Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T14:44:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 221517.pdf: 138242 bytes, checksum: 3e675de5f0d60d02b1a2e6bcdf1cf546 (MD5) / Os hormônios tireoideos classicamente atuam através da ligação com receptores nucleares. No entanto, estas iodotironinas também podem atuar por mecanismos não-genômicos ou extranucleares sinalizando novas vias de regulação celular. O objetivo deste estudo foi investigar o envolvimento da síntese de proteínas na ação estimulatória dos hormônios tireoideos no transporte de aminoácidos e caracterizar os canais de potássio envolvidos no efeito hiperpolarizante destes hormônios em células de Sertoli de testículos de ratos imaturos. O sistema A de transporte de aminoácidos e a técnica eletrofisiológica são metodologias utilizadas neste trabalho para os estudos moleculares de hormônios e fármacos em ensaios biológicos in vitro. Recentemente foi demonstrado que o T3 estimula o transporte de aminoácidos e induz uma hiperpolarização no potencial de repouso de células de Sertoli de testículos de ratos imaturos. Os resultados do presente trabalho demonstraram que o T4 (tiroxina) estimula o transporte do aminoácido neutro [4C]-MeAIB e induz uma hiperpolarização no potencial de repouso de células de Sertoli, assim como demonstrado anteriormente pelo hormônio T3. O T4 estimulou o transporte de [14C]-MeAIB numa faixa de concentração mil vezes menor do que o melhor estímulo observado para o T3 e a ação estimulatória do T4 no transporte de aminoácidos não foi alterada com a síntese protéica inibida por ciclo-heximida. Já, para o T3, o efeito estimulatório no transporte de aminoácidos foi parcialmente inibido com a síntese protéica previamente bloqueada, sugerindo que este hormônio necessita da síntese protéica ativa para regular eficientemente esta ação. Nos estudos eletrofisiológicos, o T4 demonstrou um efeito hiperpolarizante nas células de Sertoli menor quando comparado com o T3. O efeito hiperpolarizante do T3 no potencial de repouso das células de Sertoli foi totalmente inibido pelo verapamil e parcialmente inibido por tolbutamida, indicando o envolvimento de canais de cálcio dependentes da voltagem e de canais de K+ ATP, respectivamente, neste mecanismo. Na presença de TEA, o efeito hiperpolarizante do T4 e do T3 no potencial de repouso das células de Sertoli foi totalmente inibido, caracterizando o envolvimento de canais de K+ dependentes da voltagem nesse mecanismo. Na presença de apamina, o efeito hiperpolarizante do T4 foi totalmente bloqueado, caracterizando o envolvimento de canais de K+ dependentes de Ca++ neste mecanismo. Destes resultados podemos concluir que o T4 e o T3 estimulam o transporte de aminoácidos por mecanismos diferentes, uma vez que a ação estimulatória do T4 no transporte de aminoácidos é mais potente e independe da síntese protéica ativa.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia. / Made available in DSpace on 2012-10-20T07:24:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-26T02:05:23Z : No. of bitstreams: 1 186336.pdf: 9976751 bytes, checksum: 23f7b81ec4c22498bdd30e552cb9d3b0 (MD5)

Espécies reativas de oxigênio (ROS) têm sido descritas como potenciais causadoras de doenças como aterosclerose, artrite e câncer. Falhas na regulação das metaloproteinases de matriz (MMP), uma família de proteases que degradam matriz extracelular, parecem estar intimamente relacionadas com essas mesmas doenças. Além disso, autores sugerem uma relação entre a atividade das MMPs e ROS. Em trabalhos anteriores, nosso grupo de pesquisa demonstrou que o tratamento com retinol 7 μM foi capaz de induzir mudanças no metabolismo de células de Sertoli cultivadas, como o aumento da atividade de enzimas antioxidantes, aumento do dano oxidativo a biomoléculas, ativação de ERK1/2 MAPK, alteração do ciclo celular e transformação pré-neoplásica, ligando o tratamento com retinol ao estresse oxidativo. No presente trabalho, nós utilizamos a técnica de zimografia para verificar a atividade da MMP-2 em células de Sertoli tratadas com retinol e ácido retinóico. Nós encontramos que tanto o tratamento por 24 horas com retinol 7 μM, quanto o tratamento por 24 horas com ácido retinóico 1 nM, aumentaram a atividade da MMP-2 em células de Sertoli cultivadas. O cotratamento com diferentes antioxidantes reverteu o aumento da atividade da MMP-2 induzido por retinol, mas não por ácido retinóico. Além disso, o tratamento com retinol, mas não com ácido retinóico, foi capaz de aumentar a produção de ROS quantificada pela oxidação de DCFH-DA. Nós encontramos também que tanto o tratamento com retinol quanto com ácido retinóico foram capazes de aumentar a fosforilação de ERK1/2. Entretanto, somente o aumento da atividade da MMP-2 induzido por tratamento com retinol foi inibido por co-tratamento com UO126, um potente inibidor de fosforização de ERK1/2. Nossos resultados sugerem que o aumento da atividade da MMP-2 induzido por retinol, mas não por ácido retinóico, está relacionado com a fosforilação de ERK1/2 e com a geração de ERO. / Reactive oxygen species (ROS) have been hypothesized to play a causative role in numerous diseases such as atherosclerosis, arthritis and cancer. Failures in the regulation of the matrix metalloproteinases (MMP), a family of extracellular matrixdegrading proteases, appear to be intimately involved in these diseases. In addition, authors suggest a relationship between MPP activity and ROS. In early reports our research group has demonstrated that 7 μM retinol was able to induce changes in Sertoli cell metabolism, such as up-regulation of antioxidant enzyme activities, increase in oxidative damage to biomolecules, activation of ERK1/2 MAPK, cell-cycle alteration and pre-neoplasic transformation, linking retinol treatment and oxidative stress. Here, we verify the MMP activity in cultured Sertoli cells treated with vitamin A using gelatin zymography. We found that both retinol (7 μM by 24 hours) and retinoic acid (1 nM by 24 hours) treatments induces MMP-2 activity in cultured Sertoli cells. Antioxidants cotreatment reversed retinol-induced but not retinoic acid-induced MMP-2 activity. Moreover, retinol but not retinoic acid treatment increased ROS production quantified by DCFH-DA oxidation. We found that both retinol and retinoic acid treatment induced ERK1/2 phosphorylation. However, only retinol-increased MMP-2 activity was inhibited by UO126, a potent ERK1/2 phosphorylation inhibitor. Our results suggested that the increase on MMP- 2 activity induced by retinol, but not by retinoic acid, was related to ERK1/2 phosphorylation and ROS production.

A vitamina A (retinol) e seus derivados, os retinóides, são importantes reguladores do ciclo celular, exercendo um papel central na proliferação, apoptose e diferenciação de diversos tipos celulares. Atualmente, o papel dos retinóides na proliferação e diferenciação celular tem sido bastante investigado. Nesse contexto, diversos estudos têm demonstrado que formas ativas de retinóides como o ácido retinóico inibem a proliferação em modelos de células tumorais e não-tumorais, caracterizando-os como potenciais agentes quimioterápicos. Entretanto, um crescente número de estudos tem sugerido que os retinóides apresentam propriedades pró-oxidantes em sistemas biológicos, as quais podem induzir dano celular, ativação de proto-oncogenes e, até mesmo, transformação neoplásica. Essas contradições estimularam-nos a investigar as propriedades proliferativas/antiproliferativas e antioxidantes/pró-oxidantes dos principais retinóides presentes no meio intracelular - retinol e ácido retinóico- e os mecanismos envolvidos nesses efeitos em células de Sertoli, um dos principais alvos fisiológicos da vitamina A em mamíferos. A vitamina A (retinol) e seus derivados, os retinóides, são importantes reguladores do ciclo celular, exercendo um papel central na proliferação, apoptose e diferenciação de diversos tipos celulares. Atualmente, o papel dos retinóides na proliferação e diferenciação celular tem sido bastante investigado. Nesse contexto, diversos estudos têm demonstrado que formas ativas de retinóides como o ácido retinóico inibem a proliferação em modelos de células tumorais e não-tumorais, caracterizando-os como potenciais agentes quimioterápicos. Entretanto, um crescente número de estudos tem sugerido que os retinóides apresentam propriedades pró-oxidantes em sistemas biológicos, as quais podem induzir dano celular, ativação de proto-oncogenes e, até mesmo, transformação neoplásica. Essas contradições estimularam-nos a investigar as propriedades proliferativas/antiproliferativas e antioxidantes/pró-oxidantes dos principais retinóides presentes no meio intracelular - retinol e ácido retinóico- e os mecanismos envolvidos nesses efeitos em células de Sertoli, um dos principais alvos fisiológicos da vitamina A em mamíferos. A diminuição na viabilidade foi mediada pela ativação da xantina oxidase, uma vez que concentrações elevadas de retinol induziram ativação desta enzima e aumentaram a produção de espécies reativas, e a inibição da xantina oxidase com alopurinol atenuou tanto a produção de espécies reativas quanto o dano oxidativo a proteínas e a citotoxicidade induzida pelo retinol. Além disso, demonstramos que a incubação da xantina oxidase com retinol promove a produção de superóxido in vitro, e investigamos alguns fatores envolvidos nesse evento. Por outro lado, o principal derivado ativo do retinol, o ácido retinóico, não apresentou qualquer efeito pró-oxidante ou proliferativo, nem ativou MAPKs. Ao contrário do retinol, o ácido retinóico apresentou efeitos antiproliferativos, diminuindo os níveis do inibidor de CDKs p21 e induzindo parada no ciclo celular. Os dados apresentados nesse trabalho podem contribuir para a elucidação dos efeitos pró-oxidantes, proliferativos/antiproliferativos e citotóxicos da vitamina A e seus derivados em sistemas biológicos. / Vitamin A (Retinol) and its derivatives, retinoids, are important regulators of the cell cycle, playing a role on proliferation, apoptosis and differentiation of diverse cell types. In recent years, the influence of retinoids on cell growth and differentiation has been investigated. There is a growing body of in vitro data demonstrating that active retinoids as retinoic acid antagonize cell growth in a variety of normal and tumour cells, characterizing them as potential chemotherapeutic agents. On the other hand, a growing body of evidence has suggested that retinoids present pro-oxidant properties in biological systems, which might induce cell damage, proto-oncogene activation and neoplasic transformation. These discordances stimulated us to investigate the proliferative/antiproliferative properties of two major intracellular retinoids, retinol and retinoic acid, and its mechanisms in a model of Sertoli cells, a major vitamin A physiological target. Our data showed that supra-physiological concentrations of retinol, but not retinoic acid, are able to increase reactive species production in Sertoli cells. These pro-oxidant effects may induce different cellular fates depending on of retinol concentrations. At low pro-oxidant levels (7 μM), retinol induced an oxidant-dependent proliferation, which was mediated by a rapid, nonclassic and redox-sensitive activation of the MAPKs JNK1/2, p38 and ERK1/2. The investigation of potential sites of reactives species production indicated that mitochondria act as a primary source of reactive species involved in retinol redox signaling. Retinol 7 μM induces dysfunction in the mitochondrial electron transfer system leading to increases in superoxide anion production. Inhibition of the mitochondrial-dependent superoxide formation blocked both reactive species production and MAPKs activation, characterizing a new mechanism of nongenomic action of the vitamin A. MAPKs inhibition blocked retinol-induced proliferation. On the other hand, at high concentrations (10 to 20 μM) the pro-oxidant effects of retinol were significantly high to induce extensive oxidative damage and decreases in cell viability. At high concentrations, retinol-induced decreases in cell viability were mediated by stimulation of the xanthine oxidase activity in Sertoli cells, since retinol treatment increased xanthine oxidase activity and reactive species production, and inhibition of the enzyme with allopurinol attenuated retinol-induced reactive species, protein oxidative damage and cytotoxicity. In addition, we showed that incubation of xanthine oxidase with retinol promotes superoxide generation in vitro, and investigated the potential factors involved in this effect. On the other hand, the principal retinol derivative, retinoic acid, induced neither reactive species production or proliferation nor MAPKs activation. In contrast to retinol, retinoic acid presented its well documented antiproliferative effects by decreasing DNA synthesis and increasing the level of the CDK inhibitor p21 leading to cell arrest. Data presented in this work, may contribute to elucidation of the mechanisms involved in pro-oxidants, proliferatives/antiproliferatives and cytotoxic actions of vitamin A and its derivatives in biologycal systems.

A testosterona é um hormônio esteróide androgênico responsável pelas características masculinas, com importante função na fisiologia testicular. A nandrolona é um esteróide sintético derivado da testosterona, com ação anabólica e androgênica. A catequina é um flavonóide encontrado em frutas e chás, que possui efeito antioxidante, anticarcinogênico e antienvelhecimento no organismo. Estudos mostram um possível mecanismo de ação destes esteróides e do flavonóide como agonistas do receptor androgênico de membrana. Objetivo: Verificar a ação não-clássica de andrógenos (testosterona, nandrolona) e catequina nas células de Sertoli de ratos Wistar imaturos. Materiais e Métodos: Eletrofisiologia: O potencial de membrana foi registrado utilizando túbulos seminíferos isolados de testículos de ratos Wistar machos de 15 dias de idade. O registro intracelular da célula de Sertoli foi realizado utilizando microcapilares preenchidos com KCl 3mmol/L acoplados a um eletrômetro. Foi realizada a aplicação tópica do esteróide testosterona (1M), nandrolona (0.1, 0.5 e 1 M) e do flavonóide catequina (0.1, 0.5 e 1, M) isoladamente e também após a perfusão com a flutamida (1M), diazoxida (100 M) e U73122 (1 M). Captação de 45Ca2+: Os testículos (n=5) foram pré incubados em KRb com 45Ca2+ por 60 minutos para equilibrar o meio intra e extra-celular de 45Ca2+após o equilíbrio, as gônadas foram incubadas por 5 minutos em KRb com 45Ca2+ com ou sem nandrolona (1μM) ou catequina. Os resultados foram dados como média ± SEM. Os dados da variação do potencial de membrana foram analisados pelo teste T student e ANOVA para medidas repetidas com o pós-teste de Bonferroni. Resultados: A testosterona (1M) produziu uma resposta despolarizante sobre o potencial de membrana (PM) alterando de -44,62±0,53mV para -41,41 ±0,81* mV, aos 120 segundos após a sua aplicação (*p<0,05) (n=9 células de Sertoli). Esta resposta despolarizante foi observada mesmo após a perfusão com flutamida (1M). A catequina (1M) causou uma resposta de despolarização semelhante à da testosterona, alterando o PM de -40,20 ± 0,51 mV para -35,62 ± 1,07mV, aos 120 segundos após a sua aplicação (*p<0,001) (n=9 células de Sertoli). A nandrolona (1μM) provocou uma despolarização alterando o PM de -38,20 ± 0,71 para -33,42± 0,63 *p<0,05. A resposta da catequina e de nandrolona foi observada em diferentes doses e mesmo após a perfusão com flutamida (1M), diazoxida (100μM) e U73122 (2μM) anularam o efeito de nandrolona (1μM) e catequina (1μM). A nandrolona e catequina produziram aumento na captação de 45Ca2+ em 5 minutos de incubação em testículos de ratos imaturos. Conclusão: Os andrógenos testosterona, nandrolona e o flavonóide catequina apresentam uma ação despolarizante sobre o potencial de membrana de células de Sertoli de ratos Wistar, observada mesmo após o bloqueio do receptor de andrógenos intracelular (flutamida). A perfusão com U73122(bloqueador de PLC) e a perfusão com diazoxida (agonista do canal de K+ATP) anulou o efeito de nandrolona e catequina, indicando a participação da PLC e de canais de K+ATP na resposta despolarizante observada. Estes resultados indicam que nandrolona e catequina atuam em um receptor de andrógenos de membrana, assim como a testosterona, agindo através de uma via não-clássica sobre as células de Sertoli de testículos de ratos. / Testosterone is an androgenic steroid hormone responsible for male characteristics, with an important role in testicular physiology. The synthetic steroid nandrolone ia an anabolic and androgenic derivative of testosterone, Catechin is a flavonoid found in fruits and teas, which have antioxidant, anticarcinogenic and anti-aging effects in the body. Studies show a possible mechanism of action of these steroids and flavonoid as agonists of the androgen receptor membrane. Objective: The aim of this work is to investigate the non-classical effect of androgens (testosterone, nandrolone) and catechin in Sertoli cells from immature rats. Materials and Methods: Electrophysiological experiments: The membrane potential was recorded using isolated seminiferous tubules of testes of rats 15 days old. The intracellular recording of Sertoli cell was performed using microcapillary filled with KCl 3mmol/L coupled to an electrometer. We performed a topical application of testosterone (1M), nandrolone (0.1, 0.5 and 1M) and the flavonoid catechin (0.1, 0.5 and 1M) alone and also after infusion with flutamide (1M), diazoxide (100M) or U73122 (1M). 45Ca2+ uptake : The testes (n=5 in each group) are pre-incubated in KRb with 45Ca2+ (2.7kBq/sample) for 60 min in a Dubnoff metabolic incubator to equilibrate intra- and extracellular 45Ca2+ levels until they reached a plateau. Following equilibration, the gonads were incubated for 5 min in KRb with 45Ca2+, with or without nandrolone (1 μM) or catechin.The results were given as mean ± SEM. The data of the change in membrane potential were analyzed by ANOVA for repeated measures with Bonferroni post-test. Results: Testosterone (1M) produced a depolarizing response in the membrane potential (MP) by changing from -44.62 ± 0.53 mV to -41.41 ± 0.81 mV *, at 120 seconds after application (* p <0.05) (n = 9 Sertoli cells.) This depolarizing response was observed even after perfusion with flutamide (1M). Catechin (1  M) showed a similar response to depolarization of testosterone, changing the PM of -40.20 ± 0.51 mV to -35.62 ± 1.07 mV at 120 seconds after application (* p <0.001) (n = 9 Sertoli cells) after its application. The nandrolone (1μM) showed a depolarization of the PM changing -38.20 ± 0.71 to -33.42 ± 0.63 * p <0.05. The response of catechin and nandrolone was observed at different doses and even after perfusion with flutamide (1M). diazoxidae (100μM) and U73122 (2μM) nullified the effect of nandrolone (1μM) and catechin (1μM). Nandrolone and catechin increase 45Ca2+ uptake within 5 minutes of incubation with immature testes. Conclusion: The androgen testosterone, nandrolone and flavonoid catechin have a depolarizing action on the membrane potential of Sertoli cells from immature rats, observed even after the blockade of intracellular androgen receptor. The U73122 infusion and perfusion with diazoxide nullified the effect of nandrolone and catechin, indicating the involvement of PLC and K+ATP channels in depolarizing response observed. These results indicate that nandrolone and catechin act on an androgen membrane receptor, as well as testosterone through a non-classical pathway on Sertoli cells from rat testes.

A testosterona é um hormônio esteróide androgênico responsável pelas características masculinas, com importante função na fisiologia testicular. A nandrolona é um esteróide sintético derivado da testosterona, com ação anabólica e androgênica. A catequina é um flavonóide encontrado em frutas e chás, que possui efeito antioxidante, anticarcinogênico e antienvelhecimento no organismo. Estudos mostram um possível mecanismo de ação destes esteróides e do flavonóide como agonistas do receptor androgênico de membrana. Objetivo: Verificar a ação não-clássica de andrógenos (testosterona, nandrolona) e catequina nas células de Sertoli de ratos Wistar imaturos. Materiais e Métodos: Eletrofisiologia: O potencial de membrana foi registrado utilizando túbulos seminíferos isolados de testículos de ratos Wistar machos de 15 dias de idade. O registro intracelular da célula de Sertoli foi realizado utilizando microcapilares preenchidos com KCl 3mmol/L acoplados a um eletrômetro. Foi realizada a aplicação tópica do esteróide testosterona (1M), nandrolona (0.1, 0.5 e 1 M) e do flavonóide catequina (0.1, 0.5 e 1, M) isoladamente e também após a perfusão com a flutamida (1M), diazoxida (100 M) e U73122 (1 M). Captação de 45Ca2+: Os testículos (n=5) foram pré incubados em KRb com 45Ca2+ por 60 minutos para equilibrar o meio intra e extra-celular de 45Ca2+após o equilíbrio, as gônadas foram incubadas por 5 minutos em KRb com 45Ca2+ com ou sem nandrolona (1μM) ou catequina. Os resultados foram dados como média ± SEM. Os dados da variação do potencial de membrana foram analisados pelo teste T student e ANOVA para medidas repetidas com o pós-teste de Bonferroni. Resultados: A testosterona (1M) produziu uma resposta despolarizante sobre o potencial de membrana (PM) alterando de -44,62±0,53mV para -41,41 ±0,81* mV, aos 120 segundos após a sua aplicação (*p<0,05) (n=9 células de Sertoli). Esta resposta despolarizante foi observada mesmo após a perfusão com flutamida (1M). A catequina (1M) causou uma resposta de despolarização semelhante à da testosterona, alterando o PM de -40,20 ± 0,51 mV para -35,62 ± 1,07mV, aos 120 segundos após a sua aplicação (*p<0,001) (n=9 células de Sertoli). A nandrolona (1μM) provocou uma despolarização alterando o PM de -38,20 ± 0,71 para -33,42± 0,63 *p<0,05. A resposta da catequina e de nandrolona foi observada em diferentes doses e mesmo após a perfusão com flutamida (1M), diazoxida (100μM) e U73122 (2μM) anularam o efeito de nandrolona (1μM) e catequina (1μM). A nandrolona e catequina produziram aumento na captação de 45Ca2+ em 5 minutos de incubação em testículos de ratos imaturos. Conclusão: Os andrógenos testosterona, nandrolona e o flavonóide catequina apresentam uma ação despolarizante sobre o potencial de membrana de células de Sertoli de ratos Wistar, observada mesmo após o bloqueio do receptor de andrógenos intracelular (flutamida). A perfusão com U73122(bloqueador de PLC) e a perfusão com diazoxida (agonista do canal de K+ATP) anulou o efeito de nandrolona e catequina, indicando a participação da PLC e de canais de K+ATP na resposta despolarizante observada. Estes resultados indicam que nandrolona e catequina atuam em um receptor de andrógenos de membrana, assim como a testosterona, agindo através de uma via não-clássica sobre as células de Sertoli de testículos de ratos. / Testosterone is an androgenic steroid hormone responsible for male characteristics, with an important role in testicular physiology. The synthetic steroid nandrolone ia an anabolic and androgenic derivative of testosterone, Catechin is a flavonoid found in fruits and teas, which have antioxidant, anticarcinogenic and anti-aging effects in the body. Studies show a possible mechanism of action of these steroids and flavonoid as agonists of the androgen receptor membrane. Objective: The aim of this work is to investigate the non-classical effect of androgens (testosterone, nandrolone) and catechin in Sertoli cells from immature rats. Materials and Methods: Electrophysiological experiments: The membrane potential was recorded using isolated seminiferous tubules of testes of rats 15 days old. The intracellular recording of Sertoli cell was performed using microcapillary filled with KCl 3mmol/L coupled to an electrometer. We performed a topical application of testosterone (1M), nandrolone (0.1, 0.5 and 1M) and the flavonoid catechin (0.1, 0.5 and 1M) alone and also after infusion with flutamide (1M), diazoxide (100M) or U73122 (1M). 45Ca2+ uptake : The testes (n=5 in each group) are pre-incubated in KRb with 45Ca2+ (2.7kBq/sample) for 60 min in a Dubnoff metabolic incubator to equilibrate intra- and extracellular 45Ca2+ levels until they reached a plateau. Following equilibration, the gonads were incubated for 5 min in KRb with 45Ca2+, with or without nandrolone (1 μM) or catechin.The results were given as mean ± SEM. The data of the change in membrane potential were analyzed by ANOVA for repeated measures with Bonferroni post-test. Results: Testosterone (1M) produced a depolarizing response in the membrane potential (MP) by changing from -44.62 ± 0.53 mV to -41.41 ± 0.81 mV *, at 120 seconds after application (* p <0.05) (n = 9 Sertoli cells.) This depolarizing response was observed even after perfusion with flutamide (1M). Catechin (1  M) showed a similar response to depolarization of testosterone, changing the PM of -40.20 ± 0.51 mV to -35.62 ± 1.07 mV at 120 seconds after application (* p <0.001) (n = 9 Sertoli cells) after its application. The nandrolone (1μM) showed a depolarization of the PM changing -38.20 ± 0.71 to -33.42 ± 0.63 * p <0.05. The response of catechin and nandrolone was observed at different doses and even after perfusion with flutamide (1M). diazoxidae (100μM) and U73122 (2μM) nullified the effect of nandrolone (1μM) and catechin (1μM). Nandrolone and catechin increase 45Ca2+ uptake within 5 minutes of incubation with immature testes. Conclusion: The androgen testosterone, nandrolone and flavonoid catechin have a depolarizing action on the membrane potential of Sertoli cells from immature rats, observed even after the blockade of intracellular androgen receptor. The U73122 infusion and perfusion with diazoxide nullified the effect of nandrolone and catechin, indicating the involvement of PLC and K+ATP channels in depolarizing response observed. These results indicate that nandrolone and catechin act on an androgen membrane receptor, as well as testosterone through a non-classical pathway on Sertoli cells from rat testes.

Espécies reativas de oxigênio (ROS) têm sido descritas como potenciais causadoras de doenças como aterosclerose, artrite e câncer. Falhas na regulação das metaloproteinases de matriz (MMP), uma família de proteases que degradam matriz extracelular, parecem estar intimamente relacionadas com essas mesmas doenças. Além disso, autores sugerem uma relação entre a atividade das MMPs e ROS. Em trabalhos anteriores, nosso grupo de pesquisa demonstrou que o tratamento com retinol 7 μM foi capaz de induzir mudanças no metabolismo de células de Sertoli cultivadas, como o aumento da atividade de enzimas antioxidantes, aumento do dano oxidativo a biomoléculas, ativação de ERK1/2 MAPK, alteração do ciclo celular e transformação pré-neoplásica, ligando o tratamento com retinol ao estresse oxidativo. No presente trabalho, nós utilizamos a técnica de zimografia para verificar a atividade da MMP-2 em células de Sertoli tratadas com retinol e ácido retinóico. Nós encontramos que tanto o tratamento por 24 horas com retinol 7 μM, quanto o tratamento por 24 horas com ácido retinóico 1 nM, aumentaram a atividade da MMP-2 em células de Sertoli cultivadas. O cotratamento com diferentes antioxidantes reverteu o aumento da atividade da MMP-2 induzido por retinol, mas não por ácido retinóico. Além disso, o tratamento com retinol, mas não com ácido retinóico, foi capaz de aumentar a produção de ROS quantificada pela oxidação de DCFH-DA. Nós encontramos também que tanto o tratamento com retinol quanto com ácido retinóico foram capazes de aumentar a fosforilação de ERK1/2. Entretanto, somente o aumento da atividade da MMP-2 induzido por tratamento com retinol foi inibido por co-tratamento com UO126, um potente inibidor de fosforização de ERK1/2. Nossos resultados sugerem que o aumento da atividade da MMP-2 induzido por retinol, mas não por ácido retinóico, está relacionado com a fosforilação de ERK1/2 e com a geração de ERO. / Reactive oxygen species (ROS) have been hypothesized to play a causative role in numerous diseases such as atherosclerosis, arthritis and cancer. Failures in the regulation of the matrix metalloproteinases (MMP), a family of extracellular matrixdegrading proteases, appear to be intimately involved in these diseases. In addition, authors suggest a relationship between MPP activity and ROS. In early reports our research group has demonstrated that 7 μM retinol was able to induce changes in Sertoli cell metabolism, such as up-regulation of antioxidant enzyme activities, increase in oxidative damage to biomolecules, activation of ERK1/2 MAPK, cell-cycle alteration and pre-neoplasic transformation, linking retinol treatment and oxidative stress. Here, we verify the MMP activity in cultured Sertoli cells treated with vitamin A using gelatin zymography. We found that both retinol (7 μM by 24 hours) and retinoic acid (1 nM by 24 hours) treatments induces MMP-2 activity in cultured Sertoli cells. Antioxidants cotreatment reversed retinol-induced but not retinoic acid-induced MMP-2 activity. Moreover, retinol but not retinoic acid treatment increased ROS production quantified by DCFH-DA oxidation. We found that both retinol and retinoic acid treatment induced ERK1/2 phosphorylation. However, only retinol-increased MMP-2 activity was inhibited by UO126, a potent ERK1/2 phosphorylation inhibitor. Our results suggested that the increase on MMP- 2 activity induced by retinol, but not by retinoic acid, was related to ERK1/2 phosphorylation and ROS production.

Orientador: Francisco Eduardo Martinez / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T19:26:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Segatelli_TaniaMara_D.pdf: 2722114 bytes, checksum: 42553c00f75889ad9e7da916ef3940bd (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: O gerbilo (Meriones unguiculatus) é um roedor nativo das regiões áridas da Mongólia e China, é de especial interesse em pesquisas biomédicas e tem sido criado em laboratório desde 1960. Estudos sobre a estrutura e função do testículo do gerbilo são raros, em especial sobre a espermatogênese. O presente trabalho é o primeiro a realizar uma investigação mais detalhada sobre a duração do ciclo espermatogênico e analisar morfométrica e funcionalmente o testículo do gerbilo. Através da técnica de marcação com 3H-timidina, a duração do ciclo do epitélio seminífero foi estimada em 10,55 :f: 1,0 dias e a duração total do processo espermatogênico foi de 47,47 dias, considerando que 4,5 ciclos são necessários para completar o processo. Os compartimentos tubular e intersticial ocuparam volume de 92% e 8%, respectivamente. Baseado no volume ocupado pelo compartimento tubular no parênquima testicular e no diâmetro do túbulo seminífero, aproximadamente 10 metros de túbulos seminíferos foram encontrados por testículo e 18 metros por grama de testículo no gerbilo. Cerca de 12 espermatócitos primários foram formados para cada espermatogônia do tipo AI. O índice meiótico observado foi de 2,8, representando 30% de perdas celulares durante as divisões meióticas. O número de células de Sertoli por grama de testículo foi de 28 milhões, com capacidade de suporte individual de 21 células germinativas. A produção espermática diária por grama de testículo foi de 33 milhões, sugerindo alta eficiência espermatogênica nessa espécie. O gerbilo pode ser utilizado como modelo para futuras investigações do processo espermatogênico / Abstract: The gerbil (Meriones unguiculatus) is a rodent native of the arid regions of Mongolia and China, is of special interest in biomedical research and has been bred in laboratory since 1960. Studies on the structure and function of the gerbil testis are sporadic and, moreover those on spermatogenesis are rare. This is the first study to perform a more detailed investigation about duration of the spermatogenic cycle and morphometric and functional analysis of the gerbil testis. Through 3H-thymidine injection tecnic, the mean duration of seminiferous epithelium cyc1e was determined to be 10.55 :t 1.0 days and the total duration of spermatogenesis based on 4.5 cyc1es was 47.47 days. The volume density of tubular and interstitial compartments was approximately 92% and 8%, respectively. Based on the volume of the testis parenchyma and the volume occupied by seminiferous tubules in the testis and the tubular diameter, about 9 and 18 meters of seminiferous tubules were found per testis and per gram of testis, respectively. About 12 primary spermatocytes were formed for each type A1 spermatogonia. The meiotic index was 2.8. This result shows that 30% of cell loss occurs during the two meiotic divisions. The number of Sertoli cell per gram of the testis was 28 million and the supporting capacity was 21 germ cel1. The daily sperm production per gram of the testis was 33 million. This value suggest high spermatogenic efficiency in this specie. The gerbil could be utilized as an animal model for future investigation of spermatogenic process / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Ernesto Jose Doltaviano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-20T18:40:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vignado_Jane_M.pdf: 11166364 bytes, checksum: 5c6e796cff729f35ed09f7fb5556d51f (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: Embora seja do conhecimento geral que os hormônios tireoidianos estão envolvidos no desenvolvimento e manutenção de vários órgãos, ainda, existem aspectos contraditórios sobre seu papel na fisiologia testicular. Com a proposta de melhor compreender a influência dos hormônios tireoidianos na manutenção testicular, este estudo teve como objetivo avaliar parâmetros biométricos, morfológicos e hormonais em ratos de várias idades, que foram induzidos experimentalmente ao hipotireoidismo com doses diárias de 0,05 mg de Methimazole, confirmado pelas dosagens de Tiroxina (T4). Neste estudo utilizaram-se 68 ratos brancos (Rattus no veraicus, variedade albino), machos e 12 fetos. Estes animais foram sub divididos em 6 grupos experimentais, de acordo com o tempo de tratamento e a data do sacrifício e denominados: Hipotireoidismo materno-fetal (19º dia de vida fetal), 8 dias de idade, 21 dias de idade, 35 dias de idade, 50 dias de idade e 90 dias de idade. Os resultados mostraram que a indução do hipotireoidismo no oitavo dia de prenhez, que corresponde ao início da organogênese do rato, não resulta em aumento da incidência de reabsorção fetal ou de malformações congênitas e também não leva a alterações no comportamento dos animais com hipotireoidismo. Em todos os grupos experimentais analisados, os animais tratados apresentaram redução significativa (p<0,05) do peso corporal em relação aos animais controles da mesma idade. A avaliação biométrica dos testículos mostrou que os animais tratados apresentaram redução significativa (p<0,05) do peso testicular, do diâmetro dos túbulos seminíferos e do volume nuclear das células de Sertoli. Apenas os fetos com 19 dias de vida intra-uterina não mostraram diferenças nos parâmetros acima citados. A morfologia dos testículos dos animais tratados mostrou atraso no início do estadiamento do ciclo do epitélio seminífero, com redução da quantidade de células germinativas e aumento do número de células degeneradas. Nos grupos experimentais 50 dias e 90 dias de idade, os animais tratados apresentaram estadiamento completo do epitélio seminífero, mas a frequência dos estádios I, VII/VIII e XIV foi menor do que a dos animais controles da mesma idade. As dosagens em duplicata da testosterona plasmática, pelo método de fluoroimunoensaio de fase sólida, não mostraram diferenças significativas entre os valores encontrados nos animais controles e tratados. Conclui-se que o hipotireoidismo prejudica acentuadamente a espermatogênese dos ratos jovens, prejuízo detectável através da redução do peso testicular, da diminuição do diâmetro dos túbulos seminíferos, do aumento de células germinativas degeneradas, do atraso da espermatogênese e da redução do volume nuclear das células de Sertoli. Nos animais tratados com 90 dias de idade, ocorre ganho consideravelmente maior do peso testicular, do diâmetro dos túbulos seminíferos em relação aos animais controles da mesma idade e aparente estabilização no volume nuclear das células de Sertoli, sugerindo ausência da participação dos hormônios tireoidianos sobre o testículo do rato adulto / Abstract: Although it is well known that thyroidal hormones are involved in the development and maintenance of many organs, there remain several open questions as to their role in testicular physiology. The present work proposes to contribute to a better understanding of the role of thyroidal hormones in testicular maintenance. The evaluation was based on the biometric, morphologic and hormonal parameters of groups of data of different ages in which a previous experimental hypothyroidism was induced by treating them with daily 0,05mg Methimazole, and confirmed by measuring thyroxine levels. Our study involved an experimental of 68 white male rats and 12 foetuses (albino Rattus novergicus). These animals were subdivided into 6 experimental groups according to the period of treatment and their death date and will here be designated as mother-foetal ( 190 days of intrauterine life), 8 day old, 21 day old, 35 day old, 50 day old and 90 day old hypothyroidism, respectively. Our results showed that induction to hypothyroidism in the eighth day of pregnancy, which corresponds to the beginning of organogenesis in rats, did not result in any increase in the incidence of either foetal reabsorption nor congenital malformations, as well not causing behavioral alteration of animals with hypothyroidism. In all of the experimental groups considered, the treated animals have a significant reduction (p<0,05) in body weight as related to the control animals of same age. Biometric evaluation of testicles has shown that treated animals had significant reduction (p<0,05) in both the testicular weight and the diameter of seminiferous tubules as well as a reduction in the nuclear volume of Sertoli cells. Only the foetuses having 19 days of intrauterine life had no differences in such parameters, while in the treated 90 day old animals testicular recuperation was observed. As to the morphology, the testicular development of treated animals was delayed in the beginning of the seminiferous epithelium cycle, with a reduction in the quantity of germinative cells and an increase in the number of degenerated cells. In both the 50 and 90 day old experimental groups, the treated animals completed staging of the seminiferous epithelium, but the frequency of stages I, VII/VIII and XIV was reduced as compared to the control animals of the same age. Duplicated dosages of plasmic testosterone by means of solid phase fluoroimunoassays showed no significant differences in the values found for both treated and control animals. We conclude that hypothyroidism severely impairs espermatogenesis in young rats as indicated by the reduced testicular weight, the diminished seminiferous tubule diameter, the increased degeneration of germinative cells, the delayed staging in the seminiferous epithelium cycle and the reduced nuclear volume in Sertoli cell. This did not occur in adults rats. In treated animals belonging to the 90 day old experimental group we have observed the occurence of significantly larger gain in both the testicular weight and the seminiferous tubule diameter, as compared to the control animals of the same age, as well as the occurrence an apparent stabilization of the nuclear volume of Sertoli cells, which thereby suggest that there is no influence of the thyroidal hormones upon adult rats testicles / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Ciências Biológicas

Analisou-se por métodos quantitativos e qualitativos o testículo de roedores histricomorfos nas fases, pré-púbere, púbere e adulto da Paca (Cuniculus paca), Cutia (Dasyprocta leporina) e Porquinho-da-índia (Cavia porcellus). Mediante as técnicas de microscopia de luz, microscopia eletrônica de varredura, microscopia eletrônica de transmissão e método estereológico. Verificou-se a influência do Letrozol um inibidor da enzima aromatase nas dosagens de 0,15mg\\kg e 1,0 mg\\kg, sobre a morfologia testicular de pacas macho. Este modelo animal apresenta importância, comercial e científica sendo excelente alternativa para a pesquisa, colaborando com o desenvolvimento de investigações vitais ao homem e aos próprios animais. Os resultados desta investigação demonstraram, que os aspectos qualitativos da morfologia testicular do Porquinho-da-índia, Cutia e de Paca foram semelhante nas fases pré-púbere, púbere e adulta. As avaliações quantitativas do Porquinho-da-índia e Cutia realizados mediante o método estereológico permitiram quantificar parâmetros, sem hipóteses de forma, tamanho, orientação ou distribuição das partículas contadas, demonstrando ser um método imparcial e confiável para ser aplicado em estudos de reprodução. Considerando o estrógeno ser essencial para a função da espermatogênese, o efeito do Letrozol no testículo da paca (Cuniculus paca), sugeriu que a inibição da enzima aromatase mediante a utilização de Letrozol na dosagem de 0,15mg \\kg, sugeriu em um aumento no número das células de Sertoli, refletindo sobre as demais células testiculares, comparando com o testículo basal (controle). O testículo tratado (Letrozol) demonstrou epitélio germinativo íntegro, sendo este dado importante para a reprodução. No animal púbere houve um aumento no número de células de- Sertoli, semelhante ao descrito anteriormente. O epitélio seminífero mostrou com alterações morfológicas, tais como proliferação celular, presença de células germinativas com características apoptóticas, e vacúolos e núcleos em picnose. Estes dados poderão ser úteis para o estudo da Síndrome da Disgenesia testicular / Analysis by quantitative and qualitative methods testicular histricomorfs rodents in phases, pre-pubertal, pubertal and adult paca (Cuniculus paca), agouti (Dasyprocta leporina) and guinea-pig (Cavia porcellus). By means of light microscopy techniques, scanning electron microscopy, transmission electron microscopy, stereological method and the influence of an aromatase inhibitor, the Letrozole in dosages of 0.15 mg\\kg and 1.0 mg\\kg on testicular male morphology paca. This animal model has importance, excellent commercial and scientific alternative to research, contributing to the development of vital research to humans and from animals themselves. The results of this research have shown that the qualitative aspects of testicular morphology guinea-pig, Agouti and paca were similar in pre-pubertal, pubertal and adult stages. Quantitative assessments of the guinea-pig and agouti performed by the stereological method allowed quantify parameters, no change of shape, size, orientation or distribution of particles counted, it is proving to be a partial and reliable method to be applied to reproduction studies. Considering the estrogen is essential for the function of spermatogenesis, the effect of Letrozole in the testis of paca (Cuniculus paca), suggested that inhibition of aromatase enzyme through the use of Letrozole in a dosage of 0.15 mg\\kg suggested in an increase in number of Sertoli cells, reflecting on the other testicular cells, comparing the baseline testis (control). The treaty testis (Letrozole) showed intact germinal epithelium, which is important data for reproduction. In pubertal animals there was an increase in the number of de Sertoli cells, similar to that described above. The seminiferous epithelium showed to morphological changes such as cell proliferation, the presence of germ cells with apoptotic features and vacuoles and nuclei picnosis. These data may be useful for the study of testicular dysgenesis syndrome