Parmi l’infinité de compositions verrières, les silicates représentent 90 % de la production mondiale de verre et sont utilisés pour de nombreuses applications industrielles (par exemple l’automobile, le bâtiment ou les panneaux solaires). Des verres silicatés dopés avec 0.5 %pds de Fe2O3 ont été spécifiquement synthétisés dans des conditions d’oxydoréduction extrêmes, réductrices ou oxydantes. L’objectif étant d’isoler les signatures spectroscopiques respectives du Fe2+ et du Fe3+ qui sont habituellement mélangés en raison de la nature hétérovalente du fer. Cependant, les conditions de synthèse ne permettent pas d’isoler des environnements spécifiques du fer qui reste distribué dans les verres. Par conséquent, des minéraux contenant du Fe2+ et du Fe3+ dans des environnements bien définis ont été sélectionnés. La compréhension des relations structure-spectroscopie dans ces références cristallines est donc une étape préliminaire à l’interprétation des signatures spectroscopiques du fer dans les verres. Une étude multi-spectroscopique a été réalisée sur les verres et minéraux en combinant des méthodes expérimentales (absorption optique, absorption des rayons X au seuil K du fer, résonance paramagnétique électronique) et théoriques (calculs multiélectroniques dans l’approche en champ de ligand pour reproduire les spectres de pré-seuils K et de spectres optiques) pour mieux comprendre l’environnement local du fer dans les verres. L’étude des références cristallines a permis de montrer l’influence de la symétrie locale (Oh, Td, D4h/C4v et D3h/C3v) du site du fer et de l’hybridation p–d sur sa signature spectroscopique. Concernant l’étude des verres silicatés réduits, une majorité du Fe2+ est présent en coordinance 5, il est montré que cette dernière permet de reproduire et d’expliquer la signature du fer par une distribution des paramètres de champ cristallin rendant compte de la nature amorphe du verre. L’analyse des verres oxydés a permis d’appuyer l’existence de Fe3+ en coordinance 5 dans les verres sodo-calciques, dont la prise en compte est nécessaire pour l’interprétation des spectres optiques en complément des coordinances tétraédriques. Cette étude apporte un éclairage nouveau sur les variations structurales et spectroscopiques du fer en réaction à une substitution du calcium par du magnésium ou à l’absence d’alcalin dans la composition de la matrice verrière. / Among the infinite possibilities of glass compositions, soda-lime silicates represent of 90% of the glass production and are widely used for many industrial applications (e.g. automotive, solar panels, construction). Specific glasses silicate containing 0.5 wt% of Fe2O3 were synthesized with extreme redox. The use of reducing and oxidizing conditions allows to isolate the respective Fe2+ and Fe3+ spectroscopic signatures that are usually mixed due to the heterovalent nature of iron. However, synthesis conditions do not allow to isolate specific iron environment that remains distributed in glasses. Thus, Fe2+- and Fe3+-bearing minerals containing iron in well defined environments were selected. The comprehension of structure-spectroscopy relationships in these crystalline references is a preliminary step to the interpretation of iron spectroscopic signature in glasses. A multi-spectroscopic study was performed on glasses and minerals by combining experi- mental (optical absorption, X-ray absorption at the iron K edge, and electron paramagnetic resonance) and theoretical (multielectronic calculations using ligand field multiplet approach to reproduce the K pre-edge and optical absorption spectra) methods. The study of crystalline references evidenced the influence of local symmetry (Oh, Td, D4h/C4v et D3h/C3v) on iron sites and of p–d hybridization on iron spectroscopic signatures. Concerning the study of reduced silicate glasses, the majority of Fe2+ is present in 5- fold coordination, this speciation can reproduce and explain the iron signature by using a distribution of the crystal field parameters to take into account the amorphous nature of glass. The analysis of oxidized glasses supports the existence of Fe3+ in 5-fold coordination. These species need to be considered, in addition to tetrahedral geometries, for the interpretation of optical spectra. This study shed light on structural and spectroscopic variations of iron due to the substitution of calcium by magnesium or by the absence of alkali in the composition of the glass matrix.

Title: The Analysis of the Effect of Weightlifting Shoes and Bare Feet Lifting on the Performance Measures of Back Squat. Objectives: The main goal of this study was to compare speed, power, and depth of the back squat performed both barefoot and in weightlifting shoes using the training protocol 5 × 5 (5 sets with 5 reps) at 70 % one-repetition maximum (1RM). Methods: Ten elite, male participants (27 ± 3.54 years old, 93 ± 10.23 kg of body weight, 179.28 ± 8.54 cm of height) were involved and assessed for the purposes of the study. All participants' 1RM back squat was not lower than 1.5 times of their body weight and they all had many years of experience using weightlifting as a part of their athletic development. The assessment was carried out at the training adaptation lab of the Department of Physiology and Biochemistry, the Faculty of Physical Education and Sport, Charles University in Prague (UK FTVS). Each participant followed the same training protocol during two sessions not less than 48 hours apart; the first one performed barefoot and the second one wearing the weightlifting shoes. Participants were asked to perform three repetitions, first with 20 % of their estimated 1RM, then with 40 % and 60 %, followed by two repetitions with 70 % and 80 % of their estimated 1RM to determine their...

An increasing amount of hikers have added hiking poles to their outings to aid in reducing fatigue of the lower body and enhance stability. However, very little research has been conducted on the use of poles during continuous uphill hiking. The purpose of this study was to investigate the effect of pole use under field conditions on the rate of perceived exertion, physiological variables [oxygen consumption (VO2), heart rate (HR), non-protein respiratory exchange ratio (RER), & total energy expenditure (TEE)], and time to completion during a 1.68 km continuous uphill (12.6% grade) hike. Ten male and ten female (Mean age = 22.7 ± 2.0 years) hikers participated in this experimental study using a within subject cross over design with randomized, counter-balanced order. Participants hiked with and without poles, at self-selected speeds. Rate of perceived exertion was collected at five minute intervals. Physiological measures (V02, HR, RER, and METs) were measured continuously (every two seconds) during all hiking conditions using a portable metabolic system (VmaxST, SensorMedics, Yorba Linda, CA). Heart rate data was recorded by a Polar transmitter belt worn by the participant with a receiver integrated into the VmaxST base system. Hiking pole use resulted in increased oxygen consumption (M= 29.8 ± 2.6 ml∙kg⁻¹∙min⁻¹ vs. M= 28.6 ± 2.8 ml∙kg⁻¹∙min), and total energy expenditure (M= 223.3 ± 57.9 kcals vs. 209.6 ± 47.7 kcals) compared to hiking without poles. Duration, RER, HR, and RPE were not significantly different between conditions. These results indicate that the use of hiking poles during uphill hiking increases the energy cost of hiking without increasing the perceived exertion in novice pole users. To fully evaluate the effects of hiking pole use and confirm the results from this study, future field research should be conducted with and without poles, including novice and expert groups, at grades above and below 15 %.

Les NO-synthases sont des flavohémoprotéines responsables de la production de NO• chez les mammifères (mNOS). Elles se composent d’un domaine réductase, qui lie les cofacteurs FMN et FAD et le co-substrat NADPH, et d’un domaine oxygénase qui lie l’hème, le substrat L-arginine et le cofacteur redox essentiel tétrahydrobioptérine H4B. Ces quinze dernières années, plusieurs NOS d’origine bactérienne (bacNOS) ont été caractérisées et il a été montré qu’elles étaient semblables au domaine oxygénase de leurs homologues mammifères. Il existe cependant des différences significatives entre mNOS et bacNOS, la plus importante étant l’absence de domaine réductase chez les NOS d’origine bactérienne. De plus, le(s) mécanisme(s) catalytique(s) de ces dernières ainsi que leur(s) fonction(s) in vivo restent actuellement à déterminer. Plusieurs études publiées montrent que la substitution Val/Ile à proximité du site actif, conservée entre mNOS et bacNOS, est partiellement responsable des différences observées au niveau catalytique entre ces deux groupes. Dans le cadre de cette thèse, j’ai utilisé les spectroscopies d’absorption UV-visible et RPE, ainsi que des techniques de cinétiques rapides comme le stopped-flow et le freeze-quench, pour caractériser les deux mutants complémentaires bsNOS I224V et iNOS V346I afin de mieux comprendre l’influence de cette mutation. J’ai ainsi montré qu’il existait des différences fondamentales entre bacNOS et mNOS qui ne sont pas liées à la substitution Val/Ile et que ces deux familles d’enzymes suivent probablement des mécanismes catalytiques différents pour l’étape d’oxydation du NOHA. Ces résultats sont confirmés par l’étude de la NOS thermostable issue de Geobacillus stearothermophilus. Lorsqu’on s’intéresse au fonctionnement in vivo des bacNOS, se pose également la question de la nature du cofacteur redox puisque de nombreuses bactéries possédant une NOS n’ont pas la machinerie nécessaire à la synthèse de H4B ; c’est par exemple le cas de Deinococcus radiodurans pour qui l’utilisation du tétrahydrofolate H4F a été proposée. J’ai donc étudié et caractérisé deiNOS de manière approfondie en présence de différents cofacteurs afin de mieux comprendre leurs rôles redox et structural. Ceci a notamment permis de proposer un mécanisme catalytique légèrement différent de celui suivi par bsNOS ce qui suggère que ces enzymes pourraient avoir différentes fonctions in vivo. Enfin, la première caractérisation in vitro d’une NOS de plante, issue de l’algue verte unicellulaire Ostreococcus tauri est présentée dans ce manuscrit. Les résultats suggèrent que celle-ci aurait effectivement une activité NO-synthase in vivo. / NO-synthases are flavohemoproteins responsible for NO• production in mammals (mNOS). They are comprised of a reductase domain, that binds FMN, FAD and NADPH, and an oxygenase domain, that binds heme, the substrate L-arginine and the essential redox active tetrahydrobiopterin cofactor H4B. In the last 15 years, several bacterial NOS (bacNOS) have been characterized and shown to resemble the oxygenase domain of their mammalian counterpart. However bacNOS exhibit significant differences from mNOS, the most striking one being the lack of a reductase domain, and their catalytic mechanism(s) and in vivo function(s) are currently poorly understood. Previously published studies suggest that a conserved Val to Ile substitution near the active site is at least partially responsible for the differences in catalysis observed between mNOS and bacNOS. During my PhD I characterized the mutants on this particular position, bsNOS I224V and iNOS V346I, using UV-visible and EPR spectroscopies as well as rapid-kinetic technics such as stopped-flow spectrophotometry and rapid-freeze quench, to better understand the influence of this substitution. This showed that mammalian and bacterial enzymes are fundamentally different and probably follow different mechanisms for NOHA oxidation. Results from studying the thermostable NOS from Geobacillus stearothermophilus further confirm these observations. Another important issue regarding bacNOS functioning in vivo concerns the nature of the redox active cofactor since many NOS-containing bacteria do not have the machinery for H4B biosynthesis; this is for instance the case of Deinococcus radiodurans for which the use of tetrahydrofolate H4F has been proposed. I therefore performed an extensive characterization of deiNOS in the presence of various cofactors to better understand their redox and structural roles. This allowed proposing a slightly different mechanism for deiNOS, compared to bsNOS, suggesting different function(s) in vivo. Finally, the first in vitro characterization of a plant NOS from the unicellular green alga Ostreococcus tauri is reported in this manuscript. The results suggest that this NOS-like protein is indeed a genuine NO-synthase.

Dans une expérience classique de résonance paramagnétique électronique (RPE), le couplage entre les spins et leur environnement électromagnétique est faible, limitant considérablement la sensibilité de la mesure. Grâce à l’utilisation combinée d'un amplificateur paramétrique Josephson et de micro-résonateurs supraconductuers de hauts facteurs de qualité refroidis à quelques millikelvins, ce travail rapporte la conception et la mise en œuvre d’un spectromètre RPE dont la sensibilité de détection est limitée par les fluctuations quantiques du champ électromagnétique au lieu d’un bruit d’origine thermique ou technique. Des mesures de RPE pulsée sur un ensemble de doneurs Bismuth dans le silicium permettent de démontrer une sensibilité de 1700 spins détectés par écho de Hahn avec un signal-sur-bruit unitaire. La sensibilité est encore améliorée en générant un état de vide comprimé dans le guide d'onde de détection, ce qui réduit les fluctuations quantiques au-delà de la limite quantique. Les hauts facteurs de qualité et le petit volume de mode du résonateur supraconducteur développés pour une sensibilité accrue accroit également le couplage spin-résonateur jusqu'au point où les fluctuations quantiques ont un effet dramatique sur la dynamique des spins. En effet, l’émission spontanée de photons dans le résonateur micro-onde est considérablement renforcée par l'effet Purcell, ce qui en fait le mécanisme de relaxation de spin dominant. Le taux de relaxation est augmenté de trois ordres de grandeur lorsque les spins sont accordés à résonance, démontrant que la relaxation de spin peut-être contrôlée sur demande. Nos résultats fournissent une méthode nouvelle et universelle pour initialiser des systèmes de spin dans leur état fondamental, avec des applications en résonance magnétique et en information quantique. / In usual electron-spin resonance (ESR) experiments, the coupling between spins and their electromagnetic environment is quite weak, severely limiting the sensitivity of the measurements. Using a Josephson parametric microwave amplifier combined with high-quality factor superconducting micro-resonators cooled at millikelvin temperatures, this work reports the design and implementation of an ESR setup where the detection sensitivity is limited by quantum fluctuations of the electromagnetic field instead of thermal or technical noise. Pulsed ESR measurements on an ensemble of Bismuth donors in Silicon spins demonstrate a sensitivity of 1700 spins within a single Hahn echo with unit signal-to-noise (SNR) ratio. The sensitivity of the setup is improved one step further by generating squeezed vacuum in the detection waveguide, reducing the amount of noise beyond the quantum limit. The high-quality factors and small mode volume superconducting microwave ESR resonator developed for enhanced sensitivity also enhances the spin-resonator coupling up to the point where quantum fluctuations have a dramatic effect on the spin dynamics. As a consequence, the spin spontaneous emission of microwave photons in the resonator is dramatically enhanced by the Purcell effect, making it the dominant spin relaxation mechanism. The relaxation rate is increased by three orders of magnitude when the spins are tuned to resonance, showing that spin relaxation can be engineered and controlled on-demand. Our results provide a novel and general way to initialize spin systems into their ground state, with applications in magnetic resonance and quantum information processing.

Retinale Hypoxie ist ein wichtiger Faktor bei der Pathogenese der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), einer Erkrankung, die mit einer chronischen Entzündungsreaktion einhergeht. Das angeborene Immunsystem besitzt eine Vielzahl von Mechanismen, um pathogene Faktoren zu erkennen und zu eliminieren. Dazu gehört u.a. das NLRP3-Inflammasom, das wahrscheinlich auch bei der AMD in der Netzhaut aktiviert ist. Die Aktivierung des Inflammasoms ist ein Zweischrittprozess: der erste Schritt, das Priming, besteht in der Transkription von NLRP3-assoziierten Genen. Im zweiten Schritt kommt es zu einer Assemblierung der Inflammasombestandteile, so dass das aktivierte Inflammasom pro-IL-1ß in das biologisch aktive IL-1ß umwandelt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es herauszufinden, ob Hypoxie in kultivierten humanen retinalen Pigmentepithelzellen (RPE)-Zellen die Transkription und Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms induziert. Es sollte auch ermittelt werden, welche Signalwege die hypoxischen Veränderungen der Genexpression von NLRP3 und des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF-A) vermitteln. Dafür wurden Untersuchungen an humanen RPE-Zellen, die in 0,2% O2 bzw. in Anwesenheit von CoCl2 kultiviert wurden, durchgeführt. Hypoxie bewirkte keine Veränderungen der Genexpression der Inflammasom-assoziierten Proteine NLRP1, NLRP6, NLRP7, NLRP12 und NLRC4, wohingegen die Expression der NLRP3- und IL-1ß-Gene sowie der NLRP3- und IL-1ß-Proteingehalt in RPE-Zellen erhöht wurden. Verschiedene Signalwege vermitteln die Hypoxie-induzierte Transkription des NLRP3-Gens. Hierzu zählen die Transkriptionsfaktoren CREB und HIF, Proteinkinase A, IP3-Rezeptoren, calcium-bindende Proteine, TRP- und SOS-Kanäle sowie autokrine/parakrine Aktivierung von EGF-, TGF-ß1-, FGF- und IL-1ß-Rezeptoren. Desweiteren wurde auch eine Beteiligung der autokrin/parakrinen Aktivierung von purinergen Rezeptoren an der hypoxischen NLRP3-Genexpression nachgewiesen. Eine Pannexin-abhängige Freisetzung von ATP trägt über eine Aktivierung von P2Y2- und Adenosin-A1-Rezeptoren zur hypoxischen Expression des NLRP3-Gens bei. Die Aktivierung der P2Y2-Rezeptoren trägt auch zur hypoxischen Expression und Sekretion von VEGF bei. Es konnte auch gezeigt werden, dass eine durch lysosomale Destabilisierung bewirkte Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms eine Verringerung der RPE-Zellviabilität unter hypoxischen Bedingungen bewirkt. Die Daten lassen vermuten, dass Hypoxie ein Faktor ist, der ein Priming und eine Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms in RPE-Zellen bewirkt. Dies könnte eine retinale Inflammation und eine Degeneration der RPE-Zellen begünstigen. Eine Aktivierung von P2Y2-Rezeptoren trägt sowohl zur Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms als auch zur Produktion des angiogenen Faktors VEGF-A in RPE-Zellen bei.:Inhaltsverzeichnis 1. Abkürzungsverzeichnis 2. Einführung 2.1. Das retinale Pigmentepithel-Aufbau und Funktionen 2.2. Die Altersbedingte Makuladegneration (AMD) 2.2.1. Epidemiologie und Ätiologie 2.2.2. Pathophysiologie und Klassifikation der AMD 2.2.2.1. Frühe AMD 2.2.2.2. GA und CNV – Spätformen der AMD 2.3. Zusammenhang zwischen AMD und Immunsystem 2.4. Das NLRP3-Inflammasom 2.4.1. Signalerkennung, Rezeptoren und Aufbau des NLRP3-Inflammasoms 2.4.2. Aktivierung des Inflammasoms 2.4.3. Wirkung von inflammatorischen Prozessen und Zytokinen auf die RPE-Zelle 2.5. Komplementsystem und AMD 2.6. Therapie der AMD 3. Aufgabenstellung 4. Materialien und Methoden 4.1. Materialien 4.1.1. Chemikalien 4.1.2. Substanzen zur Zellstimulation 4.1.3. Geräte und Sonstige Materialien 4.1.4. Primerpaare 4.1.5. Antikörper für die Western-Blot-Analyse 4.1.6. ELISA 4.2. Methoden 4.2.1. Zellkultivierung und Zellstimulation 4.2.2. Zellvitalität 4.2.3. RNA Präparation 4.2.4. cDNA Synthese 4.2.5. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) 4.2.6. Agarose – Gelelektrophorese 4.2.7. siRNA Transfektion 4.2.8. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 4.2.9. Western-Blot, Proteinbestimmung nach Bradford und SDS-PAGE 4.3. Statistische Auswertung 5. Ergebnisse 5.1. Genexpression von Inflammasom-assoziierten Proteinen 5.2. Wirkung von Hypoxie auf die Genexpression von Inflammasomproteinen 5.3. Hypoxisch induzierte Expression von NLRP3 und IL-1ß Protein 5.4. RPE Zellvitalität 5.5. Regulation der Genexpression von NLRP3 und VEGF unter hypoxischen Bedingungen 5.5.1. Transkriptionsfaktoren 5.5.2. Beteiligung intrazellulärer Signalkaskaden 5.5.2.1. NLRP3 mRNA Expression 5.5.2.2. VEGF-A mRNA-Expression 5.5.3. Beteiligung von extrazellulären Signalproteinen 5.5.3.1. NLRP3 mRNA-Expression 5.5.3.2. VEGFA-mRNA-Expression 5.5.4. Beteiligung purinerger Rezeptoren 5.5.4.1. NLRP3 mRNA Expression 5.5.4.2. VEGF-A mRNA-Expression 5.5.5. Rolle purinerger Rezeptoren bei der Hypoxie-induzierten Sekretion von VEGF 6. Diskussion 6.1. Hypoxie induziert Priming und Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms 6.2. Hypoxie-induzierte Signalwege, die die Expression von NLRP3 und VEGF-A regulieren 6.2.1. Transkriptionsfaktoren 6.2.2. Intra- und extrazelluläre Signaltransduktion 6.2.3. Rolle purinerger Rezeptoren bei der hypoxischen Expression von NLRP3 und VEGF 6.3. Chemische Hypoxie vs. Kultivierung in 0,2% O2 6.4. Einfluss der Inflammasomaktivierung auf die Expression und Sekretion von VEGF in RPE-Zellen 6.5. Mögliche klinische Bedeutung der Ergebnisse für die AMD 7. Zusammenfassung 8. Literaturverzeichnis 9. Anhang 9.1. Danksagung 9.2. Abbildungsverzeichnis 9.3. Lebenslauf 9.4. Eigenständigkeitserklärung

Die diabetische Retinopathie (DR) gilt als häufigste chronische mikrovaskuläre Komplikation bei Diabetes mellitus sowie als häufigste Erblindungsursache bei Erwachsenen im Arbeitsalter in Industrieländern. Die diabetische Stoffwechsellage führt langfristig zu Schädigungen des Gefäßendothels, was den Zusammenbruch der Blut-Retina-Schranke verursachen kann. Die Entwicklung eines diabetischen Makulaödems mit Ablagerung von harten Exsudaten steht ebenfalls in engem Zusammenhang mit Sehverlusten. Die wichtigsten Risikofaktoren der DR sind eine Hyperglykämie sowie systemische Hypertonie. Hauptursache für die diabetische Degeneration der Retina ist die Aktivierung des Polyolwegs, der bei erhöhter Glukose-Konzentration vermehrt abläuft. Im ersten Schritt entsteht durch die Aktivität der Aldosereduktase (AR) aus Glukose Sorbitol, das bei diabetischer Stoffwechsellage akkumuliert und toxisch auf die Retinazellen wirkt. Im zweiten Schritt des Polyolwegs wird durch die Sorbitoldehydrogenase Sorbitol in Fruktose umgewandelt. Durch diätetische Kochsalz (NaCl)-Aufnahme erhöht sich die extrazelluläre Osmolarität und bewirkt dadurch akute Blutdruck-Erhöhungen. Bluthochdruck führt über erhöhten Blutfluss und Endothelzellschäden zur Progression der DR. Als Therapie sind derzeit Anti-VEGF-Medikamente, Laserphotokoagulation und intravitreal applizierte Kortikosteroide bekannt. Das retinale Pigmentepithel (RPE) bildet die äußere Blut-Retina-Schranke (BRS) und hat vielfältige Funktionen für das Sehen. Es absorbiert Licht, phagozytiert Außensegmente der Fotorezeptoren, transportiert Nährstoffe und Ionen, trägt zur Ionenhomöostase und pH-Regulation bei, wandelt all-trans-Retinal für den Sehzyklus um und sezerniert verschiedene Signalmoleküle. Die Ruptur der BRS, die bei der DR beobachtet wird, kann zu erhöhter lokaler extrazellulärer Osmolarität durch Metabolit- und Ioneneinstrom und damit hyperosmolaren Stress im RPE führen. Die Plasmaosmolarität hängt vor allem vom NaCl-Spiegel im Blut ab. Reguliert wird die hohe extrazelluläre Ionenkonzentration durch organische Osmolyte, die den intrazellulären osmotischen Druck erhöhen. Dies führt zu einer Kompensation des osmotischen Gradienten über der Zellmembran und somit zu einer Stabilisierung des Zellvolumens. Unter anderem wird vermehrt Sorbitol produziert, welches in den RPE-Zellen akkumuliert. Durch Aktivierung des Polyolwegs kann es dadurch bei der DR zu Zellschädigungen kommen. Hyperosmolarer Stress verändert außerdem den transepithelialen Widerstand, das Netzhautpotenzial, die RPE-Zellzahl sowie die Proliferation und Zellzyklusphasen. Durch hohe NaCl-Spiegel werden vermehrt angiogene Wachstumsfaktoren exprimiert, die zu chorioidalen Neovaskularisationen beitragen. Schließlich kann der erhöhte osmotische Druck in der Retina zu einer exsudativen Netzhautablösung und zu retinalen Ödemen führen, wodurch das Sehen stark beeinträchtigt wird. NFAT5 ist der hauptsächliche Transkriptionsfaktor, der die Genexpression in Reaktion auf hyperosmotischen Stress reguliert. NFAT5 wird unter hypertonen Bedingungen aktiviert und führt zu einer gesteigerten AR-Expression, wodurch die Sorbitol-Produktion stimuliert wird. Es gibt Hinweise, dass eine erhöhte extrazelluläre Osmolarität über eine Aktivierung von NFAT5 die Pathogenese der DR fördert. Deshalb befasst sich diese Arbeit mit der Untersuchung der Wirkung hoher extrazellulärer NaCl-Konzentrationen auf die Gen- und Proteinexpression der Sorbitolproduzierenden und -umwandelnden Enzyme, Aldosereduktase und Sorbitol-dehydrogenase (SDH), sowie mit der Rolle des Transkriptionsfaktors NFAT5 bei kultivierten humanen RPE-Zellen. Es ergaben sich folgende Ziele: • Regulation der Expression von AR und SDH unter verschiedenen pathogenen Bedingungen wie Hyperglykämie, Hypoxie, oxidativer Stress, extrazelluläre Hyperosmolarität • Funktion intra-und extrazellulärer Signalwege und Transkriptionsfaktoren bei der AR- und SDH-Genexpression unter hyperosmolaren bzw. hypoxischen Bedingungen • Rolle der AR- und NFAT5-Aktivitäten für die Vitalität und das Proliferationsverhalten der RPE-Zellen unter hyperosmolaren und hypoxischen Bedingungen Zur Bestimmung der Genexpression der Enzyme wurden PCR-Experimente durchgeführt. Die AR-Genexpression in RPE-Zellen wurde durch hohe extrazelluläre Glukose (25 mM), CoCl2-induzierte chemische Hypoxie (150 μM), H2O2-induzierten oxidativen Stress (20 μM) und NaCl- oder Sucrose-induzierte extrazelluläre Hyperosmolarität erhöht. Durch die gleichzeitige Stimulation mit NaCl und CoCl2 wurde die AR-Genexpression additiv erhöht, was dafür spricht, dass (teilweise) verschiedene intrazelluläre Signalwege die Genexpression unter hyperosmolaren und hypoxischen Bedingungen vermitteln. Extrazelluläre Hyperosmolarität, aber nicht Hypoxie, erhöhte außerdem die AR-Proteinmenge, die mittels Western-Blot-Analyse bestimmt wurde. Um zu ermitteln, welche Signalwege und Transkriptionsfaktoren die Expressionen von AR und SDH vermitteln, wurden jeweils spezifische Inhibitoren eingesetzt. Dabei wurde festgestellt, dass unter Kontroll- und hyperosmolaren Bedingungen die JNK-Aktivität die AR-Expression erhöht, was auf eine hemmende Funktion des Signalwegs hindeutet. Die Hemmung der p38-MAPK, ERK1/2 und PI3K-Signalwege reduzierten die Expression des AR-Gens bei extrazellulärer Hyperosmolarität und Hypoxie, was nahelegt, dass diese Signalwege die AR-Genexpression verstärken. Zudem ist die JNK-Aktivität unter hypoxischen Bedingungen an der Vermittlung der NaCl-induzierten AR-Genexpression beteiligt. Es ist bekannt, dass extrazelluläre Hyperosmolarität die Sekretion von angiogenen Wachstumsfaktoren wie VEGF, bFGF und TGFβ aus RPE-Zellen induziert. Deshalb wurde untersucht, ob eine Aktivierung von Rezeptoren für diese Wachstumsfaktoren für die NaCl-induzierte AR-Genexpression in RPE-Zellen notwendig ist. Die Hemmung des VEGF-Rezeptors 2 erhöhte unter Kontrollbedingungen die AR-Genexpression. Dies deutet daraufhin, dass RPE-Zellen unter Kontrollbedingungen kontinuiertlich VEGF freisetzen. Unter hyperosmolaren Bedingungen wurde die Expression des AR-Gens durch einen Hemmer von Rezeptoren für TGFβ1 sowie einen Hemmer von MMPs vermindert. Die AR-mRNA wurde durch die Hemmung des VEGF Rezeptor-2 und der FGF-Rezeptortyrosinkinase vermehrt exprimiert. Dies deutet auf eine negative Regulation der AR-Expression unter hyperosmolaren Bedingungen durch auto- bzw. parakrine Aktivierung von VEGF- und FGF-Rezeptoren hin. Unter hypoxischen Bedingungen vermitteln die PDGF- und EGF-Rezeptortyrosinkinasen und die Kinaserezeptoren für TGFβ1 die AR-Genexpression. Für die Rolle von Transkriptionsfaktoren an der Regulation der AR wurde gezeigt, dass NFκB unter Kontrollbedingungen die AR-Expression hemmt. Unter hypoxischen Bedingungen konnte eine Rolle von HIF-1 und STAT3 bei der Erhöhung der AR-Genexpression nachgewiesen werden. Die verwendeten Transkriptionsfaktorhemmer hatten unter hyperosmolaren Bedingungen keinen Effekt auf die AR-Expression. Für die Untersuchung der NFAT5-Aktivität wurde der Transkriptionsfaktor mit Hilfe einer siRNA ausgeschaltet. Die Transfektion mit der NFAT5-siRNA reduzierte unter hyperosmolaren sowie hypoxischen Bedingungen die NFAT5-Expression in den RPE-Zellen um etwa 60 %. Diese verringerte NFAT5-Aktivität bewirkte eine Reduktion der AR-Expression unter hyperosmolaren Bedingungen, aber nicht unter Hypoxie. Die AR-Genexpression scheint spezifisch unter hyperosmolaren Bedingungen durch NFAT5 reguliert zu werden. Um zu untersuchen, wie sich die NFAT5- bzw. die AR-Aktivität auf das Überleben und die Proliferation von RPE-Zellen auswirkt, wurde NFAT5 mittels siRNA ausgeschaltet und die AR-Aktivität mit dem spezifischen Inhibitor EBPC gehemmt. Die Herunterregulation der NFAT5-Expression oder die Inhibition der AR-Aktivität verminderte die Zellvitalität unter hyperosmolaren, aber nicht unter hypoxischen Bedingungen und verstärkte die hyperosmolare Hemmung der Zellproliferation. Dies deutet darauf hin, dass eine Herunterregulation der NFAT5-Expression den Zellzyklusarrest unter hyperosmolaren Bedingungen verstärkt, während die Aktivität der AR protektiv auf die Zellen wirkt. Die SDH-Genexpression wurde durch Hypoxie und oxidativen Stress, nicht aber durch extrazelluläre Hyperosmolarität erhöht. Hyperosmolarität und Hypoxie veränderten die SDH-Proteinmenge in den Zellen nicht. Unter Kontrollbedingungen verringerte die Aktivität der JNK die SDH-Genexpression. Der PI3-Akt-Signalweg ist für die Vermittlung der Hypoxie-induzierten SDH-Genexpression von Bedeutung. Außerdem verringerte das entzündungshemmende Glukokortikoid Triamcinolon die hypoxische Expression des SDH-Gens. Weiterhin wurde eine erhöhte SDH-Genexpression durch den VEGF-Rezeptor-2-Hemmer unter Kontrollbedingungen nachgewiesen, was auf einen hemmenden Effekt der VEGF-Rezeptoraktivierung hindeutet. Die SDH-Expression wurde durch die Inhibitoren der PDGF- bzw. EGF-Rezeptortyrosinkinasen unter Hypoxie reduziert, was eine Funktion dieser Rezeptoren an der Induktion der SDH-Expression unter diesen Bedingungen nahelegt. Der Transkriptionsfaktor NFκB hemmte unter Kontrollbedingungen die SDH-Expression, während die Transkriptionsfaktoren HIF-1 und STAT3 bei der Erhöhung der SDH-Expression unter hypoxischen Bedingungen eine Rolle spielen.:Abkürzungsverzeichnis 1 EINLEITUNG 1.1 Die diabetische Retinopathie (DR) 1.1.1 Epidemiologie und Relevanz 1.1.2 Pathogenese, Klinik und Stadien 1.1.3 Systemische Risikofaktoren 1.1.3.1 Hyperglykämie 1.1.3.2 Bluthochdruck 1.1.4 Prävention 1.1.5 Therapie 1.2 Das retinale Pigmentepithel (RPE) 1.3 Epithel-Veränderungen durch hyperosmolaren Stress im Rahmen der DR 1.4 Rolle des Transkriptionsfaktors NFAT5 2 AUFGABENSTELLUNG 3 MATERIAL UND METHODEN 3.1 Materialien 3.1.1 Chemikalien 3.1.2 Geräte und sonstige Materialien 3.1.3 Kits 3.1.4 Substanzen zur Zellstimulation 3.1.5 Antikörper 3.1.6 Primer 3.2 Zellbiologische Methoden 3.2.1 Zellkultivierung 3.2.2 Vitalitätsbestimmung mittels Trypanblau-Methode 3.2.3 Bestimmung der Proliferationsraten 3.3 Molekularbiologische Methoden 3.3.1 RNA-Präparation und DNAse-Behandlung 3.3.2 RNA-Quantifizierung 3.3.3 Reverse Transkription (cDNA-Synthese) 3.3.4 Real-Time Polymerase-Chain-Reaction (RT-PCR) 3.3.5 Bestimmung der PCR-Effizienz 3.3.6 Agarose-Gelelektrophorese 3.3.7 siRNA-Transfektion 3.4 Immunologische Methoden 3.4.1 Western Blot 3.4.1.1 Proteinextraktion und quantitative Bestimmung der Proteine nach Bradford 3.4.1.2 SDS-PAGE 3.4.1.3 Western Blot 3.5 Statistische Auswertung 4 ERGEBNISSE 4.1 Regulation der Aldosereduktase (AR)- und Sorbitoldehydrogenase (SDH)-Gen- und Proteinexpression 4.1.1 AR-Genexpression unter hyperosmolaren und hypoxischen Bedingungen 4.1.1.1 Beteiligung intrazellulärer Signalwege 4.1.1.2 Beteiligung extrazellulärer Signalwege 4.1.1.3 Rolle der Transkriptionsfaktor-Aktivität 4.1.1.4 Rolle von AR- und NFAT5-Aktivität bei der Zellvitalität und -proliferation 4.1.2 SDH-Genexpression unter hypoxischen Bedingungen 4.1.2.1 Beteiligung intrazellulärer Signalwege 4.1.2.2 Beteiligung extrazellulärer Signalwege 4.1.2.3 Rolle von Transkriptionsfaktor-Aktivitäten 5 DISKUSSION 5.1 Wirkung pathologischer Bedingungen auf die Genexpression von AR und SDH 5.1.1 Aldosereduktase 5.1.2 Sorbitoldehydrogenase 5.2 Intrazelluläre Signalwege regulieren die AR-Genexpression 5.3 Extrazelluläre Signalwege regulieren die AR-Genexpression 5.4 Transkriptionsfaktoren regulieren die AR-Genexpression 5.5 Einfluss von AR- und NFAT5-Aktivität auf die Zellvitalität und -proliferation 5.6 Hypoxie-induzierte SDH-Genexpression 5.7 Diskussion der Methodik 5.8 Klinische Relevanz der gewonnenen Ergebnisse 5.9 Aktueller Forschungsstand der Therapie mit AR-Inhibitoren 5.10 Zusammenfassende Darstellung der Regulation der Polyolweg-Enzyme und Ausblick 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 LITERATURVERZEICHNIS 8 ANLAGEN 8.1 Tabellenverzeichnis 8.2 Abbildungsverzeichnis 8.3 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit / Aus den Ergebnissen kann geschlussfolgert werden, dass Sorbitol in RPE-Zellen unter hyperosmolaren Bedingungen akkumuliert, während es unter hypoxischen Bedingungen oder bei oxidativem Stress zu keiner Sorbitolakkumulation kommt. Man kann annehmen, dass die NFAT5- und AR-vermittelte Sorbitolakkumulation die RPE-Zellen unter osmotischem Stress schützt, weil es die intrazelluläre Osmolarität erhöht. Es sollten zukünftig weitere Untersuchungen zur Vitalität der Zellen bei AR-Hemmung unter verschiedenen pathogenen Bedingungen durchgeführt werden. Derzeit befinden sich eine Vielzahl vielversprechender neuer Therapiemöglichkeiten der DR in der Entwicklung, die auf biochemische Signalwege abzielen, die mikrovaskulären Schaden verursachen. Wichtig ist zudem die weitere klinische Forschung, um die Rolle dieser neuen Therapien bei der Behandlung der DR zu ermitteln.:Abkürzungsverzeichnis 1 EINLEITUNG 1.1 Die diabetische Retinopathie (DR) 1.1.1 Epidemiologie und Relevanz 1.1.2 Pathogenese, Klinik und Stadien 1.1.3 Systemische Risikofaktoren 1.1.3.1 Hyperglykämie 1.1.3.2 Bluthochdruck 1.1.4 Prävention 1.1.5 Therapie 1.2 Das retinale Pigmentepithel (RPE) 1.3 Epithel-Veränderungen durch hyperosmolaren Stress im Rahmen der DR 1.4 Rolle des Transkriptionsfaktors NFAT5 2 AUFGABENSTELLUNG 3 MATERIAL UND METHODEN 3.1 Materialien 3.1.1 Chemikalien 3.1.2 Geräte und sonstige Materialien 3.1.3 Kits 3.1.4 Substanzen zur Zellstimulation 3.1.5 Antikörper 3.1.6 Primer 3.2 Zellbiologische Methoden 3.2.1 Zellkultivierung 3.2.2 Vitalitätsbestimmung mittels Trypanblau-Methode 3.2.3 Bestimmung der Proliferationsraten 3.3 Molekularbiologische Methoden 3.3.1 RNA-Präparation und DNAse-Behandlung 3.3.2 RNA-Quantifizierung 3.3.3 Reverse Transkription (cDNA-Synthese) 3.3.4 Real-Time Polymerase-Chain-Reaction (RT-PCR) 3.3.5 Bestimmung der PCR-Effizienz 3.3.6 Agarose-Gelelektrophorese 3.3.7 siRNA-Transfektion 3.4 Immunologische Methoden 3.4.1 Western Blot 3.4.1.1 Proteinextraktion und quantitative Bestimmung der Proteine nach Bradford 3.4.1.2 SDS-PAGE 3.4.1.3 Western Blot 3.5 Statistische Auswertung 4 ERGEBNISSE 4.1 Regulation der Aldosereduktase (AR)- und Sorbitoldehydrogenase (SDH)-Gen- und Proteinexpression 4.1.1 AR-Genexpression unter hyperosmolaren und hypoxischen Bedingungen 4.1.1.1 Beteiligung intrazellulärer Signalwege 4.1.1.2 Beteiligung extrazellulärer Signalwege 4.1.1.3 Rolle der Transkriptionsfaktor-Aktivität 4.1.1.4 Rolle von AR- und NFAT5-Aktivität bei der Zellvitalität und -proliferation 4.1.2 SDH-Genexpression unter hypoxischen Bedingungen 4.1.2.1 Beteiligung intrazellulärer Signalwege 4.1.2.2 Beteiligung extrazellulärer Signalwege 4.1.2.3 Rolle von Transkriptionsfaktor-Aktivitäten 5 DISKUSSION 5.1 Wirkung pathologischer Bedingungen auf die Genexpression von AR und SDH 5.1.1 Aldosereduktase 5.1.2 Sorbitoldehydrogenase 5.2 Intrazelluläre Signalwege regulieren die AR-Genexpression 5.3 Extrazelluläre Signalwege regulieren die AR-Genexpression 5.4 Transkriptionsfaktoren regulieren die AR-Genexpression 5.5 Einfluss von AR- und NFAT5-Aktivität auf die Zellvitalität und -proliferation 5.6 Hypoxie-induzierte SDH-Genexpression 5.7 Diskussion der Methodik 5.8 Klinische Relevanz der gewonnenen Ergebnisse 5.9 Aktueller Forschungsstand der Therapie mit AR-Inhibitoren 5.10 Zusammenfassende Darstellung der Regulation der Polyolweg-Enzyme und Ausblick 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 LITERATURVERZEICHNIS 8 ANLAGEN 8.1 Tabellenverzeichnis 8.2 Abbildungsverzeichnis 8.3 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit

Bibliographische Beschreibung cand. med. Anton Brosig Regulation der Genexpression durch virale RNA und viral-bakterielle DNA in retinalen Pigmentepithelzellen Universität Leipzig, Dissertation 103 Seiten, 120 Literaturangaben, 19 Abbildungen, 10 Tabellen Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) zählt zu den häufigsten Erblindungsursachen in der westlichen Welt. Die Pathogenese der AMD ist mit lokaler und systemischer Entzün-dung assoziiert. Verschiedene Studien weisen darauf hin, dass virale und/oder bakterielle In-fektionen zu einer Verstärkung dieser Entzündungsreaktion in der alternden Retina führen. Um ein besseres Verständnis der bei der AMD ablaufenden pathologischen Mechanismen zu erlangen, wurden die Effekte des synthetischen viralen RNA Analogons Poly(I:C) und der viral-bakteriellen DNA (CpG-ODN) auf die Expression von Genen, die bei der Pathogenese der AMD involviert sind, verglichen. Die Untersuchungen wurden an kultivierten humanen retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) durchgeführt. Es wurde gefunden, dass Poly(I:C) die Genexpression des Pattern-Recognition-Rezeptors (PRR) TLR3, der Transkriptionsfaktoren HIF-1α und p65/NF-κB, des angiogenen Faktors bFGF, von zahlreichen Entzündungsmediatoren (IL-1β, IL-6, TNFα, MCP-1, MIP-2) sowie der Komplementfaktoren C5, C9, CFB induziert. Weiterhin initiierte die Stimulation mit Po-ly(I:C) sowohl die Aktivierung der intrazellulären Signalproteine ERK1/2 und p38-MAPK als auch die Sekretion von bFGF und TNFα aus den Pigmentepithelzellen. Die Poly(I:C)-induzierte Gentranskription wird durch verschiedene Signalwege und Transkriptionsfaktoren vermittelt. CpG-ODN führte bei den RPE-Zellen nur zu einer geringen, transienten Erhöhung der Genexpression der Transkriptionsfaktoren p65/NF-κB und NFAT5 und der Komplement-faktoren C5 und C9. Die Wirkung viraler RNA und der moderate Einfluss viral-bakterieller DNA auf die Genex-pression bei RPE-Zellen legen nahe, dass vor allem virale RNA physiologische Veränderungen im RPE induziert und somit Entzündungsreaktionen in der alternden Retina verstärkt. Weiter-hin lässt sich schließen, dass eine selektive Inhibition einzelner Signalwege oder Transkripti-onsfaktoren im RPE wahrscheinlich nicht ausreicht, um die Entwicklung einer AMD effektiv zu verhindern.

L’ACC Oxydase est une enzyme à Fe(II) non-hémique impliquée dans la biosynthèse de l’éthylène chez les plantes. Notre compréhension du mécanisme ainsi le rôle des différents cofacteurs nécessite l’obtention des données structurales. Une structure cristallographique a été publiée montrant la partie C-terminale (C-term) éloignée du site actif. Ce n’est pas la conformation active car la partie C-term est essentielle à l’activité. Un modèle structural a été construit dans lequel la partie C-term est tournée vers le site actif. Différentes conformations semblent donc possibles. Le marquage de spin couplé à la spectroscopie RPE est une technique puissante pour sonder la dynamique structurale des protéines. Elle implique la liaison de nitroxydes sur des cystéines. Il est possible d’analyser la mobilité des sondes pour obtenir des informations sur leur environnement local. Par l’utilisation de techniques de RPE avancées, des mesures de distances entre deux sondes sont possibles. Des mutants portant une ou deux cystéines ont été conçus. La dynamique des mutants marqués a été étudiée in vitro par RPE. Par RPE impulsionnelle, des distances ont été mesurées pour l’ACCO en présence de différentes combinaisons de cofacteurs. Les distances expérimentales ont été comparées à celles prédites à partir des structures cristallographiques et du modèle structural et aussi à celles obtenues par des calculs de dynamique moléculaire. Pour cibler d’autres positions sur l’ACCO, l’introduction d’un acide aminé non naturel a été réalisée avec succès permettant d’obtenir de premières données structurales. Des données structurales préliminaires par RPE in cell sont également présentées / ACC Oxidase is a nonheme iron(II) containing enzyme involved in the biosynthesis of ethylene in plants. ACCO reaction mechanism and the role of the various cofactors are not well understood and structural and dynamic data are still required. A crystallographic structure has been reported showing the C-terminal part (C-term) away from the active site. This is not the active conformation as it has been shown that the C-term is essential. Later, a structural model has been proposed in which the C-term is folded towards the active site. Different conformations can be hypothesized. A technique well suited to monitor protein dynamics is site-directed spin labeling followed by EPR spectroscopy. It relies on the insertion of a nitroxide derivative on cysteines. Using this approach, it is possible to analyze the mobility of the label in order to obtain information on its local environment. Moreover using advanced EPR techniques, it is possible to acquire interspin distances between two incorporated probes. Mutants bearing one or two cysteines at desirable positions were designed. The dynamics of labeled mutants were studied in vitro using continuous wave EPR. By pulsed EPR, distances were recorded for ACCO in presence of different combinations of cofactors. The experimental distances were compared to the predicted ones obtained from the crystallographic and model structures, and also to the calculated ones obtained by molecular dynamic simulations. A successful introduction of an unnatural amino acid onto the sequence of ACCO was performed, allowing to obtain earliest results. The achievement of preliminary structural data by in cell EPR are also presented

Sprint kayaking is prominent in Europe with training methods devised and adopted from Eastern bloc training systems. There is a lack of published research on sprint kayaking locally and internationally. Consequently, the aims of this research directly address establishing a relationship between kayak specific training and the Profile of Mood States (POMS); monitoring training duration and intensity and establish a link with the POMS and Rating of Perceived Exertion (RPE); to monitor the general wellness of the kayakers. Seven elite sprint kayakers (two male, five female) with the following characteristics: age 26.5 (1.4) years, training experience 8.4 (3.7) years were part of the South African national sprint kayaking squad selected to participate in this study, based on their preparation for the 2008 Beijing Olympic Games (one male athlete did not qualify but continued to train). The females trained for the 500m K1, K2 and K4 events and the male for the 1000m K1. Three training camps (TC1, TC2, TC3) were held from 12 November to 09 December 2007, 25 February to 22 March 2008 and 14 July to 04 August 2008. RPE (Borg Scale) was recorded for each session. The 65-item POMS was completed twice a week, after half a days rest (Wednesday) and after a day and half rest (Sunday). Daily training load was calculated from RPE and session time; and an energy index calculated from the POMS vigour and fatigue scores. The Wisconsin Upper Respiratory Symptom Survey recorded illness and injury. Descriptive and Inferential Statistics, Friedman’s rank test for k correlated samples, The Wilcoxon Signed Ranks Test, Spearman rank-order correlations were used to analyse the data. Statistical significance was calculated at 5% (p=0.05) and 10% (p=0.1). The results showed higher vigour scores associated with lower RPE and low training load; and high RPE associated with higher anger, confusion, depression, fatigue and total mood disturbance scores. There was a relationship between increasing POMS scores and duration of the training camps. The POMS findings could not completely explain the relationship found between RPE and duration of the training camps. The energy index was higher pre-camp and the extended rest periods during the camps. The findings for the POMS and RPE suggested that a state of overreaching might have occurred during the camps. Monitoring of the kayakers for an extended period after the training camps would have been useful to determine whether any of these individuals became over-trained. In accordance with Kentta et al (2006), regular use of the POMS may help detect under recovery, preventing staleness and unwanted rest for extended periods. Future studies will enable a retrospective view on these results. / Dissertation (MA)--University of Pretoria, 2012. / Biokinetics, Sport and Leisure Sciences / unrestricted