Les protéines SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachment protein REceptor) sont essentielles pour la fusion membranaire. J'ai étudié chez Arabidopsis thaliana la SNARE Memb11 de l’appareil de Golgi qui intervient au début de la voie sécrétoire à l'interface Réticulum endoplasmique (RE)-appareil de Golgi. Dans les cellules de mammifères, l'orthologue de Memb11 (Membrine) est un « récepteur » potentiel de la GTPase Arf1 à la membrane golgienne. Cette dernière est impliquée dans le recrutement de la machinerie COPI nécessaire au transport rétrograde de l'appareil de Golgi vers le RE. Le but de ce travail était de déterminer si Memb11 pouvait interagir avec Arf1 dans les cellules végétales. Des anticorps dirigés contre la partie cytosolique de Memb11 ont été obtenus et ont été utilisés sur tissus végétaux pour réaliser des immunomarquages en microscopie électronique à transmission et des immunoprécipitations sur extraits de plantes. Il a été démontré que Memb11 est située au niveau de la membrane cis-golgienne et qu'elle co-immunoprécipite avec Arf1, suggérant ainsi que Arf1 peut interagir avec Memb11. J'ai confirmé l'interaction de Memb11 et Arf1 au niveau de l'appareil de Golgi par des expériences de BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) in vivo. Cette interaction est spécifique puisque ni Memb12 (90% d'identité avec Memb11) ni Sec22 interagissent avec Arf1. Grâce à une approche de bioinformatique structurale, j'ai déterminé les régions de Memb11 (différentes de Memb12) qui pourraient être critiques pour l'interaction et j’ai commencé à tester in vivo les mutants correspondants par BiFC. En outre, des expériences d’immunoprécipitations avec des protéines recombinantes produites in vitro suggèrent que la forme d’Arf1 liée au GTP interagit avec Memb11. / The SNARE proteins (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachment protein REceptor) are critical for membrane fusion in the secretory pathway. I have studied the Golgi SNARE Memb11 in Arabidopsis thaliana cells. Memb11 is involved at the ER-Golgi interface. In mammalian cells, the ortholog of Memb11 (Membrin) is the potential “receptor” of the GTPase Arf1 in the Golgi membrane. This protein is involved for the recruitment of the COPI machinery, required for retrograde transport from the Golgi to the ER. The aim of this work was to determine whether Memb11 can interact with Arf1 in plant cells. Antibodies against the cytosolic part of Memb11 were obtained and were applied on plant tissues to perform immunolabeling by transmission electron microscopy and immunoprecipitation (IP) studies. It has been shown that Memb11 is located at the cis-Golgi and that it co-immunoprecipated with Arf1, suggesting that Arf1 may interact with Memb11. I confirmed the interaction of Memb11 and Arf1 at the Golgi by in vivo BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) experiments. This interaction was specific since neither Memb12 (90% identity with Memb11) nor Sec22 interacted with ARF1. Thanks to a structural bioinformatic approach, I determined the regions in Memb11 (different from Memb12) that could be critical for the interaction and started to test corresponding mutants in vivo by BiFC. In addition, IP experiments with recombinant proteins produced in vitro suggest that the GTP-bound form of ARF1 interacts with Memb11.

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Le maintien de l’homéostasie passe notamment par la sécrétion d’hormones provenant des cellules neuro-endocrines ou endocrines telles que les cellules chromaffines ou les cellules b pancréatiques. Par exemple, la régulation de la glycémie nécessite l’exocytose de l’insuline depuis les cellules b pancréatiques des îlots de Langerhans. Une famille de protéines membranaires est au cœur de la machinerie de fusion d’une vésicule avec la membrane plasmique. Ce groupe appelé, la famille des protéines SNARE est composé de trois protéines. VAMP2 est localisée à la membrane vésiculaire alors que syntaxine 1A et SNAP25 sont localisées à la membrane plasmique. Syntaxine 1A et VAMP2 ont un domaine transmembranaire alors que SNAP25 est reliée à la membrane par prénylation de résidus cystéine. Cette famille forme le complexe cytosolique SNARE décrit comme essentiel à l’exocytose. La structure et la fonction du complexe cytosolique ont été étudiées en profondeur et ont mené au modèle du « zipper ». Celui-ci décrit un enroulement progressif des domaines cytosoliques SNARE permettant l’apposition des membranes puis la fusion. Le rôle des domaines transmembranaires reste encore peu décrit. Pourtant, leur étude est nécessaire afin d’établir un modèle complet de la fusion membranaire par les protéines SNARE. Nous avons donc mené une étude alliant une analyse structurale dynamique à une analyse biologique pour déterminer l’importance du domaine transmembranaire de VAMP2 dans la sécrétion. L’analyse biologique représente donc le centre de ma thèse. Le système biologique utilisé est basé sur l’extinction de l’expression de la protéine VAMP2 endogène et l’expression concomitante d’une protéine VAMP2 mutée dans son domaine transmembranaire. Deux lignées cellulaires considérées comme des modèles dans l’étude de la sécrétion hormonale et du trafic vésiculaire ont servi de support à notre étude. Par des approches de microscopies (confocal, TIRF) et d’analyses biochimiques, nous avons observé les conséquences fonctionnelles des mutations ponctuelles, établis par mutagénèse dirigée, sur le trafic vésiculaire et sur la capacité des cellules à sécréter.Les mutations induites présentent différents effets cellulaires. Certaines bloquent la sortie de VAMP2 du réseau golgien alors que d’autres ont un effet important sur la sécrétion hormonale et plus précisément sur l’exocytose. Les études structurales ont permis de corréler ces effets avec une diminution de la flexibilité structurale dans le cas de la diminution de l’exocytose, ou avec une restriction à la conformation hélice alpha dans le cas du sorting. Ce projet pluridisciplinaire a pu mettre en avant le rôle biologique du domaine transmembranaire de VAMP2 au cours de l’exocytose probablement soutenue par la dynamique conformationelle unique observée par le versant structural du projet. / The hormonal secretion plays a key role in the maintenance of homeostasis. For example, the maintenance of normoglycaemia requires insulin exocytosis from the pancreatic beta cells. The SNARE membrane family protein has been described as the core machinery of fusion between the vesicle containing hormones and the plasma membrane. This family consists of 3 different membrane proteins that are essential during exocytosis. VAMP2 is localized on the vesicle and Syntaxin 1A - on the plasma membrane. They both are transmembrane protein whereas SNAP25 is linked to the plasma membrane by palmitoylation. The SNAREs appear to be essential as they form the cytosolic SNARE complex to dock the vesicle to the plasma membrane. Even though the role of this cytosolic domain has been studied in depth, much less is known on the role of their transmembrane domain during the fusion. Their study remains necessary to establish a complete model of membrane fusion mediated by the SNARE proteins.Here, we have studied the behavior and the role of the SNARE transmembrane domain during exocytosis. In a multidisciplinary project, we have combined a structural approach with a biological study to evaluate the role of this domain. Using mutagenesis in the transmembrane domain of VAMP2 and a cellular system with a clean background, we have assessed the effect of mutations on the secretion and exocytosis in two different cell lines (INS1E and PC12). The biological system is based on the silencing of endogenous VAMP2 and reconstitution of the expression of VAMP2 wt or mutated in the transmembrane domain. Using biochemistry assay and TIRF microscopy we have shown that mutations in this domain can lead to a missorting of the Golgi apparatus or a reduction of the stimulated secretion and exocytosis. This effect can be correlated to a modification of the structural dynamics of this domain.The obtained results clearly demonstrate the role of the transmembrane domain of VAMP2 during exocytosis probably sustained by its unique structural dynamics observed by physico-chemistry.