Universiẗat, Diss., 2005--Giessen.

With the rising popularity of artisanal cheese in the United States, the soft washed rind category has emerged as a fast-growing segment of the marketplace. There is much anecdotal evidence to suggest a common sensorial defect in soft washed rind cheese is a gritty/sandy texture attributed to crystal growth on the rind of these cheeses A preliminary study was undertaken to develop a set of criteria to visually identify crystals found on soft washed rind cheeses. Single crystal identities were presumptively determined using polarized light microscopy (PLM), and cross-checked using powder x-ray diffractometry (PXRD). Two distinct crystal groupings were determined based on these metrics. Group 1 crystals had high birefringent coloring, angle of extinction (AE) ≈ 90°, and were smaller and less circular than Group 2 crystals (P<0.05). Group 2 crystals had no birefringent coloring and AE ≈ 18°. Using established mineralogical data, Group 1 and Group 2 crystals were identified to be struvite and ikaite, respectively. These crystalline bodies are situated in an amorphous cheese matrix (i.e. smear), which create difficulties when examining via PLM and PXRD, leading to high background noise. To remedy these issues, a novel method for harvesting crystals was developed. Smear scrapings were immersed in NaOH (pH=10) to dissolve smear material, which resulted in improved PLM and PXRD performance. A subsequent observational study was conducted to understand the prevalence of surface crystals and grittiness associated with washed rind cheeses sourced from the U.S.A. and Europe. Crystal types were identified via PXRD and PLM. Crystal size and shape (circularity) metrics were determined via PLM and image analysis. A descriptive sensory panel (n=12) was used to evaluate grittiness presence and intensity. Identified crystal types included ikaite, struvite, calcite, and brushite. Mean crystal length and area ranged from ~30μm to ~1100μm, and ~500μm2 to ~200,000μm2, respectively. Sensory perception threshold for grittiness occurred at a mean crystal length of ~70μm and mean crystal area of ~2900μm2. Below these threshold levels, cheeses presented with negligible grittiness. Above these threshold levels, grittiness was highly correlated with crystal length and area (r=0.93 and 0.96, respectively; P<0.001). These results indicate surface crystals have a direct impact on the sensorial quality of soft washed rind cheeses.

Assistierte Reproduktionstechniken (ARTs) zur Behandlung von Infertilität werden mit einer erhöhten Häufigkeit von epigenetischen Aberrationen während der Gametogenese und der frühen Embryonalentwicklung in Verbindung gebracht, speziell durch eine Beeinträchtigung von geprägten Genen. Die in vitro-Maturation (IVM) von Eizellen ist eine ART, die bereits routinemäßig zur Reproduktion von ökonomisch wertvollen Zuchttieren wie dem Hausrind (Bos taurus) eingesetzt wird. IVM-Oozyten weisen jedoch eine verringerte Entwicklungs-kompetenz zum Blastozystenstadium dar, welche möglicherweise auf eine beeinträchtigte epigenetische Regulation zurückzuführen ist. Von allen bekannten epigenetischen Mechanismen ist die DNA-Methylierung die meist untersuchte DNA-Modifikation. In dieser Arbeit wurden zur Klärung der Frage nach den Auswirkungen der IVM auf die DNA-Methylierung geprägter als auch nicht geprägter Gene Oozyten des Hausrinds analysiert. Diese Tierart weist eine ähnliche Präimplantations-entwicklung und Tragezeit wie der Mensch auf und wird daher zunehmend als Modell zum Studium der humanen Keimzell- und Embryonalentwicklung herangezogen. Im Gegensatz zu Mensch und Maus gibt es bislang nur wenig Information über bovine geprägte Gene. Das erste Ziel der hier dargestellten Forschungsarbeiten war daher die Identifizierung und Charakterisierung der bovinen differenziell methylierten Regionen (DMRs) der drei geprägten Genorte von IGF2/H19, SNRPN und PEG3, welche mit Imprintingdefekten des Menschen und/oder im Mausmodell assoziiert werden. Die hier erstmalig erfolgte Beschreibung von mehreren intergenischen DMRs mittels Bisulfitsequenzierung und Pyrosequenzierung belegt die Existenz und evolutionäre Konservierung der IGF2/H19-Imprintingkontrollregion (ICR) beim Rind. Der geprägte Zustand der IGF2/H19-ICR sowie der bovinen Gene SNRPN und PEG3 wurde durch den Nachweis differenzieller Methylierung in plazentalen und somatischen Geweben sowie in Spermien und parthenogenetischen Embryonen bestätigt. Die beobachteten Methylierungsprofile waren typisch für genomische Prägung. Die direkte Bisulfitsequenzierung nach vorangegangener Limiting Dilution (LD) erlaubt die Analyse von Methylierungsmustern einzelner Allele (DNA-Moleküle) von einigen wenigen oder auch nur einer einzigen Zelle (El Hajj et al., 2011). In einem ersten LD-Versuch an bovinen Oozyten wurden die drei vorab charakterisierten und geprägten Gene hinsichtlich möglicher epigenetischer Veränderungen untersucht, welche durch verschiedene IVM-Bedingungen und -Medien (TCM und mSOF) hervorgerufen werden könnten. Die Gesamtrate von Methylierungsfehlern einzelner CpG-Stellen sowie die von ganzen Allelen (Imprintingfehlern) unterschied sich nicht wesentlich zwischen den beiden IVM-Gruppen und der in vivo-Gruppe. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die gängigen IVM-Protokolle keinen oder nur einen geringfügigen Einfluss auf diese entscheidenden epigenetischen Markierungen haben. IVM-Oozyten präpuberaler Kälber weisen eine herabgesetzte Entwicklungskompetenz im Vergleich zu IVM-Oozyten aus adulten Tieren auf. Aus diesem Grund wurde in einem zweiten LD-Versuchsansatz die Promotormethylierung von drei entwicklungsrelevanten, nicht geprägten Genen (SLC2A1, PRDX1, ZAR1) nach ovarieller Stimulation mit FSH und/oder IGF1 untersucht. Sowohl ungereifte als auch in vitro-gereifte Oozyten präpuberaler und adulter Kühe zeigten eine deutliche, unbeeinträchtige Hypomethylierung der drei Genpromotoren ohne jegliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Alterstypen der Spendertiere oder deren Behandlung. Weder das Alter, die hormonelle Stimulation noch die IVM scheinen somit einen Einfluss auf den Methylierungsstatus dieser drei Gene zu haben. Zusammenfassend spiegelte sich die reduzierte Entwicklungsfähigkeit von IVM-Eizellen aus adulten und präpuberalen Kühen nicht in abnormalen Methylierungsmustern der untersuchten geprägten und ungeprägten Gene wider. Dies lässt auf eine generelle Stabilität der etablierten DNA-Methylierungsprofile in Oozyten schließen. Aus diesem Grund müssen andere epigenetische Mechanismen als die DNA-Methylierung wie beispielsweise ncRNAs oder Histonmodifikationen zur Reduktion der Entwicklungskompetenz von präpuberalen und IVM-Oozyten beitragen. Diese Veränderungen behindern mutmaßlich die zytoplasmatische Reifung der Eizelle, welche wiederum zu einer späteren Beeinträchtigung der Entwicklung der Zygote und des Embryos führt. / Infertility treatments by assisted reproductive technologies (ARTs) are associated with an increased incidence of epigenetic aberrations during gametogenesis and early embryo-genesis, specifically in imprinted genes. In vitro-maturation (IVM) of oocytes is an ART which is routinely applied for reproduction of agriculturally and economically important species like cattle (Bos taurus). However, IVM oocytes exhibit a reduced developmental competence to the blastocyst stage which may be caused by an impaired epigenetic regulation. Of all known epigenetic mechanisms DNA-methylation is the most studied DNA-modification. In this thesis, bovine oocytes have been analyzed in order to investigate the impact of IVM on the DNA-methylation of imprinted and non-imprinted genes. Because this species exhibits a similar preimplantation development and gestation length as humans, it is increasingly being used as a model for human germ-cell and embryo development. In contrast to humans and mice, only little information on bovine imprinted genes is available. Thus, the first attempt of the research presented here was to identify and characterize the bovine differentially methylated regions (DMRs) of the three imprinted loci, namely IGF2/H19, SNRPN and PEG3 which are each associated with imprinting defects in humans and/or the mouse model. The first description of several intergenic DMRs by bisulfite sequencing and pyrosequencing proved the existence of an intergenic IGF2/H19 imprinting control region (ICR) in the bovine. The imprinted status of the IGF2/H19-ICR as well as the bovine genes SNRPN and PEG3 was confirmed by differential methylation consistent with genomic imprinting in placental and somatic bovine tissues, in sperm and parthenogenetic embryos. Limiting Dilution (LD) Bisulfite Sequencing (El Hajj et al., 2011) followed by direct bisulfite sequencing allows the analysis of methylation profiles of individual alleles (DNA molecules) from only a few or even single cells. In a first approach using LD, the three characterized imprinted regions were analyzed to determine putative epigenetic alterations in bovine oocytes cultured with different types of IVM conditions and media (TCM and mSOF). The total rate of individual CpG and entire allele methylation errors did not differ significantly between the two IVM and the in vivo group, indicating that current IVM protocols have no or only marginal effects on these critical epigenetic marks. The developmental capacity of IVM oocytes from prepubertal calves is reduced compared with their IVM oocyte counterparts from adult animals. Therefore, in a second LD approach, the promoter methylation of three developmentally important, non-imprinted genes (SLC2A1, PRDX1, ZAR1) has been studied in IVM oocytes from prepubertal cattle after ovarial stimulation with FSH and/or IGF1. Both immature and in vitro matured prepubertal and adult oocytes showed unimpaired hypomethylation of the three gene promoters without differences between the different ages of donors and treatments. Thus, neither age nor hormonal treatment or IVM seem to influence the methylation status of these three genes. In conclusion, the reduced developmental capacity of IVM oocytes from adult and prepubertal cattle were not associated with aberrant methylation patterns of the investigated imprinted and non-imprinted genes suggesting a general stability of established DNA-methylation marks in oocytes. Therefore, epigenetic mechanisms other than DNA-methylation such as ncRNAs or histone modifications might confer to the reduced developmental competence of prepubertal and IVM oocytes. These factors are supposed to interfere with cytoplasmic maturation of the oocyte leading to an impaired development of the zygote and embryo rather than to influence nuclear maturation of the oocyte.

Zugl.: Giessen, Univ., Diss., 2009

Berlin, Freie Universität, Thesis (doctoral), 2000.

Zur Verbesserung der Fleischqualität wurde die japanische Fleischrinderrasse Wagyu (wa = Japan, gyu = Rind) in die in Sachsen etablierten Rassen eingekreuzt. Aus den Kreuzungen mit Fleisch-Fleckvieh, Angus und Hybridtieren entstanden 90 Kälber mit unterschiedlich hohem Wagyugenanteil. Über sechs Jahre wurden in drei Betrieben das Wachstum, die Mast- und Schlachtleistung und die Fleischqualität der Aufzucht untersucht. Der für Wagyu typisch hohe Gehalt an Rohfett führt bei Einkreuzungen zu einer Verbesserung der Fleischqualität. Insbesondere bei Färsen ist das Fleisch zarter und von besserem Aroma.

Seit Anfang der Siebzigerjahre werden weltweit in Rinderbetrieben in vielfältigen Variationen und Anwendungen Stoffwechseluntersuchungen durchgeführt. Das Hauptaugenmerk lag dabei stets auf Seiten der Energie- und Mineralstoffversorgung. Die Superoxid-Dismutase (SOD) fand hier bislang keine Berücksichtigung. Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, die SOD-Aktivität in Stoffwechsel-untersuchungen bei klinisch gesunden Kühen mit ein zu beziehen sowie den Einfluss von Laktation und Jahreszeit zu prüfen. Versuchsanordnung: Insgesamt wurden bei 125 SB/HF-Kühen (7990 kg fettkorregierte Milch/Jahr) folgende drei Gruppen analysiert: Gruppe 1: Im Verlauf eines Jahres wurden im Abstand von 6 Wochen jeweils 10 gesunde Kühe, die sich alle 1-2 Wochen post partum (pp) befanden, untersucht. Zusätzlich wurden die Stall- und die Außentemperaturen berücksichtigt. Gruppe 2: Zur Kontrolle des Laktationsverlaufes wurden 10 Kühe zum Zeitpunkt 4-5 Wochen ante partum (ap), 1 Woche ap, 1-2 Wochen pp, 4 Wochen pp und 8-12 Wochen pp untersucht. Gruppe 3: Um jahreszeitlich bedingte Schwankungen des Stoffwechsels und der SOD-Aktivität in Gruppe 2 auszuschließen, wurden an einem Entnahmetag jeweils sieben verschiedene Kühe zum Zeitpunkt 4-5 Wochen ap, 1 Woche ap, 1-2 Wochen pp, 4 Wochen pp, und 8-12 Wochen pp geprüft. Die Tiere aller drei Gruppen wurden nach der klinischen Untersuchung hämatologisch sowie klinisch-chemisch (SOD, β-Hydroxybutyrat (BHB), Glucose, Cholesterol, Bilirubin, Glutamat-Dehydrogenase (GLDH), Aspartat-aminotransferase (ASAT), Creatinkinase (CK), Protein, Albumin, Harnstoff, Calcium, anorganisches Phosphat, Magnesium, Natrium, Kalium, Chlorid, Eisen) getestet. Auch die Fütterung fand durch Anfertigung einer Rationsberechnung Berücksichtigung. Ergebnisse: Die Ergebnisse der Stoffwechseluntersuchungen und der SOD-Aktivität im Jahresverlauf (Gruppe 1) deuten auf eine verminderte Futteraufnahme in den Sommermonaten infolge Hitzestresses hin. Vor allem ein Absinken der Harnstoff-, Glucose- (positive Korrelation zur SOD-Aktivität), Phosphat- (positive Korrelation zur SOD-Aktivität) und Cholesterolkonzentrationen bei gleichzeitig ansteigenden BHB- (negative Korrelation zur SOD-Aktivität) und Bilirubinkonzentrationen weisen auf eine negative Energiebilanz in diesen Monaten hin. Die Calcium- und Magnesiumkonzentrationen liegen bei allen Tieren im unteren Referenzbereich. Die SOD-Aktivität klinisch gesunder Kühe im Jahresverlauf beträgt 501 bis 978 U/ml Erythrozytenlysat (Interzentilbereich). In Gruppen 2 und Gruppe 3 sind ebenfalls deutliche Schwankungen der Stoffwechselparameter Protein, Harnstoff, Bilirubin, Glucose, BHB und Cholesterol zu beobachten, wobei die stärksten Schwankungen im Zeitraum 1 Woche ap bis 4 Wochen pp vorhanden sind. Auch dies ist durch die reduzierte Futteraufnahme peripartal sowie steigende Futteraufnahme in der Frühlaktation zu erklären. Die SOD-Aktivität der Kühe aus Gruppe 2 zeigt die entsprechenden Schwankungen mit niedrigen Aktivitäten 4-5 Wochen ap bis 1-2 Wochen pp und einen deutlichen Anstieg bis 4 Wochen pp. Die Calcium- und Magnesiumkonzentrationen befinden sich auch in dieser Gruppe im unteren Referenzbereich. In der Gruppe 3 fällt bei den Kühen 4 Wochen pp eine deutliche Stoffwechselbelastung mit erhöhten Bilirubin- und BHB-Konzentrationen sowie ASAT- und GLDH-Aktivitäten auf. In dieser Gruppe sind die Calcium- und Magnesiumkonzentrationen physiologisch. Die SOD-Aktivitäten differieren nur gering mit einer tendenziell höheren Aktivität 4 Wochen pp. Insgesamt fallen im Vergleich zu Gruppe 1 und 2 deutlich höhere SOD-Aktivitäten zwischen 835 und 1758 U/ml Erythrozytenlysat (Interzentilbereich) auf, welche mit den höheren Calcium- und Magnesiumkonzentrationen in Beziehung stehen können. Schlussfolgerungen: Schwankungen von Stoffwechselparametern im Jahres- und Laktationsverlauf betreffen vor allem fütterungsabhängige Parameter. Die SOD-Aktivität verhält sich entsprechend dieser fütterungsabhängigen Parameter mit niedrigerer Aktivität bei längeren Belastungsphasen sowie im geburtsnahen Zeitraum. Statistisch gesicherte Korrelationen ergaben sich mit folgenden fütterungs-abhängigen Parametern: im Jahresverlauf mit BHB, Glucose und anorganischem Phosphat, im Laktationsverlauf in Gruppe 2 mit BHB, Cholesterol, Protein, Glucose, Magnesium und Milchharnstoff und in Gruppe 3 zu BHB und Magnesium. Die Analyse der SOD-Aktivität bereichert die Informationen bei Stoffwechselkontrollen sinnvoll.

Campylobacter fetus subsp. venerealis ist der Erreger der bovinen genitalen Campylobacteriose, einer anzeigepflichtigen Tierseuche. Er hat sein natürliches Reservoir im Präputialsack klinisch gesunder Bullen und ist in der Lage, Aborte zu verursachen (enzooti-scher Abort). Davon abzutrennen sind Infektionen mit C. fetus subsp. fetus, welcher natürlicherweise im Intestinaltrakt des Rindes auftritt und ebenfalls Aborte auszulösen vermag (spo-radischer Abort). Während C. fetus subsp. venerealis einen ausgeprägten Tropismus für die Genitalschleimhaut des Rindes aufweist, handelt es sich bei der Subspezies fetus um einen Zoonoseerreger, der beim Menschen schwerwiegende Erkrankungen mit zumeist septikämischen Charakter verursachen kann. Die Übertragung von C. fetus subsp. venerealis erfolgt hauptsächlich durch den natürlichen Deckakt, es besteht aber auch die Gefahr der Verbreitung durch künstliche Besamung, da klinisch gesunde Bullen den Erreger im Samen enthalten können. Die Unterschiede in der Epidemiologie und die klinische Bedeutung der beiden C. fetus-Subspezies erfordern eine exakte Identifizierung und Differenzierung. Der erste Teil der Untersuchung befasst sich daher mit den Möglichkeiten des molekularen Erregernachweises. Im zweiten Teil wurden 50 Isolate aus den vergangenen fünf Jahren mit molekularen Methoden auf ihre genetische Ähnlichkeit untersucht. Eine Abgrenzung durch traditionelle mikrobiologische Methoden ist sehr problematisch, da sie im Wesentlichen auf nur zwei Reaktionen beruht: die Glycin-Toleranz und die Na-Selenit-Reduktion, wobei neueste Untersuchungen unter standardisierten Bedingungen nur die Glycin-Toleranz als eindeutig charakterische Reaktion für beide Subspezies übrigließe. Aus diesem Grunde wurden PCR-Untersuchungen zur Identifizierung und Differenzierung beider C. fetus-Subspezies eingeführt. In einem ersten Schritt wurde Campylobacter fetus spezifisch nachgewiesen. Danach erfolgte die Differenzierung der Subspezie durch eine weitere PCR, in der nur bei Vorliegen der DNS von C. fetus subsp. venerealis ein Amplikon erhalten wurde. Insgesamt wurden 103 C. fetus-Isolate untersucht, einschließlich der Typenstämme von C. fetus subsp. fetus und C. fetus subsp. venerealis. Auf Grund der Ergebnisse des Gly-cintoleranztests konnten 81 C. fetus subsp. venerealis (Glycin intolerant) und 22 C. fetus subsp. fetus (Glycin tolerant) identifiziert werden. Die Ergebnisse des Glycintoleranztests und der PCR stimmten bei allen 103 C. fetus Isolaten überein. Versuche zum Direktnachweis von C. fetus subsp. venerealis aus Bullensperma durch Anwendung von fünf unterschiedlichen DNS-Extraktionsmethoden waren in ihren Ergebnissen hinsichtlich ihrer Sensitivität nicht zufrieden stellend (104 KbE/ml). Daraus ergibt sich zwingend, dass die Kultivierung des Erregers vor seiner phäno- und genotypischen Charakterisierung weiterhin unverzichtbar bleibt. Durch Untersuchungen mittels PFGE wurde gezeigt, dass die Campylobacter fetus subsp. venerealis-Population, die in Deutschland vorkommt, genetisch nicht einheitlich ist. Eine strenge Gruppierung nach geografischen Regionen war nicht möglich. Innerhalb größerer Gruppen genetisch ähnlicher Stämme fielen Isolate mit identischen Mustern auf, was auf gemeinsame Infektionsquellen hindeutet. Die ERIC-PCR sollte in der vorliegenden Arbeit als zweite Methode der Analyse des Gesamtgenoms zur weiteren Stützung der Ergebnisse der Makrorestriktionsanalyse beitragen. Die Analysen mittels ERIC-PCR machte ein hohes Maß an Heterogenität innerhalb der einzelnen Spezies sichtbar, lässt jedoch keine Assoziation zwischen Bandenprofilen und einer Zuordnung zum Krankheitsbild oder zur geographischen Herkunft zu.

Die Gebärparese gehört trotz umfangreicher pathophysiologischer Kenntnisse immer noch zu den häufigsten und wirtschaftlich bedeutensten peripartalen Erkrankungen bei Milchkühen. Ziel dieser retrospektiven Studie war, zu untersuchen, ob es bereits im antepartalen Zeitraum möglich ist, anhand von Blut- und Harnparametern eine mögliche Prädisposition für Hochleistungskühe, an Gebärparese zu erkranken, festzustellen. Zur Verfügung standen Blut- und teilweise Harnproben von Beginn des Trockenstehens bis kurz nach dem Abkalben von insgesamt 53 post partum (p.p.) festliegenden Kühen (VT). Untersucht wurden Parameter des Energie- und Fettstoffwechsels, des Leber-, Muskel- und Knochenstoffwechsels, des Eiweißstoffwechsels und des Mineral- und Spurenelementstoffwechsels. Zusätzlich wurde bei 20 dieser Kühe die fraktionelle Elimination (FE) von Calcium, Phosphat, Magnesium, Natrium und Kalium berechnet. Signifikante Differenzen ergaben sich vor allem bei der Alkalischen Phosphatase (AP), die im gesamten antepartalen Meßzeitraum signifikant erniedrigte Aktivitäten bei den VT aufwies. Desweiteren wurde eine im entsprechenenden Zeitraum durchweg erhöhte Calcium-Ausscheidung bei gleichzeitig erhöhter FE Calcium bei den VT beobachtet. Nach der ROC (Receiver Operator Characteristics)-Analyse weisen AP-Aktivitäten im Blut unter 45 U/L in der Trockenstehphase mit einer Sensitivität von etwa 80 % auf ein erhöhtes Gebärpareserisiko p.p. hin. Anhand dieser Ergebnisse kann die AP-Aktivität im Blut während der Trockenstehperiode als frühdiagnostischer Indikator für eine p.p. bestehende Gebärparesegefährdung genutzt werden.

Die Motilität und Entleerung des Labmagens, aber auch der antioxidative Status scheinen im Zusammenhang mit Labmagenverlagerungen beim Rind eine entscheidende Rolle zu spielen. Häufige Komplikationen im postoperativen Zeitraum sind in Entleerungs-störungen und einer mangelhaften Motilität des Labmagens begründet. Zur medikamentellen Beeinflussung dieser Problematik existieren bis dato nur wenige Publikationen. In der vorliegenden Untersuchung sollte geprüft werden, welches der Komponente des Kombinationspräparates Neoancemin® für den positiven Einfluss des Medikamentes auf die Entleerung des Labmagens im postoperativen Zeitraum verantwortlich ist. Weiterhin wurde der Einfluss der Komponenten auf die klinische Rekonvaleszenz, den antioxidativen Status und ausgewählte klinisch-chemische Parameter in den ersten 24 Stunden nach der Reposition des Labmagens untersucht.