Les gènes Hox sont présents dans la majorité des espèces du règne animal et sont nécessaires à la différenciation coordonnée des cellules le long de différents axes longitudinaux au cours du développement embryonnaire. Ils sont impliqués dans le maintien de l'homéostasie de nombreux tissus à l'âge adulte. Des mutations affectant leur expression et/ou leur fonction sont ainsi retrouvées dans de nombreux cancers chez l'Homme.Les gènes Hox codent pour des facteurs de transcription reconnaissant des séquences nucléotidiques très similaires. L'interaction avec une classe évolutivement conservée de cofacteurs, les protéines Pbx et Meis, permet aux protéines Hox de reconnaître des sites de liaison plus spécifiques. Cette interaction a d'abord été décrite pour dépendre d'un petit motif commun aux protéines Hox, l'hexapeptide (HX). Cependant, des analyses récentes ont montré que ce motif pouvait en fait être dispensable in vivo, soulignant une capacité étonnante des protéines Hox à pouvoir potentiellement utiliser différents motifs pour interagir avec les mêmes cofacteurs. Mon travail de thèse s'inscrit dans la problématique du rôle des petits motifs dans les interactions Hox-cofacteur. Un premier projet a consisté à réaliser une analyse systématique du mode d'interaction de chaque représentant des groupes de paralogie des protéines Hox humaines avec leurs cofacteurs Pbx/Meis. Ce travail a révélé de nouveaux modes d'interaction pour plusieurs protéines Hox. Un deuxième projet a consisté à mettre en place un nouveau système de crible moléculaire pour identifier des partenaires de la protéine humaine HoxA9 sauvage ou mutée dans son motif HX dans différentes lignées cellulaires. L'ensemble de mon travail de thèse ouvre ainsi de nouvelles perspectives sur notre compréhension du mode moléculaire d'action des protéines Hox et de leurs cofacteurs, que cela soit en contexte développemental normal ou pathologique / Hox genes are present in the vast majority of the animal kingdom, and are required for the differentiation of several longitudinal axes during embryogenesis. There are also involved in the homeostasis of several tissues in the adult organism. Mutations affecting their expression and/or function are found in numerous human cancers.Hox genes encode for transcription factors that recognize short and highly similar DNA-binding sites. The direct interaction between Hox proteins and two evolutionary classes of cofactors, the Pbx and Meis proteins, allows them to recognize more specific DNA-binding sites. This interaction was first described to rely on a common short Hox protein motif called hexapeptide (HX). However, subsequent functional and molecular analyses showed that the HX motif could be dispensable for the interaction with Pbx and Meis partner in vivo. These results strongly suggest that Hox proteins could use different motifs to interact with the same set of cofactors. Such alternative motifs are unknown in mammalian Hox proteins.My thesis work is dedicated to the issue of the role of the HX motif and other short motifs in Hox-cofactor interactions. More particularly, I developed two main projects using human Hox proteins and cell lines derived from different tissues as a model system. My first project consisted in the systematic analysis of the interaction property of all Hox paralogs with the Pbx/Meis cofactors. This work revealed new Pbx/Meis-interaction interfaces in human Hox proteins. My second project consisted in establishing a new molecular screen to identify transcriptional partners of the wild type or HX-mutated human HoxA9 protein in different cell lines.Overall, my thesis work opens new perspectives into our understanding of the molecular mode of action of Hox proteins and their cofactors, in a normal or pathological developmental context

Mit der Entwicklung und der Anwendung moderner Genomsequenzierungstechnologien können weitere Genmutationen identifiziert werden. Nach jetzigem Stand sind etwa 20% dieser Mutationen in Bereichen von Proteinen vorzufinden, die keine eindeutige 3D-Struktur haben. Diese werden intrinsisch ungeordnete Regionen genannt (intrinsic disordered regions, IDRs). Die IDRs sind für die Steuerung biologischer Prozesse wichtig. Sie enthalten kurze, lineare Abschnitte (SLiMs), die bei der Interaktion von Proteinen eine Rolle spielen und mittels Phosphorylierung reguliert werden können. Um Krankheiten besser zu verstehen, ist es entscheidend zu erforschen, wie diese IDR-Mutationen die Interaktionen von Proteinen beeinflussen. In dieser Doktorarbeit wird eine Methode verwendet, bei der synthetische Peptide, die den mutierten Proteinsequenzregionen entsprechen, auf eine Membran aufgebracht werden, um die Wechselwirkungen dieser Peptidsequenzen mit zellulären Proteinen systematisch zu untersuchen. Zusätzlich werden Änderungen dieser Interaktionen zwischen normalen, phosphorylierten oder zusätzlich sequenzveränderten Peptidvarianten untersucht, um die Auswirkungen der Genmutationen besser zu verstehen. Diese Arbeit zeigt deutliche Unterschiede in den Wechselwirkungen zwischen phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Peptiden auf. Sie sind größtenteils auf die Störung der phosphorylierungsabhängigen SLiMs zurückzuführen. Unter den Proteinen sticht insbesondere die S102P Mutation im Transkriptionsfaktor GATAD1 heraus, die mit einer Herzmuskelerkrankung in Verbindung steht. Wir haben festgestellt, dass diese Mutation eine Phosphorylierungsstelle stört, die für die Bindung an 14-3-3-Proteine verantwortlich ist. Wir haben weitere Untersuchungen durchgeführt, um diese Interaktion besser nachvollziehen zu können. Diese Arbeit trägt dazu bei, die molekularen Mechanismen von Krankheiten besser zu verstehen und bietet Möglichkeiten für weiterführende Untersuchungen und Therapieansätze auf. / Approximately 20% of disease-linked point mutations are situated within protein regions devoid of 3D structure, known as intrinsically disordered regions (IDRs). IDRs harbour short linear motifs (SLiMs) that mediate protein-protein interactions (PPIs), often through post-translational modifications such as phosphorylation. Investigating the impact of these IDR mutations on protein-protein interactions is essential to comprehend human diseases. In this doctoral thesis, I present a comprehensive exploration of a peptide-based proteomics screen, employed to study 36 disease-associated mutations that impair phosphorylation sites within IDRs. This approach, uses immobilized synthetic peptides, corresponding to the mutated regions, to capture interacting proteins from cellular extracts. This method facilitated the simultaneous comparison of interaction partners among wild-type, phosphorylated, and mutated peptide forms, enabling the functional assessment of individual mutations. Our analysis uncovered significant disparities between the interactomes of phosphorylated and non-phosphorylated peptides. Building on our findings, we placed particular emphasis on the S102P mutation within the transcription factor GATAD1, a mutation associated with dilated cardiomyopathy. Our screening demonstrated that this mutation disrupts a phosphorylation site responsible for 14-3-3 protein binding. To delve deeper into this interaction, we conducted a thorough investigation, employing techniques such as isothermal titration calorimetry, X-ray crystallography, and alanine scanning coupled with mass spectrometry. Our analyses hinted at the regulatory role of 14-3-3 binding in GATAD1's nucleocytoplasmic transport, achieved by masking its nuclear localization signal. The insights from our research shed fresh light on potential molecular mechanisms underpinning the development of various human diseases, offering a promising avenue for further investigation and therapeutic exploration.

Kürzlich wurde mithilfe von Ribo-seq Experimenten die Translation hunderter Mikroproteine in menschlichen Herzen entdeckt. Diese blieben zuvor aufgrund ihrer geringen Größe (< 100 Aminosäuren) unentdeckt, und ihre physiologische Rolle ist noch weitgehend unbekannt. Ziel dieser Promotionsarbeit ist es, potentielle Funktionen dieser neuartigen Mikroproteine zu entschlüsseln. Dabei sollen insbesondere die Aufklärung ihrer evolutionären Konservierungssignatur, subzellulären Lokalisierung und ihres Proteininteraktoms helfen. Die Konservierungsanalyse ergab, dass fast 90% der Mikroproteine nur in Primaten konserviert ist. Weiterhin konnte ich die Produktion von Mikroproteine in vitro und in vivo nachweisen, die subzelluläre Lokalisierung von 92 Mikroproteinen definieren, und Interaktionspartner für 60 Mikroproteine identifizieren. Dutzende dieser Mikroproteine lokalisieren in Mitochondrien. Dazu gehörte ein im Herzen angereichertes Mikroprotein, das aufgrund der Interaktions- und Lokalisationsdaten einen neuartigen Modulator der mitochondrialen Proteintranslation darstellen könnte. Der Interaktom-Screen zeigte außerdem, dass evolutionär junge Mikroproteine ähnliche Interaktionsfähigkeiten wie konservierte Kandidaten haben. Schließlich wurden kurze Sequenzmotive identifiziert, die Mikroprotein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln, wodurch junge Mikroproteine mit zellulären Prozessen – wie z.B. Endozytose und Spleißen – in Verbindung gebracht werden konnten. Zusammenfassend wurde die Produktion vieler kleiner Proteine im menschlichen Herzen bestätigt, von denen die meisten lediglich in Primaten konserviert sind. Zusätzlich verknüpften umfangreiche Lokalisierungs- und Interaktionsdaten mehrere Mikroproteine mit Prozessen wie Spleißen, Endozytose und mitochondrialer Translation. Weitere Untersuchungen dieses zuvor verborgenen Teils des Herzproteoms werden zu einem besseren Verständnis von evolutionär jungen Proteinen und kardiologischen Prozessen beitragen. / Recently, the active translation of hundreds of previously unknown microproteins was detected using ribosome profiling on tissues of human hearts. They had remained undetected due to their small size (< 100 amino acids), and their physiological roles are still largely unknown. This dissertation aims to investigate these novel microproteins and validate their translation by independent methods. Particularly, elucidating their conservation signature, subcellular localization, and protein interactome shall aid in deciphering their potential biological role. Conservation analysis revealed that sequence conservation of almost 90% of microproteins was restricted to primates. I next confirmed microprotein production in vitro and in vivo by in vitro translation assays and mass spectrometry-based approaches, defined the subcellular localization of 92 microproteins, and identified significant interaction partners for 60 candidates. Dozens of these microproteins localized to the mitochondrion. These included a novel cardiac-enriched microprotein that may present a novel modulator of mitochondrial protein translation based on its interaction profile and subcellular localization. The interactome screen further revealed that evolutionarily young microproteins have similar interaction capacities to conserved candidates. Finally, it allowed identifying short linear motifs that may mediate microprotein-protein interactions and implicated several young microproteins in distinct cellular processes such as endocytosis and splicing. I conclude that many novel small proteins are produced in the human heart, most of which exhibit poor sequence conservation. I provide a substantial resource of microprotein localization and interaction data that links several to cellular processes such as splicing, endocytosis, and mitochondrial translation. Further investigation into this hidden part of the cardiac proteome will contribute to our understanding of recently evolved proteins and heart biology.