No Brasil, assim como em outros países tropicais, a criação de bovinos é feita de maneira extensiva e, portanto é suscetível às intempéries climáticas. Esse tipo de criação pode levar ao estresse térmico, mesmo em animais zebuínos. Sob condições de estresse térmico é possível a ocorrência de degeneração testicular, e por isso, há a procura por animais tolerantes ao calor. Desta maneira, este trabalho objetivou a avaliação da tolerância ao calor de touros da raça Brahman utilizando o teste de tolerância ao calor, e também a análise da qualidade seminal relacionada à disponibilidade de sombra nos pastos. Para tal, foram utilizados 10 touros da raça Brahman com idades entre 24 e 30 meses. Duas semanas antes do início das análises, três amostras de sêmen foram colhidas de cada animal para o nivelamento biológico do sêmen, e então os touros foram separados em dois grupos: 5 touros foram alocados em pasto com disponibilidade de sombra enquanto 5 touros foram alocados em pasto sem qualquer tipo de sombra. O teste de tolerância ao calor foi realizado em três dias consecutivos típicos de verão, e as colheitas de sêmen foram realizadas em 14 dias durante 2 meses, totalizando 4 colheitas. Anteriormente a todas as colheitas foram avaliadas a consistência testicular e o perímetro escrotal. As características seminais avaliadas foram volume, aspecto, turbilhonamento, motilidade, vigor e concentração e morfologia espermáticas. Os dados obtidos foram analisados com o pacote estatístico Statistical Analysis System (SAS Institute Inc., 2004). Não houve diferenças estatísticas entre os dois grupos de animais. O resultado do teste de tolerância ao calor mostrou que os animais testados são tolerantes ao calor e apresentam boa capacidade termolítica. / In Brazil, similarly to others tropical countries, bovines are bred under environmental conditions of extensive system. This breed system type may lead to heat stress even on zebu animals. Under heat stress conditions, testicular degeneration can occur and, therefore, there is a search for animals that are heat tolerant. Therefore, the aim of this work was to evaluate the heat tolerance of Brahman bulls using the heat tolerance test and to verify the occurrence of any possible effect of shadow availability on pasture on semen quality. Ten Brahman bulls aging between 24 and 30 months were used in this work. For biological semen evaluation, three semen samples were collected from each animal two weeks before beginning. The bulls were then separated into two groups: 5 animals were allocated on pasture with shadow availability and 5 bulls were allocated on pasture without any kind of shadow. The heat tolerance test were performed in three consecutive typical summer days and the semen samples were collected each 14 days during 2 months, in a total of 4 semen samples per animal. Testicular consistence and scrotal circumference were measured just before every semen collection. The semen\'s characteristics evaluated were volume, aspect, mass movement, motility, straight movement, sperm concentration and morphological exam. Data obtained from experimental proceedings were analyzed by Statistical Analysis System program (SAS Institute Inc., 2004). No difference was observed (P>0.05) in any of the characteristics analyzed when Brahman bulls were maintained on pastures with or without shadow availability. The performance of tested animals on the heat tolerance test shows that these animals are heat tolerant and present good thermolitic ability.

Orientador: Eduardo Daruge Junior / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:52:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Miranda_GeraldoElias_M.pdf: 1300905 bytes, checksum: 727847fefeb94b489d815161f789fc98 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A utilização de técnicas de triagem como a alternate light source (ALS) é importante para encontrar evidências biológicas em uma cena de crime. O objetivo deste trabalho foi avaliar se a fluorescência do fluido biológico (sangue, sêmen, saliva e urina) depositado em diferentes superfícies sofre variação em função da idade da amostra. A mancha foi iluminada com uma ALS da marca Megamaxx¿ System e fotografada com o auxílio do Canon EOS Utility¿. A análise das imagens foi feita por meio de uma combinação dos programas Adobe Photoshop¿ e ImageJ¿. O Adobe Photoshop¿ foi utilizado para preparar as fotografias para as análises e o ImageJ¿ para registrar o valor do brilho do pixel da imagem. Os dados obtidos foram submetidos na técnica de análise de variância por meio do ajuste de um modelo linear generalizado misto com dois fatores fixos e um terceiro fator, o tempo, analisado como medidas repetidas no formato de efeito aleatório com matriz de covariância do tipo autorregressivo de primeira ordem. Efeitos significativos tiveram suas médias comparadas duas a duas por meio do teste de Tukey. Pode-se concluir que a fluorescência dos fluidos biológicos analisados variaram em função do tempo em que foram expostos. A fluorescência foi menor quando as amostras estavam úmidas e permaneceram constantes quando estavam secas até o tempo máximo analisado (60 dias), independentemente do substrato em que o fluido foi depositado. Portanto, o perito forense pode detectar fluidos biológicos no local do crime usando uma ALS mesmo após vários dias da ocorrência do crime / Abstract: The use of screening techniques, such as an alternative light source (ALS), is important for finding biological evidence at a crime scene. The objective of this study was to evaluate whether biological fluid (blood, semen, saliva, and urine) deposited on different surfaces changes as a function of the age of the sample. Stains were illuminated with a Megamaxx¿ ALS System and photographed with a Canon¿ camera. Adobe Photoshop¿ was utilized to prepare photographs for analysis, and then ImageJ¿ was used to record the brightness values of pixels in the images. Data were submitted to analysis of variance using a generalized linear mixed model with two fixed effects (surface and fluid). Time was treated as a random effect (through repeated measures) with a first-order autoregressive covariance structure. Means of significant effects were compared by the Tukey test. In all tests, a 5% level of significance was established. The fluorescence of the analyzed biological material varied depending on the age of the sample. Fluorescence was lower when the samples were moist. Fluorescence remained constant when the sample was dry, up to the maximum period analyzed (60 days), independent of the substrate on which the fluid was deposited. Therefore, the forensic expert can detect biological fluids at the crime scene using an ALS even several days after a crime has occurred / Mestrado / Odontologia Legal e Deontologia / Mestre em Biologia Buco-Dental

Seminal plasma (SP) is the microenvironment of spermatozoa whose composition reflects semen quality and constitutes an excellent source for detecting non-invasive biomarkers. This study characterizes good vs. poor quality semen using seminal extracellular vesicles coupled proteins and miRNA. Fresh boar semen samples were screened, centrifuged, and SP supernatants were collected for near-infrared spectroscopy (NIRS) analysis. EVs were extracted from SP (SP-EVs), characterized, and those of extremely poor or good sperm quality groups were subjected to proteomics and small RNA sequencing. Significant differences were set for P

Se utilizarán eyaculados procedentes de machos de la línea R (línea de conejos seleccionada por velocidad de crecimiento durante el periodo de engorde)alojados en diferentes centros de inseminación artificial. Una vez recuperados los eyaculados se procederá a su valoración y una muestra de todos ellos será crioconservada. La calidad seminal será de nuevo valorada tras el proceso de congelación. Junto con los anàlisis seminales se utilizarán los datos de crecimiento y pedigree de los machos y de todos los animales de la línea R desde su fundación para estimar por un lado los parámetros genéticos de las variables relacionadas con la producción y calidad de dosis seminales en fresco y tras un proceso de crioconservación y la correlación genética existente entre las variables seminales anteriormente citadas y la velocidad de crecimiento. A su vez se estimará mediante un modelo recursivo la relación entre las variables seminales en fresco y tras la descongelación. / The general aim of this thesis was to study the genetic determinism for some traits related to artificial insemination (AI) dose production of fresh and frozen-thawed semen, in order to explore the interest and limitation of different strategies for their genetic improvement in a paternal line of rabbits selected for growth rate during the fattening period (28-63 days). In chapter 1, genetic parameters of sperm production traits are estimated as well as the genetic relationship with daily gain (DG). The heritabilities (h2) of the semen traits were 0.13±0.05, 0.08±0.04 and 0.07±0.03 for ejaculate volume (V), sperm concentration (CN) and sperm production (PROD) per ejaculate, respectively. A favourable and moderate genetic correlation was observed between V and DG (0.36±0.34). From this chapter it may be concluded that if a seminal trait is to be included as a selection objective, a useful one could be sperm production, as it is a trait in which both volume and concentration are included. Moreover, there is currently no evidence to suggest that selection for DG in rabbits will affect sperm production adversely. The aim of chapter 2 was to explore the genetic determinism of some sperm quality traits and their genetic relation with the selection criteria of the paternal rabbit line. The heritabilities (h2) of semen quality traits commonly evaluated in a classic spermiogram were 0.18, 0.19 and 0.12 for NAR (%, percentage of sperm with intact acrosome), ANR (%, percentage of sperm abnormalities) and MOT (%, percentage of total motile sperm cells) respectively. We also estimated the h2 of some motion CASA parameters 0.09, 0.11, 0.10, 0.11, 0.11 and 0.11 for VAP (µm/s; average path velocity), VSL (µm/s; straight-line velocity), VCL (µm/s; curvilinear velocity), LIN (%, linearity index), ALH (µm; amplitude of the lateral head displacement), STR (%, straightness). Genetic correlations between DG and semen traits showed a high HPD95% (interval of highest density of 95%). However there is some consistent evidence of the negativity of the genetic correlations of DG with NAR and MOT (-0.40 and -0.53, respectively). Chapter 3 aims to determine the repeatability and heritability of sperm head characteristics: width (W, ¿m), area (A, ¿m2),length (L, ¿m) and perimeter (P, ¿m), and explore the relationships between them and with the selection objective (DG). The results obtained showed that sperm head dimensions are heritable (ranged between 0.2 and 0.29). The genetic correlations between sperm traits were always high and positive (between 0.72 and 0.90), with the exception of L-W genetic correlation, which was moderate. Regarding the genetic correlations between DG and sperm head characteristics, the resulting means ranged from -0.09 for L-DG to -0.43 for W-DG, showing consistent evidence of the negativity of the genetic correlations. The environmental and male effects that could have an influence on sperm freezability are studied in Chapter 4. Six different traits were evaluated: sperm concentration (CONC, 106spermatozoa/mL), acrosome integrity in fresh (NAR, %) and frozen-thawed semen (Nar-FT, %), sperm motility in fresh (MOT, %) and frozen-thawed semen (Mot-FT, %) and the percentage of viable sperm in frozen-thawed semen (Live-FT, %). In addition, two synthetic traits were computed: the relative reduction of acrosome integrity (Rnar, %) and relative reduction of motility (Rmot, %) after the freezing-thawing process. A multiple-trait recursive model was used to analyse the relationships between the semen traits considered. For the fixed effects studied, the season had the highest impact on post-thaw semen characteristics. Results of the analysis of recursive coefficients showed that fresh semen concentration and motility influence the future freezability of the semen. All traits studied presented moderate repeatabilities, ranging from 0.11 to 0.38. These results provide conclusive evidence that sperm freezability in rabbits could be heritable. Regarding male correlations, there were large positive male correlations between fresh traits (rm=0.77-0.57), as well as between direct frozen-thawed traits (rm=0.72-1). Male effects on fresh and direct frozen-thawed traits were generally positively correlated. This correlation was moderate to high for MOT with all frozen-thawed traits (rm=0.41-0.74) and for Mot-FT and all fresh traits (rm=0.5-0.74); these results suggest that these traits could be genetically related. The final chapter of this thesis focused on estimating the heritability of semen freezability traits and estimating the genetic correlation between frozen-thawed sperm traits and the growth rate in a paternal rabbit line. Estimated heritabilities showed that frozen-thawed semen traits are heritable (ranged between 0.08 and 0.15). In the case of Live-FT, the estimated heritability is the highest and suggests the possibility of effective selection. After the study of genetic correlations, it seems that DG was negatively correlated with sperm freezability, but due to the high HPD95% no further conclusions could be drawn. More data should be included in order to obtain better accuracy for the estimates of these genetic correlations. If the results obtained in the present study were confirmed, it would imply that selection for DG could alter sperm cell membranes or seminal plasma composition, both components related to sperm cryoresistance. / Lavara García, R. (2013). Genetics of fresh and frozen-thawed semen traits and their relationship with growth rate in rabbits [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/31657

El presente trabajo se realizó con el propósito de evaluar los cambios en las características clínicas, seminales y endocrinas en carneros con aislamiento escrotal térmico. Se utilizaron 12 animales adultos de raza Merino, distribuidos al azar en dos grupos: a) Control: n = 4 y b) Tratado: n = 8. Los animales del grupo tratado fueron sometidos a aislamiento escrotal con una bolsa de algodón cubierta con plástico para elevar la temperatura a 39.0 ± 0.5 °C por 48 horas. Se registraron cambios en volumen del eyaculado, consistencia testicular, circunferencia escrotal; concentración; motilidad masal (0 - 5); motilidad individual (%) ; anormalidades espermatozoides (%); perfiles endocrinos de testosterona y LH. Se realizó la colección de semen por electroeyaculación, tres veces por semana y para la determinación hormonal, los animales fueron canulados en la vena yugular y se tomó muestras de sangre por 6 horas a intervalos de 15 minutos. Las muestras fueron analizadas mediante radioinmunoanálisis. El periodo de evaluación fue de 35 días. Los resultados señalan cambios en la circunferencia escrotal de 30.43 ± 1.1 (inicio) a 25.00 ± 0.5 cm (semana 5). No se registraron cambios en volumen pero si en concentración espermática a partir de la segunda semana. En motilidad masal se registraron observaciones de valores 0 a partir de la semana 2 y 2.45 ± 3.1 en motilidad individual en la semana 2. El porcentaje de anormales se incremento a 82.3 ± 29.3 % en la semana 3, siendo las anormalidades de cabeza sola, cola doblada y gota citoplasmática, las principales anormalidades observadas. Las concentraciones de Testosterona disminuyen a partir de la semana 2 (280 ± 83 pg/ml) y se incrementan las concentraciones de LH a 0.96 ± 0.72 a partir de la semana 2, con la presencia de un mayor número de pulsos de LH (0.92 ±0 33 / 6 horas). Se concluye que la aplicación de bolsas de algodón, para incrementar la temperatura a nivel del testículo producen cambios en las características clínicas, seminales, proporción de espermatozoides normales, concentración, motilidad masal e individual y cambios en las concentraciones hormonales de Testosterona y LH, por lo que se recomienda adecuadas prácticas de manejo para evitar efectos del incremento de la temperatura a nivel escrotal y las consiguientes deficiencias en el comportamiento reproductivo de los animales machos.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Introducción: Uno de los factores que influye en la capacidad reproductiva y que posee un impacto a nivel testicular, es el desbalance entre las especies reactivas del oxígeno (ROS) y los mecanismos antioxidantes. Se ha visto que la suplementación con antioxidantes no-enzimáticos (vitaminas C y E) permite mejorar el estatus antioxidante endógeno de los machos, previniendo la peroxidación lipídica, el daño celular y otros eventos de daño oxidativo a nivel reproductivo que tienen relación con pérdidas causadas por subfertilidad o infertilidad en sistemas productivos ovinos. Objetivos y métodos: El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de vitaminas antioxidantes (C y E) sobre la estructura microscópica de testículo y epidídimo en carneros. Este estudio se realizó en las dependencias de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile. Se utilizaron 20 carneros híbridos de 1 año de edad aproximadamente, los cuales se distribuyeron en dos grupos; un grupo con tratamiento (LLV, n=10) y un grupo control sin tratamiento (LL, n=10). Se suplementó diariamente durante 60 días con vitaminas antioxidantes (600 mg. de vitamina C y 450 U.I. de vitamina E, vía oral). Se tomaron muestras de tejido provenientes de testículo y epidídimo a los 30 y 60 días posterior al inicio de la suplementación vitamínica. En cada tiempo muestral los grupos de muestreo estuvieron formados por 5 animales de cada grupo. Se obtuvieron cortes de 6 μm de grosor, los que fueron procesados mediante procedimientos histológicos estándares de rutina y teñidos con Hematoxilina-Eosina. El estudio histológico se llevó a cabo mediante la obtención y observación de imágenes microscópicas tomadas con un aumento de 100x y 400x para su posterior análisis.f Resultados y conclusiones: Los resultados muestran que la suplementación con vitaminas C y E promueve la proliferación de células de Leydig y de Sertoli en el testículo de carneros suplementados. Por otra parte, la suplementación antioxidante no posee efectos a nivel histológico en el epidídimo. En conclusión, estos efectos a nivel testicular influyen de manera directa sobre un mayor desarrollo de células espermatogénicas en el epitelio germinativo y, en consecuencia, en una mayor capacidad reproductiva y fertilidad potencial de carneros suplementados. / Background: One of the main factors that influences the reproductive capacity and that has an impact at a testicular level, is the imbalance between the reactive oxygen species (ROS) and the antioxidant mechanisms. It has been shown that a supplementation with non-enzymatic antioxidants (vitamins C and E) improves the endogenous antioxidant status, preventing lipid peroxidation, cellular damage and other events of oxidative damage at a reproductive level, which are related with losses caused by subfertility or infertility in sheep production systems. Aims and methods: The aim of this study was to evaluate the effect of antioxidant vitamins (C and E) upon the microscopic structure of testis and epididymis in rams. This study was carried out at the Faculty of Veterinary and Animal Sciences of the University of Chile. Twenty hybrid rams of 1 year old were used, which were divided into two groups; one treated group (LLV, n=10) and an untreated control group (LL, n=10). The rams of the LLV group were supplemented daily during 60 days with the antioxidant vitamins (600 mg. of vitamin C and 450 IU of vitamin E, orally). Tissue samples from testis and epididymis were taken at 30 and 60 days after beginning the vitamin supplementation. At each sampling time, the sample groups were composed of 5 animals per group. Cuts of 6 microns thick were obtained, which were processed using routine histological methods and stained with hematoxylin-eosin. Histological study was carried out by obtaining and the observation of microscopic images taken with a 40x and 10x magnification for later analysis. Results and conclusions: The results shown that supplementation with antioxidant vitamins (C and E) promotes the proliferation of Leydig and Sertoli cells in the testis of supplemented rams. Moreover, antioxidant supplementation has no effects on a microscopic level in the epididymis. In conclusion, these effects at a testicular level have a direct influence on the further development of spermatogonial cells in the germinal epithelium and, consequently, in a greater reproductive capacity and potential fertility in supplemented rams. / Proyecto Fondecyt 1130181

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El estrés oxidativo se describe como una de las principales causas la alteración de la calidad seminal del carnero, afectando a la concentración, motilidad, vitalidad y morfología espermática. Estudios muestran que la terapia antioxidante es capaz de mejorar la capacidad antioxidante, atenuar los daños por estrés oxidativo y mejorar la calidad seminal. En éste estudio se evaluó el efecto de la suplementación oral de vitaminas antioxidantes sobre las características seminales y en el estado oxidativo del carnero. Para esto se administraron 650 mg de vitamina C y 450 UI de vitamina E durante 60 días a la mitad de los animales (n=5) y la otra mitad se usó como grupo control (n=5). Se tomaron muestras de semen y sangre a los 0, 30 y 60 días, mediante electroeyaculación y venipunción, respectivamente. La evaluación de las características seminales de concentración, vitalidad espermática y motilidad progresiva se realizó con el sistema CASA. El volumen del eyaculado se evaluó con la copa de extracción y el pH mediante tiras reactivas. La evaluación del estado antioxidante se realizó mediante la medición del la capacidad antioxidante total (TAC) y la concentración de malondialdehido (MDA) en el plasma sanguíneo, mediante la técnica de ELISA. Las concentraciones plasmáticas de vitamina C y E se evaluaron mediante HPLC. Se encontró que la administración oral de vitaminas C y E aumenta significativamente las concentraciones plasmáticas de las vitaminas, tras 30 y 60 días de administración (p<0,05). Asimismo, la suplementación de vitaminas antioxidantes aumentó significativamente la concentración espermática a los 30 días de tratamiento, además de aumentar la vitalidad y concentración espermática tras 60 días de tratamiento (p<0,05). Se concluye que la suplementación oral con vitaminas E y C a partir de 30 días mejora la calidad seminal en carneros. / Oxidative stress is described as a major cause of impaired ram semen quality, affecting concentration, motility, vitality and sperm morphology. Studies show that antioxidant therapy is able to improve antioxidant status, mitigating the oxidative damage, and improving semen quality. In this study, the effect of oral antioxidant vitamins supplementation on the seminal characteristics and oxidative status were evaluated in rams. Half the animals (n = 5) were suplemented with 650 mg of vitamin C and 450 IU of vitamin E for 60 days, and the other half was the control group (n = 5). Semen and blood samples were taken at 0, 30 and 60 days of treatment by electroejaculation and venipuncture, respectively. Evaluation of seminal characteristics of like sperm concentration, sperm vitality and motility were performed by means CASA system. Volume of the ejaculate was assessed directly in the extraction cup and pH using test strips. Antioxidant status was assessed by analyzing total antioxidant capacity (TAC) and malondialdehyde (MDA) in blood plasma by ELISA. Plasma vitamins concentrations were evaluated with HPLC. It was found that oral administration of vitamin C and E significantly increased vitamins plasma concentrations at 30 and 60 days of supplementation (p <0.05). In addition, vitamins supplementation significantly increased sperm concentration by 30 days of treatment, and increase vitality and sperm concentration at 60 days of treatment (p <0.05). It is concluded that 30 days of oral vitamins C and E supplementation or more, improves semen quality in rams. / Proyecto FONDECYT 1130181

La acuicultura de peces planos se ha incrementado notablemente en los últimos años, sin embargo existen disfunciones reproductivas que no permiten una reproducción exitosa en cautiverio, por lo tanto, conocer el estado reproductivo de los ejemplares así como la calidad de sus gametos es de vital importancia. La evaluación de la calidad espermática permite incrementar no solo los índices de supervivencia larval sino la aplicación de técnicas como la fecundación in vitro, el monitoreo de las condiciones de cultivo y la criopreservación con el fin de asegurar la reproducción en cautiverio. Los resultados obtenidos en relación a los parámetros de calidad espermática del lenguado Paralichthys adspersus acondicionado al cautiverio fueron el volumen espermático con 758 ± 310 µL, la concentración espermática fue de 2.49 ± 0.26 x 1010 espermatozoides/mL, la clase de motilidad fue 4.00 ± 0.26 con un porcentaje el 50 y 90 % y la viabilidad espermática se evaluó mediante dos técnicas de tinción, se obtuvo 98.31 ± 0.26 % con Eosina-Nigrosina y 87.67 ± 8.28 % con el Kit LIVE/DEAD®. Además, se realizaron ensayos preliminares en criopreservación de espermatozoides, donde se evaluó la motilidad espermática post-incubación en soluciones crioprotectoras, obteniéndose los mejores resultados con DMSO a una concentración de 1.5 M cuya clasede motilidad fue 3.04 ± 0.23 con un 51.79 ± 5.83 %. Por otro lado, la motilidad espermática luego de la criopreservación fue 12.09 ± 2.27 %, con una tasa de congelamiento de – 15 °C/min y de descongelamiento de 50 °C/min. La presente tesis se presenta como el primer reporte de la calidad espermática de Paralichthys adspersus en cautiverio, así como los primeros ensayos para la criopreservación de espermatozoides en esta especie. -- PALABRAS CLAVE: Paralichthys adspersus, espermatozoides, calidad espermática y criopreservación. / -- Flatfish aquaculture has increased markedly in recent years; however there are reproductive dysfunctions that prevent successful reproduction in captivity, therefore, to know the reproductive status of individuals and the quality of their gametes is of great importance. The evaluation of sperm quality can increase not only the larval survival rates but the application of techniques such as artificial insemination, monitoring culture conditions and cryopreservation in order to ensure the reproduction in captivity. The results obtained in relation to semen quality parameters of flounder Paralichthys adspersus conditioned to captivity were sperm volume with 758 ± 310 µl, sperm concentration was 2.49 ± 0.26 x 1010 cells/mL, the class of motility was 4.00 ± 0.26 indicating a range 50 to 90 % and spermatozoa viability was determined using two different staining techniques, with Eosin - Nigrosine techniquewasobtained98.31±0.26 % and with the kit LIVE/DEAD ®was obtained 87.67 ± 8.28 %. In addition, preliminary assays on cryopreservation of spermatozoa were carried out, sperm motility was assessed postincubation in cryoprotectant solutions, obtaining the best results with DMSO at a concentration of 1.5 M, the class of motility was 3.04 ± 0.23 and the percentage of sperm motility was 51.79 ± 5.83 %. On the other hand, sperm motility after thawing was 12.09 ± 2.27%, with a cooling rate -15 ° C/min and thawing rate 50 ° C/min. This thesis is presented as the first study of sperm quality for P. adspersus in captivity, and the first assays for the cryopreservation of sperm in this species. -- KEY WORDS: Paralichthys adspersus, spermatozoa, sperm quality and criopreservation.

El objetivo del presente estudio fue determinar el tiempo máximo para recuperar y criopreservar espermatozoides obtenidos de la cola del epidídimo de caninos post orquiectomía. Los testículos/epidídimos fueron obtenidos después de la orquiectomía de 20 caninos adultos aparentemente saludables con edades entre 1 y 8 años. Los testículos/epidídimos fueron colocados en cloruro de sodio al 0.9% y almacenados a 5ºC durante 0, 24, 48 y 72 horas. Los espermatozoides fueron recuperados al cortar la cola del epidídimo suspendido en dilutor Tris-citrato-fructosa. Para el proceso de criopreservación, a la muestra diluida (espermatozoides + dilutor) se le añadió yema de huevo (20%) y glicerol (5%). La nueva dilución fue envasada en pajillas de 0.5ml, las cuales fueron sometidas a una curva de enfriamiento para luego ser colocadas en nitrógeno líquido. Los parámetros evaluados fueron: Motilidad total, motilidad progresiva e integridad funcional de membrana; parámetros que fueron analizados antes y después de la criopreservación. Adicionalmente se obtuvieron datos sobre morfología y concentración, evaluadas sólo antes de la criopreservación. Todos los parámetros evaluados disminuyeron gradualmente a medida que aumentó el tiempo de almacenamiento, los cuales al ser evaluados a las 48 horas de almacenamiento, antes y después del proceso de criopreservación, no variaron significativamente con respecto a los evaluados a las 0 horas. Sin embargo, cabe resaltar que todos los valores obtenidos después del proceso de criopreservación fueron marcadamente inferiores a los obtenidos antes del proceso. / --- The aim of this study was to determine the maximum time to recover and cryopreserve sperm from the tail of the epididymis of canine post-orchiectomy. The testes/epididymides were obtained by orchiectomy of 20 apparently healthy adult dogs between 1 to 8 years old. The testes/epididymides were placed in sodium chloride 0.9% and stored at 5 ° C for 0, 24, 48 and 72 hours. Sperm were recovered by cutting the tail of the epididymis dilutor suspended in Tris-citrate-fructose. For the cryopreservation process, the diluted sample (sperm + dilutor) was added egg yolk (20%) and glycerol (5%). The new dilution was packaged in 0.5ml straws, which were subjected to a cooling curve to be later placed in liquid nitrogen. The parameters evaluated were: Total motility, progressive motility and membrane functional integrity; parameters were analyzed before and after cryopreservation. Additionally, data were obtained on morphology and concentration, evaluated just before the cryopreservation. All evaluated parameters decreased gradually when the storage time increased. Such parameters to be evaluated at 48 hours of storage, before and after the cryopreservation process, did not differ significantly from those evaluated at 0 hours. However, it is noted that all values obtained after the cryopreservation process were markedly lower than those obtained before process.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Dentro de las biotecnologías reproductivas, la criopreservación de espermatozoides presenta grandes ventajas, sin embargo, involucra cambios en el espermatozoide, tanto estructurales como funcionales, que alterarían eventos fisiológicos asociados a la fecundación, como la capacitación y reacción acrosómica. Esto puede significar cambios en la activación y liberación del sistema proacrosina/acrosina, involucrada en los primeros eventos de interacción ovocito-espermatozoide, por tanto, el objetivo de este trabajo, fue evaluar el sistema proacrosina/acrosina mediante western blot en espermatozoides congelados de perro, en comparación con aquellos frescos, durante diferentes tiempos de capacitación in vitro. Se recolectaron 6 eyaculados, de tres perros sanos, a través de estimulación digital. Se utilizó la fracción espermática de cada eyaculado tanto para los controles (frescos) y los congelados. Las muestras procesadas como frescas fueron resuspendidas luego de una centrifugación en medio Fert-Talp y los espermatozoides que se sometieron a congelación se resuspendieron en diluyente en base a fructosa, TRIS, 20% de yema de huevo, ácido cítrico y 5% de glicerol y fueron posteriormente congelados a -196ºC en nitrógeno líquido. La descongelación se realizó a 60º C durante 8 segundos en agua. Las muestras se centrifugaron y el pellet de espermatozoides se diluyó en medio Fert-Talp dejándose en incubación en el mismo medio para capacitación durante 0, 30, 60 y 90 minutos. Posteriormente las muestras fueron sometidas a extracción de proteínas espermáticas a las cuales se les adicionó buffer de carga 4X para ser separadas mediante electroforesis y luego detectadas a través de western blot utilizando el anticuerpo C5F10 (anticuerpo de ratón antiacrosina humana). Una vez obtenidas las bandas de proacrosina y acrosina ( y β) se evaluó la densidad óptica de cada una de ellas con el programa PhotoShop 8.0. Los resultados obtenidos fueron analizados a través del análisis de varianza y prueba de Tukey. Los resultados mostraron la presencia del zimógeno proacrosina y las subunidades de la enzima activa ( y β acrosina) en los diferentes tiempos de capacitación en los espermatozoides frescos y congelados. En cada uno de los tiempos de capacitación se encontró mayor densidad óptica de proacrosina (P<0,05) en las muestras frescas lo cual indica una mayor cantidad del zimógeno. En la enzima activa -acrosina de las muestras congeladas, hubo diferencias (P<0,05), siendo mayor la densidad óptica a los 30 minutos de capacitación en comparación con los otros tiempos de capacitación. Se encontró mayor reactividad de -acrosina en las muestras congeladas a los 0 y 30 minutos en comparación con las muestras frescas. En β-acrosina se encontró en las muestras congeladas una mayor densidad óptica a los 0 minutos la que disminuyó hasta los 90 minutos de capacitación. Al analizar β -acrosina en cada uno de los tiempos de capacitación entre congelados y frescos se encontraron diferencias significativas (P< 0.05) a los 0, 30, 60 y 90 minutos de capacitación siendo mayor en las muestras congeladas. En conclusión los espermatozoides congelados presentan mayor activación del zimógeno al comparar con los frescos, la cual va disminuyendo en la medida que el tiempo de capacitación es mayor / Financiamiento: Proyectos Fondecyt 1060602 y 1080618