La sérotonine (5-HT) joue un rôle crucial dans l'étiologie des troubles mentaux comme la dépression majeure, les troubles de comportement et les troubles anxieux. Des études ont montré que des altérations précoces du système 5-HT peuvent potentiellement influencer le développement du cerveau et le fonctionnement du système fronto-limbique, engendrant des conséquences pour la régulation émotionnelle. Il existe aussi des évidences que le stress précoce peut affecter la méthylation de l'ADN résultant d'une altération de l'expression génique. Toutefois, le lien entre la méthylation de l'ADN et la réactivité comportementale à des facteurs de stress de la vie quotidienne est inconnu. La méthylation du gène transporteur 5-HT (SLC6A4) est d'un intérêt particulier, étant donné le rôle de SLC6A4 dans le développement du cerveau, les troubles mentaux et la régulation du stress. L'objectif de cette thèse est d'étudier l'association entre (1) les niveaux périphériques de méthylation de l'ADN dans le gène SLC6A4 et les réponses neurales aux stimuli émotionnels dans les circuits fronto-limbiques du cerveau, ainsi qu’entre (2) la méthylation périphérique de SLC6A4 et la réactivité comportementale au stress de la vie quotidienne. Nous explorons également l'association entre les réponses neuronales fronto-limbique à des stimuli émotionnels et la réactivité comportementale au stress de la vie quotidienne (3). À cette fin, vingt-deux personnes (11 femmes) d’âge moyen de 34,0 ans (SD : 1,5) avec différents niveaux de méthylation au gène SLC6A4 ont été recrutés à partir de deux études longitudinales. Les participants ont subi une analyse IRMf qui comprenait une tâche de traitement émotionnel. Un questionnaire en ligne sur la réactivité au stress quotidien de la vie a été réalisé pendant 5 jours consécutifs. Des analyses corrélationnelles et de régression ont été effectuées pour examiner les associations entre les variables primaires. Les résultats préliminaires de cette étude ont montré que la méthylation de l'ADN est associée à la désactivation significative du gyrus précentral et gyrus fusiforme respectivement face à des stimuli de peur et de tristesse. Aucune association significative n'a été observée entre les niveaux de méthylation et l'activation de l'amygdale. En outre, les scores obtenus aux variables de stress de la vie quotidienne tels que la détresse chronique ont été associées à la désactivation du précuneus et du cortex cingulaire postérieur face à la tristesse. Ces résultats suggèrent l'implication potentielle des processus épigénétiques dans l'activation cérébrale spécifique et la sensibilité au stress de la vie courante. / Serotonin (5-HT) plays a crucial role in mental disorders etiology such as major depression, conduct disorders and anxiety disorders. Studies have shown that early alterations in the 5-HT system can potentially influence frontal-limbic brain development and functioning, with consequences for emotional regulation. There is also evidence that early stress can affect DNA methylation resulting in an alteration in gene expression; however the link between DNA methylation and behavioural reactivity to current daily life stressors is not known. DNA methylation in the 5-HT transporter (SLC6A4) is of particular interest, given the role of SLC6A4 in brain development, mental disorders and stress regulation. The aim of the present thesis is to study the association between (1) peripheral levels of DNA methylation inthe SLC6A4 gene and the neural responses to emotional stimuli in the frontal-limbic brain circuitry (2) peripheral SLC6A4 methylation and behavioural reactivity to daily life stress. We also explore the association between frontal-limbic neural responses to emotional stimuli and behavioural reactivity to daily life stress (3). To this end, twenty-two individuals (11 females) with mean age of 34.0 years old (SD: 1.5) with various levels of SLC6A4 methylation gene were recruited from two longitudinal studies. Participants underwent an fMRI scan that included an emotional processing task. An online questionnaire on daily life stress reactivity was performed during 5 consecutive days. Correlations and regressions analyses were performed to investigate the associations among the primary variables. Results of this pilot study showed that DNA methylation is associated with the significant deactivation of the precentral gyrus and fusiform gyrus when respectively facing fearful and sad stimuli. No significant association was observed between levels of methylation and amygdala activation. Also, obtained scores todaily life stress variables such as chronic distress were associated with the deactivation of the precuneus and posterior cingulate cortex when facing sadness. Those results suggest the potential implication of epigenetic processes in specific brain activation and daily life stress sensitivity.

Les informations sensorielles sont traitées dans le cortex par des réseaux de neurones co-activés qui forment des assemblées neuronales fonctionnelles. Le traitement visuel dans le cortex est régit par différents aspects des caractéristiques neuronales tels que l’aspect anatomique, électrophysiologique et moléculaire. Au sein du cortex visuel primaire, les neurones sont sélectifs à divers attributs des stimuli tels que l’orientation, la direction, le mouvement et la fréquence spatiale. Chacun de ces attributs conduit à une activité de décharge maximale pour une population neuronale spécifique. Les neurones du cortex visuel ont cependant la capacité de changer leur sélectivité en réponse à une exposition prolongée d’un stimulus approprié appelée apprentissage visuel ou adaptation visuelle à un stimulus non préférentiel. De ce fait, l’objectif principal de cette thèse est d’investiguer les mécanismes neuronaux qui régissent le traitement visuel durant une plasticité induite par adaptation chez des animaux adultes. Ces mécanismes sont traités sous différents aspects : la connectivité neuronale, la sélectivité neuronale, les propriétés électrophysiologiques des neurones et les effets des drogues (sérotonine et fluoxétine). Le modèle testé se base sur les colonnes d’orientation du cortex visuel primaire. La présente thèse est subdivisée en quatre principaux chapitres. Le premier chapitre (A) traite de la réorganisation du cortex visuel primaire suite à une plasticité induite par adaptation visuelle. Le second chapitre (B) examine la connectivité neuronale fonctionnelle en se basant sur des corrélations croisées entre paires neuronales ainsi que sur des corrélations d’activités de populations neuronales. Le troisième chapitre (C) met en liaison les aspects cités précédemment (les effets de l’adaptation visuelle et la connectivité fonctionnelle) aux propriétés électrophysiologiques des neurones (deux classes de neurones sont traitées : les neurones à décharge régulière et les neurones à décharge rapide ou burst). Enfin, le dernier chapitre (D) a pour objectif l’étude de l’effet du couplage de l’adaptation visuelle à l’administration de certaines drogues, notamment la sérotonine et la fluoxétine (inhibiteur sélectif de recapture de la sérotonine). Méthodes En utilisant des enregistrements extracellulaires d’activités neuronales dans le cortex visuel primaire (V1) combinés à un processus d’imagerie cérébrale optique intrinsèque, nous enregistrons l’activité de décharge de populations neuronales et nous examinons l’activité de neurones individuels extraite des signaux multi-unitaires. L’analyse de l’activité cérébrale se base sur différents algorithmes : la distinction des propriétés électrophysiologiques des neurones se fait par calcul de l’intervalle de temps entre la vallée et le pic maximal du potentiel d’action (largeur du potentiel d’action), la sélectivité des neurones est basée sur leur taux de décharge à différents stimuli, et la connectivité fonctionnelle utilise des calculs de corrélations croisées. L’utilisation des drogues se fait par administration locale sur la surface du cortex (après une craniotomie et une durotomie). Résultats et conclusions Dans le premier chapitre, nous démontrons la capacité des neurones à modifier leur sélectivité après une période d’adaptation visuelle à un stimulus particulier, ces changements aboutissent à une réorganisation des cartes corticales suivant un patron spécifique. Nous attribuons ce résultat à la flexibilité de groupes fonctionnels de neurones qui étaient longtemps considérés comme des unités anatomiques rigides. En effet, nous observons une restructuration extensive des domaines d’orientation dans le but de remodeler les colonnes d’orientation où chaque stimulus est représenté de façon égale. Ceci est d’autant plus confirmé dans le second chapitre où dans ce cas, les cartes de connectivité fonctionnelle sont investiguées. En accord avec les résultats énumérés précédemment, les cartes de connectivité montrent également une restructuration massive mais de façon intéressante, les neurones utilisent une stratégie de sommation afin de stabiliser leurs poids de connectivité totaux. Ces dynamiques de connectivité sont examinées dans le troisième chapitre en relation avec les propriétés électrophysiologiques des neurones. En effet, deux modes de décharge neuronale permettent la distinction entre deux classes neuronales. Leurs dynamiques de corrélations distinctes suggèrent que ces deux classes jouent des rôles clés différents dans l’encodage et l’intégration des stimuli visuels au sein d’une population neuronale. Enfin, dans le dernier chapitre, l’adaptation visuelle est combinée avec l’administration de certaines substances, notamment la sérotonine (neurotransmetteur) et la fluoxétine (inhibiteur sélectif de recapture de la sérotonine). Ces deux substances produisent un effet similaire en facilitant l’acquisition des stimuli imposés par adaptation. Lorsqu’un stimulus non optimal est présenté en présence de l’une des deux substances, nous observons une augmentation du taux de décharge des neurones en présentant ce stimulus. Nous présentons un modèle neuronal basé sur cette recherche afin d’expliquer les fluctuations du taux de décharge neuronale en présence ou en absence des drogues. Cette thèse présente de nouvelles perspectives quant à la compréhension de l’adaptation des neurones du cortex visuel primaire adulte dans le but de changer leur sélectivité dans un environnement d’apprentissage. Nous montrons qu’il y a un parfait équilibre entre leurs habiletés plastiques et leur dynamique d’homéostasie. / Sensory informations are computed in the cortex by networks of co-activated neurons forming functional ensembles. Visual processing in the cortex underlies several aspects of neuronal characteristics such as anatomical, electrophysiological and molecular. In the primary visual cortex, neurons display selectivity for stimulus features such as orientation, motion direction and spatial frequency. Each stimulus property elicits a maximal firing rate of specific neuronal populations. Visual neurons display transient modifications of their response properties following prolonged exposure to an appropriate stimulus using visual learning or visual adaptation to a non-preferred stimulus. The main objective of this thesis is to investigate the neuronal mechanisms underlying the visual processing during adaptation-induced plasticity in adult animals. These mechanisms are examined through different aspects: the neuronal connectivity, the neuronal selectivity, the electrical properties of neurons, and the effects of drugs (serotonin and fluoxetine). The tested model is the orientation columns of the primary visual cortex. The present thesis is divided into four main chapters. The first chapter (A) focuses on the cortical reorganization following visual adaptation. The second chapter (B) examines the neuronal connectivity using pair-wise correlations and populational correlations of neuronal activities. The third chapter (C) further relate the previous aspects, i.e. the adaptation effects and the functional connectivity to the properties of neurons (two classes: regular-spiking and fast-spiking neurons). Finally, the fourth chapter (D) investigates the coupling of visual adaptation with the local administration of drugs (serotonin and fluoxetine). Methodology Using in vivo extracellular recordings of the neural activity in the primary visual cortex (V1) combined with intrinsic optical brain imaging, we record the spiking activity of neuronal populations and examine, from the multi-unit activity, the activity of individual neurons. The analysis of brain activity uses different algorithms: the electrophysiological distinctions between neurons are based on the trough-to-peak time of each spike (spike-width), the selectivity of neurons is based on the firing rate at different stimuli, and the functional connectivity uses a crosscorrelation computation. The usage of drugs is performed locally on the visual cortex (after craniotomy and removing of the dura). Results and conclusions In the first chapter, we demonstrate the ability of neurons to modify their selectivity to the presented stimuli following visual adaptation, exhibiting a well-organized reprogramming of the orientation columns; we attribute this result to a flexibility of functional units rather than rigid anatomical structures. Indeed, we observe an extensive restructuring of the complete orientation domain in order to refine the columnar organization where every stimulus is equally represented. This is further confirmed in the second chapter where in this case, the connectivity maps are investigated. In concordance with the previous results, the connectivity maps also exhibit restructuring but interestingly, neurons use a summative strategy to stabilize their total connectivity weights. These connectivity dynamics are examined in the third chapter in relation to electrophysiological properties of neurons. Indeed, two differently firing modes dissociate between two classes of neurons. Their distinct correlation dynamics point to the fact that they play different key roles in stimulus encoding within a neuronal population. Finally, in the last chapter, visual adaptation is coupled with the administration of serotonin and fluoxetine. Both drugs produce similar effects by facilitating the acquisition of the imposed stimulus. The non-preferred stimulus when adapted with the presence of the drug results in an increased firing rate of neurons at this particular stimulus. We present a neuronal model based on our findings to explain the fluctuations of firing with and without the drug. This thesis provides new insights into how visual neurons adapt to change their selectivity in the interplay between their plastic ability and their homeostatic dynamic.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

En plus de sa fonction de neurotransmetteur, la sérotonine (5-HT) jouerait un rôle clé dans le système cardio-vasculaire, via ses effets vasoactif, prolifératif et trophique. Nous avons étudié son implication dans les valvulopathies cardiaques, la coronaropathie, et le remodelage vasculaire. La surproduction et l’absence d’inactivation de 5-HT sont des mécanismes possibles des valvulopathies associées au syndrome carcinoïde et à la prise d’anorexigènes. Nous avons démontré que l’inactivation du gène du transporteur de 5-HT (5-HTT, responsable de la capture cellulaire de 5-HT), conduit à la fibrose cardiaque et valvulaire chez la souris. Bien que le récepteur 5-HT1B médie les effets trophiques de 5-HT sur les myofibroblastes cardiaques humains, la contribution de ce récepteur à la valvulopathie a été écartée car les souris doublement déficientes en 5-HTT et 5-HT1B présentaient les mêmes altérations cardiaques que celles déficientes en 5-HTT. Le 5-HTT (ainsi que le récepteur 5-HT2A) serait aussi impliqué dans les effets de 5-HT observés chez les patients coronariens. Nous avons évalué l’association éventuelle reliant les polymorphismes fonctionnels du 5-HTT (L/S) et du 5-HT2A (C/T) au risque et la gravité de la coronaropathie sur un total de 830 sujets d’âge différent. L’allèle L était un facteur de risque indépendant de coronaropathie chez les sujets jeunes (mais pas chez les sujets âgés). Le polymorphisme du 5-HT2A n’était pas associé avec la survenue de coronaropathie, et aucun des génotypes n’était associé à la resténose clinique. Les occlusions tardives des greffons coronaires après chirurgie de pontage ont été attribuées au remodelage vasculaire par hyperplasie néointimale des cellules musculaires lisses (CML) sous l’effet de divers facteurs de croissance dont 5-HT. Nous avons observé que le remodelage vasculaire en organoculture, ainsi que la prolifération et la migration des CML vasculaires en réponse au sérum de veau foetal étaient nettement plus élevées pour les greffons de veine saphène que pour l’artère radiale et l'artère mammaire interne. Ces différences pourraient expliquer la variabilité de perméabilité angiographique des greffons coronaires à long terme. Ces trois études confirment le rôle important de la sérotonine dans les pathologies cardiovasculaires / Serotonin (5-HT) may play a key role in the cardiovascular system, with vasoactive, proliferative and trophic properties. We aimed at studying its implication in cardiac valve disease, coronary artery disease, and vascular remodelling of coronary grafts. 5-HT overproduction and reduced inactivation are possible mechanisms responsible for cardiac valvular disease in patients with carcinoid tumors and those treated with appetite suppressants, respectively. We found that deficiency of the 5-HT transporter (5-HTT, which is responsible for 5-HT uptake) gene leads to cardiac fibrosis and valvulopathy in mice. Although 5-HT1B receptors mediated the 5-HT-induced collagen secretion by human cardiac myofibroblasts, the contribution of this receptor type to valvulopathy was ruled out because double-KO mice deficient in both 5-HTT and 5-HT1B receptors showed the same cardiac alterations as 5-HTT-KO mice. 5-HTT may also mediate the effects of the high blood serotonin levels seen in patients with premature coronary artery disease (CAD), along with 5-HT2A receptor. We prospectively evaluated associations linking functional polymorphisms of 5-HTT (L/S) and 5-HT2A (C/T) to the risk and severity of premature versus late-onset CAD in a total of 830 individuals. The L allele was an independent risk factor for premature CAD (but not late-onset CAD). 5-HT2A genotypes were not associated with CAD and neither 5-HTT nor 5-HT2A genotypes were associated with clinical restenosis. Late graft occlusions after coronary artery bypass grafting have been ascribed to vascular remodelling with neointimal hyperplasia of smooth muscle cells (SMC), which is mediated by various growth factors including 5-HT. We found that the ex vivo vascular-wall remodelling in organ cultures, as well as SMC proliferation and migration in response to fetal calf serum were significantly higher for saphenous vein rings than for radial artery and internal thoracic artery rings. These differences might shed light on reported dissimilar angiographic patency rates of these coronary grafts

Les études sur modèle animal sont essentielles pour l'élaboration de nouveaux antidépresseurs, à la compréhension de leurs mécanismes d'action et aux mécanismes de la physiopathologie de la dépression. Des facteurs génétiques jouent un rôle important dans l'étiologie des troubles de l'humeur. Notre équipe de recherche a créé un modèle basé sur la reproduction dirigée de souris présentant un trait comportemental relatif à la symptomatologie dépressive en se basant sur les performances obtenues dans l'épreuve de suspension par la queue, obtenant ainsi une lignée résignée et une lignée non résignée . Au cours de ces travaux, nous avons validé un protocole de résignation apprise (RA) chez la souris CD1. Cette épreuve consiste en i) une période de conditionnement, ii) une période de test. Il a été montré que 4 périodes de conditionnement avec des chocs à 0,3 mA sont nécessaires à l'obtention d'une résignation. Un second protocole de RA, sur 3 semaines, a également été validé chez la souris CD1 consistant en 4 périodes de conditionnement suivies de tests à J5, J10, J15 et J20. L'introduction d'un « rappel » de choc en J8 a permis d'entretenir la résignation jusqu'en J20 contrairement à un protocole identique sans rappel. Ce nouveau protocole s'avère être particulièrement adapté pour étudier les effets de traitements chroniques. Deux autres modèles animaux de dépression (issues de 8 souches de souris différentes) ont été également crées dans le laboratoire sur la base de performances dans l'épreuve de suspension par la queue (TST) ou l'épreuve de nage forcée (FST). Les résultats révèlent que les modèles issus de 8 souches criblés au TST ou au FST présentent des caractéristiques neurochimiques différentes, qui en plus d'un comportement différent dans l'épreuve de résignation apprise, confirment que ceux sont bien deux modèles animaux distincts / Studies on animal models are essential to the development of new antidepressants, to the understanding of their mechanisms of action and to the mechanisms underlying depressive disorders. Genetics factors play an important role in the etiology of mood disorders. Our research team elaborated a model based on the selective breeding of mice displaying a behavioural trait of the depression symptomatology. On the basis of the behaviour in the TST, two strains of mice with “helpless” or “non helpless” phenotype were developed. During this work, we validated a learned helplessness protocol in CD1 mice. This paradigm consists in i) a conditioning period. ii) an escape test. It has been found that 4 conditioning periods with 0.3 mA shocks were necessary to induce helplessness. A second learned helplessness protocol was developed in CD1 mice, consisting in 4 conditioning periods followed by escape test in D5, D10, D15 and D20. A “shock reminder” at D8 allowed to maintain helplessness up to D20. This new protocol is particularly appropriate for investigating effects of chronic treatments. The selective breeding lines (from 8 strains of mice) were based on their performance in either the tail suspension test or the forced swimmed test. The results confirmed that lines models (bred from 8 lines) have not only behavioural differences but also display different biochemical characteristics

Les effets négatifs des produits pharmaceutiques (PPs) sur les écosystèmes aquatiques est une préoccupation de plus en plus sensible. Nous avons analysé les effets du 17α-éthinylestradiol (EE2), composant des pilules contraceptives, et de la fluoxétine (FLX), l'antidépresseur le plus vendu au monde, sur deux poissons. Le pejerrey (Odontesthes bonariensis) vit dans des lagunes qui sont des réservoirs d'eaux usées, où la présence d'EE2 est détectée. En utilisant l'expression des gènes cyp19a1b (aromatase cérébrale) et cyp19a1a (aromatase gonadique) comment marqueurs biologiques nous avons constaté que l'exposition à EE2 n'affectait pas l'expression du gène cyp19a1b. Cependant, augmente significativement l'expression du cyp19a1a, liée à la différenciation ovarienne, et diminue l'expression de hsd11b2, liée a la différenciation testiculaire, chez les larves et mâles juvéniles. Aussi, produit une déviation des ratios male/femelles en faveur des femelles chez les larves et l'apparition de caractéristiques typique du développement ovarien dans les testicules de mâles juvéniles. Chez le poisson zèbre (Danio rerio) nous avons évalué le rôle de la sérotonine (5-HT) comme modulateur de la prolifération; et l'effet de la FLX, inhibiteur sélectif de sa recapture. Tout d'abord, nous avons montré que les neurones sérotoninergiques de l'hypothalamus sont générés à partir de cellules gliales radiaires présente dans cette région. Ensuite, nous avons constaté une réduction significative du nombre de cellules en prolifération dans le noyau du recessus lateral (NRL) et posterior (NRP) de l'hypothalamus, après de l'inhibition de la synthèse de 5-HT ; et dans le NRL, après d'exposition a FLX. / Over the last 10-15 years risks of pharmaceuticals and personal care products (PPCPs) in the environment have acquired significant relevance. In the present work we studied the effects of 17α-ethinylestradiol (EE2), component of contraceptive pills, and fluoxetine (FLX), the world’s most widely prescribed antidepressant, in fishes. Pejerrey (Odontesthes bonariensis) a south American teleost fish that inhabit aquatic ecosystems where EE2 has been reported. Exposure to EE2 did not alter the expression of cyp19a1b (brain aromatase). In contrast, expression of cyp19a1a (gonadal aromatase), involved in ovarian differentiation, was up-regulated; while expression of hsd11b2, associated with testicular differentiation, was down-regulated in larvae or juvenile males. Also, EE2 was able to shift sex ratios toward the female in larvae and alter the gonadal morphology of testicles of juvenile males. In zebrafish, a model organism considered as a useful tool in EDs screening, we investigated the potential role of serotonin (5-HT) as modulators of brain cell proliferation; in particular, we also analyzed the effects of FLX, a selective 5-HT reuptake inhibitor. We showed that 5-HT neurons of the hypothalamus originate from proliferative radial glial cells presents in this area. Treatment 5-HT synthesis inhibitor and exposure to environmentally relevant concentrations of FLX caused a significant decrease in the number of proliferating cells in the hypothalamus, resulting in a further decline in the number of own 5-HT neurons. These results provide evidence for the detrimental effect in teleost fish induced by the exposure to two pharmaceuticals considered as endocrine disruptors.

La transmission des messages douloureux depuis les nocicepteurs périphériques jusqu’aux structures supraspinales est sous le contrôle de systèmes modulateurs, parmi lesquels figurent les voies bulbo-spinales sérotoninergiques. Cependant leur rôle n’est pas complètement élucidé puisque selon le type de récepteur sérotoninergique mis en jeu, elles pourraient soit réduire la sensation douloureuse soit au contraire l’exacerber. De plus, le contrôle exercé par la sérotonine (5 HT) pourrait dépendre du type de douleur, aiguë, inflammatoire ou neuropathique chronique. En réalité, ces ambiguïtés tiennent au fait que les études réalisées jusqu’à présent ont surtout impliqué des approches pharmacologiques souvent peu fiables. Ce constat m’a conduit à mettre en œuvre une nouvelle approche expérimentale pour tenter de cerner le véritable rôle modulateur des voies sérotoninergiques bulbo-spinales sur différents types de douleur dans des conditions physiologiques normales ou physiopathologiques chez le rat. A cette fin, j’ai réalisé ce travail de thèse en trois étapes. La première étape a consisté à préciser les caractéristiques anatomiques des voies sérotoninergiques bulbo-spinales visualisées par un marquage antérograde (PHA-L) couplé à l’immunomarquage du transporteur de la sérotonine (SERT). L’étude différentielle des deux sous-structures de la région bulbaire B3 : le noyau raphé magnus (RMg) et le noyau paragigantocellulaire latéral (LPGi) m’a permis de montrer que les neurones sérotoninergiques qu’elles contiennent se projettent respectivement dans les couches profondes (VI-VI) et superficielles (I-II) de la corne dorsale, à tous les étages de la moelle épinière. Afin de dépléter sélectivement la 5-HT dans la corne dorsale, j’ai, dans une deuxième étape, injecté bilatéralement dans la région B3 un lentivirus recombinant LV-shTPH2 pour y éteindre l’expression de la TPH2, l’enzyme limitante de la synthèse de 5-HT. Les contrôles immunohistochimiques ont montré l’inhibition bilatérale de l’expression de la TPH2 dans le RMg et le LPGi, et la diminution de l’immunomarquage de la 5-HT sélectivement dans la corne dorsale, l’expression inchangée du transporteur SERT confirmant le maintien de l’intégrité des fibres sérotoninergiques chez les rats LV-shTPH2. L’évaluation de la sensibilité des animaux ainsi déplétés en 5-HT à différents tests validés de nociception aiguë n’a pas révélé de modifications significatives par rapport aux témoins. Mais dans des conditions de forte stimulation nociceptive thermique (50°C) ou chimique (carragénine), l’augmentation de l’immunomarquage de c-Fos dans la corne dorsale chez les rats LV-shTPH2 montre que la déplétion de 5-HT facilite la sensibilisation synaptique. Des différences encore plus nettes entre les rats LV-shTPH2 et les témoins sont surtout apparues en cas de douleur inflammatoire (formaline) ou neuropathique (ligature du nerf sciatique). Les modifications induites par la déplétion de 5-HT n’étaient cependant pas univoques puisqu’une hypoalgésie a été observée dans le cas d’une douleur inflammatoire et, qu’au contraire, l’hyperalgésie associée à la douleur neuropathique était exacerbée chez les rats LV-shTPH2. Ces modulations opposées laissant à penser l’implication de projections et/ou de récepteurs sérotoninergiques distincts, nous avons réalisé, dans une troisième étape, une étude pharmacologique qui a permis de montrer que l’effet pro-hyperalgésique observé chez les rats neuropathiques déplétés en 5-HT était probablement lié à un déficit d’activation de récepteurs 5 HT7. Notre étude démontre la réalité du contrôle physiologique du relai spinal des voies nociceptives par la 5-HT, via l’implication de projections bulbo-spinales et de récepteurs sérotoninergiques dont l’identification pourrait déboucher sur de nouvelles perspectives thérapeutiques. / The transmission of pain signals from peripheral nociceptors to supraspinal structures is under the control of modulatory systems, which include bulbo-spinal serotoninergic pathways. However, their role is not yet fully understood, as they may as well reduce or exacerbate pain as a function of 5-HT receptor types involved. Furthermore, their modulatory role might also differ depending on whether pain is acute, or chronic, with inflammatory or neuropathic origin. In fact, this ambiguous knowledge results from data essentially obtained with rather unreliable pharmacological approaches. This led me to set up an innovative experimental approach for a better assessment of the real implication of bulbo-spinal serotoninergic projections in pain control mechanisms under validated physiological and pathophysiological conditions in the rat. To this goal, I performed my PhD thesis work in three steps. The first step consisted of a precise anatomical description of bulbo-spinal serotoninergic projections identified by anterograde labeling (with PHA-L) and immunolabeling of the 5-HT transporter (SERT). The differential labeling of the two sub-areas within the B3 bulbar region : the nucleus raphé magnus (RMg) and the nucleus paragigantocellularis lateralis (LPGi) allowed the demonstration that their respective 5-HT neuron groups project separately into the deep (V-VI) and superficial (I-II) laminae of the dorsal horn, at all levels of the spinal cord. For the second step, aimed at depleting 5-HT selectively within the dorsal horn, I injected bilaterally into the B3 area a recombinant lentivirus, LV-shTPH2, designed to suppress the expression of TPH2, the rate limiting enzyme for 5-HT synthesis. Immunohistochemical controls showed that the resulting bilateral inhibition of TPH2 expression in both the RMg and the LPGi was associated with 5-HT depletion but no change in SERT (as expected of unaltered 5-HT fibers) in the dorsal horn. Using various behavioral tests, I could not detect any change in acute pain sensitivity in 5-HT-depleted rats. In contrast, the increased c-Fos immunohistochemical labeling within the dorsal horn after strong thermal (50°C) or chemical (carrageenan) noxious stimulation showed that 5-HT depletion promotes synaptic sensitization. Even more striking differences between LV-shTPH2 injected rats and paired controls were observed in case of inflammatory (formalin) or neuropathic (sciatic nerve ligation) pain. However, 5-HT depletion-induced changes differed under both conditions since hypoalgesia was noted in case of inflammatory pain, whereas neuropathic pain-evoked hyperalgesia was enhanced in 5-HT depleted, LV-shTPH2-injected rats. Because such opposite modulations might have been underlain by distinct serotoninergic pathways (i.e. from the RMg versus the LPGi for instance) and/or distinct 5-HT receptors, we decided, within the time remaining for achieving my PhD work, to perform a third step, focused on the 5-HT7 receptor type. Using pharmacological approaches, we could obtain data showing that exacerbated hyperalgesia in 5-HT-depleted neuropathic rats resulted from loss of tonic 5-HT7 receptor activation by endogenous 5-HT. Altogether, our data clearly demonstrate that bulbospinal serotoninergic projections are involved in the physiological control of pain signaling at spinal cord level. Further identification of underlying neuronal pathways and receptors might open novel therapeutic perspectives.

Les inhibiteurs sélectifs de recapture de la sérotonine (5-HT) (ISRS) bloquent directement le transporteur de la 5-HT (SERT) et stimulent indirectement de multiples auto- et hétérorécepteurs5-HT par l’augmentation de la concentration extracellulaire de 5-HT dans la fente synaptique. Cependant, le rôle des différents récepteurs ainsi que leur interaction dans les effets thérapeutiques des ISRS restent mal connus. Nous avons tenté de les identifier à l'aide de tests neurochimiques (microdialyse intracérébrale in vivo) et électrophysiologiques en utilisant une approche pharmacologique (utilisation de escitalopram, de ligands des récepteurs 5-HT1A/2A) et génétique (utilisation de souris knock-out [KO] SERT, 5-HT1A ou 5-HT2A). Les études neurochimiques et électrophysiologiques révèlent que les auto-(1A) et hétéro-(2A) récepteursagissent de concert pour maintenir une influence inhibitrice sur le système sérotoninergique, en particulier, en réponse au escitalopram : l'absence d'un récepteur est compensée par une régulation de l'autre. Enfin, les souris KO SERT constituent un nouveau modèle pour tester le mécanisme du escitalopram dans l’augmentation des concentrations de noradrénaline (NA). / Selective serotonin (5-HT) reuptake inhibitors (SSRIs) directly block the 5-HT transporter(SERT) and indirectly stimulate multiple 5-HT (auto- and hetero-) receptors by enhancing itsextracellular levels in the synaptic cleft, although the role of particular receptors as well asinteraction(s) among different receptors in the therapeutic effects of SSRIs is not fullyunderstood. We tried to highlight it using neurochemical (in vivo intracerebral microdialysis) andelectrophysiological tests with a pharmacological (using escitalopram, 5-HT1A/2A receptorsagonists and antagonists) and genetic (using SERT, 5-HT1A ou 5-HT2A receptor knock-out [KO]mice) approaches. Neurochemical and electrophysiological experiments indicated that 5-HT1Aauto- and 5-HT2A hetero-receptors act in concert to maintain an inhibitory influence on theserotonergic system, particularly in response of escitalopram to increased levels of endogenous 5-HT: the absence of one receptor being compensated by an up-regulation of the other. Finally,SERT knockout mice might be a new model to test the mechanism of escitalopram for anincrease of norephedrine (NE) level.

Les erreurs innées du métabolisme (EIM) constituent un large panel de désordres métaboliques héréditaires. Parmi les EIM, les anomalies de la neurotransmission peuvent affecter, entre autres, la synthèse ou le transport des neurotransmetteurs, notamment les amines biogènes (dopamine et sérotonine) et les folates. La reconnaissance de ces affections est d’une importance capitale pour le diagnostic et le traitement éventuel. L’analyse chimique du liquide céphalo-rachidien (LCR) est incontournable pour le diagnostic de ces pathologies. Or, les méthodes actuelles de dosage ne sont pas simples. Longues et fastidieuses, elles ont été, pendant longtemps, réservées aux laboratoires spécialisés. L’objectif de ce travail était de développer des méthodes simples et rapides de diagnostic des troubles de la neurotransmission et d’établir les valeurs normales fréquentes dans la population française. Le travail réalisé a permis, dans un premier temps, de développer une méthode de dosage directe, en une seule étape, de la tetrahydrobioptérine (BH4), cofacteur des hydroxylases intervenant dans la synthèse des amines biogènes, et des ptérines impliquées dans le cycle de synthèse et de dégradation de ce cofacteur, dans le LCR. Auparavant, le dosage de ces substances nécessitait au moins deux analyses chromatographiques précédées chacune d’une étape propre de préparation de l’échantillon. Par la suite, nous avons développé une méthode de diagnostic rapide, en moins de 10 minutes, par UHPLC (chromatographie liquide à ultra haute performance), couplée à une détection séquentielle par coulométrie et par fluorescence, des troubles dopaminergique et sérotoninergique. Cette méthode permet de doser simultanément, en une seule étape, tous les métabolites de la dopamine, de la sérotonine et de la noradrénaline, ainsi que les ptérines d’intérêt diagnostic, principalement la dihydroneoptérine (NH2) et la dihydrobioptérine (BH2). L’ensemble de ces explorations nécessitait, auparavant, la mise en œuvre d’au moins trois méthodes de dosage par HPLC (chromatographie liquide à haute performance), précédées chacune d’une étape propre de préparation de l’échantillon. Pour compléter l’exploration du métabolisme de la BH4 et du suivi thérapeutique des troubles de la neurotransmission, nous avons également proposé une méthode de dosage rapide, en une seule étape, par UHPLC, de tous les métabolites et de toutes les ptérines, incluant la BH4. Enfin, une méthode rapide de dosage (moins de 2 minutes), par UHPLC, du 5-méthyltetrahydrofolate dans le LCR a été développée, afin de compléter le diagnostic biologique de l’ensemble des troubles neurologiques visés. L’application des outils ainsi développés à plus de 1400 patients nous a permis d’établir des valeurs normales fréquentes dans la population française ainsi que de poser le diagnostic de quelques déficits enzymatiques. / Inborn errors of metabolism (IEM) consist of a wide range of hereditary metabolic disorders. Among IEM, neurotransmission anomaly can affect the synthesis or the transport of neurotransmitters, notably biogenic amines (dopamine and serotonin) and folates. Early diagnosis of such affections is of utmost importance especially as some of them can be treated effectively. Chemical analysis of cerebrospinal fluid (CSF) is essential for the diagnosis of neurotransmitter disorders; however, current quantitative methods are tedious and time consuming. For a long time the chemical diagnosis of neurotransmitter disorders has been available only in specialized laboratories. The purpose of this work was to develop simple and fast diagnosis methods of neurotransmitter disorders as well as to establish the reference values in French population. For this purpose, in a first step, we developed a single step direct method of simultaneous quantification of tetrahydrobiopterin (BH4), which is the main cofactor of the hydroxylases involved in biogenic amines syntheses, and the relevant reduced and oxidized forms of pterins involved in the cycle of synthesis – regeneration of BH4. Formerly, the quantification of those compounds required at least two chromatographic methods with two specific sample preparation procedures. Thereafter we developed a method of fast diagnosis in less than 10 minutes of dopaminergic and serotoninergic disorders using UHPLC (ultra high performance liquid chromatography) hyphenated to a sequential coulometric and fluorimetric detection. With only a simple filtration step as sample preparation procedure, this method enables the simultaneous quantification of all dopamine, serotonin and noradrenaline metabolites as well as dihydroneopterin (NH2) and dihydrobiopterin (BH2), the relevant pterin forms for the complete diagnosis. Formerly, at least three HPLC (high performance liquid chromatography) quantification methods preceeded by three tedious specific sample preparation procedures were required for such a diagnosis. To complete the investigation of BH4 metabolism and the follow up of neurotransmission disorders, we also developed a fast UHPLC method of simultaneous quantification of all the cited metabolites and pterins including BH4. In order to complete the rapid diagnosis of all targeted neurological disorders, we finally developed an UHPLC method of 5-methyltetrahydrofolate quantification in CSF. The application of these analytical tools in more than 1400 CSF samples, collected from patients followed in some Neurology centers located in several French areas covering nearly the entirety of the territory, allowed us to establish the reference values in French population as well as to diagnose several cases of enzymatic deficits.

La sclérose amyotrophique latérale (SLA) est une maladie neurodégénérative due à la dégénérescence des motoneurones supérieurs dans le cortex moteur et des motoneurones inférieurs situés dans la moelle épinière et le tronc cérébral. La perte des neurones moteurs provoque l’atrophie et la paralysie progressive des muscles. Notre laboratoire a démontré en 2013 que la dégénérescence associée à la SLA n’était pas limitée aux motoneurones mais aussi aux neurones sérotoninergiques chez les patients et les modèles animaux de SLA. L’objectif de ma thèse a été de caractériser le rôle des neurones sérotoninergiques dans la SLA. On a observé une augmentation de l’expression du gène codant pour le récepteur 2B de la sérotonine (5-HT2B) chez les modèles murins de SLA. L’analyse du rôle du récepteur 5-HT2B dans le cas de SLA a montré que ce dernier est un modulateur de la maladie. La perte du récepteur 5-HT2B accélère la progression de la maladie et modifie la régulation de la réponse inflammatoire. En plus, nos travaux ont révélé que la perte des neurones sérotoninergiques est à l’origine du développement de la spasticité, un symptôme douloureux chez les patients SLA. Ces résultats ouvrent la voie à des approches thérapeutiques qui ciblent cette population neuronale affectée lors de la maladie pour traiter la spasticité et la neuroinflammation au cours de la maladie. / Amyotrophic lateral sclerosis (SLA) is a neurodegenerative disease characterize by the loss of upper motor neurons in the motor cortex and lower motor neurons in the brainstem and spinal cord. The loss of motor neurons leads to muscle atrophy and progressive paralysis. In 2013 our laboratory identified a new neuronal population affected in ALS. They observed the degeneration of serotoninergic neurons in ALS patients and animal models. For this, the aim of my PhD is to identify the role of serotoninergic neurons in case of ALS. We observed an upregulation of serotonin receptor 5-HT2B in ALS mice models. The investigation of the role of 5-HT2B receptor in case of ALS showed its role as a disease modulator. The loss of 5-HT2B receptor accelerated disease progression and modulated neuroinflammatory response. Moreover, our results showed that the loss of serotoninergic neurons is responsible of the development of spasticity, a painful symptom observed in ALS patients. All these opened the way for therapeutic strategies targeting spasticity and neuroinflammation in case of ALS.