<p>Ribosome biogenesis is a major metabolic expense of bacteria and a promising target for antibacterial drug discovery. <em>Trans-</em>acting proteins, called ribosome biogenesis factors, aid this complex and cooperative process. EngA (YfgK, Der) is a widely distributed bacterial GTPase that is shown here to be important for normal ribosome biogenesis. EngA is an attractive antibacterial target because it is essential for viability in bacteria but is absent in humans.</p> <p>The GTPase activity and cellular function of EngA was investigated in <em>Escherichia coli</em>. Depletion of EngA caused accumulation of 30S and 50S ribosomal subunits at the expense of 70S ribosomes, showing for the first time that EngA is important for normal ribosome biogenesis. Mutation of either of the tandem GTPase domains of EngA led to abnormal ribosome profiles, cell death and loss of GTPase activity, revealing that the two GTPase domains act cooperatively to carry out an essential function. EngA bound the 50S subunit of the ribosome in cells and <em>in vitro</em>. Depletion of EngA resulted in sensitization to aminoglycoside antibiotics, which bind at the aminoacyl-tRNA binding site of ribosomes. To search for an inhibitor of ribosome biogenesis, a high-throughput screen of the GTPase activity of EngA was developed. A specific inhibitor was not identified, however, this robust screen can be extended to other compound libraries. Thus, we showed that the GTPase domains of EngA have a cooperative function in ribosome biogenesis, probably in maturation of the 50S subunit, and that EngA is an amenable target for further inhibitor screens.</p> / Doctor of Philosophy (PhD)

<p>Using the model organism <em>Escherichia coli</em>, we discuss herein two novel antimicrobial targets: namely, the protein YjeE and the process of ribosome assembly.</p> <p>YjeE is essential for viability and widely conserved amongst bacterial pathogens and has no human homologue. We searched for a small molecule probe of the function of YjeE to help circumvent the inadequate genetic tools that are available for studying this protein. Sensitive methods for detecting ligand binding were optimized; however, this effort yielded no inhibitors. A second approach to studying the function of YjeE was the development of a reporter using a promoter that is directly upstream of <em>yjeE </em>in <em>E. coli</em>. The activity of this promoter was tested in the presence of small molecules of known function and in diverse gene deletion backgrounds. YjeE found to be linked to the inhibition of DNA and protein translation as well as central metabolism and respiration. These interactions prompted experiments that revealed YjeE to be dispensable under anaerobic conditions.</p> <p>Many antibiotics target ribosomal protein synthesis; however, no current antibiotics target the process of ribosome biogenesis. In order to identify new biogenesis factors, the non-essential fraction of the <em>E. coli </em>genome was screened for deletions that gave rise to cold-sensitive growth. We found that genes associated with ribosome function were the most represented cold sensitive factors amongst the genes of known function. We identified and present here two new putative ribosome biogenesis factors, <em>prfC</em> and <em>ychF</em>, which had phenotypes associated with ribosome assembly defects.</p> / Doctor of Philosophy (PhD)

Yes / The ribosome exit site is a focal point for the interaction of protein-biogenesis factors that guide the fate of nascent polypeptides. These factors include chaperones such as NAC, N-terminal-modifying enzymes like Methionine aminopeptidase (MetAP), and the signal recognition particle (SRP), which targets secretory and membrane proteins to the ER. These factors potentially compete with one another in the short time-window when the nascent chain first emerges at the exit site, suggesting a need for regulation. Here, we show that MetAP contacts the ribosome at the universal adaptor site where it is adjacent to the α subunit of NAC. SRP is also known to contact the ribosome at this site. In the absence of NAC, MetAP and SRP antagonize each other, indicating a novel role for NAC in regulating the access of MetAP and SRP to the ribosome. NAC also functions in SRP-dependent targeting and helps to protect substrates from aggregation before translocation. / This work was supported by grants from the BBSRC [H007202/1] and Wellcome Trust [097820/Z/11/A].

Les résultats ont été obtenus avec le logiciel "Insight-2" de Accelris (San Diego, CA) / En 2000, les structures à hautes résolutions des deux sous-unités ribosomiques ont finalement été mises à la disposition du public. L'année suivante, la structure aux rayons X de l'ensemble du ribosome bactérien a été publiée. Ces grandes réalisations ont ouvert une nouvelle ère dans l'étude des mécanismes de la synthèse des protéines. Dès lors, il est devenu possible de relier différents aspects de la fonction du ribosome à des éléments particuliers de sa structure tertiaire. L'établissement de la relation structure-fonction peut toutefois être problématique en raison de l'immense complexité de la structure du ribosome. En d'autres termes, pour que les données cristallographiques sur la structure tertiaire du ribosome soient vraiment utiles à la compréhension du fonctionnement du ribosome, ces données devraient elles-mêmes faire l'objet d'une analyse approfondie. Le travail, présenté ici, peut être vu comme une tentative de ce genre. En appliquant l’analyse systématique des structure cristallographiques du ribosome disponibles, nous avons essayé de résoudre deux problèmes fondamentaux de la biologie ribosomale concernant (1) la nature des réarrangements du ribosome qui ont lieu à différentes étapes de son cycle de fonctionnement et (2) la possibilité de reconstitution de l'évolution du ribosome du monde-à-ARN jusqu’à nos jours. Dans le premier projet, nous avons systématiquement comparé les structures du ribosome disponibles et de sa sous-unité afin d'identifier les domaines rigides, qui ont toujours la même conformation, et les régions flexibles dont la conformation peut varier d'une structure de ribosome à une autre. Il y a deux types de réarrangements structuraux connus dont nous voulions comprendre les mécanismes: le « ratchet-like movement » et la «fermeture de domaines ». Le premier a lieu au cours de la translocation du ribosome et est plus ou moins perçu comme une rotation d'une sous-unité par rapport à l'autre. Le deuxième se produit dans la petite sous-unité et est associé à la reconnaissance codon-anticodon au site A. La comparaison des conformations ribosomales disponibles a révélé les mécanismes spécifiques des deux réarrangements. Bien que la sélection de l'aminoacyl-ARNt appropriée au site A et la translocation du ribosome n'ont jamais été considérés comme ayant quelque chose en commun, nous démontrons ici que les réarrangements de la structure des ribosomes associés au premier processus répète les réarrangements associés au deuxième mais dans l’ordre inverse. En d'autres termes, pendant le cycle d'élongation, la fermeture de domaine et le « ratchet » peuvent ii être considérés comme un mouvement de va-et-vient, qui renvoie finalement le ribosome à sa conformation initiale. Dans le second projet, nous avons fait une tentative de reconstitution de l'évolution de l'ARNr 23S, du monde-à-ARN jusqu`à nos jours. Ici nous nous sommes basés sur la supposition que l'évolution de cette molécule a procédé par des insertions aléatoires des régions relativement courtes dans différentes parties de la chaîne poly-nucléotidique. Pour cela, nous avons élaboré des critères de l'intégrité de la structure ribosomale et présumé que lors de l'évolution, la structure du ribosome s’est toujours adaptée à ces standards. Nous avons examiné l'interaction de type A-mineur, un arrangement fréquent dans la structure de l’ARN ribosomique, constitué d'un empilement d’adénosines non-appariées, attachées à une double hélice. Nous avons supposé que dans toutes les interactions A-mineurs existantes dans le ribosome, la double hélice est apparue avant ou au moins simultanément avec la pile d’adénosines correspondantes. L'application systématique de ce principe à la structure tertiaire de l’ARN 23S a permis d'élucider de manière progressive l'ordre dans lequel les parties différentes de l’ARN 23S ont rejoint la structure. Pris ensemble, les deux projets démontrent l'efficacité de l'analyse systématique in-silico de la structure tertiaire du ribosome et ouvrent la voie à de futures découvertes. / In the year 2000, the first high-resolution structures of the individual ribosomal subunits became available to the public. The following year, the X-ray structure of the complete bacterial ribosome was published. These major achievements opened a new era in studying the mechanisms of protein synthesis. From then on, it became possible to attribute different aspects of the ribosome function to particular elements of its tertiary structure. However, establishing the structure-function relationships is problematic due to the immense complexity of the ribosome structure. In other words, in order to make the crystallographic data on the ribosome tertiary structure really useful for understanding of how the ribosome functions, it must be thoroughly analyzed. Here, based on systematic analysis of the available X-ray conformations of the ribosome we have tried to resolve two fundamental problems of the ribosome biology: concerning (1) the nature of rearrangements in the ribosome that take place at different steps of its functional cycle, and (2) the reconstruction of the ribosome evolution from the RNA world to present time. In the first project, we systematically compared the available structures of the ribosome and its subunits to identify rigid domains, which always have the same conformation, and flexible regions, where the conformation can vary from one ribosome structure to another. There were two known types of structural rearrangements whose mechanisms we wanted to understand: the ratchet-like motion and the so-called domain closure. The ratchet-like motion takes place during the ribosomal translocation and is roughly seen as a rotation of one subunit with respect to the other. The domain closure occurs in the small subunit and is associated with the cognate codon-anticodon recognition in the A-site. Comparison of the available ribosome conformations revealed the detailed mechanisms of both rearrangements. Although the selection of the cognate amino-acyl-tRNA in the A-site and of the ribosomal translocation have never been thought to have anything in common, we demonstrate that the rearrangements in the ribosome structure associated with the first process repeat in reverse order the rearrangements associated with the second process. In other words, during the ribosome elongation cycle, the domain closure and the ratchet-like motion can be seen as a back-and-forth movement, which eventually returns the ribosome to the initial conformation. iv In the second project, we attempted to reconstruct the evolution of the 23S rRNA from the RNA world to present time based on the presumption that the evolutionary expansion of this molecule proceeded though random insertions of relatively short regions into different regions of the polynucleotide chain. We developed criteria for integrity of the ribosome structure and presumed that during the evolutionary expansion, the ribosome structure always matched to these standards. For this, we specifically considered the A-minor interaction, a frequent arrangement in the rRNA structure consisting of a stack of unpaired adenosines tightly attached to a double helix. We presumed that in all A-minor interactions present in the ribosome, the double helix emerged before or at least simultaneously with the corresponding adenosine stack. The systematic application of this principle to the known tertiary structure of the 23S rRNA allowed us to elucidate in a step-vise manner the order in which different part of the modern 23S rRNA joined the structure. Taken together, the two projects demonstrate the effectiveness of the systematic in-silico analysis of the ribosome tertiary structure and pave the way for future discoveries.

Les interactions entre les squelettes sucre-phosphate de nucléotides jouent un rôle important dans la stabilisation des structures tertiaires de larges molécules d’ARN. Elles sont régies par des règles particulières qui gouverne leur formation mais qui jusque là demeure quasiment inconnues. Un élément structural d’ARN pour lequel les interactions sucre-phosphate sont importantes est le motif d’empaquetage de deux doubles hélices d’ARN le long du sillon mineur. Ce motif se trouve à divers endroits dans la structure du ribosome. Il consiste en deux doubles hélices interagissant de manière à ce que le squelette sucre-phosphate de l’une se niche dans le sillon mineur de l’autre et vice versa. La surface de contact entre les deux hélices est majoritairement formée par les riboses et implique au total douze nucléotides. La présente thèse a pour but d’analyser la structure interne de ce motif et sa dépendance de stabilité résultant de l’association optimale ou non des hélices, selon leurs séquences nucléotidiques. Il est démontré dans cette thèse qu’un positionnement approprié des riboses leur permet de former des contacts inter-hélices, par l’entremise d’un choix particulier de l’identité des pairs de bases impliquées. Pour différentes pairs de bases participant à ce contact inter-hélices, l’identité optimale peut être du type Watson-Crick, GC/CG, or certaines pairs de bases non Watson-Crick. Le choix adéquat de paires de bases fournit une interaction inter-hélice stable. Dans quelques cas du motif, l’identité de certaines paires de bases ne correspond pas à la structure la plus stable, ce qui pourrait refléter le fait que ces motifs devraient avoir une liberté de formation et de déformation lors du fonctionnement du ribosome. / Although backbone-backbone interactions play an important role in stabilization of the tertiary structure of large RNA molecules, the particular rules that govern the formation of these interactions remain basically unknown. One RNA structural element for which the backbone-backbone interactions are essential is the along-groove packing motif. This motif is found in numerous locations in the ribosome structure; it consists of two double helices arranged such that the backbone of one helix is packed in the minor groove of the other helix and vice versa. The contact area between the two helices is mostly formed by riboses and totally involves twelve nucleotides. Here we analyze the internal structure of the along-groove packing motif and the dependence of stability of the association of the helices on their nucleotide sequences. We show that the proper positioning of the riboses that allows them to form inter-helix contacts is achieved through the particular choice of the identities of the base pairs involved. For different base pairs participating in the inter-helix contacts the optimal identities can be Watson-Crick, GC/CG, or certain non-Watson-Crick base pairs. The proper choice of the base pairs provides for the stable inter-helix interaction. In some cases of the motif, the identities of certain base pairs do not correspond to the most stable structure, which may reflect the fact that these motifs should break and form during the ribosome function.

Hygromycin A (HygA) binds to the large ribosomal subunit and inhibits its peptidyl transferase (PT) activity. The presented structural and biochemical data indicate that HygA does not interfere with the initial binding of aminoacyl-tRNA to the A site, but prevents its subsequent adjustment such that it fails to act as a substrate in the PT reaction. Structurally we demonstrate that HygA binds within the peptidyl transferase center (PTC) and induces a unique conformation. Specifically in its ribosomal binding site HygA would overlap and clash with aminoacyl-A76 ribose moiety and, therefore, its primary mode of action involves sterically restricting access of the incoming aminoacyl-tRNA to the PTC. / Bizkaia:Talent and the European Union's Seventh Framework Program (Marie Curie Actions; COFUND; to S.C., A.S., T.K.); Marie Curie Actions Career Integration Grant (PCIG14-GA-2013-632072 to P.F.); Ministerio de Economía Y Competitividad (CTQ2014-55907-R to P.F., S.C.); FIRB Futuro in Ricerca from the Italian Ministero dell'Istruzione, dell'Universitá e della Ricerca (RBFR130VS5_001 to A.F.); Peruvian Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Productividad (382-PNICP-PIBA-2014 (to P.M. and A.F.)). Funding for open access charge: Institutional funding. / Revisión por pares

Escherichia coli ribosomal RNA (rRNA) is post-transcriptionally modified by site-specific enzymes. The role of most modifications is not known and little is known about how these enzymes recognize their target substrates. In this thesis, we have structurally and functionally characterized two S-adenosyl-methionine (SAM) dependent 23S rRNA methyltransferases (MTases) that act during the early stages of ribosome assembly in E. coli. RlmM methylates the 2'O-ribose of C2498 in 23S rRNA. We have solved crystal structures of apo RlmM at 1.9Å resolution and of an RlmM-SAM complex at 2.6Å resolution. The RlmM structure revealed an N-terminal THUMP domain and a C-terminal catalytic Rossmann-fold MTase domain. A continuous patch of conserved positive charge on the RlmM surface is likely used for RNA substrate recognition. The SAM-binding site is open and shallow, suggesting that the RNA substrate may be required for tight cofactor binding. Further, we have shown RlmM MTase activity on in vitro transcribed 23S rRNA and its domain V. RlmJ methylates the exocyclic N6 atom of A2030 in 23S rRNA. The 1.85Å crystal structure of RlmJ revealed a Rossmann-fold MTase domain with an inserted small subdomain unique to the RlmJ family. The 1.95Å structure of the RlmJ-SAH-AMP complex revealed that ligand binding induces structural rearrangements in the four loop regions surrounding the active site. The active site of RlmJ is similar to N6-adenine DNA MTases. We have shown RlmJ MTase activity on in vitro transcribed 23S rRNA and a minimal substrate corresponding to helix 72, specific for adenosine. Mutagenesis experiments show that residues Y4, H6, K18 and D164 are critical for catalytic activity. These findings have furthered our understanding of the structure, evolution, substrate recognition and mechanism of rRNA MTases.

En 2000, les structures à hautes résolutions des deux sous-unités ribosomiques ont finalement été mises à la disposition du public. L'année suivante, la structure aux rayons X de l'ensemble du ribosome bactérien a été publiée. Ces grandes réalisations ont ouvert une nouvelle ère dans l'étude des mécanismes de la synthèse des protéines. Dès lors, il est devenu possible de relier différents aspects de la fonction du ribosome à des éléments particuliers de sa structure tertiaire. L'établissement de la relation structure-fonction peut toutefois être problématique en raison de l'immense complexité de la structure du ribosome. En d'autres termes, pour que les données cristallographiques sur la structure tertiaire du ribosome soient vraiment utiles à la compréhension du fonctionnement du ribosome, ces données devraient elles-mêmes faire l'objet d'une analyse approfondie. Le travail, présenté ici, peut être vu comme une tentative de ce genre. En appliquant l’analyse systématique des structure cristallographiques du ribosome disponibles, nous avons essayé de résoudre deux problèmes fondamentaux de la biologie ribosomale concernant (1) la nature des réarrangements du ribosome qui ont lieu à différentes étapes de son cycle de fonctionnement et (2) la possibilité de reconstitution de l'évolution du ribosome du monde-à-ARN jusqu’à nos jours. Dans le premier projet, nous avons systématiquement comparé les structures du ribosome disponibles et de sa sous-unité afin d'identifier les domaines rigides, qui ont toujours la même conformation, et les régions flexibles dont la conformation peut varier d'une structure de ribosome à une autre. Il y a deux types de réarrangements structuraux connus dont nous voulions comprendre les mécanismes: le « ratchet-like movement » et la «fermeture de domaines ». Le premier a lieu au cours de la translocation du ribosome et est plus ou moins perçu comme une rotation d'une sous-unité par rapport à l'autre. Le deuxième se produit dans la petite sous-unité et est associé à la reconnaissance codon-anticodon au site A. La comparaison des conformations ribosomales disponibles a révélé les mécanismes spécifiques des deux réarrangements. Bien que la sélection de l'aminoacyl-ARNt appropriée au site A et la translocation du ribosome n'ont jamais été considérés comme ayant quelque chose en commun, nous démontrons ici que les réarrangements de la structure des ribosomes associés au premier processus répète les réarrangements associés au deuxième mais dans l’ordre inverse. En d'autres termes, pendant le cycle d'élongation, la fermeture de domaine et le « ratchet » peuvent ii être considérés comme un mouvement de va-et-vient, qui renvoie finalement le ribosome à sa conformation initiale. Dans le second projet, nous avons fait une tentative de reconstitution de l'évolution de l'ARNr 23S, du monde-à-ARN jusqu`à nos jours. Ici nous nous sommes basés sur la supposition que l'évolution de cette molécule a procédé par des insertions aléatoires des régions relativement courtes dans différentes parties de la chaîne poly-nucléotidique. Pour cela, nous avons élaboré des critères de l'intégrité de la structure ribosomale et présumé que lors de l'évolution, la structure du ribosome s’est toujours adaptée à ces standards. Nous avons examiné l'interaction de type A-mineur, un arrangement fréquent dans la structure de l’ARN ribosomique, constitué d'un empilement d’adénosines non-appariées, attachées à une double hélice. Nous avons supposé que dans toutes les interactions A-mineurs existantes dans le ribosome, la double hélice est apparue avant ou au moins simultanément avec la pile d’adénosines correspondantes. L'application systématique de ce principe à la structure tertiaire de l’ARN 23S a permis d'élucider de manière progressive l'ordre dans lequel les parties différentes de l’ARN 23S ont rejoint la structure. Pris ensemble, les deux projets démontrent l'efficacité de l'analyse systématique in-silico de la structure tertiaire du ribosome et ouvrent la voie à de futures découvertes. / In the year 2000, the first high-resolution structures of the individual ribosomal subunits became available to the public. The following year, the X-ray structure of the complete bacterial ribosome was published. These major achievements opened a new era in studying the mechanisms of protein synthesis. From then on, it became possible to attribute different aspects of the ribosome function to particular elements of its tertiary structure. However, establishing the structure-function relationships is problematic due to the immense complexity of the ribosome structure. In other words, in order to make the crystallographic data on the ribosome tertiary structure really useful for understanding of how the ribosome functions, it must be thoroughly analyzed. Here, based on systematic analysis of the available X-ray conformations of the ribosome we have tried to resolve two fundamental problems of the ribosome biology: concerning (1) the nature of rearrangements in the ribosome that take place at different steps of its functional cycle, and (2) the reconstruction of the ribosome evolution from the RNA world to present time. In the first project, we systematically compared the available structures of the ribosome and its subunits to identify rigid domains, which always have the same conformation, and flexible regions, where the conformation can vary from one ribosome structure to another. There were two known types of structural rearrangements whose mechanisms we wanted to understand: the ratchet-like motion and the so-called domain closure. The ratchet-like motion takes place during the ribosomal translocation and is roughly seen as a rotation of one subunit with respect to the other. The domain closure occurs in the small subunit and is associated with the cognate codon-anticodon recognition in the A-site. Comparison of the available ribosome conformations revealed the detailed mechanisms of both rearrangements. Although the selection of the cognate amino-acyl-tRNA in the A-site and of the ribosomal translocation have never been thought to have anything in common, we demonstrate that the rearrangements in the ribosome structure associated with the first process repeat in reverse order the rearrangements associated with the second process. In other words, during the ribosome elongation cycle, the domain closure and the ratchet-like motion can be seen as a back-and-forth movement, which eventually returns the ribosome to the initial conformation. iv In the second project, we attempted to reconstruct the evolution of the 23S rRNA from the RNA world to present time based on the presumption that the evolutionary expansion of this molecule proceeded though random insertions of relatively short regions into different regions of the polynucleotide chain. We developed criteria for integrity of the ribosome structure and presumed that during the evolutionary expansion, the ribosome structure always matched to these standards. For this, we specifically considered the A-minor interaction, a frequent arrangement in the rRNA structure consisting of a stack of unpaired adenosines tightly attached to a double helix. We presumed that in all A-minor interactions present in the ribosome, the double helix emerged before or at least simultaneously with the corresponding adenosine stack. The systematic application of this principle to the known tertiary structure of the 23S rRNA allowed us to elucidate in a step-vise manner the order in which different part of the modern 23S rRNA joined the structure. Taken together, the two projects demonstrate the effectiveness of the systematic in-silico analysis of the ribosome tertiary structure and pave the way for future discoveries. / Les résultats ont été obtenus avec le logiciel "Insight-2" de Accelris (San Diego, CA)

Les ribosomes sont des macrocomplexes ribonucléoprotéiques sophistiqués, essentiels pour décoder l’information génétique et la traduire en protéines fonctionnelles. Chez les organismes eucaryotes, le ribosome est constitué de deux sous-unités, la petite (40S) et la grande (60S). Leur biogenèse est un processus fondamental, très complexe, qui mène à la synthèse et l’assemblage de 4 ARNr et 80 protéines ribosomiques (79 chez la levure). La biogenèse du ribosome a longtemps été étudiée chez Saccharomyces cerevisiae. Près de 20 ans de recherches ont été nécessaires à la communauté scientifique pour identifier les quelques 200 facteurs de synthèse du ribosome levurien. Alors que le schéma global de cette voie de biosynthèse semble conservé chez les organismes eucaryotes, de nombreux éléments suggèrent qu’elle serait plus élaborée chez l’homme et nécessiterait un plus grand nombre de facteurs que chez la levure. De plus, la caractérisation de nombreuses ribosomopathies, ou maladies du ribosome prédisposant aux cancers, a suscité un intérêt accru pour l’étude de la voie de biosynthèse du ribosome dans le paradigme expérimental le plus approprié, la cellule humaine.<p><p>Au cours de ma thèse de doctorat, j’ai contribué à un projet systématique d’identification de facteurs d’assemblage (FA) du ribosome chez l’homme. Pratiquement, nous avons identifié 286 FA humains, dont beaucoup sont homologues aux facteurs levuriens connus, et 74 sont sans équivalent chez la levure. Par ailleurs, j’ai caractérisé en détail certains facteurs. En particulier, Trm112 pour lequel j’ai montré qu’il agit comme un stabilisateur de la méthyltransférase (MTase) Bud23, spécifique à l’ARNr 18S de la sous-unité levurienne 40S. J’ai également participé à la caractérisation de mutations à l’interface du complexe Bud23-Trm112. Enfin, j’ai contribué à l’étude de trois FA que nous avons identifiés chez l’homme, DIMT1L et WBSCR22-TRMT112. J’ai montré que ces protéines sont les orthologues des MTases levuriennes Dim1 et Bud23-Trm112, qu’elles sont requises pour la synthèse et la modification de l’ARNr mature de la petite sous-unité ribosomique, et qu’elles seraient impliquées dans un mécanisme conservé contrôlant la qualité de la voie de biosynthèse du ribosome.<p><p>La totalité des FA que nous avons identifiés en cellule humaine sont à la disposition de la communauté scientifique dans une base de données en ligne accessible sur la page www.RibosomeSynthesis.com. Nous espérons que cette ressource contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents au développement des ribosomopathies et à l’élaboration d’agents thérapeutiques efficaces.<p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le travail retranscrit dans cette thèse regroupe l'étude de différents processus biologiques impliqués dans la synthèse protéique bactérienne. Dans un premier chapitre, les origines de la synthèse protéique au temps du monde ARN sont traitées en guise d'introduction. Ce travail théorique se poursuit par la présentation d'une structure à haute résolution du facteur d'élongation G (EF-G) en complexe avec le ribosome par cryo-microscopie électronique à transmission (cryo-MET). Grâce aux avancées techniques de la cryo-MET, nous avons observé pour la première fois EF-G lié au ribosome en l'absence de tout inhibiteur. Cet état particulièr d'EF-G permet de visualiser une flexibilité de son doamine III. Cette étude permet aussi de rationaliser le fonctionnement de l'antibiotique acide fusidique. Nous nous sommes ensuite intéressés aux voies de sauvetage de la synthèse protéique et plus particulièrement de la trans-traduction. Ce mécanisme fascinant permet le recyclage des ribosomes bloqués sur un ARN messager défectueux. Cette voie de sauvetage est généralement vitale ou alors indispensable pour la virulence bactérienne. Nous avons réalisé une étude structurale préliminaire de la dégradation de l'ARNm défectueux durant ce processus. Après une revue traitant du sujet, nous présentons une étude de la trans-traduction comme cible pour le développement de nouveaux antibiotiques. Pour cela, nous avons mis au point un système rapporteur avec contrôle interne de l'activité trans-traductionnelle bactérienne. Après avoir mis au point ce système et validé son utilisation, nous l'avons exploité en testant des molécules ciblant la trans-traduction. / The current PhD work brings together various studies linked to bacterial protein synthesis. The first chapter is about the origins of protein synthesis at the time of the RNA world. This theoretical work continues with the presentation of a high-resolution structure of the elongation factor G (EF-G) in complex with the ribosome by cryo-electron transmission microscopy (cryo-TEM). We describe for the first time EF-G bound to the ribosome in the absence of any inhibitor. This particular structure of EF-G displays a yet unseen positioning of its third domain, which becomes very flexible. This study helps to understand the way the antibiotic fusidic acid blocks translation. The work then switches to a study of trans-translation, the main rescuing system of stalled ribosomes in bacteria. Trans-translation is generally vital or at least necessary for bacterial virulence. We conducted a preliminary structural study on the way faulty mRNAs are degraded during this process. This is why we present a study of trans-translation as a target for the development of new antibiotics. For this we developed and validated a reporter system for trans-translation, which is used to screen molecules targeting trans-translation.