CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A toxicidade ao meio ambiente, a baixa biodegrabilidade e a crescente resistÃncia de insetos praga da agricultura e de insetos vetores de doenÃas aos inseticidas tradicionalmente utilizados tem estimulado o desenvolvimento de alternativas com maior biodegradabilidade e especificidade, especialmente de origem vegetal. Nesse sentido, o presente estudo consistiu na purificaÃÃo, caracterizaÃÃo e avaliaÃÃo do efeito biolÃgico in vitro de um novo inibidor de tripsina obtido das sementes de Sapindus saponaria sobre as enzimas digestivas de insetos. AtravÃs de precipitaÃÃo com Ãcido tricloroacÃtico (TCA), cromatografia de afinidade à tripsina e cromatografia de fase reversa em sistema UFLC, foi purificado um novo inibidor de tripsina (SSTI2) pertencente ao grupo de inibidores do tipo Batata I, uma categoria de inibidores de peptidases serÃnicas com reconhecido efeito tÃxico sobre insetos. O inibidor nativo e fragmentos desse gerados por tratamento enzimÃtico com tripsina e pepsina foram analisados e sequenciados por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF e ESI-TOF, determinando assim a sua massa molecular acurada (MM = 7571, 976 Da) e elucidando a sua estrutura primÃria (64/69 aminoÃcidos). O inibidor apresentou uma IC50 de 8,3 x 10-2 μmol.L-1 contra a tripsina bovina, mas apresentou baixa atividade inibitÃria sobre as enzimas quimotripsina (13,24  0,28%) e papaÃna (5,28  0,42%), e nÃo foi capaz de inibir a proteÃlise promovida pela bromelaÃna. O SSTI2 inibiu moderadamente a atividade catalÃtica das enzimas digestivas totais dos insetos, com percentual de inibiÃÃo variando entre 4,74  0,45% a 56,06  1,41%. No entanto, o inibidor foi eficaz em atuar sobre as enzimas digestivas do tipo tripsina presentes nos intestinos dos insetos Aedes aegypti (92,44  0,99%), Anthonomus grandis (77,93  0,12%), Anticarsia gemmatalis (32,21  0,57%) e Spodoptera frugiperda (71,44  1,23%). Esse expressivo efeito inibitÃrio do SSTI2 sobre a atividade catalÃtica das peptidases do tipo tripsina provenientes do intestino mÃdio dos insetos sugere um possÃvel efeito supressor no desenvolvimento e sobrevivÃncia de insetos alimentados com dietas contendo o inibidor. Assim, futuros estudos in vivo e avaliaÃÃes de outras propriedades bioquÃmicas do inibidor serÃo importantes para determinar a potencial aplicaÃÃo biotecnolÃgica do SSTI2, especialmente para o combate de A. aegypti, A. grandis e A. gemmatalis. AlÃm disso, a sequÃncia do SSTI2 elucidada nesse estudo possibilita a sÃntese, clonagem do gene codificante e expressÃo heterÃloga dessa potencial ferramenta biotecnolÃgica. / Environmental toxicity, low biodegradability and increased resistance in agricultural pest insects and in insect vectors of diseases to insecticides traditionally used for their control have encouraged the development of chemical alternatives with greater specificity and biodegradability especially from plants. In this way, the present study aimed the purification, characterization and evaluation of activity towards pest insect digestive enzymes of a new trypsin inhibitor obtained from Sapindus saponaria seeds. This new trypsin inhibitor obtained from S. saponaria seeds (SSTI2) belongs to Potato I inhibitor family and was purified by protein precipitation with trichloroacetic acid, affinity chromatography and reverse phase chromatography using UFLC system. The native inhibitor and its fragments generated by enzymatic treatment with trypsin and pepsin were analyzed and sequenced by MALDI-TOF and ESI-TOF mass spectrometry, determining its accurate molecular mass (MM = 7571, 976 Da) and primary structure (64 of 69 amino acids). The SSTI2 showed an IC50 of 8.3 x 10-2 μmol.L-1 against bovine trypsin, and a much lower inhibitory activity on the enzymes chymotrypsin (13.24  0.28%) and papain (5.28  0 , 42%), but was unable to inhibit proteolysis promoted by bromelain. In spite to show moderate inhibition of total digestive enzymes (4.74  0.45% to 56.06  1.41%), the inhibitor was very effective upon trypsin-like enzymes present in Aedes aegypti (92.44  0.99%), Anthonomus grandis (77.93  0.12%), Anticarsia gemmatalis ( 32.21  0.57%) and Spodoptera frugiperda (71.44  1.23%) guts. This strong inhibitory effect of SSTI2 on the catalytic activity of trypsin-like peptidases of insectâs midguts suggests a possible suppressive effect on development and survival of insects fed with diets containing the inhibitor. Thus, future in vivo assays and evaluation of other biochemical properties will be important to establish the potential biotechnological application of SSTI2, especially for the combat of Ae. aegypti, A. grandis and An. gemmatalis. Furthermore, the sequence of SSTI2 elucidated in this study allows the chemical synthesis, cloning of coding gene sequence and heterologous expression of this potential new biotechnological tool.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2017-03-20T14:09:41Z No. of bitstreams: 1 Sheylla Cristiny Alves da Silva.pdf: 930193 bytes, checksum: 6479c6df5d48434d77f83fe239c22811 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-20T14:09:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sheylla Cristiny Alves da Silva.pdf: 930193 bytes, checksum: 6479c6df5d48434d77f83fe239c22811 (MD5) Previous issue date: 2015-08-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The Sapindus saponaria L. commonly known as soap belongs to the Sapindaceae family, it is a forest that has ornamental and medicinal purposes, and is used in folk medicine for a long time. The objective was to evaluate the effect of different levels of shading and depth in the production of seedlings of S. saponaria. After removal of seed from the fruit, they were placed in sulfuric acid 98% for 60 minutes, and dormancy breaking method, then seeded in polypropylene bags containing as soil substrate and goat manure in the proportion of 4: 1 in the depths of one and two cm. The bags were placed at 0, 50 and 75% shading. The experiment was conducted in a randomized block in a factorial 3 x 2 (shading x depth), with four replications. The following variables were evaluated: percentage, first count and emergence speed index, plant height, stem diameter, number of leaves, chlorophyll content, root volume, leaf area, length and dry mass of roots and shoots. Data were subjected to analysis of variance and means compared by Tukey test at 5% probability. The production of S. saponaria L. seedlings can be performed under shading (50 and 75%) with seeding at 1 and 2 cm deep. As well as the shading of 0% at a depth of 2cm. / A Sapindus saponaria L. conhecida popularmente como saboneteira, pertencente à família Sapindaceae, é uma florestal que possui fins ornamentais e medicinais, sendo utilizada na medicina popular há muito tempo. O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito de diferentes níveis de sombreamento e profundidades na produção de mudas de S. saponaria. Após a retirada das sementes dos frutos, as mesmas foram postas em ácido sulfúrico a 98% por 60 minutos, como método de quebra de dormência, em seguida semeadas nos sacos de polipropileno contendo como substrato solo e esterco de caprino na proporção de 4:1 nas profundidades de um e dois cm. Os sacos foram acondicionados em 0, 50 e 75% de sombreamentos. O experimento foi realizado em blocos casualizados em esquema fatorial 3 x 2 (sombreamento x profundidade), com quatro repetições. Foram avaliadas as variáveis: porcentagem, primeira contagem e índice de velocidade de emergência, altura de plantas, diâmetro caulinar, número de folhas, teor de clorofila, volume de raiz, área foliar, comprimento e massa seca da raiz e parte aérea. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade. A produção de mudas de Sapindus saponaria L. pode ser realizada sob sombreamento de 50 e 75% independente da profundidade de semeadura e a 0% na profundidade de 2 cm.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-02-23T11:37:53Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 27205195 bytes, checksum: c620cb2a8c1f22a42311c26dd469e04e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-23T11:37:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 27205195 bytes, checksum: c620cb2a8c1f22a42311c26dd469e04e (MD5) Previous issue date: 2016-08-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Sapindus saponaria L. (Sapindaceae), popularmente conhecida no Brasil como "Sabão­de­ soldado" e saboneteira é uma árvore nativa e produz anualmente grande quantidade de pequenos frutos. Neste trabalho foram estudados a composição química das sementes e de seu frutos e realizadas transformações química da hederagnina, aglicona mais abundante localizada no pericarpo do fruto. Em primeiro lugar, para saber a composição química da semente, estas foram separadas do pericarpo dos frutos quebradas e sumetida a extraida com hexano. Da fração hexânica foi isolado e identificado cianolipídeo tipo III (o 1­ciano­2­ hidroximetilprop­1­en­3­ol) que representa 5% da composição do óleo. A parte graxa desta fração é formada pelos ácidos graxos: ácido cis­11­octadecenóico (ácido cis­vacênico), ácido cis­11­icosenóico e o ácido icosanóico (ácido araquídico). Este é o primeiro estudo de composição detalhada do óleo de semente de S. saponaria, confirmando a quimiotaxonomia da família cuja presença de metabólitos secundários tipo cianolipídeo em suas sementes é característica. Posteriormente, do pericarpo do fruto foi obtido o extrato etanólico, tendo sido isolados o glicosídeo 2­metoxi­6­metiltetrahidro­2H­piran­3,4,5­triol (3c), até agora não reportado na literatura para esta espécie de planta. Também desses extratos foram isolados o ácido oleanolico (3b) e a hederagenina (3a). Em seguida, a hederagenina foi derivatizada em diferentes ésteres e amidas na posição­28. Inicialmente foram preparados 24 ésteres da hederagenina (4a­x) com rendimentos entre 35­90% e 9 amidas da hederagenina (5a­i) com rendimentos na faixa de 70­96%, todos inéditos. Esta primeira série de análogos foi submetida a ensaios de atividade citotóxica frente a seis linhagens de células tumorais [518A2 (células de melanoma), células A2780 (carcinoma do ovário), HT29 (adenocarcinoma de cólon), MCF7 (adenocarcinoma de mama), A549 (câncer de pulmão), 8505C (carcinoma de tireóide)], utilizando o ensaio de sulforodamina­B (SRB). Embora a maior parte dos compostos apresentasse níveis moderados a elevados de citotoxicidade todos foram mais potentes do que o produto natural hederagenina. Os compostos mais ativos foram às amidas que tinham como substituinte o grupo etilpirimidinil (5f) e etilpirrolidinil (5c), mostrando um EC 50 variando entre 1,1­6,5 μM, para todas as linhagens avaliadas. Além disso, por meios de ensaio de coloração AO/PI adicional usando células de adenocarcinoma de ovário (A2780), verificou­se que o composto 5c atua principalmente por apoptose. Posteriormente uma série de novos aril­1H­1,2,3­triazol­4­il­metil éster (6a­o) e amida (7a­o) derivados da hederagenina foi sintetizada a partir dos alcinos 4x (éster) e 5e (amida) com diferentes azidas de benzila (a­o) por meio da reação “click” ou reação de cicloadição 1,3­dipolar de Huisgen, com rendimentos de 35% a 95%. As atividades citotóxicas de todos os compostos foram testadas contra as mesmas linhagens celulares de câncer humano acima mencionado além, do fibroblasto não­ malignas de ratos (NIH 3T3) usando o mesmo ensaio de sulforodamina­B (SRB). Em comparação com a hederagenina a maioria dos compostos exibiu maior citotoxicidade contra todas as linhagens celulares de câncer testadas. Os derivados de éster foram mais ativos que as amidas. Além disso, os ésteres com grupo meta­substituídos tais como 6c (m­Br), 6g (m­Cl) e 6n (m­NO2) foram os derivados mais ativos contra todas as linhagens celulares testadas, mostrando um EC50 na faixa de 3,0­4,1 μM. Por outro lado, os análogos 6a (benzil) e 6j (o­F), foram os mais citotóxicos contra células do câncer do cólon (HT29) com um EC 50 = 2,8 μM e 1,6 μM, respectivamente. O composto 6j mostrou índice de seletividade de 5,4. Adicionalmente um experimento de exclusão de corante de laranja de acridina/iodeto de propidio (AO/PI) empregando células de câncer de mama (MCF7) dos análogos 6g e 6j, mostrou que os dois compostos atuam principalmente por morte celular programada. Por outro lado, alguns derivados da hederagenina (1­60) foram avaliados in vitro sobre a proliferação intracelulares de formas amastigotas de Leishmania infantum. Alguns derivados (3, 4, 44, 49 e 52) mostraram atividade a nível micromolar e baixa toxicidade contra células BGM e HepG2. Além disso, a capacidade dos derivados da hederagenina 3 (IC 50 = 9,7 μΜ), 4 (12 μΜ), 44 (11 μΜ) e 49 (2 μΜ), para impedir a proliferação intracelular de formas amastigotas de L. infantum e o seu maior índice de seletividade e baixa toxicidade em relação com a droga comercial usada como controle positivo (tri­hidrato de tartarato de potássio e antimonio) (IC50 = 80,0 ± 0,13 μΜ, IS = 0,1), fazem estes compostos promissores candidatos para o tratamento da leishmaniose. / Sapindus saponaria L. (Sapindaceae) popularly known in Brazil as "soap­de­soldier" and soap is a native tree and annually produces great quantities of small fruits. In this work we studied the chemical composition of the seeds and their fruits and chemical transformations of hederagnina, most abundant aglycone located in the pericarp of the fruit. Firstly, to know the chemical composition of the seeds, were collected and separated from the fruit pericarp, broken and extracted with hexane. The hexane fraction was isolated and identified cyanolipid type III (1­cyano­2­hydroxymethylprop­1­en­3­ol) which represents 5% of the oil composition. The grease of this fraction is formed by the fatty acids: cis­11­octadecenoic acid (cis­vaccenic acid), cis­11­icosenóico acid and icosanoic acid (arachidic acid). This is the first study in detail the composition of the oil of the S. saponaria seed, confirming the family chemotaxonomy, whose presence cyanolipids groups in its seeds is characteristic. From the fruit pericarp was obtained an ethanol extract and was isolated the glycoside 2­methoxy­6­ methyltetrahydro­2H­pyran­3,4,5­triol (3c), so far not reported in the literature for this kind of plant. Also these extracts, were isolated the oleanolic acid (3b) and hederagenin (3a). Them, the hederagenin was transformed into different esters and amides at position­28. Initially, hederagenin was transformed in 24 esters (4a­x) with yields between 35­90% and 9 amide (5a­i) with revenues in the range of 70­96%, all unpublished. This first series of analogues was tested for cytotoxic activity against six tumor cell lines [518A2 (melanoma cells), A2780 cells (ovarian carcinoma), HT29 (colon adenocarcinoma), MCF7 (breast adenocarcinoma), A549 (lung cancer), 8505c (thyroid carcinoma)] using the SRB assay. Although most of the compounds presented moderately to high levels of cytotoxicity were all more potent than the natural product hederagenin. The most active compounds are the amides carrying substituted the ethylpyrimidinyl group (5f) and ethylpyrrolidinyl (5c), showing an EC 50 ranging from 1.1 to 6.5 μM for all tested tumor cells. Moreover, by an additional AO/PI staining experiment, using additional ovarian adenocarcinoma cells (A2780), it was found that compound 5c acts mainly by apoptose. Subsequently a series of new aryl­1H­1,2,3­triazol­4­yl­methyl ester (6a­o) and amide (7a­o) of hederagenin derivative was synthesized from alkynes 4x (ester) and 5e (amide) with different benzyl azides (a­o) by reacting "click" or reaction of 1,3­dipolar cycloaddition Huisgen, with yields between 35% and 95%. The cytotoxic activities of all the compounds were tested against the same cell lines of human cancer aforementioned. In addition, was employing a non­malignant fibroblast mice (NIH 3T3) using the same SRB assay. Compared with hederagenin the most compounds exhibit greater cytotoxicity against all tested cancer cell lines. The ester derivatives were more active than amides. In addition, esters with group meta­substituted such as 6c (m­Br) 6g (m­Cl) and 6n (m­NO2) were the most active derivatives against all the cell lines tested, showing an EC 50 in the range of 3.0 to 4.1 μM. Moreover, the analogues 6a (benzyl) and 6j (o­F), were more cytotoxic against colon cancer cells (HT29) with an EC50 = 2.8 μM and 1.6 μM, respectively. The compound 6j showed selectivity index of 5.4. Besides, an experiment of dye exclusion orange acridine/propidium iodide (AO/PI) using breast cancer cells (MCF­7) and analogues 6g and 6j showed that both compounds act primarily by programmed cell death. On the other hand, some derivatives of hederagenin (1­60) were evaluated in vitro on the proliferation of intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Some derivatives (3, 4, 44, 49 and 52), showed activity at micromolar level and low toxicity against BGM and HepG2 cells. Moreover, the ability of hederagenin derivatives 3 (IC50 = 9.7 μΜ), 4 (12 μΜ), 44 (11 μΜ) and 49 (2 μΜ), to prevent proliferation of intracellular amastigote forms of L. infantum and their higher selectivity index and low toxicity compared to commercial positive drug control of choice (potassium antimonyl tartrate trihydrate) (IC50 = 80.0 ± 0.13 μΜ, SI = 0.1), make these compounds promising candidates for the treatment of leishmaniasis.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2003.pdf: 2958413 bytes, checksum: 4160426061ec67f4e48d4d92b60d4806 (MD5) Previous issue date: 2006-12-15 / Universidade Federal de Sao Carlos / This work reports the study of a surprising plant microorganism relationship, involving the plant Sapindus saponaria, which is rich in antigungal saponins, and an endophyte fungus isolated from the pericarpe of the fruits collected in the host plant, and identified as Xylaria sp. The main objective of this work was to understand the survival mechanism of this fungus in such inhospitable ambient. It was found that this fungus biotransforms the structure of the saponins present in S. saponaria, making it less toxic, allowing the fungus to survive in the plant tissue. The reaction involved in this survival mechanism was a hidroxilation at ring C of the aglicone skeleton of saponins present in S. saponaria. This study also had as objective the stablishment of a fast method for the isolation and identification of saponins and ASOG (Acyclic Sesquiterpene Oligoglycosides) present in the plant s fruits. For the isolation of these compounds, the Sephadex® LH-20 column showed to be very efficient and the mass spectrometry technique (ESI-MS) was used as a rapid method of identification of this substances. The Xylaria sp. fungus was cultivated in synthetic mediums for the isolation of secondary metabolites. The microorganism showed a great potential for the production of several compounds, especially the isocoumarins. The analytical tools used to monitor all the experiments reported here comprises chromatographic and spectrometric techniques as HPLC, GC, open column chromatography, MS and MS/MS, 1D NMR and 2D NMR. Mechanisms of fragmentation were tentativelly suggested for all compounds studied by mass spectrometry. / Esse trabalho relata o estudo de uma surpreendente relação planta-microrganismo envolvendo a planta Sapindus saponaria, uma espécie extremamente rica em saponinas, em concentrações elevadas, as quais são compostos que possuem ação antifúngica bastante acentuada e, e um fungo do gênero Xylaria. O trabalho em questão teve por objetivo compreender o mecanismo de sobrevivência deste fungo em um ambiente tão inóspito. A resposta encontrada para esta questão foi que o fungo realiza uma biotransformação na estrutura das saponinas presentes em S. saponaria, possibilitando assim a sobrevivência deste nos tecidos da planta. Trata-se de uma reação de hidroxilação localizada no esqueleto triterpênico das saponinas presentes em S. saponaria. Outro objetivo do estudo foi encontrar um método rápido para o isolamento e identificação de saponinas e OGSA (Oligoglicosídeos Sesquiterpênicos Acíclicos) presentes nos frutos da planta. Para o isolamento destes compostos a fase estacionária Sephadex® LH-20 apresentou grande eficiência e a técnica de espectrometria de massas (MS) foi utilizada como um método rápido para identificação destas substâncias. O fungo Xylaria sp. foi cultivado em meios sintéticos para isolamento de metabólitos secundários. O microrganismo apresentou grande potencial para produção de diversos compostos, dando destaque para a classe das isocumarinas. Para realização deste trabalho foram utilizadas técnicas cromatográficas e espectrométricas como HPLC, GC, cromatografia em coluna, MS e MS/MS, 1D NMR e 2D NMR. Foram realizadas propostas de fragmentação para todos os compostos estudados por espectrometria de massas.

LIMA, Glauber Pacelli Gomes de. Purificação, caracterização bioquímica e atividade biológica in vitro contra insetos praga de um novo inibidor de tripsina isolado de sementes de Sapindus saponaria L. (Sapindaceae). 119 f. : Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-05-20T13:23:01Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_gpglima.pdf: 2370771 bytes, checksum: 509ae0531057d53f967b325467f88d5c (MD5) / Approved for entry into archive by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-23T11:59:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_gpglima.pdf: 2370771 bytes, checksum: 509ae0531057d53f967b325467f88d5c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-23T11:59:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_gpglima.pdf: 2370771 bytes, checksum: 509ae0531057d53f967b325467f88d5c (MD5) Previous issue date: 2012 / Environmental toxicity, low biodegradability and increased resistance in agricultural pest insects and in insect vectors of diseases to insecticides traditionally used for their control have encouraged the development of chemical alternatives with greater specificity and biodegradability especially from plants. In this way, the present study aimed the purification, characterization and evaluation of activity towards pest insect digestive enzymes of a new trypsin inhibitor obtained from Sapindus saponaria seeds. This new trypsin inhibitor obtained from S. saponaria seeds (SSTI2) belongs to Potato I inhibitor family and was purified by protein precipitation with trichloroacetic acid, affinity chromatography and reverse phase chromatography using UFLC system. The native inhibitor and its fragments generated by enzymatic treatment with trypsin and pepsin were analyzed and sequenced by MALDI-TOF and ESI-TOF mass spectrometry, determining its accurate molecular mass (MM = 7571, 976 Da) and primary structure (64 of 69 amino acids). The SSTI2 showed an IC50 of 8.3 x 10-2 μmol.L-1 against bovine trypsin, and a much lower inhibitory activity on the enzymes chymotrypsin (13.24 ± 0.28%) and papain (5.28 ± 0 , 42%), but was unable to inhibit proteolysis promoted by bromelain. In spite to show moderate inhibition of total digestive enzymes (4.74 ± 0.45% to 56.06 ± 1.41%), the inhibitor was very effective upon trypsin-like enzymes present in Aedes aegypti (92.44 ± 0.99%), Anthonomus grandis (77.93 ± 0.12%), Anticarsia gemmatalis ( 32.21 ± 0.57%) and Spodoptera frugiperda (71.44 ± 1.23%) guts. This strong inhibitory effect of SSTI2 on the catalytic activity of trypsin-like peptidases of insect’s midguts suggests a possible suppressive effect on development and survival of insects fed with diets containing the inhibitor. Thus, future in vivo assays and evaluation of other biochemical properties will be important to establish the potential biotechnological application of SSTI2, especially for the combat of Ae. aegypti, A. grandis and An. gemmatalis. Furthermore, the sequence of SSTI2 elucidated in this study allows the chemical synthesis, cloning of coding gene sequence and heterologous expression of this potential new biotechnological tool. / A toxicidade ao meio ambiente, a baixa biodegrabilidade e a crescente resistência de insetos praga da agricultura e de insetos vetores de doenças aos inseticidas tradicionalmente utilizados tem estimulado o desenvolvimento de alternativas com maior biodegradabilidade e especificidade, especialmente de origem vegetal. Nesse sentido, o presente estudo consistiu na purificação, caracterização e avaliação do efeito biológico in vitro de um novo inibidor de tripsina obtido das sementes de Sapindus saponaria sobre as enzimas digestivas de insetos. Através de precipitação com ácido tricloroacético (TCA), cromatografia de afinidade à tripsina e cromatografia de fase reversa em sistema UFLC, foi purificado um novo inibidor de tripsina (SSTI2) pertencente ao grupo de inibidores do tipo Batata I, uma categoria de inibidores de peptidases serínicas com reconhecido efeito tóxico sobre insetos. O inibidor nativo e fragmentos desse gerados por tratamento enzimático com tripsina e pepsina foram analisados e sequenciados por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF e ESI-TOF, determinando assim a sua massa molecular acurada (MM = 7571, 976 Da) e elucidando a sua estrutura primária (64/69 aminoácidos). O inibidor apresentou uma IC50 de 8,3 x 10-2 μmol.L-1 contra a tripsina bovina, mas apresentou baixa atividade inibitória sobre as enzimas quimotripsina (13,24 ± 0,28%) e papaína (5,28 ± 0,42%), e não foi capaz de inibir a proteólise promovida pela bromelaína. O SSTI2 inibiu moderadamente a atividade catalítica das enzimas digestivas totais dos insetos, com percentual de inibição variando entre 4,74 ± 0,45% a 56,06 ± 1,41%. No entanto, o inibidor foi eficaz em atuar sobre as enzimas digestivas do tipo tripsina presentes nos intestinos dos insetos Aedes aegypti (92,44 ± 0,99%), Anthonomus grandis (77,93 ± 0,12%), Anticarsia gemmatalis (32,21 ± 0,57%) e Spodoptera frugiperda (71,44 ± 1,23%). Esse expressivo efeito inibitório do SSTI2 sobre a atividade catalítica das peptidases do tipo tripsina provenientes do intestino médio dos insetos sugere um possível efeito supressor no desenvolvimento e sobrevivência de insetos alimentados com dietas contendo o inibidor. Assim, futuros estudos in vivo e avaliações de outras propriedades bioquímicas do inibidor serão importantes para determinar a potencial aplicação biotecnológica do SSTI2, especialmente para o combate de A. aegypti, A. grandis e A. gemmatalis. Além disso, a sequência do SSTI2 elucidada nesse estudo possibilita a síntese, clonagem do gene codificante e expressão heteróloga dessa potencial ferramenta biotecnológica.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:30:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6649.pdf: 9701388 bytes, checksum: 3e40ab44238910a6a41ff07222755928 (MD5) Previous issue date: 2015-03-06 / Universidade Federal de Sao Carlos / The organization and dynamic of community are determined, among other factors, by the balance of positive and negative interactions of species. Research of plants with allelopathic activity comes from the need to introduce new alternatives in the management of agricultural pests. Species of Sapindaceae family are rich source of phytochemicals and have a huge potential for the production of secondary compounds with biopesticide activity. This study attempted to clarify the following issues: (1) leaves and stems/bark extracts of Serjania lethalis A. St.-Hil. and Sapindus saponaria L. could interfere in the diaspores germination and seedling growth of sesame (Sesamum indicum L.), radish (Raphanus sativus L.), wheat (Triticum aestivum L.)? (2) In addition, these extracts could affect the development of wild poinsettia (Euphorbia heterophylla L.) and barnyardgrass (Echinochloa crus-galli (L.) P. Beauv.), allowing thus the control of these weeds? (3) The fractionated extracts from S. saponaria could present insecticidal activity against the mortality of Toxoptera citricidus Kirkaldy (Homoptera: Aphididae) adults and nymphs? (4) Among the active extracts, which is most promising for start a bioprospecting, allowing isolate and identify the compounds present? To answer these questions bioassays were performed with ethanol or aqueous crude extract (2.5, 5.0, 7.5 and 10%, w/v) and tested with fractionated extract by liquid-liquid partition using hexane, ethyl acetate (EtOAc) and butanol. Leaf and stem/stem bark extracts of S. lethalis and S. saponaria were phytotoxic and inhibited the process of germination and seedling growth of weeds and cultivated species, showing concentration-dependent effect. The phytotoxic effect of the extracts ranged according to the receptor species, and, in most cases, the leaf extract showed greater inhibitory activity. For some variables, this effect was similar and even superior to commercial herbicide. One of the action modes was observed in root growth of sesame and wild poinsettia seedlings, wherein the extract caused a significant decrease in elongation of metaxylem cells. The EtOAc fraction from the ethanol extract of S. saponaria leaves showed inhibitory effect greater than the hexane fraction on the development of barnyardgrass and wild poinsettia seedlings. The phytochemical study of this fraction resulted in the isolation of 3-(1,2-dimethyl-5-oxabicyclo [2.1.1] hexan-2-yl) but-2-enoic acid, a monoterpene acid with spectroscopic characteristics not known in the literature. This compound also inhibited the germination and growth of weeds; however, the EtOAc fraction was more active in reducing seedlings growth. The hexane fraction from the ethanol extract of S. saponaria leaves showed phytotoxic effect on elongation of wheat coleoptile and caused high mortality of T. citricidus nymphs and adults. The main substances 22 identified in this fraction were flavonols derivative of kaempferol and quercetin, and these may be involved in the biological activity observed. Thus, S. saponaria may be a donor species of compound with insecticide and herbicide potential, and a good candidate to supply allelochemicals for future use in agriculture. / A organização e dinâmica de uma comunidade são determinadas, entre outros fatores, pelo balanço das interações positivas e negativas das espécies. A investigação de plantas com atividade alelopática vem de encontro com a necessidade de se apresentar novas alternativas no manejo de pragas agrícolas. As espécies da família Sapindaceae são uma fonte rica de fitoquímicos e possuem um imenso potencial para a produção de compostos secundários com atividade biopesticida. Assim, este trabalho tentou esclarecer as seguintes questões: (1) os extratos de folhas e caules/cascas de Serjania lethalis A. St.-Hil. e Sapindus saponaria L. poderiam interferir no processo de germinação dos diásporos e crescimento das plântulas de gergelim (Sesamum indicum L.), rabanete (Raphanus sativus L.) e trigo (Triticum aestivum L.)? (2) Além disso, esses extratos poderiam afetar o desenvolvimento do amendoim-bravo (Euphorbia heterophylla L.) e capim-arroz (Echinochloa crus-galli (L.) P. Beauv.), possibilitando, assim, o controle destas espécies daninhas? (3) Os extratos fracionados de S. saponaria poderiam apresentar atividade inseticida sobre a mortalidade de adultos e ninfas de Toxoptera citricidus Kirkaldy (Homoptera: Aphididae)? (4) Dentre os extratos ativos, qual o mais promissor para se iniciar uma bioprospecção, permitindo isolar e identificar os compostos presentes? Para responder essas perguntas foram realizados bioensaios com extratos brutos aquosos ou etanólicos (2,5; 5,0; 7,5 e 10%, m/v) e, posteriormente, testes com extrato fracionado por partição líquido-líquido utilizando hexano, acetato de etila (AcOEt) e butanol. Os extratos de folha e caule/cascas do caule de S. lethalis e S. saponaria foram fitotóxicos e inibiram o processo de germinação e o crescimento das plântulas de espécies cultivadas e daninhas, com efeito dependente da concentração. A fitotoxicidade dos extratos variou de acordo com a espécie receptora, sendo que, na maioria dos casos, o extrato foliar apresentou maior atividade inibitória. Para algumas variáveis, esse efeito foi similar e até mesmo superior ao do herbicida comercial. Um dos modos de ação observado foi no crescimento radicular das plântulas de gergelim e amendoim-bravo, em que os extratos ocasionaram uma diminuição significativa no alongamento das células do metaxilema. A fração AcOEt proveniente do extrato etanólico das folhas de S. saponaria apresentou efeito inibitório superior ao da fração hexânica sobre o desenvolvimento das plântulas de capim arroz e amendoim-bravo. O estudo fitoquímico dessa fração resultou no isolamento do ácido 3-(1,2-dimetil-5-oxabiciclo[2.1.1]hexan-2-il)but-2-enoico, um ácido monoterpeno com características espectroscópicas não conhecidas na literatura. Esse composto também inibiu a germinação e o crescimento das espécies daninhas; porém, a fração AcOEt atuou com mais intensidade na redução do crescimento dessas plântulas. Por outro lado, a fração hexânica oriunda do extrato etanólico de folhas de S. saponaria apresentou efeito fitotóxico sobre o alongamento dos coleóptilos de trigo e ocasionou elevada mortalidade sobre ninfas e 20 adultos de T. citricidus. As principais substâncias identificadas nessa fração foram os flavonóis derivados do caempferol e quercetina e, estes podem estar envolvidos na atividade biológica observada. Assim, S. saponaria pode ser uma espécie doadora de compostos com potencial inseticida e herbicida, sendo uma boa candidata para o fornecimento de aleloquímicos para uso futuro na agricultura.

LIMA, G. P. G. Purificação, caracterização bioquímica e atividade biológica in vitro contra insetos praga de um novo inibidor de tripsina isolado de sementes de Sapindus saponaria L. (Sapindaceae). 2012. 122 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2015-03-12T15:00:00Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_gpglima.pdf: 2370771 bytes, checksum: 509ae0531057d53f967b325467f88d5c (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2016-03-29T17:18:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_gpglima.pdf: 2370771 bytes, checksum: 509ae0531057d53f967b325467f88d5c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-29T17:18:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_gpglima.pdf: 2370771 bytes, checksum: 509ae0531057d53f967b325467f88d5c (MD5) Previous issue date: 2012 / Environmental toxicity, low biodegradability and increased resistance in agricultural pest insects and in insect vectors of diseases to insecticides traditionally used for their control have encouraged the development of chemical alternatives with greater specificity and biodegradability especially from plants. In this way, the present study aimed the purification, characterization and evaluation of activity towards pest insect digestive enzymes of a new trypsin inhibitor obtained from Sapindus saponaria seeds. This new trypsin inhibitor obtained from S. saponaria seeds (SSTI2) belongs to Potato I inhibitor family and was purified by protein precipitation with trichloroacetic acid, affinity chromatography and reverse phase chromatography using UFLC system. The native inhibitor and its fragments generated by enzymatic treatment with trypsin and pepsin were analyzed and sequenced by MALDI-TOF and ESI-TOF mass spectrometry, determining its accurate molecular mass (MM = 7571, 976 Da) and primary structure (64 of 69 amino acids). The SSTI2 showed an IC50 of 8.3 x 10-2 μmol.L-1 against bovine trypsin, and a much lower inhibitory activity on the enzymes chymotrypsin (13.24 ± 0.28%) and papain (5.28 ± 0 , 42%), but was unable to inhibit proteolysis promoted by bromelain. In spite to show moderate inhibition of total digestive enzymes (4.74 ± 0.45% to 56.06 ± 1.41%), the inhibitor was very effective upon trypsin-like enzymes present in Aedes aegypti (92.44 ± 0.99%), Anthonomus grandis (77.93 ± 0.12%), Anticarsia gemmatalis ( 32.21 ± 0.57%) and Spodoptera frugiperda (71.44 ± 1.23%) guts. This strong inhibitory effect of SSTI2 on the catalytic activity of trypsin-like peptidases of insect’s midguts suggests a possible suppressive effect on development and survival of insects fed with diets containing the inhibitor. Thus, future in vivo assays and evaluation of other biochemical properties will be important to establish the potential biotechnological application of SSTI2, especially for the combat of Ae. aegypti, A. grandis and An. gemmatalis. Furthermore, the sequence of SSTI2 elucidated in this study allows the chemical synthesis, cloning of coding gene sequence and heterologous expression of this potential new biotechnological tool. / A toxicidade ao meio ambiente, a baixa biodegrabilidade e a crescente resistência de insetos praga da agricultura e de insetos vetores de doenças aos inseticidas tradicionalmente utilizados tem estimulado o desenvolvimento de alternativas com maior biodegradabilidade e especificidade, especialmente de origem vegetal. Nesse sentido, o presente estudo consistiu na purificação, caracterização e avaliação do efeito biológico in vitro de um novo inibidor de tripsina obtido das sementes de Sapindus saponaria sobre as enzimas digestivas de insetos. Através de precipitação com ácido tricloroacético (TCA), cromatografia de afinidade à tripsina e cromatografia de fase reversa em sistema UFLC, foi purificado um novo inibidor de tripsina (SSTI2) pertencente ao grupo de inibidores do tipo Batata I, uma categoria de inibidores de peptidases serínicas com reconhecido efeito tóxico sobre insetos. O inibidor nativo e fragmentos desse gerados por tratamento enzimático com tripsina e pepsina foram analisados e sequenciados por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF e ESI-TOF, determinando assim a sua massa molecular acurada (MM = 7571, 976 Da) e elucidando a sua estrutura primária (64/69 aminoácidos). O inibidor apresentou uma IC50 de 8,3 x 10-2 μmol.L-1 contra a tripsina bovina, mas apresentou baixa atividade inibitória sobre as enzimas quimotripsina (13,24 ± 0,28%) e papaína (5,28 ± 0,42%), e não foi capaz de inibir a proteólise promovida pela bromelaína. O SSTI2 inibiu moderadamente a atividade catalítica das enzimas digestivas totais dos insetos, com percentual de inibição variando entre 4,74 ± 0,45% a 56,06 ± 1,41%. No entanto, o inibidor foi eficaz em atuar sobre as enzimas digestivas do tipo tripsina presentes nos intestinos dos insetos Aedes aegypti (92,44 ± 0,99%), Anthonomus grandis (77,93 ± 0,12%), Anticarsia gemmatalis (32,21 ± 0,57%) e Spodoptera frugiperda (71,44 ± 1,23%). Esse expressivo efeito inibitório do SSTI2 sobre a atividade catalítica das peptidases do tipo tripsina provenientes do intestino médio dos insetos sugere um possível efeito supressor no desenvolvimento e sobrevivência de insetos alimentados com dietas contendo o inibidor. Assim, futuros estudos in vivo e avaliações de outras propriedades bioquímicas do inibidor serão importantes para determinar a potencial aplicação biotecnológica do SSTI2, especialmente para o combate de A. aegypti, A. grandis e A. gemmatalis. Além disso, a sequência do SSTI2 elucidada nesse estudo possibilita a síntese, clonagem do gene codificante e expressão heteróloga dessa potencial ferramenta biotecnológica.