A investigação do potencial terapêutico de compostos naturais não tóxicos capazes de prevenir ou reduzir o impacto do estresse oxidativo em doenças inflamatórias diretamente relacionadas a dor tem exercido um papel fundamental no desenvolvimento de novas medicamentos. O ácido chiquímico (ACH) é um composto natural originalmente extraído da Illicium verum Hook. f., uma planta medicinal usada no tratamento de doenças inflamatórias. Apesar do ACH ter sido usado como um precursor químico na síntese do antiviral Tamiflu®, o seu potencial como um composto anti-inflamatório e antioxidante, já enraizado pelo uso popular, ainda permanece desconhecido. Baseado nisso, o objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade antioxidante, anti-inflamatória e antinociceptiva do ACH em modelos in vitro e in vivo. Inicialmente as propriedades físico-químicas do ACH foram avaliadas e a atividade antioxidante comprovada, bem como seu potencial de proteger a morte celular induzida por peróxido de hidrogênio em células de neuroblastoma SH-SY5Y. O ACH atenuou a inflamação induzida pelo LPS em macrófagos RAW 264.7, foi capaz de inibir a produção de citocinas (TNF-α e IL-β) e de NO, assim como a ativação das MAPKs (ERK1/2 e P38) induzida pelo LPS, sugerindo que o ACH pode exercer uma atividade anti-inflamatória. In vivo, o ACH bloqueou a hiperalgesia mediada pela carragenina (CG), TNF-α, prostaglandinas (PEG2) e dopamina (DA) em camundongos. Esses resultados sugerem que o efeito antinociceptivo do ACH pode ser atribuído, em parte, a sua ação antioxidante e anti-inflamatória, dois mecanismos que sustentam a transdução do sinal doloroso. / The investigation of the therapeutic potential of natural non-toxic compounds capable of counteracting oxidative stress associated with inflammatory disease and painful conditions, has been of key interest in drug development. Shiquimic acid (SA) is a nature-derived compound originally extracted from Illicium verum Hook. f., a chinese medicinal herb used to treat inflammatory diseases. Even though SA has currently been used as a chemical precursor for synthesis of the antiviral Tamiflu, its potential as an anti-inflammatory and antioxidant compound – already rooted by its popular use - remains unknown until now. Based on that, the aim of this study was to evaluate the antioxidant, anti-inflammatory and anti-nociceptive activity of SA in vitro and in vivo models. Initially the physic-chemical properties of SA were evaluated and proven antioxidant activity, as well as its potential to protect hydrogen peroxide-induced cell death in neuroblastoma SH-SY5Y cells. SA attenuates LPS-induced inflammation in RAW 264.7 macrophages, SA was capable of inhibiting TNF-α and IL-1β cytokines production, NO production as well as LPS-induced activation of MAPKs (p38 and ERK1/2), thus suggesting that SA may exert anti-inflammatory activity. In vivo, SA blocked carrageenan, TNF-alpha-, prostaglandin (PE2)-, and dopamine-induced hyperalgesia in mice. These results suggest that anti-nociceptive effect of SA could be attributed, at least in part, to their antioxidant and anti-inflammatory actions, two mechanisms underpinning painful signal transduction.

A investigação do potencial terapêutico de compostos naturais não tóxicos capazes de prevenir ou reduzir o impacto do estresse oxidativo em doenças inflamatórias diretamente relacionadas a dor tem exercido um papel fundamental no desenvolvimento de novas medicamentos. O ácido chiquímico (ACH) é um composto natural originalmente extraído da Illicium verum Hook. f., uma planta medicinal usada no tratamento de doenças inflamatórias. Apesar do ACH ter sido usado como um precursor químico na síntese do antiviral Tamiflu®, o seu potencial como um composto anti-inflamatório e antioxidante, já enraizado pelo uso popular, ainda permanece desconhecido. Baseado nisso, o objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade antioxidante, anti-inflamatória e antinociceptiva do ACH em modelos in vitro e in vivo. Inicialmente as propriedades físico-químicas do ACH foram avaliadas e a atividade antioxidante comprovada, bem como seu potencial de proteger a morte celular induzida por peróxido de hidrogênio em células de neuroblastoma SH-SY5Y. O ACH atenuou a inflamação induzida pelo LPS em macrófagos RAW 264.7, foi capaz de inibir a produção de citocinas (TNF-α e IL-β) e de NO, assim como a ativação das MAPKs (ERK1/2 e P38) induzida pelo LPS, sugerindo que o ACH pode exercer uma atividade anti-inflamatória. In vivo, o ACH bloqueou a hiperalgesia mediada pela carragenina (CG), TNF-α, prostaglandinas (PEG2) e dopamina (DA) em camundongos. Esses resultados sugerem que o efeito antinociceptivo do ACH pode ser atribuído, em parte, a sua ação antioxidante e anti-inflamatória, dois mecanismos que sustentam a transdução do sinal doloroso. / The investigation of the therapeutic potential of natural non-toxic compounds capable of counteracting oxidative stress associated with inflammatory disease and painful conditions, has been of key interest in drug development. Shiquimic acid (SA) is a nature-derived compound originally extracted from Illicium verum Hook. f., a chinese medicinal herb used to treat inflammatory diseases. Even though SA has currently been used as a chemical precursor for synthesis of the antiviral Tamiflu, its potential as an anti-inflammatory and antioxidant compound – already rooted by its popular use - remains unknown until now. Based on that, the aim of this study was to evaluate the antioxidant, anti-inflammatory and anti-nociceptive activity of SA in vitro and in vivo models. Initially the physic-chemical properties of SA were evaluated and proven antioxidant activity, as well as its potential to protect hydrogen peroxide-induced cell death in neuroblastoma SH-SY5Y cells. SA attenuates LPS-induced inflammation in RAW 264.7 macrophages, SA was capable of inhibiting TNF-α and IL-1β cytokines production, NO production as well as LPS-induced activation of MAPKs (p38 and ERK1/2), thus suggesting that SA may exert anti-inflammatory activity. In vivo, SA blocked carrageenan, TNF-alpha-, prostaglandin (PE2)-, and dopamine-induced hyperalgesia in mice. These results suggest that anti-nociceptive effect of SA could be attributed, at least in part, to their antioxidant and anti-inflammatory actions, two mechanisms underpinning painful signal transduction.

Submitted by Michele Mologni (mologni@unoeste.br) on 2017-08-30T13:15:11Z No. of bitstreams: 1 Fláive Loyze Baldassarini Silva.pdf: 2001999 bytes, checksum: e6f3c3f0169423517f9b8ffac6f5f788 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-30T13:15:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fláive Loyze Baldassarini Silva.pdf: 2001999 bytes, checksum: e6f3c3f0169423517f9b8ffac6f5f788 (MD5) Previous issue date: 2017-06-27 / The association between proline metabolism in the plant and the pentose phosphate pathway has been proposed as a model to stimulate one of the biosynthetic routes of secondary metabolism related to the production of the different phenolic compounds in plants, known as the shikimic acid pathway. In transgenic plants in which overexpression of the P5CS gene Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase encoding the key enzyme of proline biosynthesis occurs, in addition to increased tolerance to abiotic stresses, there is the possibility of promoting the synthesis of phenolic compounds as a pleiotropic effect. The objective of this work was to evaluate the role of proline "per se" in relation to the production of phenolic compounds in transgenic tobacco plants accumulating this amino acid (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1) and to verify if water stress would modify this answer. The experiment was carried out under greenhouse conditions, at Campus II of Universidade do Oeste Paulista, Presidente Prudente - SP. A completely randomized design was used in the factorial scheme 3x2 consisting of 3 genotypes (two transgenic events with constitutive expression 35S::P5CSF129A and untransformed control plants) and two levels of water regime, with daily water replenishment of 100% and 30% of field capacity (water stress). The role of proline "per se" was evaluated by means of biometric growth analyzes (plant height, shoot and root dry mass and leaf number) in addition to proline analyzes, glucose-6-phosphate dehydrogenase activity (G6PDH), phenylalanine ammonia lyase (PAL), total phenolic compounds in leaves and lignin. In a natural response to water stress, a reduction in biometric parameters was observed for all genotypes. The accumulation of proline occurred in a greater proportion in the transgenic plants as expected by the constitutive expression of the P5CS gene, but the activity of the G6PDH enzyme was lower in the transgenic plants. The link between increased proline endogenous content and increased phenol synthesis occurred both under normal hydration conditions (for E2 event) and in the presence of water stress (for both transgenic events), as well as PAL activity. Lignin contents increased in all genotypes in response to stress. Thus, the results of this research lead us to affirm the existence of distinct responses between exogenous application of proline reported in the literature and endogenous cellular metabolism. It was not possible to confirm the hypothesis that the proline metabolism linked to the pentose phosphate pathway induces the synthesis of phenolic compounds, since the activity of the G6PDH enzyme was lower in the transgenic plants in the two water conditions. It is suggested that the precursors to the pathway of phenolic compounds linked to proline may be provided by other metabolic pathways such as glycolysis and the Calvin cycle. Further study will be needed to clarify this issue. / A associação entre o metabolismo de prolina na planta e a via pentose fosfato tem sido proposta como um modelo para se estimular uma das rotas do metabolismo secundário relacionada à produção dos diferentes compostos fenólicos em plantas, denominada via do ácido chiquímico. Em plantas transgênicas nas quais ocorrem a superexpressão do gene P5CS Δ1-pirrolina-5-carboxilato sintetase, que codifica a enzima-chave da biossíntese de prolina, além do aumento de tolerância a estresses abióticos, existe a possibilidade de promoção da síntese de compostos fenólicos como um efeito pleiotrópico. O objetivo deste trabalho foi avaliar o papel da prolina “per se” em relação à produção de compostos fenólicos em plantas transgênicas de tabaco acumuladoras deste aminoácido (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1) e verificar se o estresse hídrico modificaria essa resposta. O experimento foi realizado em condições de casa de vegetação, no Campus II da Universidade do Oeste Paulista, Presidente Prudente - SP. Utilizou-se o delineamento experimental em arranjo inteiramente casualizado, no esquema fatorial 3x2, formado por 3 genótipos (dois eventos transgênicos com expressão constitutiva 35S::P5CSF129A e plantas controle não transformadas) e dois níveis de regime hídrico, com reposições diárias de água de 100% e de 30% da capacidade de campo (estresse hídrico). O papel da prolina “per se” foi avaliado por meio de análises biométricas de crescimento (altura de plantas, massas seca de parte aérea e raiz e número de folhas) além das análises de prolina, atividade das enzimas glicose-6-fosfato-desidrogenase (G6PDH), fenilalanina amônia liase (FAL), compostos fenólicos totais nas folhas e lignina. Em resposta natural ao estresse hídrico, foi observado uma redução nos parâmetros biométricos para todos os genótipos. O acúmulo de prolina ocorreu em maior proporção nas plantas transgênicas como esperado pela expressão constitutiva do gene P5CS, porém a atividade da enzima G6PDH foi menor nas plantas transgênicas. A vinculação entre um maior conteúdo endógeno de prolina com a síntese aumentada de fenóis ocorreu tanto em condições normais de hidratação (para o evento E2) como na presença de estresse hídrico (para ambos os eventos transgênicos), assim como a atividade da FAL. Os teores de lignina aumentou em todos os genótipos em resposta ao estresse. Desta forma, os resultados dessa pesquisa levam-nos a afirmar a existência de respostas distintas entre aplicação exógena de prolina relatada na literatura e o metabolismo endógeno celular. Não foi possível confirmar a hipótese de que o metabolismo de prolina vinculado à via pentose fosfato induz a síntese de compostos fenólicos, pois a atividade da enzima G6PDH foi menor nas plantas transgênicas nas duas condições hídricas. Sugere-se que os precursores para a via dos compostos fenólicos ligados a prolina podem ser fornecidos por outras vias metabólicas tais como a glicólise e o ciclo de Calvin. Estudos mais aprofundados serão necessários para esclarecer esta questão.

Coffee contains many antioxidants including purpurogallin, which is a hydrophobic phenolic antioxidant that is difficult to measure with reported methods. A method combining solid-phase extraction and liquid chromatography–mass spectrometry was developed to detect and quantify purpurogallin in brewed beverages, including coffee. For beverage preparation, water extraction was adopted for improved correlation with moka pot brewing. Purpurogallin was detected in all commercial coffee samples, and its content in ground coffees ranged from 455-630 ng/g dry weight. Purpurogallin was only detected in two English breakfast tea samples (335-360 ng/g dry weight) and was not detected in any cocoa sample. Antioxidant activity, total phenolic content, and phenolic profile of coffees with different degrees of roasting were determined and analyzed. The developed methodology was then further improved, and coffees with different roasting degrees were analyzed for their antioxidant activity, total phenolic content, and phenolic profile. The antioxidant activity ranged from 63.9-92.0 mg Trolox equivalents per gram of coffee (dry weight), and the total phenolic content ranged from 36.0-57.7 mg gallic acid equivalents per gram of coffee (dry weight). However, the total phenolic content was not correlated with the roasting degree (p > 0.05). When the roasting degree increases, chlorogenic acid decreases drastically, but shikimic acid, caffeic acid, gallic acid, pyrogallol, and purpurogallin increase correspondingly. The results suggest that purpurogallin is a common antioxidant in roasted coffees, and an increase in roasting degree will not only lead to dramatic breakdown of chlorogenic acid, but also promote significant formation of other phenolic compounds that can provide antioxidant activity.

Na literatura existe um consenso que os herbicidas glifosato (Gli) e 2,4-D interagem antagonicamente quando aplicados em combinação. No entanto, as bases bioquímicas e fisiológicas destes antagonismos são desconhecidas. Utilizou-se espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) para a caracterização de moléculas de Gli e 2,4-D em várias formulações analíticas, preparadas de maneira que os herbicidas fossem obtidos sem os ingredientes inertes das formulações comerciais. Não foram encontradas alterações significativas na conformação atômica do herbicida nos espectros de RMN entre as formulações analíticas de Gli isopropilamina, dimetilamina, potássio ou amônio; 2,4-D Dimetilamina ou colina, quando analisadas separadamente ou em mistura. Avaliando também formulações comerciais dos herbicidas, não foram encontradas diferenças significativas entre os espectros de RMN para a mistura entre Gli e 2,4-D. A formulação comercial de Gli amoníaco apresentou alterações na conformação molecular do Gli, principalmente na região P da molécula que mostrou maior deslocamento químico, mas isso foi atribuído aos maiores teores de Na encontrados nessa formulação. Aplicando-se as diferentes formulações comerciais na espécie modelo de tomate Micro-Tom (MT), foram estudados os padrões de absorção dos herbicidas. A absorção de Gli radiomarcado pelas plantas de MT foi reduzida somente para a formulação Gli sal de amônio, independentemente da presença de 2,4-D. Neste trabalho, não se observou efeito antagônico na absorção entre Gli e 2,4-D. Por meio de um ensaio fatorial para determinar o efeito antagônico dos herbicidas em plantas de MT, observou-se que a dose de maior antagonismo para 2,4-D foi: 35 g i.a. ha-1 - 0,65 mM e para Gli, 70 g g i.a. ha-1 - 1,7 mM. A translocação do Gli radiomarcado foi significativamente reduzida em MT, quando aplicado com 2,4-D. Experimentos utilizando o marcador molecular GUS no gene DR5 do MT, mostraram que o Gli reduz a resposta de expressão gênica pelas vias de sinalização do 2,4-D. Os ensaios de quantificação de espécies reativas de oxigênio (EROs) induzidas pela atuação do 2,4-D, apresentaram menor produção na presença do Gli. O acúmulo de ácido chiquímico causado pelo Gli no MT foi maior quando aplicado sem mistura com 2,4-D. A interferência do 2,4-D na atuação do Gli foi confirmada nos mutantes insensíveis à auxina diageotropica (dgt) e Never ripe (Nr), em que a produção de EROs foi menor e a translocação do Gli foi mantida independente da aplicação com o 2,4-D. O acúmulo de ácido chiquímico na aplicação de Gli e a mistura dos herbicidas, foram semelhantes. O mutante yellow-green2 (yg2), menos sensível ao Gli, apresentou menor translocação do herbicida. O acúmulo de ácido chiquímico para este mutante foi menor quando aplicado com Gli, mas na mistura de Gli + 2,4-D, a quantidade do ácido aumentou. A insensibilidade ao Gli proporcionou o reestabelecimento da produção de EROs pelo 2,4-D na aplicação da mistura dos herbicidas. Neste trabalho, em contraposição ao conhecimento atual, não se observou qualquer efeito antagônico entre Gli e 2,4-D a nível químico, mas o antagonismo ocorreu por fatores da inter-relação dos mecanismos que cada herbicida induz nos níveis fisiológicos, bioquímicos e genéticos na biologia do organismo vegetal. / A consensus exists in literature that the herbicides glyphosate and 2,4-D interact antagonistically when applied in combination. However, the biochemical and physiological basis of this antagonism are unknown. It was used Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectrometry to characterize the molecules of glyphosate and 2,4-D prepared with high purity analytical compounds without the commercial formulations inert ingredients. No changes in atomic herbicide conformation ware found in NMR spectra of glyphosate formulations isopropylamine, dimethylamine, potassium or ammonium and 2,4-D dimethylamine or choline, when evaluated separately or in mixture. Analysing also the commercial herbicides formulations, no differences in NMR spectra for the mixture between glyphosate and 2,4-D ware found in chemical shift. The ammonium salt glyphosate formulations, presented changes in molecular conformation in P region of glyphosate showing higher chemical shift, which was attributed to higher levels of Na found in its composition. It was applied different commercial formulations in tomato cultivar Micro-Tom (MT) to study the pattern of herbicide absorption. The absorption of radiolabeled glyphosate by MT was reduced in the ammonium salt formulation, regardless of the 2,4-D\'s presence. In this work, no antagonistic effect in plant absorption was observed between glyphosate and 2,4-D. Factor assay was conducted using different concentrations of 2,4-D and glyphosate to determine the antagonistic effect on tomato plants. It was observed that the dose of greater antagonism to 2,4-D form 35 g a.i. ha-1 - 0.65 mM and for glyphosate, 70 g a.i. ha-1 - 1.7 mM. Assays using molecular reporter GUS in MT`s DR5 gene, showed that the glyphosate reduces gene expression responses through signalling pathways of the 2,4-D. The absorption of radiolabeled glyphosate was significantly reduced in MT, when it was applied with 2,4-D. In trials that it was quantified production of reactive oxygen species (ROS) on MT induced by 2,4-D performance, lower production were found when 2,4-D ware applied with glyphosate. The shikimic acid accumulation affected by glyphosate action in MT was higher when applied without 2,4-D mixture. The interference of 2,4-D in glyphosate`s actions was confirmed in auxin insensitive mutants diageotropica (dgt) and Never ripe (Nr), which ROS production was lower. In those mutants, glyphosate translocation was maintained regardless 2,4-D application and shikimic acid accumulation between glyphosate treatment and herbicide mixture were similar. The yellow-green2 (yg2) mutant was less sensitive to glyphosate, presenting low translocation to the herbicide. The shikimic acid accumulation for yg2 mutant was lower when applied with glyphosate, but when it was treated with glyphosate + 2,4-D, the amount of acid was increased. The insensitivity of glyphosate provided reestablishment of ROS production by 2,4-D, when the mixture of herbicides were applied. In this paper it was show that, in contrast to current knowledge, there was no antagonistic effect between glyphosate and 2,4-D in chemical level, but the antagonism occurred by factors of the interrelationship of the mechanisms that each herbicide induces in the physiological, biochemical and genetic levels in the biology of the plant organism.

Na literatura existe um consenso que os herbicidas glifosato (Gli) e 2,4-D interagem antagonicamente quando aplicados em combinação. No entanto, as bases bioquímicas e fisiológicas destes antagonismos são desconhecidas. Utilizou-se espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) para a caracterização de moléculas de Gli e 2,4-D em várias formulações analíticas, preparadas de maneira que os herbicidas fossem obtidos sem os ingredientes inertes das formulações comerciais. Não foram encontradas alterações significativas na conformação atômica do herbicida nos espectros de RMN entre as formulações analíticas de Gli isopropilamina, dimetilamina, potássio ou amônio; 2,4-D Dimetilamina ou colina, quando analisadas separadamente ou em mistura. Avaliando também formulações comerciais dos herbicidas, não foram encontradas diferenças significativas entre os espectros de RMN para a mistura entre Gli e 2,4-D. A formulação comercial de Gli amoníaco apresentou alterações na conformação molecular do Gli, principalmente na região P da molécula que mostrou maior deslocamento químico, mas isso foi atribuído aos maiores teores de Na encontrados nessa formulação. Aplicando-se as diferentes formulações comerciais na espécie modelo de tomate Micro-Tom (MT), foram estudados os padrões de absorção dos herbicidas. A absorção de Gli radiomarcado pelas plantas de MT foi reduzida somente para a formulação Gli sal de amônio, independentemente da presença de 2,4-D. Neste trabalho, não se observou efeito antagônico na absorção entre Gli e 2,4-D. Por meio de um ensaio fatorial para determinar o efeito antagônico dos herbicidas em plantas de MT, observou-se que a dose de maior antagonismo para 2,4-D foi: 35 g i.a. ha-1 - 0,65 mM e para Gli, 70 g g i.a. ha-1 - 1,7 mM. A translocação do Gli radiomarcado foi significativamente reduzida em MT, quando aplicado com 2,4-D. Experimentos utilizando o marcador molecular GUS no gene DR5 do MT, mostraram que o Gli reduz a resposta de expressão gênica pelas vias de sinalização do 2,4-D. Os ensaios de quantificação de espécies reativas de oxigênio (EROs) induzidas pela atuação do 2,4-D, apresentaram menor produção na presença do Gli. O acúmulo de ácido chiquímico causado pelo Gli no MT foi maior quando aplicado sem mistura com 2,4-D. A interferência do 2,4-D na atuação do Gli foi confirmada nos mutantes insensíveis à auxina diageotropica (dgt) e Never ripe (Nr), em que a produção de EROs foi menor e a translocação do Gli foi mantida independente da aplicação com o 2,4-D. O acúmulo de ácido chiquímico na aplicação de Gli e a mistura dos herbicidas, foram semelhantes. O mutante yellow-green2 (yg2), menos sensível ao Gli, apresentou menor translocação do herbicida. O acúmulo de ácido chiquímico para este mutante foi menor quando aplicado com Gli, mas na mistura de Gli + 2,4-D, a quantidade do ácido aumentou. A insensibilidade ao Gli proporcionou o reestabelecimento da produção de EROs pelo 2,4-D na aplicação da mistura dos herbicidas. Neste trabalho, em contraposição ao conhecimento atual, não se observou qualquer efeito antagônico entre Gli e 2,4-D a nível químico, mas o antagonismo ocorreu por fatores da inter-relação dos mecanismos que cada herbicida induz nos níveis fisiológicos, bioquímicos e genéticos na biologia do organismo vegetal. / A consensus exists in literature that the herbicides glyphosate and 2,4-D interact antagonistically when applied in combination. However, the biochemical and physiological basis of this antagonism are unknown. It was used Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectrometry to characterize the molecules of glyphosate and 2,4-D prepared with high purity analytical compounds without the commercial formulations inert ingredients. No changes in atomic herbicide conformation ware found in NMR spectra of glyphosate formulations isopropylamine, dimethylamine, potassium or ammonium and 2,4-D dimethylamine or choline, when evaluated separately or in mixture. Analysing also the commercial herbicides formulations, no differences in NMR spectra for the mixture between glyphosate and 2,4-D ware found in chemical shift. The ammonium salt glyphosate formulations, presented changes in molecular conformation in P region of glyphosate showing higher chemical shift, which was attributed to higher levels of Na found in its composition. It was applied different commercial formulations in tomato cultivar Micro-Tom (MT) to study the pattern of herbicide absorption. The absorption of radiolabeled glyphosate by MT was reduced in the ammonium salt formulation, regardless of the 2,4-D\'s presence. In this work, no antagonistic effect in plant absorption was observed between glyphosate and 2,4-D. Factor assay was conducted using different concentrations of 2,4-D and glyphosate to determine the antagonistic effect on tomato plants. It was observed that the dose of greater antagonism to 2,4-D form 35 g a.i. ha-1 - 0.65 mM and for glyphosate, 70 g a.i. ha-1 - 1.7 mM. Assays using molecular reporter GUS in MT`s DR5 gene, showed that the glyphosate reduces gene expression responses through signalling pathways of the 2,4-D. The absorption of radiolabeled glyphosate was significantly reduced in MT, when it was applied with 2,4-D. In trials that it was quantified production of reactive oxygen species (ROS) on MT induced by 2,4-D performance, lower production were found when 2,4-D ware applied with glyphosate. The shikimic acid accumulation affected by glyphosate action in MT was higher when applied without 2,4-D mixture. The interference of 2,4-D in glyphosate`s actions was confirmed in auxin insensitive mutants diageotropica (dgt) and Never ripe (Nr), which ROS production was lower. In those mutants, glyphosate translocation was maintained regardless 2,4-D application and shikimic acid accumulation between glyphosate treatment and herbicide mixture were similar. The yellow-green2 (yg2) mutant was less sensitive to glyphosate, presenting low translocation to the herbicide. The shikimic acid accumulation for yg2 mutant was lower when applied with glyphosate, but when it was treated with glyphosate + 2,4-D, the amount of acid was increased. The insensitivity of glyphosate provided reestablishment of ROS production by 2,4-D, when the mixture of herbicides were applied. In this paper it was show that, in contrast to current knowledge, there was no antagonistic effect between glyphosate and 2,4-D in chemical level, but the antagonism occurred by factors of the interrelationship of the mechanisms that each herbicide induces in the physiological, biochemical and genetic levels in the biology of the plant organism.

This diploma thesis deals with the development of an HPLC method for the determination of selected compounds participating in enzymatic reaction leading to the formation of gallic acid. The analysed reaction mixture contains the following reagents: shikimic acid, NADP+ and shikimatedehydrogenase (SDH) extracted from parsley; the presumed product of the reaction is gallic acid. Two chromatographic methods for the determination of the above mentioned compounds were developed using C18 HPLC column and porous graphitic carbon Hypercarb column. Molecular absorption spectrometric detection in the UV range was used in all measurements. Separation on the C18 column was found particularly suitable for analysing the composition of the end products of the reaction. Because of the NADP+ and shikimic acid peak overlap it is necessary to observe absorbance at 212 and 260 nm. Shikimic acid and NADP+ can be quantified due to the fact that shikimic acid does not absorb at 260 nm while NADP+ absorb radiation at both wavelengths. Separation via Hypercarb column was found particularly suitable for analysing the process of the reaction; additional products or intermediates can be seen in chromatograms compared to the C18 method. Determination with Hypercarb column is characterized by higher sensitivity and lower limit...

Submitted by GILMAR JOSÉ PICOLI JUNIOR null (gilmarpicoli@yahoo.com.br) on 2016-03-01T21:07:14Z No. of bitstreams: 1 Tese versão definitiva.pdf: 3101518 bytes, checksum: 929d40efab9e6e768e639133eb923580 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-03-04T12:31:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 picolijunior_gj_dr_bot.pdf: 3101518 bytes, checksum: 929d40efab9e6e768e639133eb923580 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-04T12:31:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 picolijunior_gj_dr_bot.pdf: 3101518 bytes, checksum: 929d40efab9e6e768e639133eb923580 (MD5) Previous issue date: 2016-01-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / No Brasil, o azevém (Lolium multiflorum) foi identificado como resistente ao glyphosate se tornando um grande problema em determinadas lavouras. Dessa forma, entender o comportamento a nível bioquímico e fisiológico desta planta daninha são ferramentas que auxiliam num manejo eficiente. Com isso, o objetivo deste trabalho foi comparar o perfil bioquímico e fisiológico de populações de azevém suscetíveis e resistentes ao herbicida glyphosate aplicação do mesmo. Foram realizados quatro estudos em casa-de-vegetação com delineamento experimental inteiramente casualizados com quatro repetições sendo semeadas três populações de azevém (Lolium multiflorum) consideradas como suscetível (S), com suspeita de resistência (R1) e resistente (R2) ao herbicida glyphosate. No primeiro estudo foi obtido o controle aos 21 dias após a aplicação (DAA) e quantificada a massa seca aos 28 DAA das três populações. Os tratamentos foram constituídos da aplicação do herbicida glyphosate composto pelas doses: 0, 135, 270, 540, 1080, 2160, 4320, 8640 g e.a. ha-1. O segundo estudo teve como objetivo determinar a atividade da enzima fenilalanina amônia liase (PAL) nas diferentes populações as 12, 24, 48 e 72 horas após a aplicação (HAA). Os tratamentos foram compostos de duas doses (720 g e.a. ha-1 e 1080 g e.a. ha-1) mais uma testemunha sem aplicação. No terceiro estudo foram realizadas avaliações da fotossíntese nas três populações ao 1, 3, 7 e 28 DAA. As variáveis analisadas foram: taxa de assimilação líquida de CO2, condutância estomática, concentração interna de CO2, transpiração, eficiência do uso da água e eficiência instantânea de carboxilação. Os tratamentos foram compostos de duas doses (720 g e.a. ha-1 e 1080 g e.a. ha-1) mais uma testemunha sem aplicação. O quarto estudo teve o objetivo de quantificar compostos alterados da rota do ácido chiquímico. Para isso, foram utilizados os mesmos tratamentos do primeiro estudo e realizadas coletas das folhas aos 5, 11 e 28 DAA. Os compostos analisados foram: glyphosate, AMPA (ácido aminometilfosfônico), ácido chiquímico, ácido quínico, shiquimato-3-fosfato, os aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina e triptofano, ácido ferúlico, ácido coumárico e ácido cafeico. Na população considerada resistente, a atividade da enzima fenilalanina amônia liase manteve-se alta após a aplicação do glyphosate. Todas as variáveis fisiológicas foram afetadas após a aplicação do glyphosate nas três populações, porém, R2 foi capaz de se recuperar apresentando valores semelhantes à testemunha. Os níveis de ácido chiquímico e quínico apresentaram padrões semelhantes onde houve aumento para as populações suscetíveis com o aumento da dose do herbicida enquanto que para a resistente os valores se mantiveram semelhantes. Ocorreu aumento dos níveis de shiquimato-3-fosfato para a população R2 se mantendo constante para as suscetíveis. Houve redução dos aminoácidos aromáticos com a aplicação do glyphosate para as populações suscetíveis. / In Brazil, ryegrass (Lolium multiflorum) was identified as resistant to glyphosate becoming a major problem in certain crops. Thus, understanding the behavior of the biochemical and physiological level of this weed are tools that help in efficient management. Thus, the aim of this study was to compare the biochemical and physiological profile of ryegrass populations susceptible and resistant to glyphosate after spray it. Four studies were carried out in greenhouse with experimental design completely randomized with four replications being seeded three populations of ryegrass (Lolium multiflorum) considered as susceptible (S), suspected of having resistance (R1) and resistant (R2) to the herbicide glyphosate. In the first study was measured the control at 21 days after application (DAA) and at 28 DAA, the dry mass the three populations. The treatments consisted of application of the glyphosate composed of doses: 0, 135, 270, 540, 1080, 2160, 4320, 8640 g a.i. ha-1. The second study aimed to determine the phenylalanine ammonia lyase (PAL) activity in different populations at 12, 24, 48 and 72 hours after application (HAA). The treatments consisted of two doses (720 g a.i. ha-1 and 1080 g a.i. ha-1) plus a control without application. In the third study were carried out photosynthesis assessments at three populations at 1, 3, 7 and 28 DAA. The variables analyzed were: CO2 net assimilation rate, stomatal conductance, CO2 internal concentration, transpiration, water use efficiency and instantaneous carboxylation efficiency. The treatments consisted of two doses (720 g a.i. ha-1 and 1080 g a.i. ha-1) plus a control without application. The fourth study aimed to quantify altered compounds of the shikimic acid pathway. For this, the same treatments of the first experiment were used and made collections of leaves at 5, 11, 28 DAA. The compounds analyzed were: glyphosate, AMPA (aminomethylphosphonic acid), shikimic acid, quinic acid, shikimate 3-phosphate, the aromatic amino acids phenylalanine, tyrosine and tryptophan, ferulic acid, coumaric acid and caffeic acid. The phenylalanine ammonia lyase enzyme was not influenced by glyphosate in resitant population. All physiological variables were affected after the application of glyphosate at the three populations, but R2 was able to recover with values similar to the control. The shikimic and quinic acid levels showed similar patterns where, there was an increase for susceptible populations with increasing doses of the herbicide while in resistant, the values remained similar. There was increase in levels of shikimate-3-phosphate to the R2 population, remaining constant for susceptible. There was a reduction of the aromatic amino acids with the application of glyphosate for the susceptible populations.

A buva (Conyza spp.) é uma planta daninha anual, comum em lavouras de soja da região Sul do Brasil, onde os herbicidas chlorimuron-ethyl e glyphosate são os mais utilizados para o seu controle. No entanto, nas últimas safras de soja observou-se controle insatisfatório desta planta daninha com esses herbicidas. Esse fato gerou a suspeita de seleção de biótipos resistentes. Assim, o objetivo da pesquisa foi avaliar a ocorrência de resistência múltipla aos herbicidas chlorimuron-ethyl e glyphosate em biótipos de buva. Na primeira etapa do trabalho, foram feitas coletas de sementes de buva em áreas com controle insatisfatório, totalizando 25 biótipos. Esses biótipos foram avaliados com relação à suscetibilidade e resistência ao chlorimuron e glyphosate, aplicando-se a máxima dose de registro desses herbicidas. Para segunda etapa do trabalho, foram selecionados 5 biótipos de buva com grau de suscetibilidade contrastante. Esses biótipos foram avaliados com curvas de dose-resposta e com 5 doses do herbicida chlorimuron-ethyl, aplicadas no estádio fenológico de 3 a 4 folhas. Na terceira etapa do trabalho, foi avaliada a resposta de 4 biótipos de buva aos herbicidas chlorimuron-ethyl, glyphosate e associação de chlorimuron-ethyl e glyphosate. Os herbicidas foram empregados em oito doses: 0,0; 6,25; 12,5; 25; 50; 100; 200 e 400, representadas em porcentagem da dose de 20 g ha-1 chlorimuron-ethyl, e de 720 g e.a. ha-1 glyphosate, aplicadas em três estádios de desenvolvimento (altura 0,5 a 1 cm e/ou 3 a 4 folhas; altura 1 a 2 cm e/ou 6 a 7 folhas e; altura 10 a 12 cm e/ou 12 a 14 folhas) dos biótipos de buva. Na última etapa do trabalho, avaliaram-se 15 herbicidas para controle alternativo da buva no estádio de desenvolvimento de 5 a 7 cm de altura e/ou 7 a 8 folhas. O trabalho foi conduzido na casa de vegetação, da Estação Experimental da Embrapa Trigo, em Passo Fundo/RS. Os resultados evidenciam que todos os biótipos são controlados com a dose de 20 g ha-1 de chlorimuronethyl, no estádio de desenvolvimento de 3 a 4 folhas. Contudo, observou-se susceptibilidade diferencial entre os biótipos em doses menores que 20 g ha-1 indicando resistência de nível baixo. Também, ficou evidente que os estádios de desenvolvimento dos biótipos de buva afetam significativamente a resposta destes aos herbicidas, sendo que quanto mais avançado o estádio menor a sensibilidade. A exceção foi o biótipo 5 que demonstrou resistência ao glyphosate, independentemente do estádio de desenvolvimento. Por fim, os tratamentos alternativos 2,4-D (1.042 g ha-1); amonium glufosinate (400 g ha-1); glyphosate (900 g e.a. ha- 1) + 2,4-D (1.042 g ha-1); glyphosate (900 g e.a ha-1) + amonium glufosinate (400 g ha-1); paraquat (600 g ha-1) + diuron (300 g ha-1); tembotrione (84 g ha-1) e tembotrione (84 g ha-1) + atrazine (1.000 g ha-1) controlaram, eficientemente, os biótipos de buva avaliados. Como conclusão, indica-se a aplicação do herbicida chlorimuron-ethyl nas doses máximas registradas, em estádios de desenvolvimentos da buva inferiores a cinco folhas, e que a prática de rotação de mecanismos de ação seja usada no manejo químico dessas áreas. / The horseweed (Conyza spp.) is an annual weed, common in soybean crops in southern Brazil, where the herbicide chlorimuron-ethyl and glyphosate are the most commonly used for its control. However, in recent soybean harvests it was observed unsatisfactory control of this weed with these herbicides. This fact originated suspicion of selection of resistant biotypes. The objective of the research was to evaluate the occurrence of multiple resistances to herbicides chlorimuron-ethyl and glyphosate in horseweed biotypes. In the first stage of the research, were collected horseweed seeds in areas with unsatisfactory control, totaling 25 biotypes. These biotypes were assessed for susceptibility and resistance to chlorimuron and glyphosate, applying the maximum dose of herbicide registration. In the second stage, were selected 5 horseweed biotypes with contrasting degree of susceptibility and evaluated dose-response curves, with 5 doses of the herbicide chlorimuron-ethyl applied at growth stage 3 - 4 leaves. In the third stage, we evaluated the response of four biotypes of horseweed to the herbicide chlorimuron-ethyl, glyphosate and association of chlorimuronethyl and glyphosate. Herbicides were applied in eight doses: 0.0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 and 400, represented as a percentage of the dose of 20 g ha-1 chlorimuron-ethyl, and 720 g a.e. ha-1 glyphosate applied at three stages of development (height 0.5 - 1 cm and / or 3 - 4 leaves, height 1 - 2 cm, and / or 6 - 7 and leaves, height 10 - 12 cm and / or 12 - 14 leaves) biotypes of horseweed. In the last stage of the study, evaluated 15 alternative herbicides to control horseweed at stage 5 - 7 cm high and / or 7 - 8 leaves. The study was conducted in a greenhouse, at the Experimental Station of Embrapa Trigo, Passo Fundo / RS. The results show that all biotypes can be controlled with the dose of 20 g ha-1 chlorimuron-ethyl, at stage 3 - 4 leaves. However, it was observed differential susceptibility among biotypes at doses under than 20 g ha-1 indicating low resistance. It was also evident that the developmental stages of the biotypes of horseweed, significantly affect the response to these herbicides, whereas the more advanced the stage the lower sensitivity. The exception was the biotype 5 that show resistance to glyphosate, regardless of the stage of development. Finally, alternative treatments 2,4-D (1.042 g ha-1); ammonium glufosinate (400 g ha-1), glyphosate (900 g a.e. ha- 1) + 2,4-D (1.042 g ha-1), glyphosate (900 g a.e. ha-1) + ammonium glufosinate (400 g ha-1), paraquat (600 g ha-1) + diuron (300 g ha-1); tembotrione (84 g ha-1) and tembotrione (84 g ha- 1) + atrazine (1,000 g ha-1), effectively controlled the biotypes of horseweed evaluated. Conclusion indicates the application of herbicide chlorimuron-ethyl in maximum doses recorded in stadiums horseweed developments less than five leaves, and that the practice of rotating mechanisms of action are used in the chemical management of these areas.

A buva (Conyza spp.) é uma planta daninha anual, comum em lavouras de soja da região Sul do Brasil, onde os herbicidas chlorimuron-ethyl e glyphosate são os mais utilizados para o seu controle. No entanto, nas últimas safras de soja observou-se controle insatisfatório desta planta daninha com esses herbicidas. Esse fato gerou a suspeita de seleção de biótipos resistentes. Assim, o objetivo da pesquisa foi avaliar a ocorrência de resistência múltipla aos herbicidas chlorimuron-ethyl e glyphosate em biótipos de buva. Na primeira etapa do trabalho, foram feitas coletas de sementes de buva em áreas com controle insatisfatório, totalizando 25 biótipos. Esses biótipos foram avaliados com relação à suscetibilidade e resistência ao chlorimuron e glyphosate, aplicando-se a máxima dose de registro desses herbicidas. Para segunda etapa do trabalho, foram selecionados 5 biótipos de buva com grau de suscetibilidade contrastante. Esses biótipos foram avaliados com curvas de dose-resposta e com 5 doses do herbicida chlorimuron-ethyl, aplicadas no estádio fenológico de 3 a 4 folhas. Na terceira etapa do trabalho, foi avaliada a resposta de 4 biótipos de buva aos herbicidas chlorimuron-ethyl, glyphosate e associação de chlorimuron-ethyl e glyphosate. Os herbicidas foram empregados em oito doses: 0,0; 6,25; 12,5; 25; 50; 100; 200 e 400, representadas em porcentagem da dose de 20 g ha-1 chlorimuron-ethyl, e de 720 g e.a. ha-1 glyphosate, aplicadas em três estádios de desenvolvimento (altura 0,5 a 1 cm e/ou 3 a 4 folhas; altura 1 a 2 cm e/ou 6 a 7 folhas e; altura 10 a 12 cm e/ou 12 a 14 folhas) dos biótipos de buva. Na última etapa do trabalho, avaliaram-se 15 herbicidas para controle alternativo da buva no estádio de desenvolvimento de 5 a 7 cm de altura e/ou 7 a 8 folhas. O trabalho foi conduzido na casa de vegetação, da Estação Experimental da Embrapa Trigo, em Passo Fundo/RS. Os resultados evidenciam que todos os biótipos são controlados com a dose de 20 g ha-1 de chlorimuronethyl, no estádio de desenvolvimento de 3 a 4 folhas. Contudo, observou-se susceptibilidade diferencial entre os biótipos em doses menores que 20 g ha-1 indicando resistência de nível baixo. Também, ficou evidente que os estádios de desenvolvimento dos biótipos de buva afetam significativamente a resposta destes aos herbicidas, sendo que quanto mais avançado o estádio menor a sensibilidade. A exceção foi o biótipo 5 que demonstrou resistência ao glyphosate, independentemente do estádio de desenvolvimento. Por fim, os tratamentos alternativos 2,4-D (1.042 g ha-1); amonium glufosinate (400 g ha-1); glyphosate (900 g e.a. ha- 1) + 2,4-D (1.042 g ha-1); glyphosate (900 g e.a ha-1) + amonium glufosinate (400 g ha-1); paraquat (600 g ha-1) + diuron (300 g ha-1); tembotrione (84 g ha-1) e tembotrione (84 g ha-1) + atrazine (1.000 g ha-1) controlaram, eficientemente, os biótipos de buva avaliados. Como conclusão, indica-se a aplicação do herbicida chlorimuron-ethyl nas doses máximas registradas, em estádios de desenvolvimentos da buva inferiores a cinco folhas, e que a prática de rotação de mecanismos de ação seja usada no manejo químico dessas áreas. / The horseweed (Conyza spp.) is an annual weed, common in soybean crops in southern Brazil, where the herbicide chlorimuron-ethyl and glyphosate are the most commonly used for its control. However, in recent soybean harvests it was observed unsatisfactory control of this weed with these herbicides. This fact originated suspicion of selection of resistant biotypes. The objective of the research was to evaluate the occurrence of multiple resistances to herbicides chlorimuron-ethyl and glyphosate in horseweed biotypes. In the first stage of the research, were collected horseweed seeds in areas with unsatisfactory control, totaling 25 biotypes. These biotypes were assessed for susceptibility and resistance to chlorimuron and glyphosate, applying the maximum dose of herbicide registration. In the second stage, were selected 5 horseweed biotypes with contrasting degree of susceptibility and evaluated dose-response curves, with 5 doses of the herbicide chlorimuron-ethyl applied at growth stage 3 - 4 leaves. In the third stage, we evaluated the response of four biotypes of horseweed to the herbicide chlorimuron-ethyl, glyphosate and association of chlorimuronethyl and glyphosate. Herbicides were applied in eight doses: 0.0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 and 400, represented as a percentage of the dose of 20 g ha-1 chlorimuron-ethyl, and 720 g a.e. ha-1 glyphosate applied at three stages of development (height 0.5 - 1 cm and / or 3 - 4 leaves, height 1 - 2 cm, and / or 6 - 7 and leaves, height 10 - 12 cm and / or 12 - 14 leaves) biotypes of horseweed. In the last stage of the study, evaluated 15 alternative herbicides to control horseweed at stage 5 - 7 cm high and / or 7 - 8 leaves. The study was conducted in a greenhouse, at the Experimental Station of Embrapa Trigo, Passo Fundo / RS. The results show that all biotypes can be controlled with the dose of 20 g ha-1 chlorimuron-ethyl, at stage 3 - 4 leaves. However, it was observed differential susceptibility among biotypes at doses under than 20 g ha-1 indicating low resistance. It was also evident that the developmental stages of the biotypes of horseweed, significantly affect the response to these herbicides, whereas the more advanced the stage the lower sensitivity. The exception was the biotype 5 that show resistance to glyphosate, regardless of the stage of development. Finally, alternative treatments 2,4-D (1.042 g ha-1); ammonium glufosinate (400 g ha-1), glyphosate (900 g a.e. ha- 1) + 2,4-D (1.042 g ha-1), glyphosate (900 g a.e. ha-1) + ammonium glufosinate (400 g ha-1), paraquat (600 g ha-1) + diuron (300 g ha-1); tembotrione (84 g ha-1) and tembotrione (84 g ha- 1) + atrazine (1,000 g ha-1), effectively controlled the biotypes of horseweed evaluated. Conclusion indicates the application of herbicide chlorimuron-ethyl in maximum doses recorded in stadiums horseweed developments less than five leaves, and that the practice of rotating mechanisms of action are used in the chemical management of these areas.