal (TcFeSOD) que reconheceu um polipeptídio de 26 kDa em todas as linhagens estudadas. Quantificação por qPCR mostrou que o mRNA do gene é 3,6X menos expresso na linhagem L. guyanensis resistente LgSbR, por outro lado a proteína está 2,0X mais expressa nessa linhagem. A FeSOD-A está 3,0X menos expressa em L. amazonensis resistente LaSbR, mas o nível de mRNA foi o mesmo entre as linhagens LaWTS e LaSbR. Ensaios de atividade enzimática mostraram que FESOD-A possui maior atividade nas linhagens resistentes de L. braziliensis e L. infantum chagasi (LbSbR e LcSbR) comparado com as linhagens selvagens. A análise funcional foi realizada para determinar se a superexpressão do gene FeSOD-A nas linhagens LbWTS/LbSbR e LcWTS/LcSbR iria alterar o fenótipo de resistência dos parasitos transfectados. Ensaios de Western blot e de atividade enzimática mostraram que o nível de expressão da proteína e atividade da FeSOD-A foram maiores nos parasitos transfectados em comparação com os não-transfectados. Análise IC50 do SbIII mostrou que a superexpressão FeSOD-A nas linhagens de LbWTS e LcWTS aumentou 1,7X e 1,6X o fenótipo de resistência ao antimônio, respectivamente. A superexpressão da enzima FeSOD-A na linhagem LbSbR reduziu o fenótipo resistência, enquanto que na linhagem LcSbR não houve alteração no fenótipo. Resultados de tolerância ao estresse oxidativo induzido por paraquat mostrou que o clone superexpressor de LbWTS apresentou maior proteção ao estresse comparado à linhagem não-transfectada. Concluindo, nossos resultados sugerem que a enzima FeSOD-A está envolvida no fenótipo de resistência de L. braziliensis e L. chagasi ao antimonial. Para o gene KMP-11 análise por Southern blot mostrou semelhante perfil de hibridização entre as diferentes espécies analisadas, com exceção da linhagem LgWTS que apresentou perfil de fragmentos diferentes. Análise de Northern blot revelou a presença de dois transcritos, 1,0 Kb e 3,0 Kb, em todas as linhagens de Leishmania spp., com exceção da linhagem LgWTS que apresentou apenas um transcrito de 1,0 Kb. Quantificação por qPCR mostrou que mRNA do gene KMP-11 está 2,9X menos expresso na linhagem de LbSbR e 1,5X mais expresso na linhagem LcSbR comparado com os respectivos pares selvagens. A expressão de KMP-11 utilizando anticorpo policlonal anti-KMP-11, mostrou que ele reconheceu um polipeptídio de 11 kDa em todas as linhagens de Leishmania spp. estudadas. Análises de densitometria mostraram que KMP-11 está 1,5X mais expressa em LcSbR comparado com o par selvagem LcWTS e 2,0X menos expressa em LbSbR comparado ao par LbWTS. Ensaios de transfecção do gene KMP-11 foram realizados nas linhagens LbWTS e LbSbR. Análise de Western blot mostrou maior expressão da proteína KMP-11 nos parasitos resistentes transfectados. Avaliação da susceptibilidade ao SbIII mostrou que a superexpressão de KMP-11 na linhagem selvagem de LbWTS não alterou o fenótipo. Por outro lado, a superexpressão dessa proteína na linhagem resistente (LbSbR) reduziu o fenótipo resistência. Ensaios in vitro e in vivo com as linhagens LbWTS não-transfectadas e os clones transfectados com KMP-11 não mostraram diferenças quanto à infectividade dos parasitos em células THP-1 e em camundongos nocaute para interferon-γ. Apenas o clone 6 apresentou menor infectividade em camundongos. Estudos adicionais são necessários para investigar melhor a possível participação da proteína KMP-11 no fenótipo de resistência ao antimonial e na infectividade dos parasitos. / In this study, we characterize the iron superoxide dismutase-A (FeSOD-A) enzyme and kinetoplastid membrane protein-11 (KMP-11) in New World Leishmania spp. lines wild and resistant to antimonials. Both proteins are very important in metabolism of the parasite, since that FeSOD-A is involved in antioxidant defense and KMP-11, present on the surface of kinetoplastids membrane, may be related to antimony-resistance phenotype. Southern blot analysis showed the presence of polymorphisms in the FeSOD-A gene sequence between the Leishmania lines evaluated. The expression level of FeSOD-A was analyzed using polyclonal antibody (anti-TcFeSOD) that recognized a polypeptide of 26 kDa in all lines studied. Quantification by qPCR showed that the FeSOD-A mRNA is 3.6-fold less expressed in SbIII-resistant L. guyanensis line (LgSbR), on the other hand the protein is 2.0-fold more expressed in this line. FeSOD-A is 3.0-fold less expressed in L. amazonensis resistant line (LaSbR), but the level of mRNA was the same between LaWTS and LaSbR lines. Enzymatic activity assays showed that SbIII-resistant L. braziliensis and L. infantum chagasi lines (LbSbR and LcSbR) present a higher FeSOD-A activity than their susceptible pairs. Functional analysis was performed to determine whether overexpression of the FeSOD-A gene in LbWTS/LbrSbR and LcWTS/LcSbR lines should alter the SbIII-resistance phenotype of transfected parasites. Western blot and enzymatic activity assays showed that the protein expression level and activity of FeSOD-A were higher in the transfected parasites compared to non-transfected ones. Analysis of IC50 for SbIII showed that the overexpression of FeSOD-A in the LbWTS and LcWTS lines increased 1.7- and 1.6-fold the SbIII-resistance phenotype, respectively. Overexpression of FeSOD-A enzyme in the LbSbR line reduced the SbIII-resistance phenotype, whereas in the LcSbR line no change in phenotype was observed. Results about the tolerance of parasites to oxidative stress induced by paraquat showed that the clone from LbWTS overexpressor of FeSOD-A presented higher protection to stress compared to non-transfected lines. In conclusion, our results suggest that the FeSOD-A enzyme may be involved to antimony-resistance phenotype in L. braziliensis and L. chagasi lines. Concerning KMP-11 gene, Southern blot analysis showed similar hybridization profile between different Leishmania lines analyzed, with exception of LgWTS line that presented different profile. Northern blot analysis revealed the presence of two transcripts, 1.0 kb and 3.0 kb in all lines of Leishmania analyzed, except for LgWTS line that showed only a transcript of 1.0 kb. Quantification by qPCR showed that mRNA KMP-11 is 2.9-fold less expressed in LbSbR line and 1.5-fold more expressed in LcSbR line compared with their wild pairs. The expression of KMP-11 using anti-KMP11 polyclonal antibody, showed that it recognized a polypeptide of 11 kDa in all Leishmania lines analyzed. Densitometry analysis showed that KMP-11 is 1.5-fold more expressed in the LcSbR line compared with its wild pair and 2.0-fold less expressed in the LbSbR line compared whit its resistant pair. Transfection assays of KMP-11 gene in the LbWTS and LbSbR lines were carried out. Western blot analysis revealed expression increased of KMP-11 protein in transfected resistant parasites. Evaluation of SbIII usceptibility showed that transfection of KMP-11 in the wild LbWTS line did not alter the phenotype. On the other hand, overexpression of this protein in the resistant LbrSbR line reduced the SbIII-resistance phenotype. In vitro and in vivo assays using LbWTS lines and non-transfected clones overexpressors of KMP-11 showed no difference in infectivity of the parasite in THP-1 cells and in interferon-γ knockout mice. Only the clone 6 showed lower infectivity in mice. Additional studies are needed to further investigate a possible involvement of KMP-11 protein in SbIII-resistance phenotype and in infectivity of parasites.