Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de récepteurs transmembranaires. Ils sont impliqués dans une large variété de processus physiologiques et par conséquent ils représentent une cible thérapeutique d'intérêt pour le développement de médicaments. Plusieurs études ont démontré que les RCPGs sont capables d'interagir entre eux pour former des complexes oligomériques. Cependant, leur existence in vivo et leur rôle fonctionnel reste sujet à débats. Afin de mieux appréhender ce phénomène, nous avons utilisé un RCPG de classe C comme modèle d'étude, le récepteur de l'acide γ-aminobutyrique (GABAB), qui est impliqué dans une grande variété de désordres neurologiques et psychiatriques. Son originalité réside dans le fait qu'il est un hétérodimère obligatoire composé de deux sous-unités : GABAB1 et GABAB2 (GB1 et GB2). La liaison de l'agoniste sur GB1 conduit à l'activation de GB2. Au cours de ma thèse, nous avons montré en utilisant une nouvelle approche biophysique basée sur un marquage fluorescent enzymatique appelé Snap-tag que, contrairement aux récepteurs métabotropiques du glutamate, le récepteur GABAB forme des dimères de dimères (tétramères). Cette organisation hétéro-oligomérique est assurée par des contacts stables entre les domaines extracellulaires des sous-unités GB1. De plus, nous avons apporté des données en faveur de l'existence physiologique de cet assemblage en utilisant des membranes de cerveau de rat et de souris. Dans une seconde partie, nous avons souhaité déterminer les conséquences fonctionnelles de cette organisation. Nos résultats suggèrent une efficacité de couplage à la protéine G réduite du récepteur GABAB lorsqu'il est associé en dimères de dimères. Collectivement, nos données rapportent pour la première fois, l'existence de larges complexes allostériques de RCPGs dans le cerveau. / The G-protein coupled receptors (GPCR) constitute the main family of transmembrane receptors. They are involved in many physiological processes and, as a consequence, they represent a therapeutic target of interest for the development of new drugs. Few studies have demonstrated that GPCRs are able to interact with each other to form oligomeric complexes. However, the existence in vivo and the functional interest of these oligomers remain a subject of intense debates. To address this issue, we have used a class C GPCR as a model, the γ-aminobutyrate B receptor (GABAB), which is involved in a wide variety of neurological and psychiatric disorders. This receptor has the particularity to be an obligatory heterodimer composed of two subunits GABAB1 and GABAB2 (GB1 and GB2). Agonist binding on GB1 leads to G-protein activation by GB2. During my thesis, we developed a new biophysical approach based on an enzyme-mediated fluorescent labeling calle d Snap-Tag and showed that, unlike metabotropic glutamate receptors, GABAB forms dimers of dimers (tetramers). This oligo-heterodimers organization is mediated via stable contacts between extracellular domains of GB1 subunits. Furthermore, we brought evidence of the physiological reality of this assembly using rat and mouse brain membranes. Then, we aimed at assessing what would be the functional rational of the GABAB dimer of heterodimers. Our results suggest that the GABAB receptor has a lower G protein-coupling efficacy when associated into dimers of dimers. Altogether, our data report for the first time, the existence of large allosteric GPCR complexes in the brain.

Le récepteur tyrosine kinase FLT3 est impliqué dans le maintien et le renouvellement des cellules souches et des progéniteurs hématopoïétiques. Dans environ 30% des cas de leucémies aiguës myéloïdes, il est activé constitutivement par des mutations, dont les plus fréquentes impliquent une duplication de séquence dans le domaine juxtamembranaire (Internal Tandem Duplication, ou ITD). Des inhibiteurs chimiques de FLT3 ont été développés dans le cadre de thérapies anti-cancéreuses, mais leurs essais cliniques se sont révélés assez décevants avec des effets essentiellement transitoires. Par ailleurs, certaines études ont mis en évidence une signalisation intracellulaire spécifique au mutant FLT3-ITD, comme l’activation spécifique de STAT5a. Ces données soulignent la nécessité d’étudier exhaustivement et en détail la signalisation intracellulaire induite par le récepteur FLT3 et ses mutants oncogéniques dans des modèles pertinents, avec l’espoir d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous avons surexprimé FLT3 et sa forme mutante ITD dans la lignée murine de progéniteurs myéloïdes FDCP-1/Fms. Ce modèle s’est avéré représentatif des processus observés in vivo en termes de survie, de prolifération et de différenciation monocytaire. Nous l’avons alors utilisé dans une approche protéomique pour identifier des protéines différemment phosphorylées et/ou exprimées entre les deux cas. L’utilisation d’ARN interférant et la surexpression des protéines candidates ou de leurs mutants a permis de révéler l’implication fonctionnelle de plusieurs d’entre elles dans la signalisation FLT3, telles que Hcls1, Ezrin, et PAK1 qui sont toutes des régulateurs du cytosquelette / The FLT3 receptor is involved in stem cells and myeloid progenitors self renewal processes. In about 30% of the acute myeloid leukemia cases, this receptor is mutated and constitutively active, the most common mutation being duplication of sequences in the juxtamembrane domain (Internal Tandem Duplication, ITD). Many chemical inhibitors of FLT3 have been developed for anti-cancer therapies but the clinical trials were a bit disappointing, showing mainly transient effect on blast reduction. Several studies have shown that FLT3-ITD triggers a different signaling from the wild-type receptor, like the specific activation of STAT5a. These data show the necessity of the exhaustive and detailed study of the intracellular signaling induced by FLT3 and its oncogenic mutants, to identify new therapeutic targets. We have overexpressed wild-type and ITD mutant forms of FLT3 in the murine myeloid progenitors cell line FDCP-1/Fms. This model proved it-self representative of the in vivo processes described in the literature in terms of survival, proliferation and monocytic differentiation. Consequently, we have used it for a proteomic approach to identify differentially expressed and/or phosphorylated proteins depending on FLT3 status. Using RAN interference and overexpression of these identified candidate proteins, we have demonstrated the functional involvement of several of them in FLT3 signaling, including Hcls1, Ezrin, and PAK1, which all regulate the cytoskeleton

La maladie d’Alzheimer est majoritairement sporadique et peu est connu sur les mécanismes déclenchant le développement de cette forme de la maladie. Les études sur la forme familiale ont attribué une importance particulière à la bêta-amyloïde (Aβ), un produit de clivage du précurseur de la protéine amyloïde (APP). Plusieurs facteurs de risques ont été identifiés comme déclencheurs potentiels du développement de la maladie d’Alzheimer dont le diabète de type II (T2D). En effet, la déficience de la signalisation de l’insuline par la désensibilisation des récepteurs de l’insuline (IR) dans le cerveau semble être une caractéristique commune aux deux maladies. Les effets à long terme de la résistance à l’insuline sur l’accumulation d’Aβ et sur la phosphorylation de Tau ont été étudiés, mais les effets de la perturbation aiguë des IR sont moins bien caractérisés. Aussi, les désordres métaboliques sont également des caractéristiques communes aux deux maladies. Le but de notre étude est de déterminer si la perturbation aiguë des IR peut affecter le clivage de l’APP et si la privation énergétique par le jeûne peut sensibiliser ce clivage à la perturbation aiguë des IR. Pour évaluer ceci, nous avons utilisé la Tyrphostin AG1024 à faible dose pour simuler une perturbation des IR plutôt qu’un blocage complet des récepteurs. Pour quantifié le clivage de l’APP, nous avons mesuré les changements de la quantité d’APP taille pleine totale par immunobuvardage de type Western. Pour s’assurer que les changements de la quantité d’APP taille pleine traduisait bien un clivage, nous avons développé un système de lecture par luciférase. Ce système nous permet de suivre le clivage de l’APP via l’expression de la luciférase Firefly puisque le facteur de transcription GAL4 est lié à la portion C-terminale de l’APP . Tout d’abord, nous avons observé que la perturbation aiguë des IR par la Tyrphostin mène au clivage de l’APP et que le jeûne augmente la vulnérabilité au clivage de l’APP suite à une plus petite dose de Tyrphostin. Ce clivage serait imputable à la voie amyloïdogénique puisque l’inhibition de la β-secrétase et de la γ-secrétase empêche le clivage de l’APP. Nous avons aussi montré que la perturbation des IR est nécessaire alors que la perturbation spécifique des IGF-1R n’est pas suffisante. De plus, ni l’autophagie, ni les caspases et ni le protéasomes ne semblent impliqués dans le clivage de l’APP suivant la combinaison du jeûne et de la petite perturbation des IR. L’activité de mTOR n’est également pas requise. Cependant, l’activité de la GSK3 est nécessaire au clivage et semble affecter le clivage par la γ-secrétase. Nous avons ensuite confirmé dans des cultures primaires neuronales que la combinaison du jeûne et de la perturbation aiguë des IR cause le clivage de l’APP et que la GSK3 est encore une fois fortement active. Ainsi, nos résultats suggèrent que la perturbation de la signalisation de l’insuline tel qu’observé dans le T2D augmente le clivage de l’APP via la voie amyloïdogénique et, donc, contribue à la pathologie de la maladie d’Alzheimer. / Little is known about the mechanisms that trigger the onset of Alzheimer’s disease (AD), a primarily sporadic disease. Studies on the familial form of AD attributed a particular importance to Amyloid beta (Aβ), a cleavage product of the Amyloid precursor protein (APP). Many risk factors have been identified as potential triggers of the development of AD including Type 2 diabetes (T2D). Indeed, the impairment of insulin signaling by the desensitization of insulin receptors (IR) in the brain seems to be a common hallmark of both diseases. The long term effects of IR resistance on the accumulation of Aβ and Tau hyperphosphorylation have been studied, but the acute effects of IR perturbation is less characterized. Also, both diseases show metabolic defects. Our research aimed to determine whether acute perturbation of IR signaling affects APP processing and if starving (energy deprivation) could sensitize this processing to acute perturbation of IR. To assess this, we used small doses of Tyrphostin AG1024 to simulate IR perturbations rather than a complete blocakade of the receptors. To quantify APP processing, we measured the change of total full- lenght APP by Western blot. To ensure that this change reflected APP processing we developed a luciferase based readout system. This system allowed us to monitor the occurrence of APP cleavage via GAL4-UAS Firefly luciferase driven expression because we linked GAL4 transcription factor to the C-terminal region of APP. First, we showed that IR perturbation with Tyrphostin leads to APP processing and that starving increased IR susceptibility to a smaller doses of Tyrphostin. This APP processing occurs via the amyloidogenic pathway because inhibition of β- and γ-secretase inhibited APP processing. We showed that this processing absolutely requires IR perturbation, while IGF-1R perturbation alone is insufficient. Furthermore, neither autophagy, caspases nor proteasome seemed to be implicated in APP processing following starvation and small IR perturbation. The activity of mTOR is also not required. On the contrary, GSK3 activation is necessary for the processing and seems to affect γ-secretase cleavage. We then confirmed in primary cultured neurons that the combination of acute starvation and small IR perturbation causes APP cleavage and GSK3 is again strongly activated. Taken together, our results suggest that the impairment of IR signalling seen in T2D increases the processing of APP via the amyloidogenic pathway and thereby contributes to the pathology of AD.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Depuis la découverte de la première protéine possédant une activité tyrosine kinase (protein tyrosine kinase [PTK]) dans les années 1980, l’importance des PTKs et de la phosphorylation sur résidu tyrosine dans la régulation des événements de signalisation intracellulaire est bien établie. Quant aux protéines qui possèdent une activité tyrosine phosphatase (protein tyrosine phosphatase [PTP]), dont l’existence n’a été dévoilée qu’une dixaine d’années plus tard, elles ont longtemps été perçues comme des enzymes dont le rôle ne se résumait qu'à contrecarrer passivement les activités des PTKs. Il est maintenant clair que les activités des PTPs sont spécifiques, hautement régulées, et qu’elles doivent être coordonnées avec celles des PTKs pour une régulation adéquate des événements de signalisation intracellulaire. En dépit de cette évidence, la contribution des PTPs à la régulation des différents processus physiologiques fondamentaux demeure encore peu caractérisée. C’est le cas, notamment, de l’angiogenèse, le processus par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins sont formés à partir de ceux préexistants. Le VEGF (Vascular endothelial growth factor), un des facteurs angiogéniques les plus importants, est connu pour induire majoritairement ses effets biologiques via l’activation du récepteur à activité tyrosine kinase VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2). Puisque l’angiogenèse est impliquée dans le développement d’une multitude de pathologies, dont la progression tumorale, une meilleure caractérisation des PTPs qui assurent la qualité de la réponse angiogénique en agissant de pair avec le VEGFR2 s’avère cruciale et ce, afin de raffiner les outils thérapeutiques actuels. L’expression de la PTP DEP-1 corrèle avec la déphosphorylation du récepteur VEGFR2 localisé au niveau des jonctions cellules-cellules et contribue à l’inhibition de la prolifération des cellules endothéliales en réponse au VEGF lorsque les cellules sont à confluence. Par contre, la contribution spécifique de DEP-1 à la régulation des voies de signalisation et des réponses biologiques induites par le VEGF demeurait toujours inconnue. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse démontrent tout d’abord que DEP-1 régule négativement l’activité tyrosine kinase de VEGFR2 en déphosphorylant spécifiquement les résidus tyrosine Y1054/Y1059 de sa boucle d’activation. Cette déphosphorylation mène par conséquent à une diminution générale de la phosphorylation du récepteur et à une atténuation de la plupart des voies de signalisation induites par le VEGF, incluant la voie mitogénique PLCγ-ERK1/2. Par ailleurs, malgré ce rôle négatif global, nos travaux révèlent étonnement, et pour la première fois, que DEP-1 contribue d’une manière positive à la promotion de la survie des cellules endothéliales via l’activation de la voie Src-Gab1-Akt en aval du récepteur VEGFR2. Ce pouvoir pro-survie de DEP-1 dans les cellules endothéliales réside avant tout dans sa capactié à déphosphoryler la tyrosine inhibitrice de Src (Y529). Au cours de notre étude, nous avons pu identifier deux résidus tyrosine au niveau de l’extrémité carboxy-terminale de DEP-1, Y1311 et Y1320, dont la phosphorylation est dépendante de Src. Nos travaux révèlent par ailleurs que ces deux résidus tyrosine phosphorylés lient le domaine SH2 de Src et que la Y1320 est principalement requise pour l’activation de Src et d’Akt en réponse au VEGF dans les cellules endothéliales. Ces résultats constituent donc une avancée majeure dans la compréhension des mécanismes moléculaires par lesquels DEP-1 peut réguler le programme angiogénique dépendant du VEGF. De plus, cette découverte d’un rôle positif pour DEP-1 dans la survie des cellules endothéliales pourrait mener à l’élaboration de nouvelles approches thérapeutiques visant à inhiber cette fonction spécifique de DEP-1 pour bloquer l'angiogenèse pathologique. / Since the discovery of the first protein tyrosine kinase [PTK] in 1980, the importance of these proteins and of tyrosine phosphorylation cascades in the regulation of intracellular signaling events has been well-established. The protein tyrosine phosphatases [PTPs], whose existence was only revealed ten years later, have been regarded for a long time as passive PTKs conteracting enzymes. It is now evident that PTPs activities are specific, exquisitely regulated, and that they have to be coordinated with PTKs activities for an appropriate regulation of intracellular signaling events. Despite these findings, the contribution of PTPs to the regulation of many fundamental physiological processes is not well-characterized. This is the case of angiogenesis, the process whereby new vessels are generated from pre-existing ones. Vascular endothelial growth factor (VEGF), one of the most important angiogenic factors, is known to induce its biological effects mainly by activating VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2). As angiogenesis is involved in the development of a multitude of pathologies, including tumoral progression, a better characterization of PTPs, which ensure the quality of the angiogenic response by acting together with VEGFR2, is crucial to refine current therapeutic tools. Expression of a PTP called DEP-1 correlates with dephosphorylation of VEGFR2, and contributes to the inhibition of VEGF-induced endothelial cell proliferation at high cell confluence. However, the specific contribution of DEP-1 to the regulation of signaling pathways and biological responses induced by VEGF remained unknown. The research presented in this thesis demonstrates that DEP-1 negatively regulates the tyrosine kinase activity of VEGFR2 by dephosphorylating the specific tyrosine residues Y1054/Y1059 in its activation loop. Consequently, this leads to a global decrease in the phosphorylation of the receptor and to a reduced activation of most of the signaling cascades induced by VEGF, including the mitogenic PLCγ- ERK1/2 pathway. Moreover, despite this negative role, our work reveals for the first time that DEP-1 contributes in a positive way to promote the survival of endothelial cells via the activation of the Src-Gab1-Akt pathway downstream of VEGFR2. This survival function of DEP-1 in endothelial cells is accomplished by the dephosphorylation of the Src inhibitory tyrosine (Y529). During our study, we identified two residues in the carboxy-terminal tail of DEP-1, Y1311 and Y1320, whose phosphorylation is dependent on Src. These two phosphorylated tyrosine residues bind to the SH2 domain of Src, and our work also revealed that mostly Y1320 is required for Src and Akt activation upon VEGF stimulation of endothelial cells. These findings represent a major step forward in our understanding of the molecular mechanisms by which DEP-1 may regulate the VEGF-dependent angiogenic program. Moreover, the discovery of a positive role for DEP-1 in the survival of endothelial cells could lead to the development of new therapeutic approaches to inhibit this specific function of DEP-1 in order to block pathological angiogenesis.

Le GABA est le principal neurotransmetteur inhibiteur du SNC et est impliqué dans le développement du cerveau, la plasticité synaptique et la pathogénèse de maladies telles que l’épilepsie, les troubles de l’anxiété et la douleur chronique. Le modèle actuel de fonctionnement du récepteur GABA-B implique l’hétérodimérisation GABA-B1/B2, laquelle est requise au ciblage à la surface membranaire et au couplage des effecteurs. Il y est cependant des régions du cerveau, des types cellulaires et des périodes du développement cérébral où la sous-unité GABA-B1 est exprimée en plus grande quantité que GABA-B2, ce qui suggère qu’elle puisse être fonctionnelle seule ou en association avec des partenaires inconnus, à la surface cellulaire ou sur la membrane réticulaire. Dans le cadre de cette thèse, nous montrons la capacité des récepteurs GABA-B1 endogènes à activer la voie MAPK-ERK1/2 dans la lignée dérivée de la glie DI-TNC1, qui n’exprime pas GABA-B2. Les mécanismes qui sous-tendent ce couplage demeurent mal définis mais dépendent de Gi/o et PKC. L’immunohistochimie de récepteurs endogènes montre par ailleurs que des anticorps GABA-B1 dirigés contre la partie N-terminale reconnaissent des protéines localisées au RE tandis des anticorps C-terminaux (CT) marquent une protéine intranucléaire. Ces données suggèrent que le domaine CT de GABA-B1 pourrait être relâché par protéolyse. L’intensité des fragments potentiels est affectée par le traitement agoniste tant en immunohistochimie qu’en immunobuvardage de type western. Nous avons ensuite examiné la régulation du clivage par le protéasome en traitant les cellules avec l’inhibiteur epoxomicine pendant 12 h. Cela a résulté en l’augmentation du marquage intranucléaire de GABA-B1-CT et d’un interacteur connu, le facteur de transcription pro-survie ATF-4. Dans des cellules surexprimant GABA-B1-CT, l’induction et la translocation nucléaire d’ATF-4, qui suit le traitement epoxomicine, a complètement été abolie. Cette observation est associée à une forte diminution du décompte cellulaire. Étant donné que les trois derniers résidus de GABA-B1-CT (LYK) codent un ligand pseudo-PDZ et que les protéines à domaines PDZ sont impliquées dans la régulation du ciblage nucléaire et de la stabilité de protéines, en complément de leur rôle d’échaffaud à la surface cellulaire, nous avons muté les trois derniers résidus de GABA-B1-CT en alanines. Cette mutation a complètement annulé les effets de GABA-B1-CT sur l’induction d’ATF-4 et le décompte cellulaire. Cette deuxième série d’expériences suggère l’existence possible de fragments GABA-B1 intranucléaires régulés par le traitement agoniste et le protéasome dans les cellules DI-TNC1. Cette régulation d’ATF-4 dépend des résidus LYK de GABA-B1-CT, qui modulent la stabilité de GABA-B1-CT et favorisent peut-être la formation d’un complexe multiprotéique incluant GABA-B1-CT, ATF-4, de même qu’une protéine d’échaffaudage inconnue. En somme, nous démontrons que les sous-unités GABA-B1 localisées au RE, lorsque non-hétérodimérisées avec GABA-B2, demeurent capables de moduler les voies de signalisation de la prolifération, la différentiation et de la survie cellulaire, via le couplage de protéines G et possiblement la protéolyse régulée. Les mécanismes de signalisation proposés pourraient servir de nouvelle plate-forme dans la compréhension des actions retardées résultant de l’activation des récepteurs 7-TMs. / GABA is the principal inhibitory neurotransmitter in the CNS and is implicated in brain development, synaptic plasticity and the pathogenesis of diseases such as epilepsy, anxiety disorders and chronic pain. In the current model of GABA-B function, there is a requirement for GABA-B1/B2 dimerization for targetting to the cell surface and effector coupling. However, there are certain brain regions (putamen), cell types (glial cells) and times during brain development where GABA-B1 is expressed in higher amounts than GABA-B2, suggesting that GABA-B1 might be functional alone or in association with unidentified partners, either at the cell surface or on the ER membranes. In this thesis, we first show the capacity of endogenous GABA-B1 receptors to activate the MAPK-ERK1/2 pathway in the DI-TNC1 glial-derived cell line which does not express GABA-B2. The underlying mechanisms remain incompletely defined but depend on Gi/o and PKC. Immunohistochemistry of endogenous receptors shows that GABA-B1 N-terminal antibodies recognize ER-localized proteins and that C-terminal (CT) antibody shows intranuclear distribution. This data suggests that fragments of the GABA-B1 receptor are generated by proteolysis and indeed we show that agonist treatment affects the intensity of certain C-terminal GABA-B1 fragments both in immunohistochemistry and western blots suggesting that the GABA-B1 receptor is subjected to regulated proteolysis. Since a 13-residue potential PEST sequence was localized immediately distal to the ER retention motif in the GABA-B1 CT, we examined proteasome regulation of the cleavage event. Following a 12h treatment with the proteasome inhibitor, epoxomicin, we detected increases in intranuclear staining for both GABA-B1 and a known interactor, the pro-survival transcription factor ATF-4, using confocal microscopy and by western blotting of nuclear extracts. These increases are due either to proteasome inhibition or activation of the ER stress pathway. In cells overexpressing GABA-B1-CT, ATF-4 induction and nuclear translocation, which normally follows epoxomicin treatment, was completely abolished. This observation was associated to a strong decrease in cell number. Since the last three residues of GABA-B1-CT (LYK) encode a pseudo-PDZ ligand and that PDZ domain protein regulate nuclear targeting and protein stability, in complement to their role in scaffolding at the cell surface, we mutated the last three residues of GABA-B1-CT to alanines. This mutation completely reversed the effect of GABA-B1-CT on ATF-4 induction and on cell number. This second set of data suggests the existence of agonist and proteasome-regulated intranuclear GABA-B1 fragments in DI-TNC1 cells. Further, the GABA-B1-CT pseudo-PDZ ligand appears to be critically important in regulating ATF-4 induction by modulating GABA-B1-CT stability and perhaps by favoring the formation of a multiprotein complex with ATF-4, ATF-4 interactors and an unknown scaffolding protein. Overall, we show that ER-localised GABA-B1 subunits, when not dimerized with GABA-B2, can still modulate proliferation, differentiation and survival pathways, both through G-protein coupling and regulated proteolysis. The signalling mechanisms which we propose could serve as a new platform in understanding the long term effects of 7-TM receptor activation.

Grâce aux nombreuses études sur le sujet, nous savons qu’une stimulation inflammatoire vasculaire excessive entraîne un débalancement des fonctions homéostatiques de l’endothélium. Ce débalancement est à l’origine d’une dysfonction endothéliale définie comme étant l’étape clé contribuant au développement de l’athérosclérose. Le Toll-like receptor-2 (TLR2) est impliqué dans l’activation cellulaire via la transcription des gènes liés à l’inflammation. Il reconnaît des molécules microbiennes mais également des facteurs endogènes non-infectieux tels que sécrétés par les tissus endommagés provenant de la dysfonction endothéliale. Ainsi, l’activation et la signalisation du TLR2 sont en étroite relation avec le développement de l’athérosclérose. Les études épidémiologiques ont confirmé le rôle athéroprotecteur de l’œstrogène via de nombreux mécanismes d’action. Ainsi, nous avons cherché à identifier de nouvelles cibles moléculaires permettant de mieux interpréter les bénéfices potentiels de l’œstrogène sur le système cardiaque. Pour la première fois chez les cellules endothéliales (CE) vasculaires de souris, nos travaux ont confirmé l’effet anti-inflammatoire de l’œstrogène via la diminution de l’expression et de l’activité du TLR2. Nous avons également déterminé l’influence de l’œstrogène sur le profil de la réponse inflammatoire de ce récepteur en mesurant les potentiels endothéliaux de migration et d’adhésion. De plus, nous avons caractérisé les voies de signalisation impliquées en démontrant l’influence négative de l’œstrogène sur la phosphorylation des kinases activées par le TLR2; illustrant l’interaction entre l’œstrogène et la signalisation de ce récepteur. Nos travaux amènent ainsi de nouvelles connaissances sur la régulation endothéliale du TLR2 et mettent en lumière les effets anti-inflammatoires et vasculaires rapides de l’œstrogène. / Evidence supports the contribution of immune responses in atherosclerosis development in part by alterations in the endothelium activation status and by the recruitment of inflammatory cells triggered by cardiovascular risk factors. These alterations are the principal cause of endothelial dysfunction defined as the key step contributing to the development of atherosclerosis. Via the transcription of genes related to inflammation, the Toll-like receptor-2 (TLR2) is involved in endothelial cell activation. It generally recognizes microbial molecules but also non-infectious endogenous factors such as those secreted by damaged tissues from the endothelial dysfunction. Thus, activation and signalization of the TLR2 are closely linked with the development of atherosclerosis. Epidemiological studies have confirmed the atheroprotective role of estrogen through multiple mechanisms of action. Thus, to better interpret the potential benefits of estrogen on the cardiovascular system, we sought to identify new molecular targets such as TLR2 regulation. For the first time in mouse vascular endothelial cells (EC), our results have confirmed the anti-inflammatory effect of estrogen via the decreased expression and activity of TLR2. We also determined the influence of estrogen on the profile of the inflammatory response triggered through this receptor by measuring endothelial migration and adhesion potentials. Furthermore, we demonstrated the interaction between estrogen and TLR2 signalling pathways with a negative influence of estrogen on the phosphorylation level of kinases activated by this receptor. Thus, our study brings new insights into the endothelial regulation of TLR2 and highlights rapid anti-inflammatory and cardioprotective effects from estrogen.

Les opiacés figurent parmi les analgésiques les plus puissants pour le traitement des douleurs sévères. Les agonistes du DOR (récepteur delta opiacé) induisent moins d'effets secondaires que ceux du mu, ce qui les rend une cible d'intérêt pour le traitement des douleurs chroniques. Cependant, ils induisent la tolérance à l'analgésie. Des hypothèses récentes proposent que le potentiel des drogues à induire la tolérance soit la conséquence de la stabilisation de différentes conformations du récepteur induites par la liaison avec différents ligands, chacune ayant différentes propriétés de trafic. Dans ce contexte, nous avons déterminé si différents ligands du DOR différaient dans leur capacité à induire la signalisation et le trafic du récepteur. Nos résultats indiquent que DPDPE et SNC-80 sont les drogues les plus efficaces à inhiber la production d’AMPc, suivis par UFP-512, morphine et TIPP. DPDPE et SNC-80 induisent à eux seuls l’internalisation du DOR dans les cellules HEK-293 de façon dépendante de la β-arrestine mais pas de la GRK2 ni PKC. Ces deux drogues induisent également l’internalisation du DOR dans les neurones corticaux et c’est seulement le DPDPE qui permet au DOR de regagner la membrane des cellules HEK-293 et des neurones après récupération. Cette capacité de recyclage était suggérée comme un mécanisme protégeant contre la survenue de la tolérance. Ces observations indiquent que le DOR peut subir différentes régulations en fonction du ligand lui étant associé. Cette propriété de sélectivité fonctionnelle des ligands pourrait être utile pour le développement de nouveaux opiacés ayant une activité analgésique plus durable. / Opiates are among the most powerful painkillers to treat severe pain. Delta opioid receptor (DOR) agonists induce fewer side effects than mu opioid receptor agonists, which makes them a target of interest for the treatment of chronic pain. However, they induce tolerance to analgesia. Recent hypotheses suggest that drugs tolerance is the result of stabilization of ligand-specific conformations of the receptor, with distinct traffic properties such as internalization and/or recycling. In this context, we determined whether different DOR ligands differed with respect to their ability to induce signaling and receptor trafficking. Our results indicate that DPDPE and SNC-80 are the most effective drugs to inhibit the production of cAMP, followed by UFP-512, morphine and TIPP. Only DPDPE and SNC-80 manage to induce DOR internalization in HEK-293 cells. This effect is dependent on β-arrestin but not on GRK2 or PKC. Of these two internalizing agonists, only DPDPE allows the DOR to recycle back to the membrane of HEK-293 cells after recovery. DPDPE and SNC-80 also trigger similar DOR internalization in cortical neurons, and as observed in HEK293 cells only DPDPE allowed the receptor to recycle back to the membrane. This recycling capacity was suggested as a mechanism to protect against the onset of tolerance. These observations indicate that the DOR can undergo different regulations depending on the ligand bound to it. This property of functional selectivity of DOR ligands could be useful for the development of new opiates with longer lasting analgesic properties.

Introduction: Notre laboratoire a précédemment établi que Hoxa9 accélérait l’apparition de leucémie de type B induite par E2A-PBX1. Une analyse par qRT-PCR a montré que les niveaux d’ARN de Flt3, une cible de Hoxa9, étaient 32 fois plus élevés dans les leucémies Hoxa9/E2A-PBX1 par rapport que dans les leucémies E2A-PBX1. Il est important de noter que l’expression aberrante de Flt3 est retrouvée dans les leucémies ALL de type B et les AML. De plus, l’activation constitutive de Flt3 est associée à un faible pronostic. Nous avons posé l’hypothèse que la maintenance/ré-initiation des leucémies de type pré-B induites par E2A-Pbx1 est associée à la présence du récepteur Flt3. Méthodes et Résultats: Premièrement, nous avons analysé par FACS la présence de Flt3 et mesuré l’expression de Flt3 par qRT-PCR des cellules E2A-PBX1 leucémiques pré-B. Nous avons montré que les cellules leucémiques E2A-PBX1 expriment l’ARNm du gène Flt3. Cependant, le récepteur n’était détectable à la surface cellulaire que dans des proportions variant de 0.3 à 28%. Deuxièmement, nous avons évalué le potentiel leucémique des fractions positive et négative pour Flt3. Toutes deux ont été capables de ré-initier la leucémie environ 20 jours après transplantation. Des analyses par FACS ont montré qu’une proportion de cellules leucémiques exprimaient Flt3, incluant même celles provenant de la fraction Flt3-. Troisièmement, une stratégie de perte de fonction de Flt3 par shARN a été mise en œuvre afin d’examiner le rôle de la voie de signalisation de Flt3 dans les cellules leucémiques E2A-PBX1. Pour ce faire, des cellules primaires leucémiques ont été infectées, soit par le shARN anti-Flt3 soit shARN contrôle, et transplantées dans des souris receveuses. Les cellules leucémiques contenant le shARN ont été capables de régénérer la leucémie. Cependant, une proportion des cellules exprimaient toujours Flt3, ce qui indique que l’efficacité des shARn n’était pas suffisante. Conclusion et Perspectives: Nos shARN ne sont pas suffisamment efficaces sur les cellules leucémiques choisies. De ce fait, nous proposons d’utiliser des cellules leucémiques moins agressives tout en réalisant le même set-up expérimental. Des transplantations dans des receveurs KO Flt3-/- seraient également requises afin de réellement étudier l’impact de la voie de signalisation Flt3 dans la ré-initiation leucémique. / Introduction: Previous work in the laboratory have established that Hoxa9 accelerated the onset of E2A-PBX1 induced B cell leukaemia. qRT-PCR analysis showed that RNA levels of HOXA9 target Flt3 was 32-fold increased in Hoxa9/E2A-PBX1 compared to E2A-PBX1 leukaemia. It is important to note that aberrant expression of Flt3 is found in both B-ALL and AML. Moreover, constitutive activation of Flt3 is associated with a poor prognosis. We hypothesized that the acceleration of E2A-PBX1 B-ALL by Hoxa9 is caused through increased Flt3 signalling. Methods and Results: First, to evaluate whether Flt3 signalling is functionally relevant for E2A-PBX1 induced leukaemia, Flt3 expression was analysed by FACS and qRT-PCR. So far, we showed that E2A-PBX1 B-ALL express FLT3 but the receptor was detected on a variable proportion of the cells, ranging from 0.3-28 %. Secondly, we evaluated the leukemic potential of Flt3 positive and negative fractions. Both reinitiate leukaemia around 20 days post-transplantation. Thirdly, a shRNA mediated knockdown strategy for Flt3 has been applied to test the relevance of Flt3 signalling on E2A-PBX1 leukemic cells. To test this, primary leukaemic cells were infected, either with the shRNA anti-Flt3 or the shRNA control, and transplanted into recipient mice. Unexpectedly, no difference was observed between the two groups of mice. Conclusion and Relevance: Our shFLT3 is not efficient enough on the chosen leukemic cells. Therefore, we propose to apply the same set-up to a less aggressive leukaemia. Moreover, transplanting cells in Flt3-/- KO mice is required to really assess the impact of Flt3 signalling.

L’ostéoarthrose (OA) se caractérise par une perte du cartilage articulaire, une sclérose osseuse, et une inflammation de la membrane synoviale. Des études in vivo et in vitro indiquent que les modifications du tissu osseux sont responsables de la perte du cartilage articulaire. Les ostéoblastes (Ob) OA présentent une réduction de la réponse à l’hormone parathyroïdienne (PTH), un signal anabolique important pour le tissu osseux, versus les Ob normaux. Le récepteur à la PTH (PTH-R) interagit avec le LRP6, le récepteur des ligands Wnts, et les antagonistes Dickkopf (DKK) bloquent cette interaction. Puisque le niveau de DKK2 est élevé en réponse au TGF-β1 dans les OA Ob, nous proposons que DKK2 altère l’interaction LRP6/PTH-R, le recyclage de PTH-R, et inhibe la réponse à la PTH. Nous avons utilisé des Ob OA et normaux humains en culture primaire. L’expression de PTH-R, LPR6 et DKK2 est mesurée par RT-PCR. Les niveaux protéiques de LRP6, PTH-R et DKK2 ont été déterminés par immunobuvardage. L’inhibition de DKK2 s’est effectuée par siRNA et l’AMP cyclique (AMPc) a été mesurée par ELISA. L’effet de TGF-β1 sur l’expression de DKK2 et PTH-R a été testé sur des cellules d’ostéosarcome SaOS-2. L’expression de PTH-R et LRP6 est similaire entre Ob normaux et OA, mais le niveau protéique de PTH-R est réduit dans les Ob OA. Par contre, l’expression et la production de DKK2 sont plus élevées dans les Ob OA. L’inhibition de DKK2 ne modifia pas l’expression de LRP6 et PTH-R dans les Ob OA mais a augmenté le niveau protéique de PTH-R détecté par immunobuvardage alors que celui de LRP-6 demeura inchangé. L’inhibition de DKK2 dans les Ob OA entraîna une augmentation de PTH-R dans la fraction membranaire et une diminution de la fraction intracellulaire. Les résultats de l'inhibition de la voie de clathrine par le triflupromazine ont montré une expression accrue du récepteur PTH dans la fraction membranaire qui peut être due à l'inhibition de sa dégradation par la voie de clathrine. L’induction de DKK2 dans les cellules SaOS-2 par TGF-β1 entraîna l’inhibition de PTH-R mais non celle de LRP6. L’inhibition de DKK2 dans les Ob OA a stimulé la production d’AMPc en réponse à la PTH par les Ob OA. En outre, le traitement de TGF-β1 dans les cellules SaOS-2 réduit la production d'AMPc en réponse à la PTH.Ces résultats démontrent que les niveaux élevés de DKK2, via l’inhibition de la signalisation Wnt/bcaténine, sont aussi responsables de l’altération de la réponse à la PTH observée dans les Ob OA. Le niveau élevé de DKK2 diminue spécifiquement l’affichage membranaire de PTH-R dans ces cellules et non son expression. Ces résultats suggèrent donc une altération du cross-talk entre LRP6 et PTH-R dans les Ob OA en lien avec leur niveau de DKK2. / Osteoarthritis (OA) is characterized by loss of articular cartilage, bone sclerosis and synovial membrane inflammation. In vivo and in vitro studies indicate that the changes in bone tissue are responsible for the loss of articular cartilage. OA Osteoblasts (Ob) show a reduced response to parathyroid hormone (PTH), an important anabolic signal for bone tissue, versus normal Ob. The PTH receptor (PTH-R) interacts with LRP6, a receptor of Wnt ligands, and DKK antagonists block this interaction. Since DKK2 production is high in OA Ob whereas DKK2 is increased in normal Ob in response to TGF-β1, we propose that DKK2 alters the LRP6/PTH-R interaction, PTH-R recycling and inhibits the response to PTH. We used human OA and normal osteoblasts in primary culture. PTH-R, DKK2 and LRP6 expression were measured by RT-PCR. LRP6, PTH-R and DKK2 protein levels were determined by immunoblotting. Inhibition of DKK2 levels in OA Ob was performed by DKK2-siRNA, and cAMP production was measured by ELISA. The effect of TGF-β1 on DKK2, PTH-R and cAMP production was tested in osteosarcoma cells SaOS-2. In OA Ob, PTH-R and LRP6 mRNA levels were not changed following DKK2 siRNA treatment. However, PTH-R protein expression increased while that for LRP-6 remained unchanged after treatment with DKK2-siRNA. Compared to control, the distribution of PTH-R was higher in the membrane fraction and lower in the intracellular fraction in OA Ob following DKK2 inhibition. In contrast, LRP6 levels remained almost unchanged following these treatments. The results of the inhibition of the clathrin pathway by triflupromazin showed an increased expression of the PTH receptor in the membrane fraction that may be due to inhibition of their degradation by clathrin pathway. In OA Ob, DKK2 inhibition stimulated cAMP production in response to PTH. DKK2 induction by TGF-β1 in SaOS-2 cells, as assessed by qRT-PCR, caused the inhibition of PTH-R protein expression but not of LRP6. In addition, TGF-β1 treatment in SaOS-2 cells reduced cAMP production in response to PTH. These results demonstrate that high levels of DKK2 in OA Ob are responsible for the altered response to PTH. DKK2 antagonists decrease specifically PTH-R membrane display while they do not affect LRP6 recycling. These results suggest an altered cross-talk between LRP6 and PTH-R in OA Ob due to high levels of DKK2 in these cells.