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Osteoclasts are multinucleated, bone resorbing cells that carry out their function using specialized actin-based structures called actin rings and podosomes. Rho GTPases function as molecular switches that regulate the actin cytoskeleton in osteoclasts and many other cell types. Filamin A (FLNa) and SBDS are two proteins that have the potential to interact with both F-actin and Rho GTPases, and thus regulate osteoclast formation, differentiation, or function. We found that in FLNa-null pre-osteoclasts, activation of RhoA, Rac1, and Cdc42 was perturbed, leading to defective pre-osteoclast migration prior to fusion. Ablation of SBDS resulted in the blockage of osteoclast differentiation downstream of RANK and defective RANKL-mediated upregulation of Rac2 that is required for pre-osteoclast migration. Therefore, both FLNa and SBDS are required to coordinate Rho GTPase activation during osteoclastogenesis, in addition to a role for SBDS in osteoclast differentiation downstream of RANK.

Osteoclasts are multinucleated, bone resorbing cells that carry out their function using specialized actin-based structures called actin rings and podosomes. Rho GTPases function as molecular switches that regulate the actin cytoskeleton in osteoclasts and many other cell types. Filamin A (FLNa) and SBDS are two proteins that have the potential to interact with both F-actin and Rho GTPases, and thus regulate osteoclast formation, differentiation, or function. We found that in FLNa-null pre-osteoclasts, activation of RhoA, Rac1, and Cdc42 was perturbed, leading to defective pre-osteoclast migration prior to fusion. Ablation of SBDS resulted in the blockage of osteoclast differentiation downstream of RANK and defective RANKL-mediated upregulation of Rac2 that is required for pre-osteoclast migration. Therefore, both FLNa and SBDS are required to coordinate Rho GTPase activation during osteoclastogenesis, in addition to a role for SBDS in osteoclast differentiation downstream of RANK.

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Endothelzellen kleiden als einschichtiger Zellverband das Innere der Blutgefäße aus und wirken als Barriere zwischen Blut und Interstitium. Entzündungen und Erkrankungen wie Lungenödem oder Arteriosklerose sind gekennzeichnet durch einen Zusammenbruch der Endothelbarriere. Erste Untersuchungen deuten auf eine bedeutende Rolle der GTPasen der Rho-Familie mit den Hauptvertretern Rho A, Rac 1 und Cdc42 als Regulatoren der Endothelbarriere hin. Bezüglich der Regulation der Endothelbarriereintegrität werden den GTPasen Rho A und Rac 1 meist antagonistische Funktionen zugeschrieben. In einem ersten Teil dieser Dissertation wurde daher die Funktion der Rho-GTPasen Rho A, Rac 1 und Cdc42 für die Endothelbarriere in verschiedenen Endothelien untersucht. Hierzu wurden drei mikrovaskuläre Endothelzelltypen verschiedenen Ursprungs sowie makrovaskuläre Endothelzellen der Pulmonalarterie mit GTPase-aktivierenden oder inaktivierenden bakteriellen Toxinen behandelt. Die Aktivierung von Rho A resultierte in allen Endothelzelltypen mit Ausnahme der mikrovaskulären myokardialen Endothelzellen in einem Zusammenbruch der Endothelbarriere. Die Aktivierung von Rac 1 und Cdc42 führte in allen Endothelzellarten zu einer Barrierestabilisierung. Darüber hinaus konnte in fast allen Endothelzelltypen durch pharmakologische Inhibition der Rho-Kinase eine Stabilisierung der Endothelbarriere induziert werden. Die Inaktivierung aller GTPasen sowie die alleinige Inaktivierung von Rac 1 führte zu einem kompletten Zusammenbruch der Endothelbarriere in vitro. Zudem ergaben in vivo-Experimente an perfundierten Rattenmesenterien eine gesteigerte Permeabilität nach Inaktivierung von Rho A, Rac 1 und Cdc42. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die cAMP-vermittelte Stabilisierung der Endothelbarriere genauer charakterisiert und dabei der Einfluss gesteigerter cAMP-Spiegel auf die Aktivität von Rho-GTPasen in humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen untersucht. Hierbei wurde die cAMP-Konzentration zum einen durch den Einsatz einer Kombination aus dem Adenylatzyklase-Aktivator Forskolin und dem Phosphodiesterase 4-Inhibitor Rolipram und zum anderen durch das cAMP-Analogon 8-pCPT-2’-O-Me-cAMP (O-Me-cAMP) gesteigert. O-Me-cAMP stellt hierbei einen selektiven Aktivator des cAMP nachgeschalteten Epac/Rap 1-Signalweges dar, wohingegen Forskolin/Rolipram durch die generelle cAMP-Steigerung zusätzlich die durch Proteinkinase A (PKA) vermittelten Signalwege stimuliert. Messungen des transendothelialen elektrischen Widerstandes zeigten nach cAMP-Anstieg in beiden Fällen eine Barrierestabilisierung, die mit den Effekten einer Aktivierung von Rac 1 vergleichbar waren. Dies ging mit Veränderungen der Organisation und der Morphologie von Zell-Zell-Kontakten einher. Zusätzlich kam es nach cAMP-Steigerung zu einer gesteigerten Rac 1-Aktivierung ohne Beeinflussung der Rho A-Aktivität. Darüber hinaus zeigten Endothelzellen nach cAMP-Anstieg die Bildung eines corticalen Aktinrings und verminderte Stressfaserbildung, was typische Indizien einer Aktivierung von Rac 1 sind. Um die Rolle von Rac 1 näher zu untersuchen, wurden Rac 1-Inhibitionsstudien durchgeführt. Die pharmakologische Inhibition der Rac 1-Aktivität resultierte in einer verminderten Endothelbarriereintegrität. Für beide cAMP-steigernden Mediatoren kann nach Kombinationsstudien angenommen werden, dass die durch cAMP-Steigerung vermittelten barrierestabilisierenden Effekte durch Rac 1 vermittelt zu sein scheinen. Somit kann aus den Untersuchungen des zweiten Teils dieser Arbeit geschlussfolgert werden, dass cAMP eine gesteigerte Endothelbarrierefunktion sowohl über PKA- als auch über Epac/Rap 1-abhängige Rac 1-Aktivierung vermittelt. Um die Rolle der Rho-GTPasen und von cAMP während einer Barrieredestabilisierung zu untersuchen, wurde im dritten Teil Thrombin als barrieredestabilisierender physiologischer Mediator in humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen genutzt. Thrombin-Gabe führte zu einem reversiblen Zusammenbruch der Endothelbarriere. Zu diesen Zeitpunkten kam es zu einer signifikanten Inhibition von Rac 1 und einer deutlichen Aktivierung von Rho A. Erst nach 15 min fielen die gesamtzellulären cAMP-Spiegel ab. Innerhalb von 60 min erholte sich die Endothelbarriere und Rac 1- bzw. Rho A-Aktivitäten sowie der cAMP-Spiegel erreichten wieder ihr Ausgangsniveau. Vorinkubation der Endothelzellen mit beiden cAMP-steigernden Mediatoren inhibierte den Thrombin-induzierten Barriere-zusammenbruch ebenso wie die Thrombin-vermittelten Veränderungen der Rac 1- und Rho A-Aktivitäten. Auch in diesem Zusammenhang durchgeführte Rac 1-Inhibitionsstudien deuten darauf hin, dass die Hemmung der Thrombineffekte durch cAMP-Steigerung u.a. durch Aktivierung von Rac 1 vermittelt wird. / Endothelial cells build a monolayer coating the inner surface of blood vessels and thereby form a dynamic barrier between plasma and interstitial space. Impaired endothelial barrier function can result in vascular diseases such as edema, atherosclerosis and inflammation. Small GTPases of the Rho family such as Rho A, Rac 1 and Cdc42 are well known regulators of endothelial barrier integrity. It is generally believed that Rho A and Rac 1 regulate endothelial barrier functions in antagonistic manner. According to this concept, Rho A destabilizes barrier integrity whereas Rac 1 enhances endothelial barrier properties. In a first step we investigated the role of Rho A, Rac 1 and Cdc42 in endothelial barrier regulation in four different types of endothelial cells. Microvascular endothelial cells of different origin (myocardium, mesentery and dermis) and macrovascular endothelial cells from pulmonary artery were treated with bacterial toxins to specifically activate or inactivate Rho GTPases. Effects on endothelial barrier functions were revealed by immunfluorescence microscopy, measurement of transendothelial electrical resistance and FITC-dextran flux as well as by quantification of VE-cadherin-mediated adhesion using laser tweezers. Activation of Rho A resulted in break-down of endothelial barrier functions in all endothelial cell types except microvascular myocardial endothelial cells. Activation of Rac 1 and Cdc42 as well as pharmacological inhibition of Rho kinase stabilized endothelial barrier function in all endothelial cell types. Moreover, inactivation of all three GTPases as well as inactivation of Rac 1 alone resulted in endothelial barrier-breakdown in all endothelial cell types. From these data we conclude that Rac 1 is a highly important regulator required for maintenance of endothelial barrier function. In the second part of the study, we characterized the role of Rho GTPases in cAMP-mediated barrier stabilizing effects in microvascular endothelium. Therefore, we analyzed cAMP-induced effects on transendothelial electrical resistance, Rho GTPase activity and cell junction morphology in human dermal microvascular endothelial cells. To increase intracellular cAMP levels we used the cAMP-analogue 8-pCPT-2’-O-Me-cAMP (O-Me-cAMP) or combined treatment with adenylat cyclase-stimulating agent forskolin together with phosphodiesterase 4 inhibitor rolipram. In this approach O-Me-cAMP is used to selectively activate the Epac/Rap 1 pathway whereas forskolin/rolipram-induced increase of cAMP triggers both protein kinase A (PKA)- and Epac/Rap 1-dependent mechanisms. Measurement of transendothelial electrical resistance revealed barrier stabilizing effects of both Epac/Rap 1 and PKA signaling pathways. Barrier stabilization was accompanied by changes in cell junction morphology and both O-Me-cAMP and forskolin/rolipram treatment strongly activated Rac 1 without affecting Rho A activity. Moreover, endothelial cells displayed changes in actin distribution and cortactin localization typical for activation of Rac 1. To investigate the role of Rac 1 activation in cAMP-mediated barrier stabilization we performed Rac 1 inhibition studies. Pharmacological inhibition of Rac 1 activity decreased transendothelial electrical resistance which was accompanied by formation of intercellular gaps. Under these conditions the efficacy of increased cAMP to stabilize endothelial barrier functions was reduced and O-Me-cAMP had no effect. This indicates that barrier-stabilizing effects of cAMP are at least in part mediated by Rac 1-dependent mechanisms which are induced via PKA and Epac/Rap 1 signaling. Next, to address the importance of cAMP and of Rac 1 under conditions of impaired endothelial barrier integrity we used the physiological permeability-increasing mediator thrombin. Thrombin induced a transient breakdown of endothelial barrier function accompanied by increased stress fiber and gap formation in human dermal microvascular endothelial cells. Rac 1 was significantly inactivated whereas Rho A was strongly activated 5 and 15 min after thrombin treatment. Additionally, cAMP levels were decreased. After 60 min Rac 1 and Rho A activity as well as cAMP levels reached baseline values and endothelial barrier function was restored. Increase of cAMP completely blocked endothelial barrier breakdown and largely prevented thrombin-mediated effects on Rac 1 and Rho A activity indicating that reduction of cAMP was the primary mechanism causing the thrombin response. When Rac 1 was inactivated in parallel, both O-Me-cAMP and forskolin/Rolipram were not effective to prevent thrombin-induced endothelial barrier breakdown.

La protéine Rnd3 est un membre atypique de la famille des Rho GTPases. Dénuée d’activité GTPasique, elle est ainsi constitutivement sous forme active et liée au GTP. La régulation de cette protéine ne passe donc pas par le cycle classique des Rho GTPases mais par d’autres mécanismes transcriptionnels, post-transcriptionnels ou encore traductionnels. Dans le carcinome hépatocellulaire (CHC), Rnd3 est significativement sous-exprimée, et cette sous-expression procure un avantage invasif aux hépatocytes. Ce projet de thèse avait pour objectif de déterminer plus précisément les mécanismes à la base de la régulation de Rnd3 dans les cellules tumorales, et notamment les cellules dérivées de carcinome hépatocellulaire. Les travaux de cette thèse ont été divisés en deux axes principaux. Dans une première partie, la régulation de Rnd3 par la β-caténine a été étudiée. En effet, la β-caténine est retrouvée mutée dans plus d’un tiers des CHC, et la présence de mutations activatrices de la β-caténine corrèle avec un faible niveau d’expression de Rnd3 dans les CHC. L’établissement d’un modèle original dans les cellules de CHC, HepG2, a permis d’étudier indépendamment l’implication de la β-caténine sauvage et la β-caténine mutée dans la régulation d’expression de Rnd3. Ce modèle a permis de mettre en évidence une régulation différentielle de Rnd3 par les deux formes de la β-caténine, la forme sauvage régulant Rnd3 au niveau transcriptionnel, et la forme mutée régulant Rnd3 au niveau post-transcriptionnel. La deuxième partie de ce travail, qui constitue la partie principale du projet, s’est intéressée à la régulation de Rnd3 par la voie de mécanotransduction MRTF/SRF. L’activation de cette voie de signalisation est très intimement reliée à l’organisation du cytosquelette d’actine, et cette voie régule en retour l’expression de nombreux gènes impliqués dans la dynamique de l’actine. Les résultats obtenus ont permis de déterminer Rnd3 comme une nouvelle cible directe de la voie MRTF/SRF dans les cellules tumorales, et placent Rnd3 au centre d’une boucle de régulation de cette voie de mécanotransduction. L’ensemble des résultats obtenus au cours de ce projet de thèse ont permis de mieux caractériser la régulation de l’expression de Rnd3 dans les cellules tumorales. / Rnd3 protein is an atypical member of the Rho GTPase family, devoid of GTPase activity and constitutively active and bound to GTP. Rnd3 regulation does not occur through the classical GTPase cycle but is achieved at transcriptional, posttranscriptional or translational level. Rnd3 is underexpressed in hepatocellular carcinoma (HCC), and this down-regulation increases HCC cell invasion and is linked to HCC progression. The aim of this thesis project was to better decipher the mechanisms involved in Rnd3 expression in tumor cells, and particularly in HCC cells. In a first part, Rnd3 regulation by β-catenin was studied. β-catenin is found mutated in one third of HCC, and activating β-catenin mutations in human HCC correlates with the lowest levels of Rnd3. An original model established in HepG2 cells allowed the study of the involvement of WT β-catenin versus mutated β-catenin in the regulation of Rnd3 expression.Interestingly, our results demonstrated that both forms of ß-catenin independently regulate Rnd3 mRNA expression. The WT β-catenin regulates Rnd3 at the transcriptional level, whereas the mutated β-catenin acts through the 3’UTR of Rnd3 mRNA. The second and main part of this thesis project was the study of the regulation of Rnd3 expression by the mechanotransduction pathway MRTF/SRF. The activation of this signaling pathway is tightly regulated by actin cytoskeleton, and the MRTF/SRF pathway directs in return the expression of a huge number of genes involved in actin dynamics. Our results uncovered Rnd3 as a new direct target of MRTF/SRF pathway in tumor cells. Indeed, upon actin dynamics changes, MRTF/SRF is able to bind Rnd3 promoter in order to favor its expression. As Rnd3 also acts as a regulator of the actin cytoskeleton, our results highlight Rnd3 at the center of a feedback loop of the MRTF/SRF mechanotransduction pathway. Taken together, all of the results obtained helped to better decipher the mechanisms of Rnd3 regulation in tumor cells.

Durant la division cellulaire, la cellule subit des changements importants dans sa forme et son adhésion qui dépendent de l'efficacité du remodelage du cytosquelette d'actine. Ce processus est localement et temporellement régulé pour assurer le bon déroulement de la cytokinèse, l'étape finale de la division cellulaire. Il est contrôlé par les GTPases de la famille Rho via le remodelage du cytosquelette d'actine. Les Rho-GTPases fonctionnent comme des interrupteurs moléculaires, passant d'une forme au repos (liée au GDP) à une forme active (liée au GTP). La forme au repos interagit avec des facteurs d'échange, les GEFs (Guanine nucleotide Exchange Factors) qui déplacent le GDP et permet la fixation du GTP. Le retour à la forme inactive se fait par hydrolyse du GTP en GDP, stimulée par les protéines GAPs (GTPase Activating Proteins). RhoA est un régulateur positif de la cytokinèse, activée spécifiquement à l'équateur de la cellule, et qui promeut l'assemblage et la constriction de l'anneau d'actomyosine. En contraste, Rac1 a été proposée pour réguler négativement ce processus et doit être inactivée spécifiquement à l'équateur de la cellule pour le bon déroulement de la cytokinèse. Ainsi, une GAP de Rac1, MgcRacGAP, qui est localisé sur le fuseau central de microtubules, inactive Rac1 à l'équateur de la cellule. La déplétion de MgcRacGAP induit des défauts de cytokinèse qui peuvent être sauvés en co-déplétant Rac1. Cependant, le Rho-GEF activant Rac1 durant la division cellulaire n'a pas encore été identifié. Pour identifier un GEF régulant l'activité de Rac1 dans les cellules en division, nous avons réalisé une approche de « screening » par siRNA dans les cellules HeLa. Les Rac-GEFs sont déplétés par siRNA seul ou en combinaison avec un siRNA ciblant MgcRacGAP, dans le but d'identifier lesquels sont capables de sauver le nombre de cellules multinuclées induit par la déplétion de MgcRacGAP. De façon intéressante, la co-déplétion de MgcRacGAP et du Rho-GEF Trio, un GEF caractérisé principalement pour son rôle dans la croissance et le guidage axonal, entraîne une forte diminution du nombre de cellules multinuclées. Par la suite, nous démontrons que ce sauvetage du phénotype passe par la voie Trio-Rac1 en utilisant des mutants GEFs inactifs de Trio et un inhibiteur spécifique de l'activation de Rac1 par Trio. Ces résultats et le rôle de MgcRacGAP dans l'inactivation de Rac1 en cytokinèse, suggèrent que la déplétion de Trio pourrait sauver les défauts de cytokinèse induits par la déplétion de MgcRacGAP en diminuant l'activité de Rac1. Cela suggère aussi que Trio pourrait être un GEF de Rac1 dans les cellules en division. Pour directement tester si Trio pouvait fonctionner comme un GEF de Rac1 dans les cellules en division, la quantité de Rac1 a été mesurée par « pull-down assay » dans des cellules synchronisées en mitose. Comparé aux cellules traitées avec un siRNA contrôle, la déplétion de Trio réduit de moitié la quantité de Rac1 activée dans les cellules en mitose, démontrant que Trio active Rac1 en mitose. De plus, la déplétion de Trio induit des défauts de remodelage du cytosquelette d'actine dans les cellules en anaphase. De façon intéressante, la déplétion de Trio phénocopie la déplétion de Rac1 et de son effecteur Arp2/3, en accord avec un rôle de la voie Trio-Rac1 dans le contrôle du remodelage du cytosquelette d'actine dans les cellules en division. L'ensemble de ce travail a permis d'identifier pour la première fois un GEF contrôlant l'activité de Rac1 dans les cellules en division dont l'activité s'oppose à la fonction de MgcRacGAP en cytokinèse. Nous proposons ainsi un modèle dans lequel Trio contrôle l'activation de Rac1 et le remodelage du cytosquelette d'actine au cortex cellulaire dans les cellules en division. Dans notre modèle, MgcRacGAP s'oppose à l'action de Trio en inhibant localement et temporellement l'activation de Rac1 au plan de division, assurant ainsi le bon déroulement de la cytokinèse. / During cell division, cells undergo dramatic changes in shape and adhesion that depend on efficient actin cytoskeleton remodeling. This process has to be locally and temporally regulated to accurately ensure cytokinesis, the final stage of cell division. The small GTPases Rac1 and RhoA play an essential role in this process by controlling F-actin cytoskeleton remodeling. GTPases oscillate between an inactive, GDP-bound state and an active, GTP-bound state. They are activated by Guanine-nucleotide Exchange Factors (GEFs), which stimulate the GDP-to-GTP exchange, while they are turned off by GTPase-Activating Proteins (GAPs) which catalyse the hydrolysis of GTP. RhoA is a positive regulator of cytokinesis specifically activated at the division plane, which promotes the assembly and constriction of the actomyosin network. In contrast, Rac1 has been proposed to negatively regulate this process and has to be inactivated at the division plane for cytokinesis to occur properly. A central spindle localized GAP, MgcRacGAP, component of the centralspindlin complex, controls Rac1 inactivation at the cleavage plane. Depletion of Rac1 can suppress the cytokinesis failure induced by MgcRacGAP depletion. However, the Rho-GEF that activates Rac1 during cell division has not been identified yet. To identify a GEF regulating Rac1 activity in dividing cells, we performed a siRNA screening approach in HeLa cells. Rac-GEFs were depleted by siRNA alone or in combination with MgcRacGAP siRNAs, in order to identify the ones able to rescue the multinucleated cells induced by MgcRacGAP depletion. Importantly, co-depletion of MgcRacGAP and Rho-GEF Trio, a GEF characterized primarily for its role in axon outgrowth and guidance resulted in a strong decrease in the number of multinucleated cells. Then, we demonstrate that this rescue is mediated by the Trio-Rac1 pathway, using GEF dead mutants of Trio and a specific inhibitor of Rac1 activation by Trio. These data and the fact that MgcRacGAP was recently described to be essential for Rac1 inactivation in cytokinesis, suggest that Trio depletion could rescue the cytokinesis failure induced by MgcRacGAP depletion by decreasing Rac1 activity. It therefore suggests that Trio could be a GEF of Rac1 in dividing cells. To directly test if Trio could function as a GEF of Rac1 in dividing cells, the amount of activated Rac1 was monitored by pull down assay in synchronized mitotic cells. Compared to control siRNA-treated cells, Trio depletion reduced by half the amount of activated Rac1 in mitotic cells, showing that Trio activates Rac1 in mitosis. Strikingly, Trio depletion led to defects in F-actin cytoskeleton remodeling in anaphase cells. Indeed, the F-actin staining at the cortex was significantly reduced in Trio-depleted cells compared to control cells. Interestingly, Trio depletion phenocopied the depletion of Rac1, consistent with a role for the Trio-Rac1 pathway in controlling F-actin remodeling in dividing cells.Overall, this work identifies for the first time a GEF controlling Rac1 activation in dividing cells that counteracts MgcRacGAP function in cytokinesis. Based on these observations, we propose a model in which Trio functions as a GEF of Rac1 during cell division. Trio, which is expressed throughout the cell cycle, activates Rac1 to control F-actin cytoskeleton remodeling at the cell cortex of dividing cells. MgcRacGAP therefore counteracts the action of Trio by locally and temporally inhibiting Rac1 activation at the division plane, subsequently ensuring accurate cytokinesis.

Chez E. coli, Rho est un facteur essentiel qui contrôle l’expression de multiples unités transcriptionnelles via le phénomène de terminaison de la transcription. Rho est un moteur moléculaire ATP-dépendant ayant une activité ARN hélicase caractéristique de sa capacité à dissocier des obstacles (comme l’ARN polymérase) lors de sa translocation le long de sa piste ARN. Il existe différentes structures de Rho en interaction avec l’ARN qui suggèrent des mécanismes de translocation contradictoires. Afin de mieux comprendre ces mécanismes, nous avons utilisé deux approches complémentaires pour identifier les fonctionnalités moléculaires importantes au sein de l’ARN et de Rho : l’approche NAIM (Nucleotide Analog Interference Mapping) développée au laboratoire et la mutagenèse dirigée. Nos résultats excluent une organisation de l’anneau hexamérique en «trimère de dimère» (ainsi que les mécanismes de translocation qui en découlent) mais sont compatibles avec différents aspects rencontrés dans une structure en anneau asymétrique plus récente. Toutefois, nos résultats ne supportent pas le mécanisme d’escorte nucléotide par nucléotide qui découle de cette structure asymétrique. Ainsi, nous montrons que Rho contacte la chaîne ARN de façon hétérogène et ne nécessite un groupement 2’-OH que tous les sept nucléotides en moyenne. Par ailleurs, nous avons exploré l’interactome d’E. coli dans le but d’identifier d’éventuels régulateurs de la fonction de Rho. Nous montrons que la protéine hexamèrique Hfq présente une similitude topologique avec les protéines endogènes NusG et YaeO et que, comme elles, Hfq s’associe à Rho pour en réguler la fonction. L’interaction Hfq:Rho inhibe les activités enzymatiques de Rho. Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme d’anti-terminaison de la transcription avec diverses implications possibles dans le métabolisme bactérien et/ou la virulence de germes pathogènes. / In E. coli, Rho is an essential factor that controls the expression of multiple transcriptional units via the phenomenon of transcription termination. Rho is an ATP-dependent molecular motor displaying RNA helicase activity, a feature typical of Rho’s ability to dissociate obstacles (such as RNA polymerase) during translocation along its RNA track. Different structures of the Rho-RNA complex have been published and suggest contradictory mechanisms of translocation. In order to understand these mechanisms, we have used two complementary approaches to identify functionality molecular comports in RNA and Rho : the NAIM (Nucleotide Analog Interference Mapping) approach developed in the laboratory and site-directed mutagenesis. Our results exclude that Rho forms a functional "trimer of dimer" ring (which rules out related translocation mechanisms) but are compatible with various aspects encountered in a recent asymmetric ring structure. However, our results do not support the "nucleotide by nucleotide" escort mechanism inferred from this asymmetric structure. Indeed, we show that Rho forms heterogonous contacts with the RNA chain and only requires a 2'-OH every seven nucleotides on average. Furthermore, we explored the interactome of E. coli in order to identify potential regulators of Rho function. We show that the hexameric protein Hfq displays topological similarity with the endogenous proteins NusG and YaeO and, that, like them, Hfq associates with Rho to regulate Rho function. The Hfq:Rho interaction inhibits the enzymatic activities of Rho. These results reveal a novel mechanism of transcription anti-termination with potentially important implications in bacterial metabolism and/or virulence of pathogens.

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Engineered protein systems have been created to impart new functions, or “re-program” mammalian cells for applications including cancer and HIV/AIDS therapies. The successful development of mammalian cells for re-programming will depend on having well-defined, modular systems. Migration is a particularly important cell function that will determine the efficiency and efficacy of many re-programming applications in vivo, and Rho proteins are responsible for regulation of cell migration natively. While there have been several reports of photo-activated Rho proteins, no strategy has been developed such that Rho proteins and cell migration can be controlled by a variety of extracellular stimuli that may be compatible with signaling in large organisms. Here, several methods are described for engineering Ca2+-sensitive Rho proteins so that the large, natural toolbox of Ca2+-mobilizing proteins can use the Ca2+ intermediate to activate Rho proteins in response to a variety of exogenous stimuli, including chemicals, growth factors, and light. First, an unreported calmodulin binding site was identified in RhoA. This knowledge was used to create a tandem fusion of RhoA and calmodulin that mediated Ca2+-sensitive bleb retraction in response to a variety of Ca2+-elevating chemicals. Ca2+-mobilizing modules including channelrhodopsin-2 and nicotinic acetylcholine receptor α4 were used for light- and acetylcholine-dependent bleb retraction. Second, a more robust morphology switch was created by embedding a calmodulin binding site into RhoA to enable Ca2+-responsive bleb formation. A wider range of Ca2+-mobilizing modules were also used here including LOVS1K/Orai1 and vascular endothelial growth factor 2. Combining Ca2+-mobilizing and Ca2+-responsive modules increased amoeboid-like cell migration in wound closure and transwell assays. Finally, the embedded peptide design was applied to Rac1 and Cdc42 to enable control of new morphologies and migration modes. The modular Ca2+ control over Rho proteins developed here is an important contribution to cell re-programming because it shows that control over cell migration can be rewired in a way that is flexible and tunable.