Introdução: A epitestosterona é um epímero α da testosterona. Esse esteroide possui uma atividade antiandrogênica, assim como um efeito neuroprotetor. No entanto, o mecanismo de ação da epitestosterona ainda não foi elucidado. Objetivos: O objetivo desse trabalho é investigar o efeito não clássico da epitestosterona sobre o potencial de membrana de células de Sertoli de testículos de ratos de 15, 21 e 35 dias de idade e sobre a captação de 45Ca2+ no tecido testicular de ratos de 12 dias de idade. Materiais e métodos: O potencial e a resistência de membrana das células de Sertoli foram registrados através da técnica eletrofisiológica de registro intracelular. Foi realizada a aplicação de epitestosterona (0,5, 1 e 2μM) ou de testosterona (1μM), com ou sem a perfusão com flutamida (1μM), verapamil (100μM) ou U73122 (2μM). Os testículos de ratos de 12 dias de idade foram pré-incubados com 45Ca2+, com ou sem flutamida (1μM), e incubados com epitestosterona (1μM) ou testosterona (1μM). Análise estatística: Teste t de Student ou ANOVA para medidas repetidas seguido do pós-teste de Bonferroni. Resultados: A epitestosterona produziu uma resposta de despolarização do potencial de membrana, assim como um aumento na resistência de membrana em células de Sertoli de ratos de 15, 21 e 35 dias de idade. Esse esteroide apresentou uma resposta semelhante à apresentada pela testosterona. Os efeitos da epitestosterona não foram modificados após a perfusão com flutamida, um inibidor do receptor androgênico intracelular. A epitestosterona promoveu um aumento na captação de 45Ca2+ após 5 minutos de incubação, e esse efeito não foi bloqueado pela flutamida. O efeito despolarizante desse esteroide foi parcialmente inibido pelo fármaco verapamil, um bloqueador dos canais de cálcio tipo L, e pelo U73122, um inibidor da enzima fosfolipase C. Conclusão: Esses resultados indicam uma atuação da epitestosterona em células de Sertoli através de uma ação não clássica; esses efeitos são semelhantes aos encontrados para a testosterona em células de Sertoli de testículos de ratos. / Introduction: Epitestosterone is the 17α-epimer of testosterone. It seems to possess an antiandrogenic activity, as well as a neuroprotective effect. The mechanism of action of epitestosterone has not been elucidated. Objective: The aim of this work is to investigate the non-classical effect of epitestosterone on the membrane of Sertoli cells from testis of 12-, 15-, 21- and 35-day-old rats. Materials and Methods: The membrane potential and the membrane input resistance of Sertoli cells was recorded using a standard single microelectrode technique. Application of epitestosterone (0.5, 1 and 2μM) or testosterone (1μM) alone and after infusion with flutamide (1μM), verapamil (100μM) or U73122 (2μM) was made. The testes from 12-day-old rats were pre-incubated with 45Ca2+ with or without flutamide (1μM) and incubated with epitestosterone (1μM) or testosterone (1μM). Student's t-test or ANOVA for repeated measures with Bonferroni post-test was used. Results: Epitestosterone produced a depolarization in the membrane potential and increased the input membrane resistance on Sertoli cells from 15-, 21- and 35-day-old rats. This steroid showed a similar response to testosterone. The effect of epitestosterone was not changed after perfusion with flutamide, an intracellular androgen receptor inhibitor. Epitestosterone increased 45Ca2+ uptake within 5 minutes and this effect was also not inhibited by flutamide. The depolarizing effect was slightly inhibited by verapamil, a voltage-dependent calcium channel blocker, and by U73122, a PLC inhibitor. Conclusion: These results indicate that epitestosterone acts on the Sertoli cells via a non-classical signaling pathway; the effects are similar to that of testosterone in Sertoli cells in whole seminiferous tubules from rat testes.

published_or_final_version / Zoology / Doctoral / Doctor of Philosophy

As células de Sertoli são células fundamentais que fornecem fatores essenciais para a progressão da espermatogênese. Do período fetal ao imaturo, as células de Sertoli estão proliferando. A via não-clássica dos androgênios é caracterizada por rápido evento que conduz à ativação de cascatas de sinalização citosólicas desencadeadas por receptores de membrana. Diferente dessa, na via clássica são necessárias horas ou até mesmo dias para a produção de novas proteínas. Existe um receptor de membrana específico para os andrógenos que estimula a cascata de sinalização não-clássica nas células de Sertoli por interação com o ZIP9, um transportador de zinco. Esse estudo teve por objetivos: avaliar o envolvimento do receptor ZIP9 nos efeitos de membrana de células de Sertoli produzidos em resposta à aplicação de testosterona ou de nandrolona. Avaliar o papel do quelante de zinco (TPEN), nas concentrações 10 nM, 20 nM e 40 nM, sobre o potencial de membrana das células de Sertoli de ratos imaturos e avaliar o papel do quelante de zinco (TPEN), nas concentrações 10 nM, 20 nM e 40 nM, sobre a resposta eletrofisiológica da testosterona e da nandrolona em túbulos seminíferos isolados de testículos de ratos imaturos. O potencial e a resistência de membrana das células de Sertoli foram registrados através da técnica eletrofisiológica de registro intracelular. O registro intracelular da célula de Sertoli foi realizado utilizando microcapilares de borossilicato preenchidos com KCl 3 M acoplados a um eletrômetro. Nos túbulos seminíferos de animais entre o 12º e o 15º dpn foram aplicados e/ou perfundidos, DMSO (veículo) n = 8; quelante de zinco (TPEN) nas concentrações 10 nM n = 7; 20 nM n = 6; e 40 nM n = 8; Testosterona (T) 1 μM n = 15; T + TPEN 10 nM n = 10; T + TPEN 20 nM n = 9; T + TPEN 40 nM n= 7; Nandrolona (N) 1 μM n = 19; N + TPEN 10 nM n = 13; N + TPEN 20 nM n =12; N + TPEN 40 nM n= 9. Os dados foram analisados por ANOVA de medidas repetidas, seguida do pós-teste de Bonferroni. O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA/UFRGS nº 29644. A aplicação tópica de DMSO e a perfusão de TPEN nas diferentes concentrações não altera o potencial de membrana de células de Sertoli. A aplicação tópica de T e de N resultou em despolarização do potencial de membrana de células de Sertoli e em aumento da resistência da membrana de células de Sertoli. A aplicação tópica da T e da N em meio com perfusão de TPEN, nas concentrações 10 nM, 20 nM e 40 nM, não alterou o potencial de membrana e a resistência da membrana de células de Sertoli de ratos imaturos. Concluímos que o quelante de zinco afeta o receptor de membrana de andrógenos na membrana de células de Sertoli de ratos entre o 12º e o 15º dpn. E podemos inferir que há envolvimento do ZIP9 nos efeitos de membrana de células de Sertoli produzidos em respostas à aplicação de T e de N. / Sertoli cells are key cells that provide essential factors for the progression of spermatogenesis. From the fetal to the immature period, Sertoli cells are proliferating. The non-classical signaling pathway is characterized by a rapid event that leads to the activation of cytosolic signaling cascades triggered by membrane receptors. On the other hand, in the classical pathway it takes hours or even days are necessary for the production of new proteins. There is an androgen-specific membrane receptor that stimulates the non-classical signaling cascade in Sertoli cells by interaction with ZIP9, a zinc transporter. This aim of this study was to evaluate the involvement of the ZIP9 receptor in the membrane effects of Sertoli cells produced in response to the application of testosterone or nandrolone. Also, to evaluate the role of zinc chelator TPEN at 10 nM, 20 nM and 40 nM concentrations on the membrane potential of Sertoli cells from immature rats and to evaluate the role of zinc chelator TPEN in 10 nM, 20 nM and 40 nM concentrations in the electrophysiological response of testosterone and nandrolone in seminiferous tubules isolated from testes of immature rats. The membrane potential and membrane resistance of Sertoli cells were recorded using a standard single microelectrode technique. The intracellular recording of Sertoli cells was performed using microcapillaries filled with 3 M KCl coupled to an electrometer. In the seminiferous tubules of animals between post-natal day (pnd) 12 and 15 were applied and/or perfused, DMSO (vehicle) n = 8; Zinc chelator (TPEN) at concentrations of 10 nM n = 7; TPEN 20 nM n = 6; and TPEN 40 nM n = 8; Testosterone (T) 1 μM n = 15; T + TPEN 10 nM n = 10; T + TPEN 20 nM n = 9; T + TPEN 40 nM n = 7; Nandrolone (N) 1μM n = 19; N + TPEN 10 nM n = 13; N + TPEN 20 nM n = 12; N + TPEN 40 nM n = 9. For statistical analyses it was used ANOVA for repeated measures followed by Bonferroni post-test. This study was approved by the Ethics Committee for Animal Research of UFRGS (CEUA/UFRGS nº 29644). Topical application of DMSO and perfusion of TPEN at different concentrations did not cause membrane potential depolarization of Sertoli cells. Topical application of T and N cause membrane potential depolarization of Sertoli cells and increased the cell resistance of Sertoli cells. Topical application of T and N in TPEN infusion at concentrations of 10 nM, 20 nM and 40 nM did not cause membrane potential depolarization and the cell resistance of the Sertoli cell membrane of immature mice. In summary, zinc chelator affects the androgen membrane receptor on the Sertoli cell membrane of rats between pnd 12 and 15. We can infer that there is the involvement of the ZIP9 in the membrane effects of Sertoli cells produced in response to T and N.

A vitamina A (retinol) e seus derivados, os retinóides, são importantes reguladores do ciclo celular, exercendo um papel central na proliferação, apoptose e diferenciação de diversos tipos celulares. Atualmente, o papel dos retinóides na proliferação e diferenciação celular tem sido bastante investigado. Nesse contexto, diversos estudos têm demonstrado que formas ativas de retinóides como o ácido retinóico inibem a proliferação em modelos de células tumorais e não-tumorais, caracterizando-os como potenciais agentes quimioterápicos. Entretanto, um crescente número de estudos tem sugerido que os retinóides apresentam propriedades pró-oxidantes em sistemas biológicos, as quais podem induzir dano celular, ativação de proto-oncogenes e, até mesmo, transformação neoplásica. Essas contradições estimularam-nos a investigar as propriedades proliferativas/antiproliferativas e antioxidantes/pró-oxidantes dos principais retinóides presentes no meio intracelular - retinol e ácido retinóico- e os mecanismos envolvidos nesses efeitos em células de Sertoli, um dos principais alvos fisiológicos da vitamina A em mamíferos. A vitamina A (retinol) e seus derivados, os retinóides, são importantes reguladores do ciclo celular, exercendo um papel central na proliferação, apoptose e diferenciação de diversos tipos celulares. Atualmente, o papel dos retinóides na proliferação e diferenciação celular tem sido bastante investigado. Nesse contexto, diversos estudos têm demonstrado que formas ativas de retinóides como o ácido retinóico inibem a proliferação em modelos de células tumorais e não-tumorais, caracterizando-os como potenciais agentes quimioterápicos. Entretanto, um crescente número de estudos tem sugerido que os retinóides apresentam propriedades pró-oxidantes em sistemas biológicos, as quais podem induzir dano celular, ativação de proto-oncogenes e, até mesmo, transformação neoplásica. Essas contradições estimularam-nos a investigar as propriedades proliferativas/antiproliferativas e antioxidantes/pró-oxidantes dos principais retinóides presentes no meio intracelular - retinol e ácido retinóico- e os mecanismos envolvidos nesses efeitos em células de Sertoli, um dos principais alvos fisiológicos da vitamina A em mamíferos. A diminuição na viabilidade foi mediada pela ativação da xantina oxidase, uma vez que concentrações elevadas de retinol induziram ativação desta enzima e aumentaram a produção de espécies reativas, e a inibição da xantina oxidase com alopurinol atenuou tanto a produção de espécies reativas quanto o dano oxidativo a proteínas e a citotoxicidade induzida pelo retinol. Além disso, demonstramos que a incubação da xantina oxidase com retinol promove a produção de superóxido in vitro, e investigamos alguns fatores envolvidos nesse evento. Por outro lado, o principal derivado ativo do retinol, o ácido retinóico, não apresentou qualquer efeito pró-oxidante ou proliferativo, nem ativou MAPKs. Ao contrário do retinol, o ácido retinóico apresentou efeitos antiproliferativos, diminuindo os níveis do inibidor de CDKs p21 e induzindo parada no ciclo celular. Os dados apresentados nesse trabalho podem contribuir para a elucidação dos efeitos pró-oxidantes, proliferativos/antiproliferativos e citotóxicos da vitamina A e seus derivados em sistemas biológicos. / Vitamin A (Retinol) and its derivatives, retinoids, are important regulators of the cell cycle, playing a role on proliferation, apoptosis and differentiation of diverse cell types. In recent years, the influence of retinoids on cell growth and differentiation has been investigated. There is a growing body of in vitro data demonstrating that active retinoids as retinoic acid antagonize cell growth in a variety of normal and tumour cells, characterizing them as potential chemotherapeutic agents. On the other hand, a growing body of evidence has suggested that retinoids present pro-oxidant properties in biological systems, which might induce cell damage, proto-oncogene activation and neoplasic transformation. These discordances stimulated us to investigate the proliferative/antiproliferative properties of two major intracellular retinoids, retinol and retinoic acid, and its mechanisms in a model of Sertoli cells, a major vitamin A physiological target. Our data showed that supra-physiological concentrations of retinol, but not retinoic acid, are able to increase reactive species production in Sertoli cells. These pro-oxidant effects may induce different cellular fates depending on of retinol concentrations. At low pro-oxidant levels (7 μM), retinol induced an oxidant-dependent proliferation, which was mediated by a rapid, nonclassic and redox-sensitive activation of the MAPKs JNK1/2, p38 and ERK1/2. The investigation of potential sites of reactives species production indicated that mitochondria act as a primary source of reactive species involved in retinol redox signaling. Retinol 7 μM induces dysfunction in the mitochondrial electron transfer system leading to increases in superoxide anion production. Inhibition of the mitochondrial-dependent superoxide formation blocked both reactive species production and MAPKs activation, characterizing a new mechanism of nongenomic action of the vitamin A. MAPKs inhibition blocked retinol-induced proliferation. On the other hand, at high concentrations (10 to 20 μM) the pro-oxidant effects of retinol were significantly high to induce extensive oxidative damage and decreases in cell viability. At high concentrations, retinol-induced decreases in cell viability were mediated by stimulation of the xanthine oxidase activity in Sertoli cells, since retinol treatment increased xanthine oxidase activity and reactive species production, and inhibition of the enzyme with allopurinol attenuated retinol-induced reactive species, protein oxidative damage and cytotoxicity. In addition, we showed that incubation of xanthine oxidase with retinol promotes superoxide generation in vitro, and investigated the potential factors involved in this effect. On the other hand, the principal retinol derivative, retinoic acid, induced neither reactive species production or proliferation nor MAPKs activation. In contrast to retinol, retinoic acid presented its well documented antiproliferative effects by decreasing DNA synthesis and increasing the level of the CDK inhibitor p21 leading to cell arrest. Data presented in this work, may contribute to elucidation of the mechanisms involved in pro-oxidants, proliferatives/antiproliferatives and cytotoxic actions of vitamin A and its derivatives in biologycal systems.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2003. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 71-83).

Thesis (Ph. D.)--University of Hong Kong, 2010. / Includes bibliographical references (leaves 128-151). Also available in print.

Not available / text

published_or_final_version / Zoology / Master / Master of Philosophy

No description available.

Includes bibliographical references (leaves 98-128). / iv, 128 leaves, [22] leaves of plates : ill. ; 30 cm. / Title page, contents and abstract only. The complete thesis in print form is available from the University Library. / Investigates protein secretion by bovine Sertoli cells in culture. Cultures were obtained from bulls at all stages of post natal development and from sexually mature animals. / Thesis (Ph.D.)--University of Adelaide, Dept. of Animal Sciences, 1987