A tecnologia de sequenciamento de nova geração (next-generation sequencing – NGS) e suas aplicações tem sido cada vez mais utilizada na prática médica para elucidar a base molecular de doenças Mendelianas. Embora seja uma poderosa ferramenta de pesquisa, ainda existe uma importante transição quanto à análise dos dados entre as tecnologias tradicionais de sequenciamento e o NGS. A primeira parte deste trabalho aborda aspectos analíticos envolvidos nesta mudança, com foco na plataforma Ion Torrent Personal Genome Machine. Esta é uma plataforma amplamente utilizada para sequenciar painéis de genes, já que esta aplicação requer menor rendimento de dados. Este trabalho demonstra indicadores adequados para avaliar a qualidade de corridas de sequenciamento e também uma estratégia baseada em valores de profundidade de cobertura para avaliar a performance de amplicons em diferentes cenários. Por outro lado, o NGS permitiu a realização de estudos populacionais em larga escala que estão mudando nossa compreensão sobre as variações genéticas humanas. Um desses exemplos são as mutações até então chamadas de silenciosas, que estão sendo implicadas como causadoras de doenças humanas. A segunda parte deste trabalho investiga a patogenicidade de polimorfismos de núcleotídeo único sinônimos (synonymous single nucleotide polymorphisms – sSNP) baseado em dados públicos obtidos do Exome Aggregation Consortium (ExAC) (exac.broadinstitute.org/) utilizando o software Silent Variant Analysis (SilVA) (compbio.cs.toronto.edu/silva/) e outros recursos para reunir informações adicionais sobre consequências funcionais visando fornecer um panorama dos efeitos patogênicos de sSNP em mais de 60.000 exomas humanos. Nós demonstramos que de 1,691,045 variantes sinônimas, um total de 26,034 foram classificadas como patogênicas pelo SilVA, com frequência alélica menor que 0,05. Análises funcionais in silico revelaram que as variantes sinônimas patogênicas estão envolvidas em processos biológicos importantes, como regulação celular, metabolismo e transporte. Ao expor um cenário de variações sinônimas patogênicas em exomas humanos, nós concluímos que filtrar sSNP em workflows de priorização é razoável, no entanto em situações específicas os sSNP podem ser considerados. Pesquisas futuras neste campo poderão fornecer uma imagem clara do papel de tais variações em doenças genéticas. / Next-generation sequencing (NGS) technologies and its applications are increasingly used in medicine to elucidate the molecular basis of Mendelian diseases. Although it is a powerful research tool, there is still an important transition regarding data analysis between traditional sequencing techniques and NGS. The first part of this work addresses analytical aspects involved on this switch-over, focusing on the Ion Torrent Personal Genome Machine platform. This is a widely used platform for sequencing gene panels, as this application demands lower throughput of data. We present indicators suitable to evaluate quality of sequencing runs and also a strategy based on depth of coverage values to evaluate amplicon performance on different scenarios. On the other hand, NGS enabled large-scale population studies that are changing our understanding about human genetic variations. One of these examples are the so-called silent mutations, that are being implied as causative of human diseases. The second part of this work investigates the pathogenicity of synonymous single nucleotide polymorphisms (sSNP) based on public data obtained from the Exome Aggregation Consortium (ExAC) (exac.broadinstitute.org/) using the software Silent Variant Analysis (SilVA) (compbio.cs.toronto.edu/silva/) and other sources to gather additional information about affected protein domains, mRNA folding and functional consequences aiming to provide a landscape of harmfulness of sSNP on more than 60,000 human exomes. We show that from 1,691,045 synonymous variants a total of 26,034 were classified as pathogenic and by SilVA, with allele frequency lower than 0.05. In silico functional analysis revealed that pathogenic synonymous variants found are involved in important biological process, such as cellular regulation, metabolism and transport. By exposing a scenario of pathogenic synonymous variants on human exomes we conclude that filtering out sSNP on prioritization workflows is reasonable, although in some specific cases sSNP should be considered. Future research on this field will provide a clear picture of such variations on genetic diseases.

A tecnologia de sequenciamento de nova geração (next-generation sequencing – NGS) e suas aplicações tem sido cada vez mais utilizada na prática médica para elucidar a base molecular de doenças Mendelianas. Embora seja uma poderosa ferramenta de pesquisa, ainda existe uma importante transição quanto à análise dos dados entre as tecnologias tradicionais de sequenciamento e o NGS. A primeira parte deste trabalho aborda aspectos analíticos envolvidos nesta mudança, com foco na plataforma Ion Torrent Personal Genome Machine. Esta é uma plataforma amplamente utilizada para sequenciar painéis de genes, já que esta aplicação requer menor rendimento de dados. Este trabalho demonstra indicadores adequados para avaliar a qualidade de corridas de sequenciamento e também uma estratégia baseada em valores de profundidade de cobertura para avaliar a performance de amplicons em diferentes cenários. Por outro lado, o NGS permitiu a realização de estudos populacionais em larga escala que estão mudando nossa compreensão sobre as variações genéticas humanas. Um desses exemplos são as mutações até então chamadas de silenciosas, que estão sendo implicadas como causadoras de doenças humanas. A segunda parte deste trabalho investiga a patogenicidade de polimorfismos de núcleotídeo único sinônimos (synonymous single nucleotide polymorphisms – sSNP) baseado em dados públicos obtidos do Exome Aggregation Consortium (ExAC) (exac.broadinstitute.org/) utilizando o software Silent Variant Analysis (SilVA) (compbio.cs.toronto.edu/silva/) e outros recursos para reunir informações adicionais sobre consequências funcionais visando fornecer um panorama dos efeitos patogênicos de sSNP em mais de 60.000 exomas humanos. Nós demonstramos que de 1,691,045 variantes sinônimas, um total de 26,034 foram classificadas como patogênicas pelo SilVA, com frequência alélica menor que 0,05. Análises funcionais in silico revelaram que as variantes sinônimas patogênicas estão envolvidas em processos biológicos importantes, como regulação celular, metabolismo e transporte. Ao expor um cenário de variações sinônimas patogênicas em exomas humanos, nós concluímos que filtrar sSNP em workflows de priorização é razoável, no entanto em situações específicas os sSNP podem ser considerados. Pesquisas futuras neste campo poderão fornecer uma imagem clara do papel de tais variações em doenças genéticas. / Next-generation sequencing (NGS) technologies and its applications are increasingly used in medicine to elucidate the molecular basis of Mendelian diseases. Although it is a powerful research tool, there is still an important transition regarding data analysis between traditional sequencing techniques and NGS. The first part of this work addresses analytical aspects involved on this switch-over, focusing on the Ion Torrent Personal Genome Machine platform. This is a widely used platform for sequencing gene panels, as this application demands lower throughput of data. We present indicators suitable to evaluate quality of sequencing runs and also a strategy based on depth of coverage values to evaluate amplicon performance on different scenarios. On the other hand, NGS enabled large-scale population studies that are changing our understanding about human genetic variations. One of these examples are the so-called silent mutations, that are being implied as causative of human diseases. The second part of this work investigates the pathogenicity of synonymous single nucleotide polymorphisms (sSNP) based on public data obtained from the Exome Aggregation Consortium (ExAC) (exac.broadinstitute.org/) using the software Silent Variant Analysis (SilVA) (compbio.cs.toronto.edu/silva/) and other sources to gather additional information about affected protein domains, mRNA folding and functional consequences aiming to provide a landscape of harmfulness of sSNP on more than 60,000 human exomes. We show that from 1,691,045 synonymous variants a total of 26,034 were classified as pathogenic and by SilVA, with allele frequency lower than 0.05. In silico functional analysis revealed that pathogenic synonymous variants found are involved in important biological process, such as cellular regulation, metabolism and transport. By exposing a scenario of pathogenic synonymous variants on human exomes we conclude that filtering out sSNP on prioritization workflows is reasonable, although in some specific cases sSNP should be considered. Future research on this field will provide a clear picture of such variations on genetic diseases.

A tecnologia de sequenciamento de nova geração (next-generation sequencing – NGS) e suas aplicações tem sido cada vez mais utilizada na prática médica para elucidar a base molecular de doenças Mendelianas. Embora seja uma poderosa ferramenta de pesquisa, ainda existe uma importante transição quanto à análise dos dados entre as tecnologias tradicionais de sequenciamento e o NGS. A primeira parte deste trabalho aborda aspectos analíticos envolvidos nesta mudança, com foco na plataforma Ion Torrent Personal Genome Machine. Esta é uma plataforma amplamente utilizada para sequenciar painéis de genes, já que esta aplicação requer menor rendimento de dados. Este trabalho demonstra indicadores adequados para avaliar a qualidade de corridas de sequenciamento e também uma estratégia baseada em valores de profundidade de cobertura para avaliar a performance de amplicons em diferentes cenários. Por outro lado, o NGS permitiu a realização de estudos populacionais em larga escala que estão mudando nossa compreensão sobre as variações genéticas humanas. Um desses exemplos são as mutações até então chamadas de silenciosas, que estão sendo implicadas como causadoras de doenças humanas. A segunda parte deste trabalho investiga a patogenicidade de polimorfismos de núcleotídeo único sinônimos (synonymous single nucleotide polymorphisms – sSNP) baseado em dados públicos obtidos do Exome Aggregation Consortium (ExAC) (exac.broadinstitute.org/) utilizando o software Silent Variant Analysis (SilVA) (compbio.cs.toronto.edu/silva/) e outros recursos para reunir informações adicionais sobre consequências funcionais visando fornecer um panorama dos efeitos patogênicos de sSNP em mais de 60.000 exomas humanos. Nós demonstramos que de 1,691,045 variantes sinônimas, um total de 26,034 foram classificadas como patogênicas pelo SilVA, com frequência alélica menor que 0,05. Análises funcionais in silico revelaram que as variantes sinônimas patogênicas estão envolvidas em processos biológicos importantes, como regulação celular, metabolismo e transporte. Ao expor um cenário de variações sinônimas patogênicas em exomas humanos, nós concluímos que filtrar sSNP em workflows de priorização é razoável, no entanto em situações específicas os sSNP podem ser considerados. Pesquisas futuras neste campo poderão fornecer uma imagem clara do papel de tais variações em doenças genéticas. / Next-generation sequencing (NGS) technologies and its applications are increasingly used in medicine to elucidate the molecular basis of Mendelian diseases. Although it is a powerful research tool, there is still an important transition regarding data analysis between traditional sequencing techniques and NGS. The first part of this work addresses analytical aspects involved on this switch-over, focusing on the Ion Torrent Personal Genome Machine platform. This is a widely used platform for sequencing gene panels, as this application demands lower throughput of data. We present indicators suitable to evaluate quality of sequencing runs and also a strategy based on depth of coverage values to evaluate amplicon performance on different scenarios. On the other hand, NGS enabled large-scale population studies that are changing our understanding about human genetic variations. One of these examples are the so-called silent mutations, that are being implied as causative of human diseases. The second part of this work investigates the pathogenicity of synonymous single nucleotide polymorphisms (sSNP) based on public data obtained from the Exome Aggregation Consortium (ExAC) (exac.broadinstitute.org/) using the software Silent Variant Analysis (SilVA) (compbio.cs.toronto.edu/silva/) and other sources to gather additional information about affected protein domains, mRNA folding and functional consequences aiming to provide a landscape of harmfulness of sSNP on more than 60,000 human exomes. We show that from 1,691,045 synonymous variants a total of 26,034 were classified as pathogenic and by SilVA, with allele frequency lower than 0.05. In silico functional analysis revealed that pathogenic synonymous variants found are involved in important biological process, such as cellular regulation, metabolism and transport. By exposing a scenario of pathogenic synonymous variants on human exomes we conclude that filtering out sSNP on prioritization workflows is reasonable, although in some specific cases sSNP should be considered. Future research on this field will provide a clear picture of such variations on genetic diseases.

Este trabalho descreve o isolamento e purificação de uma sequência genômica de Phanerochaete chrysosporium. Esta sequência mostrou alta homologia a um fragmento de 860 pb do gene de β-glucosidase de Trichoderma reesei que foi amplificado através da técnica de reação de polimerização em cadeia (PCR). Os ensaios de hibridização contra o DNA genômico de P. chrysosporium digerido com enzimas de restrição (HindIII, SalI, PstI, EcoRI e BamHI) mostraram várias bandas. Uma única banda de, aproximadamente, 6Kb foi verificada na digestão com EcoRI. Essa banda foi isolada e clonada no sítio de EcoRI do bacteriófago λgt11. Desta forma, foi feito um banco genômico enriquecido. Através da triagem deste banco foi possível isolar e purificar clones com alta homologia a sonda molecular. / This work describes the isolation and purification of a genomic sequence from Phanerochaete chrysosporium. This sequence has shown a high homology to an 860 bp β-glucosidase gene fragment from Trichoderma reesei which was amplified through polymerase chain reaction technique and employed as probe. The hybridization assays against Phanerochaete chrysosporium genomic DNA digested with restriction enzymes (Hind 111, SalI, PstI, EcoRI, BamHI) showed several bands. A unique band, about 6 Kb, was verified within the digestion with EcoRI. This band was isolated and cloned into λgt11 bacteriophage EcoRI cloning site, so, this way, an enhanced genomic library was made. Throughout the screening of this library was possible to isolate and purify clones with high homology to the probe.

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:36:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_7170_Ludymila Brandão Motta.pdf: 7486868 bytes, checksum: a0e1e33cf1278b9f7fc7367d7bccdaa3 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / A genotipagem por sequenciamento (GBS) é capaz de identificar e genotipar milhares de polimorfismos do tipo SNPs de forma simultânea. Objetiva-se contribuir para o melhoramento genético do cafeeiro Conilon através da caracterização da ocorrência de SNPs no genoma de Coffea canephora e de associações destes com características de interesse agronômico. Os145 indivíduos de duas famílias de irmãos completos (clones 109x120/120x109 e 76x48) do programa de melhoramento do Instituto Capixaba de Pesquisa, Assistência Técnica e Extensão Rural (Incaper)foram fenotipados e os DNAs foram multiplexados em sequenciador Ilumina na Universidade de Cornell. Detectaram-se 91.105 SNPs antes de aplicar os parâmetros de filtragem, sendo que após os filtros houve redução de 64%. Ampla distribuição dos SNPs foi encontrada, sendo que foram detectados em média 1330 SNPs gênicos e 2955 intergênicos, por pseudocromossomo. Verificou-se que o padrão de distribuição dos SNPs nas regiões do genoma difere. A menor ocorrência de SNPs detectada em regiões gênicas é esperada como consequência da pressão de seleção, que limita as alterações de aminoácidos nas sequências proteicas. Os estudos de associação permitiram encontrar 18 SNPs associados a características fenotípicas de Coffea canephora (S2_9329731, S2_4579518, S2_41329025, S2_17821870, S2_20934616, S3_23227842, S4_22978689, S5_10964474, S6_9949547, S7_13991105, S7_13991086, S7_13991077, S9_4618814, S9_18527411, S10_24840747, S11_30063996, S11_23828233). Localizam-se em regiões intergênicas 33% dos SNPs, sendo que os demais se distribuem em região de íntrons, éxons e 3UTR. Os SNPs em região codificadora são responsáveis por alterações não sinônimas em 82% das ocorrências. Os resultados encontrados são importantes para a cafeicultura e podem contribuir para a seleção assistida por marcadores. Palavras-chave: cafeeiro, sequenciamento, SNP, genotipagem, estudos de associação.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:48:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo111_1.pdf: 2108554 bytes, checksum: 7c12ed18827845d85ca40cd1cc8553e0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O paramyxovírus ofídio (OPMV) Brasil foi isolado em cultivo de células Vero, a partir de amostras coletadas do fluido pulmonar de serpentes Crotalus durissus terrificus. Estas apresentavam sinais de pneumonia, enquanto eram mantidas no Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos, Botucatu, São Paulo, Brasil. Amostras do OPMV Brasil purificado por ultracentrifugação em gradiente de sacarose foram inicialmente submetidas a alguns tratamentos no intuito de eliminar possíveis ácidos nucléicos contaminantes. Com o objetivo de realizar o sequenciamento do seu genoma, foi padronizada a técnica de PCR randômica. Através desta técnica foram obtidos seis fragmentos que representam proteínas de nucleocapsídeo, fosfoproteína, fusão e polimerase viral, variando entre 413 a 553 pb, exibindo identidade entre 82% a 89% com a espécie tipo dos paramyxovírus de répteis, o Fer-de-Lance vírus (FDLV - AY141760). Com base nestas informações outros primers foram desenhados e mais um fragmento com 670 pb foi sequenciado, o qual corresponde ao gene U com 85% de identidade com o FDLV. Juntamente com outras sequências obtidas por PCR para os genes HN, F e L, bem como uma sequência parcial para o gene F publicada por outros pesquisadores (AF251500) foram montadas sequências contíguas utilizando o software MEGA v4.0, as quais foram alinhadas e comparadas através do BLASTn contra os dados depositados no GenBank. Ao todo foram obtidos 10 fragmentos genômicos do OPMV Brasil, 3 fragmentos por PCR tradicional, 6 por PCR randômica e 1 por primer walking. Cerca de 5313 nucleotídeos foram sequenciados, ou seja, um terço do genoma se comparado com 15378 pb do FDLV. Não foram obtidas sequências apenas para o gene M (matrix). As sequências de aminoácidos apresentaram identidade entre 77% e 97% com o FDLV e as sequências de aminoácidos de 4 fragmentos foram homólogas aos domínios conservados das proteínas N, F, HN e L. Quando comparadas as sequências para o gene F obtidas durante esta pesquisa com a depositada no GenBank sob número de acesso AF251500, constatou-se 100% de similaridade entre 328 nucleotídeos comuns, cerca de 109 aminoácidos. Portanto sugere-se que, em 2001, o mesmo agente viral afetou, no mesmo período, as serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus em diferentes regiões do estado de São Paulo. Baseado nas comparações das sequências de aminoácidos com o FDLV, OPMV Brasil pode ser considerado uma espécie diferente. Contudo, é necessário identificar as relações filogenéticas do OPMV Brasil com outras espécies de paramyxovírus isoladas até o momento

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-12-19Bitstream added on 2014-06-13T18:41:11Z : No. of bitstreams: 1 silva_gp_dr_rcla.pdf: 1260750 bytes, checksum: f19ff28f2ada22b250d02543a6ad96ca (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Hialuronidases pertencem a um grupo de enzimas hidrolíticas, as quais degradam o ácido hialurônico, um polissacarídeo de alta massa molecular, encontrado em todos os tecidos de mamíferos e fluídos corpóreos. O ácido hialurônico é um componente da matriz extracelular de vertebrados, que preenche os espaços entre células e fibras, e age como lubrificante, bem como uma barreira à penetração de partículas estranhas. Os níveis de ácido hialurônico são marcadamente aumentados durante a embriogênese, inflamação, transformação maligna e em qualquer lugar que seja requerido a rápida substituição de tecido e remodelamento. Os defeitos no metabolismo do ácido hialurônico parecem relacionar-se a várias doenças sugerindo que o seu nível seja altamente controlado. No entanto, surpreendentemente, o estudo de enzimas envolvidas na síntese e degradação do ácido hialurônico tem sido negligenciado. Em venenos de insetos Hymenoptera (abelhas, formigas e vespas), a hialuronidase é uma enzima comum e um dos mais importantes alérgenos, sendo também, o único em potencial, que pode promover reatividade-cruzada entre os venenos de abelhas e vespas, como também entre os de diferentes gêneros e espécies de vespídeos, levando à produção de reações alérgicas mediadas por IgE, umas das maiores causas de anafilaxia em pacientes alérgicos ao veneno. Neste trabalho, através da metodologia de RACE-PCR, foi determinada e caracterizada, a seqüência completa de cDNA do alérgeno - hialuronidase - do veneno da vespa urbana Polybia paulista, a qual, é bastante agressiva e abundante no Estado de São Paulo, sendo responsável por muitos acidentes de importância médica, devido ao seu veneno que, assim como em outros vespídeos, apresenta três conhecidos alérgenos - hialuronidase, fosfolipase e antígeno 5. O cDNA foi obtido a partir do mRNA extraído dos abdomens dos insetos e amplificado por iniciadores gene-específicos.... / Hyaluronidases are a group of hydrolytic enzymes which degrade Hyaluronic acid (HA), the most abundant glycocaminoglycan of vertebrate extracellular space. HA is a high molecular weight polysaccharide found in virtually all mammalian tissues and body fluids, where it fills the space between cells and fibers and acts as a lubrificant as well as a barrier to penetration by foreign particles. Hyaluronic acid levels are markedly increased during the embryogenesis, inflammation, malignant transformation and whenever fast tissue turnover and remodeling is required. Defects in HA metabolism appear to be related to various diseases suggesting that the level of HA must be tightly controlled. Surprisingly, the study of the enzymes involved in HA synthesis and degradation has been greatly neglected. In venoms of Hymenoptera insects (bees, ants and wasps), the hyaluronidase is a common enzyme and one of the most important allergen, being potentially the unique that are able to promote immunological cross-reactivity between venoms from bees and wasps, and also among vespid venoms from different genus and species, producing allergic reactions IgE-mediated, one of the main causes of anaphylaxis in venom-allergic patients. In this work, by the RACE-PCR methodology, the hyaluronidase cDNA complete sequence from the urban wasp Polybia paulista was determined and characterized. This wasp is very aggressive and abundant in the São Paulo state, being responsible for many accidents of medical importance due its venom, which contains, like other vespids, three well known allergens- hyaluronidase, phospholipase and antigen 5. The cDNA was obtained from mRNA extracted from insect abdomens and amplified by gene-specific primers. At first, two consecutive sequences of about 800 and 600 bp were obtained, purified, cloned and sequenced. After, the hyaluronidase cDNA complete sequence of 991pb was obtained, purified and directly sequenced The resulting data were analyzed .

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-05-03T12:50:05Z No. of bitstreams: 1 2016_FlaviaMileneBarrosSantos.pdf: 1735456 bytes, checksum: dd60486e946e2722c9df890ca5d11303 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2016-05-13T13:48:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_FlaviaMileneBarrosSantos.pdf: 1735456 bytes, checksum: dd60486e946e2722c9df890ca5d11303 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-13T13:48:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_FlaviaMileneBarrosSantos.pdf: 1735456 bytes, checksum: dd60486e946e2722c9df890ca5d11303 (MD5) / Em todo o mundo, as florestas são responsáveis por ocupar cerca de 4 bilhões de hectares. O Brasil apresenta a segunda maior floresta do mundo, com cerca de 54,4% do seu território nacional sendo constituído por florestas naturais e plantadas, distribuídas em seis biomas. As espécies florestais/arbóreas são de grande importância econômica para o país, pois a partir dos produtos obtidos direta ou indiretamente podem favorecer o sustento da população. Além disso, espécies arbóreas podem servir de habitat para diversos microorganismos, entre eles os vírus. Os estudos de vírus infectando espécies arbóreas no Brasil ainda são escassos, devido a algumas dificuldades para detecção e caracterização desse grupo de patógenos devido às suas características peculiares. Com isso o principal objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar espécies virais em espécies arbóreas nativas de diversos biomas encontrados no Brasil. Recentemente novas ferramentas como a metagenômica e plataformas de sequenciamento em alta escala têm propiciado ampliar o conhecimento da diversidade de organismos em diferentes ambientes. Nesse contexto, 60 mudas sintomáticas de espécies arbóreas distribuídas em 27 espécies botânicas e classificadas em 14 famílias, foram coletadas em ambiente de viveiro II da Companhia Urbanizadora da Nova Capital do Brasil (NOVACAP). As amostras analisadas, em pool, tiveram o RNA extraído (protocolo Trizol) após procedimento de semi-purificação visando enriquecimento de partículas virais. Após este procedimento uma amostra composta foi formada e enviada para sequenciamento na Universidade Católica de Brasília (UCB) por meio da tecnologia NGS (Next Generation Sequencing), com o uso da plataforma Illumina Miseq. Os resultados obtidos a partir da análise genômica produziram 2.162 contigs que foram comparados com resultados do banco de dados no programa BLASTX (Basic Local Alignment Search Tool). A partir do sequenciamento foi obtido um genoma com 9.529 nucleotídeos (nt). Após várias análises verificou-se que o espécime em estudo relaciona-se filogeneticamente com membros da ordem Picornavirales, ao qual denominamos aqui de Hovenia dulcis associated virus (HDAV) Primers específicos para este genoma foram sintetizados e por meio de RT-PCR foi possível realizar a detecção viral em uma amostra de uva do Pará (Hovenia dulcis). Ainda com base no resultado de NGS, sequências de outras seis espécies virais foram obtidas e encontram-se listadas a seguir: Cowpea mild mottle virus - CPMMV (gênero Carlavirus e família Betaflexiviridae), Eupatorium vein clearing virus e Strawberry vein banding virus - SVBV (gênero Caulimovirus e família Caulimoviridae), Cowpea severe mosaic virus - CPSMV (gênero Comovirus e família Secoviridae), Broad bean wilt virus - BBWV e Mikania micrantha mosaic virus - MMMV (gênero Fabavirus família Secoviridae). __________________________________________________________________________ ABSTRACT / Worldwide, forests are responsible for occupying about 4 billion hectares. Brazil shows the second largest forest in the world, with about 54, 4% of its territory consisting of natural and planted forests, distributed in six biomes. The forest species are of great economic importance to the country, producing many products, directly or indirectly, that can help the sustenance of the population. Furthermore, tree species can harbor some microorganisms such as viruses. Studies about infecting-tree-specie viruses in Brazil are still scarce due to some difficulties for detection and characterization of this pathogen group because it shows peculiar characteristics. Thus, the main objective of this study was to identify and characterize viral species ocurrying in native tree species from six biomes found in Brazil. Recently new tools such as metagenomics and large-scale sequencing platforms have led to increase knowledge about the diversity of organisms in different environments. In this context, 60 symptomatic seedlings of tree species, distributed in 27 botanical species and classified into 14 families, were collected in Companhia Urbanizadora da Nova Capital do Brasil (NOVACAP) nursery environment. The samples were analyzed in pool and had their RNA extracted by a Trizol protocol after semi-purification procedure in order to enrich viral particles. After this procedure, a compose sample was formed and sent for sequencing at Universidade Católica de Brasília (UCB) by NGS (Next Generation Sequencing) technology using the Illumina platform Miseq. The results from the genomic analysis produced 2,162 contigs, which were compared with database results BLASTX (Basic Local Alignment Search Tool) program. From the sequencing was obtained with a genome 9529 nucleotides (nt) was initially identified as Hovenia dulcis associated virus (HDAV). Specific primers were designed and synthesized for viral detection in plants used in this study. By RT-PCR it was possible to viral detection in a sample of grape Para (Hovenia dulcis). Due to the low percentage of identity of viral species with species Dicistroviridae genus and the difference in host of the virus, it is proposed a new member of Picornavirales order to house this species detected. Phylogenetic analysis of the fields (PRO) and dependent RNA polymerase RNA polymerase (POL) put this virus on a branch near the Picornaviridae family). Also based on the result of NGS sequences of other viral species were obtained and are listed below: Cowpea mild mottle virus - CPMMV (genus Carlavirus and family Betaflexiviridae), Eupatorium vein clearing virus (genus Caulimovirus and family Caulimoviridae), Strawberry vein banding virus - SVBV (genus Caulimovirus and family Caulimoviridae), Cowpea severe mosaic virus - CPSMV (genus Comovirus and family Secoviridae), Broad bean wilt virus - BBWV (genus Fabavirus and family Secoviridae) and Mikania micrantha mosaic virus - MMMV (genus Fabavirus and family Secoviridae).

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2016-07-21T16:19:42Z No. of bitstreams: 2 2016_HeideMunizSilva.pdf: 6047221 bytes, checksum: 393ff7b5b49bc2e5512f55136faab835 (MD5) 2016_HeideMunizSilva.pdf: 6047221 bytes, checksum: 393ff7b5b49bc2e5512f55136faab835 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-02-22T20:05:48Z (GMT) No. of bitstreams: 2 2016_HeideMunizSilva.pdf: 6047221 bytes, checksum: 393ff7b5b49bc2e5512f55136faab835 (MD5) 2016_HeideMunizSilva.pdf: 6047221 bytes, checksum: 393ff7b5b49bc2e5512f55136faab835 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-22T20:05:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 2016_HeideMunizSilva.pdf: 6047221 bytes, checksum: 393ff7b5b49bc2e5512f55136faab835 (MD5) 2016_HeideMunizSilva.pdf: 6047221 bytes, checksum: 393ff7b5b49bc2e5512f55136faab835 (MD5) / Com o advento das plataformas de sequenciamento de alto desempenho (HTS), tornou-se possível obter amplas amostragens das bibliotecas produzidas por phage display, cujo enorme volume dificulta a análise da diversidade das bibliotecas bem como a detecção de clones selecionados, a qual classicamente é realizada por ensaios de afinidade do anticorpo pelo antígeno. Considerando tal desafio, foi desenvolvido um método in silico automatizado para a análise de sequências de imunoglobulinas produzidas por phage display, que permite encontrar clones selecionados, a partir de bibliotecas sequenciadas por plataformas HTS. O método é composto por 6 etapas: montagem de reads, filtragem de sequências, tradução, análise de enriquecimento, numeração de resíduos e classificação de germlines. Para validar o método, foram analisados três conjuntos de dados, cada um contendo as bibliotecas original e final, sendo dois deles sequenciados pela plataforma Illumina, e o terceiro pela plataforma 454 Roche. A análise completa de cada par de bibliotecas foi executada em menos de 3 horas. Os tempos de execução promissores devem-se principalmente aos programas de tradução e cálculo de frequência dos clones, os quais foram desenvolvidos com estratégias inteligentes para analisar bibliotecas contendo mais de 106 reads, em menos de 5 minutos. Como saída final, é produzida uma lista de clones candidatos, enriquecidos e reconhecidos como domínio variável de imunoglobulina, ordenados por fold change de frequência e com sua respectiva classificação de germlines, os quais muito provavelmente foram selecionados pelo experimento de phage display. Além da eficiência do método no que diz respeito ao curto tempo necessário para sua execução, a abordagem utiliza um critério biológico para detectar clones candidatos, baseando-se nas marcas canônicas de domínio variável de imunoglobulina. / Since high-throughput sequencing (HTS) platforms provide larger sampling of phage display libraries, the amount of data imposes challenges to analyze libraries diversity and to find selected clones, which are traditionally tested by antibody affinity assays. Considering that, we developed an automated in silico method to analyze immunoglobulin sequences produced by phage display, which allows the detection of selected clones, from libraries sequenced by HTS platforms. The method consists of 6 steps: reads joining, sequence filtering, translation, enrichment analysis, residues numbering and germline classification. In order to validate the method, 3 sets of data were analysed, each containing initial and final phage display libraries, being 2 sets sequenced by Illumina and one by 454 Roche platform. The complete analysis of each pair of libraries was performed in less than 3 hours. The promising execution time is mainly due to the translation and frequency calculation programs, which were developed with intelligent strategies to process libraries composed of more than 106 reads, in less than 5 minutes. As final output, the method creates a list of candidate clones, enriched and recognized as immunoglobulin variable domain, sorted by fold change of frequency and classified by germline, which probably were selected by phage display experiments. Besides the efficiency of the method concerning the fast performance, the present approach uses a biological criterion to find candidate clones, based on canonical signature of immunoglobulin variable domain.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-12T14:05:19Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Mariana Gomes Vidal Sampaio.pdf: 1339369 bytes, checksum: 84c1bb427810dad835d8566650b0231a (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T14:05:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Mariana Gomes Vidal Sampaio.pdf: 1339369 bytes, checksum: 84c1bb427810dad835d8566650b0231a (MD5) Previous issue date: 2014-02-25 / FACEPE / O presente estudo objetivou produzir e caracterizar, utilizando-se ferramentas espectroscópicas e físico-químicas, um polissacarídeo bacteriano, visando investigar seu potencial biotecnológico. O bastonete Gram-positivo produtor do polissacarídeo foi identificado por meio de técnicas de biologia molecular, que permitiram a amplificação do gene rDNA 16S pela PCR, os produtos da PCR foram sequenciados e identificados por meio da comparação com outras sequências depositadas no banco de dados Genbank do NCBI. A bactéria estudada, identificada como Lactobacillus fermentum, foi isolada como contaminante de mosto de fermentação alcoólica de uma indústria sucroalcooleira do estado de Pernambuco/Brasil. Para produção do biopolímero foi utilizado o meio líquido a base de melaço-sacarose, as fermentações foram realizadas durante 72 horas sob condições agitada (210 rpm) e estática, a 35 °C e pH inicial 6,5. O isolamento do polímero foi feito por precipitação com etanol P.A gelado, a concentração de biomassa foi determinada através de peso seco e a concentração de substrato (glicose, frutose e sacarose) foi quantificada utilizando a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). O processo estático obteve uma quantidade de biomassa em torno de 7,37 g L-1, enquanto o processo agitado apresentou 2,37 g L-1 de biomassa. O processo estático também se apresenta como condição favorável para a produção do polissacarídeo, atingindo 44,5 g L-1, enquanto na fermentação agitada a concentração obtida foi de 8,0 g L-1. Houve uma queda constante na concentração do substrato sacarose durante a fermentação não agitada com consumo de quase 100% desse açúcar, entretanto, encontrando-se o sistema sob agitação foi consumido 37,9% de substrato, demonstrando menor consumo pela bactéria em condições de maior oxigenação. Os grupos funcionais presentes no polissacarídeo foram elucidados a partir da espectroscopia da região do infravermelho. A investigação acerca dos constituintes monoméricos do polímero (elucidação estrutural) foi realizada por ressonância magnética nuclear 1H e 13C evidenciando que o mesmo era composto por glicose e galactose na razão 1,15 : 1. Foram realizados testes para o conhecimento de suas propriedades térmicas como: análise termogravimétrica (TGA), calorimetria exploratória diferencial (DSC) e ponto de fusão; sendo verificada para este último, uma temperatura de decomposição (em torno de 225 °C). Os resultados das análises químicas e térmicas comprovaram que a linhagem de Lactobacillus fermentum produz um exopolissacarídeo com características ainda não relatadas na literatura, que poderão ser de interesse para uso na indústria de cosméticos, farmacêutica ou de alimentos.