Résumé : Les podocytes, cellules épithéliales rénales, sont nécessaires au maintien de la structure et de la fonction de filtration des glomérules rénaux. La dédifférenciation et l’apoptose des podocytes sont des évènements précoces de la néphropathie diabétique. Des études ont rapporté que l’insuline est nécessaire à la survie des podocytes puisque la délétion du récepteur à l’insuline dans les podocytes de souris entraîne une pathologie glomérulaire semblable à la néphropathie. D’autres études ont montré que la protéine tyrosine phosphatase Src homology-2 domain-containing phosphatase-1 (SHP-1) inhibe les voies de signalisation de l’insuline au niveau du foie et du muscle en déphosphorylant la sous-unité bêta du récepteur à l’insuline (IRβ) et la kinase Phosphatidylinositide 3-kinase (PI3K). Il a récemment été démontré que l’expression de SHP-1 est élevée dans les cortex rénaux de souris diabétiques. Nous avons donc émis l’hypothèse que l’expression de SHP-1 induite par l’hyperglycémie altère les actions de l’insuline dans les podocytes. Nous avons premièrement utilisé un modèle in vivo de souris diabétiques de type 1 (Ins2+/C96Y; Akita). Comparées aux souris contrôles (Ins2+/+), les souris Akita présentaient une apoptose élevée des podocytes ainsi qu’une perte des pédicelles. La phosphorylation de la protéine kinase B (Akt) et de Extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2), suite à une injection systémique d’insuline, était également significativement diminuée dans les cortex rénaux des souris Akita. Cette diminution correspondant à une résistance à l’insuline corrélait avec une augmentation de deux fois de l’expression de SHP-1 dans les glomérules. Nous avons ensuite utilisé une lignée immortalisée de podocytes murins en culture et avons observé que l’exposition à des concentrations élevées de glucose (HG; 25 mM) pendant 96 h, entraînait l’augmentation de l’expression de marqueurs apoptotiques et de l’activité enzymatique de caspase-3/7 en comparaison aux concentrations normales de glucose (NG; 5,6 mM). L’exposition en HG a augmenté l’expression de l’ARNm et protéique de SHP-1, en plus de réduire la signalisation de l’insuline dans les podocytes. La surexpression de la forme dominante-négative de SHP-1 dans les podocytes a permis de renverser les effets de HG et de restaurer les actions de l’insuline. Finalement, l’augmentation de l’expression de SHP-1, tant in vivo qu’in vitro, a été directement corrélée à son association avec IRβ et à la diminution de la phosphorylation de IRβ, Akt et ERK1/2 suite à une stimulation à l’insuline. En conclusion, nous avons montré que l’expression élevée de SHP-1 dans les glomérules cause une résistance à l’insuline et la mort des podocytes contribuant ainsi à la néphropathie diabétique. // Abstract : Podocytes are epithelial renal cells required to preserve glomerular structure and filtration. Their dedifferentiation and apoptosis are early events of diabetic nephropathy progression. Previous studies have shown that insulin action is critical for podocyte survival since deletion of its receptor lead to a glomerular pathology similar to nephropathy. It has also been demonstrated that Src homology-2 domain-containing phosphatase-1 (SHP-1), a protein tyrosine phosphatase, inhibits insulin signaling pathway in liver and muscle by dephosphorylating tyrosine residues on insulin receptor beta-subunit (IRβ) and the Phosphatidylinositide 3-kinase (PI3K). A recent study concluded that SHP-1 is elevated in kidney cortex of type 1 diabetic mice. We hypothesized that hyperglycemia-induced SHP-1 expression may affect insulin actions in podocytes. To confirm this hypothesis, we used type 1 diabetic Akita mice (Ins2+/C96Y). Compared to control littermate mice (Ins2+/+), Akita mice developed elevated podocyte foot process effacement and podocyte apoptosis. In contrast to control mice, insulin-stimulated protein kinase B (Akt) and extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) phosphorylation was remarkably reduced in renal podocytes of Akita mice. This phosphorylation diminution associated to a renal insulin resistance was correlated with a two-fold increase of SHP-1 expression in the glomeruli. We then used cultured murine podocytes cell line to confirm our in vivo results. Podocytes exposed to high glucose concentration (HG; 25 mM) for 96 h exhibited high levels of apoptotic markers and caspase-3/7 enzymatic activity as compared to normal glucose concentration (NG; 5,6 mM). HG exposure raised mRNA and protein levels of SHP-1 and reduced the insulin-signaling pathway in podocytes. Overexpression of dominant-negative SHP-1 in podocytes prevented HG effects and restored insulin actions. Finally, elevated SHP-1 expression induced by high glucose levels was directly correlated to an increased association with insulin receptor-β subunit (IRβ) in vitro and in vivo. This association is therefore leading to the reduction of both IRβ phosphorylation and insulin-stimulated Akt and ERK phosphorylation. In conclusion, our results showed that high levels of SHP-1 in glomeruli cause insulin resistance and podocyte loss, thereby contributing to diabetic nephropathy.

Dans le contexte de l'étude pan-génomique de données d'expression des gènes (transcriptome), différents outils existent déjà. Parmi eux, les techniques de réduction de dimensionnalité cherchent les formes remarquables et les composants importants du système qui peuvent aider à résumer les données. Au cours de ma thèse, j'ai étudié en profondeur les différentes techniques existantes dans ce domaine. Nous avons ensuite développé notre propre approche basée sur la combinaison de la décomposition en valeurs singulières (Singular Value Decomposition) et le Multidimensional Scaling. Nous avons prouvé son utilité et sa précision. En plus des outils d'analyse de données spécifiques à l'étude de l'expression des gènes, nous avons développé un logiciel qui permet de correler l'expression des gènes à des réseaux d'interactions protéine-protéine. Et ceci afin de lier l'information sur l'expression des gènes à celle des interactions entre protéines (protéome) qui ont lieu au sein de la cellule. Tous les outils venant d'être décrits et de nombreux autres ont été utilisés afin d'analyser différent types de données biologiques. La première application a été de corréler l'expression d'auto-anticorps et de cytokines dans le corps humain lors d'une infection au paludisme. Nous avons déterminé des marqueurs spécifiques du paludisme cérébral, permetant à termes de prévenir et détecter plus tôt la maladie. La plus grande analyse que nous avons réalisé visait à définir le profil du transcriptome des cellules T régulatrices (Treg). Ces cellules sont détruites au cours d'une infection par le VIH, une bonne caractérisation moléculaire de celles-ci permettrait par exemple de mieux suivre l'évolution des Treg au cours des traitements pour le SIDA. Parmi les nouveaux marqueurs moléculaires de Treg que nous avons étudié, un nouveau facteur de transcription FOXLF a été découvert, qui pourrait jouer un rôle important dans l'apparition du caractère de "regulation" chez les Treg.

Les voies de signalisation cellulaires permettent aux cellules de percevoir et d'échanger de l'information sous la forme de signaux chimiques. Un tel signal génère une réponse de la cellule au travers des étapes cruciales de réception et transduction. Différents types de protéines sont organisés dans une cascade de réactions de proche en proche qui relaient le signal de l'extérieur vers l'intérieur de la cellule, notamment au travers de la membrane. Les protéines de signalisation sont restreintes à des compartiments avec des degrés de liberté différents, et diffusent soit dans la membrane cellulaire qui est bidimensionnelle, soit dans le cytoplasme qui est en trois dimensions. De plus, au sein même de ces espaces, leurs distributions respectives sont hétérogènes. Or l'étude de la dynamique des voies de signalisation repose classiquement sur des modèles mathématiques supposant une homogénéité de distribution spatiale. Nous avons développé des modèles de réactions biochimiques entre populitions de molécules oú l'état et la position de chaque molécule sont caractérisés. La diffusion et les interactions entre molécules simulées sont reproduites sur la base de processus stochastiques issus de la biophysique. Ceci permet de recréer des distributions spatiales et des modes de diffusion hétérogènes tels qu'observés en biologie et d'étudier leur effet sur la dynamique de la signalisation en simulation. L'exploitation des modèles a été menée sur les différentes étapes de signalisation. Premièrement, l'étude a porté sur l'interaction entre un ligand dans le milieu extracellulaire et des récepteurs membranaires fixes. Lorsque les récepteurs forment des grappes au lieu d'être répartis uniformément, cela provoque une perte de sensibilité globale de l'étage de réception. Deuxièmement, l'analyse a été poursuivie au niveau de l'étage de transduction entre les récepteurs et un effecteur au niveau de la membrane. Là aussi, une distribution en grappe plutôt qu'uniforme des récepteurs provoque une perte de sensibilité. Enfin, l'étude s'est portée sur un modèle intégrant un mécanisme de diffusion non-homogène en mettant en interaction des récepteurs mobiles et leur substrat membranaire. Lorsque des zones restreintes de diffusion ralentie sont définies sur la membrane, deux effets opposés apparaissent sur la dynamique de transduction : un phénomène d'amplification si le ralentissement affecte les deux protéines, et un phénomène de perte de sensibilité si seuls les récepteurs sont ralentis. Globalement, les résultats illustrent comment les hétérogénéités spatiales modifient les distributions de collision et d'évènements de réaction dans le temps et l'espace à l'échelle microscopique, et comment cela se traduit par un effet sur la dynamique globale de la voie de signalisation à l'échelle macroscopique.

Le Costimulateur Inductible (ICOS) est un récepteur exprimé à la surface des cellules T CD4 auxiliaires et T CD8 cytotoxiques. Il fut démontré à l’aide de modèles murins de transplantation de moelle osseuse que ICOS joue un rôle important dans l’induction de la maladie du greffon contre l’hôte aigüe (GVHD). ICOS potentialise deux signaux médiés par le récepteur de cellules T (TCR) : l’activation de la phosphoinositide 3-kinase (PI3K) ainsi que la mobilisation interne de calcium. En conditions in vitro, dans les cellules CD4 et CD8, ICOS réussi à potentialiser le flux de calcium médié par le TCR indépendamment de PI3K. La voie de signalisation de ICOS impliquée dans la GVHD demeure inconnue. Cependant, en utilisant une lignée de souris ‘knock-in’ nommée ICOS-Y181F, dans laquelle le cellules T ont sélectivement perdu la capacité d’activer PI3K par l’entremise d’ICOS, nous avons démontré que les cellules T peuvent utiliser un mécanisme ICOS indépendant de PI3K afin d’induire la GVHD. La mobilisation interne du Ca2+ mène à l’activation de NFAT, un facteur de transcription clé régulant des gènes comme IFN-γ, qui exprime une des cytokines clés impliquées dans la GVHD. Nous émettons comme hypothèse que la capacité pathogénique intacte des cellules T ICOSY181F à induire la GVHD, repose sur la signalisation du Ca2+ indépendante de PI3K. Le but de mon projet est d’identifier les résidus responsables de cette signalisation de Ca2+ médiée par ICOS ainsi que le mécanisme par lequel ce récepteur fonctionne. À l’aide de la mutagénèse dirigée, j’ai généré des mutants d’ICOS et j’ai analysé par cytométrie en flux leur capacité à activer le flux de Ca2+. J’ai ainsi identifié un groupe de lysine sur la queue cytoplasmique d’ICOS situé à proximité de la membrane comme étant essentiel à la fonction de potentialisation du flux de Ca2+. Je fournis également des preuves de l’implication de la kinase Lck, membre de la famille de kinases Src, dans la voie de signalisation de ICOS médiant la potentialisation du flux de Ca2+. Ainsi, ICOS s’associe à Lck et mène à une augmentation de l’activation de PLCγ1, la protéine effectrice clé causant la sortie de Ca2+ de la réserve intracellulaire. En conclusion, notre étude permet de comprendre davantage une des voies de signalisation d’ICOS. L’influx de Ca2+ dans les cellules T implique la voie ICOS-Lck-PLCγ1. Une compréhension plus approfondie de cette voie de signalisation pourrait s’avérer bénéfique afin d’élaborer de nouvelles stratégies menant à la prévention de maladies reliées à ICOS, comme la GVHD. / The Inducible Costimulator (ICOS) is a receptor expressed on activated CD4 helper and CD8 cytotoxic T cells. It was previously shown that ICOS plays an important role in inducing acute graft versus host disease (GVHD) in murine models of allogeneic bone marrow transplantation (BMT). ICOS potentiates TCR-mediated phosphoinositide 3-kinase (PI3K) activation and intracellular calcium mobilization. In both CD4+ and CD8+ T cells, ICOS can potentiate TCR-mediated calcium flux in a PI3K-independent manner in vitro. However, the ICOS signal transduction pathway involved in GVHD remains unknown. Using a knockin strain of mice (termed ICOS-Y181F) in which T cells have selectively lost the ability to activate PI3K, we have recently shown that T cells can utilize PI3K-independent ICOS signaling pathways to induce GVHD. The mobilization of intracellular Ca2+ leads to the activation of NFAT, a key transcription factor regulating genes such as IFN-γ, one of the key T cell cytokines involved in GVHD. Therefore, we hypothesize that the intact pathogenic capacity of ICOS-Y181F T cells to induce GVHD relies on ICOSdependent, PI3K-independent calcium signaling. My goal is to identify the residue(s) responsible for this ICOS-mediated Ca2+ signaling and find the mechanism by which the receptor achieves its function. Through sitedirected mutagenesis and flow cytometric analysis of calcium fluxing capacities of mutant ICOS proteins, I identified a membrane proximal cluster of lysine residues that is essential in inducing ICOS-mediated Ca2+ signaling. I also provide evidence for the involvement of the Src family kinase Lck in ICOS-mediated Ca2+signaling. ICOS associates with Lck molecules, leading to the activation of PLCγ1, the key effector protein causing the release of Ca2+ from the intracellular pool. Taken together, our study is beginning to unravel a complexity in ICOS signaling, and implicates the ICOS-Lck-PLCγ1 axis in T cell calcium signaling and potentially the induction of GVHD. Further understanding of this pathway could prove beneficial in designing new strategies to prevent ICOS-related diseases such as GVHD.

Les opioïdes sont les analgésiques les plus puissants mais leur utilisation prolongée peut entraîner le développement d’une tolérance analgésique. La tolérance serait en partie associée à l’inhibition prolongée de l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) entraînant des changements compensatoires dans la voie de l’adénylate cyclase. Pour cette étude, nous avons eu recours à un biosenseur basée sur la technologie de Bioluminescence Resonnance Energy Transfer (BRET) et qui fournit des mesures de l’AMPc en fonction du temps réel. Durant les 15 premières minutes de stimulation, la réponse de l’AMPc est bi-phasique. Cette progression de la réponse à l’AMPc n’est pas la même pour tous les ligands. Par exemple, la deltorphine II qui induit l’internalisation du récepteur opioïde delta (DOR) affiche une baisse de l’inhibition de l’AMPc. À l’inverse la morphine qui n’induit pas l’internalisation du DOR affiche une réponse stable à l’inhibition de l’AMPc. Ainsi le profil d’internalisation permet de prédire la progression de l’inhibition de l’AMPc à court terme (15 minutes). Nous avons aussi mesuré la réponse à l’AMPc durant 30, 60 et 120 min, étant donné qu’un traitement chronique aux opioïdes induit une tolérance analgésique. Selon les résultats obtenus, le profil d’internalisation du DOR induits par les ligands ne permet pas d’expliquer l’inhibition persistante de l’AMPc. / Opioids are the most powerful analgesics but their prolonged use can cause the development of analgesic tolerance. The tolerance may be associated with the duration of response to cAMP. For this study, we used a biosensor based on Bioluminescence Resonnance Energy Transfer technology that provides measurements of cAMP levels as a function of real time. The aim of our study was to determine whether there is a correlation between the internalization profile of delta-opioid receptor (DOR) when stimulated by different ligands, with respect to the duration of signaling in the short-term (≤15 min) and long term (120 min). This evolution of the duration of cAMP inhibition is biphasic and is explained in part by the efficiency of ligands to promote Gαi activation and by the profile of internalization for each of the different ligands used in this study. For example, deltorphin II which displayed high efficiency to promote Gαi activation and internalization shows a more pronounced decline in cAMP response, unlike morphine which displayed low efficiency to promote Gαi activation, and a poor sequestration, displaying a minimal response decay of inhibition of cAMP. However, ligand ability to promote internalization of DOR does not explain the kinetic profile of a persistent inhibition of cAMP over a longer period of 120 min.

En premier lieu, en utilisant des inhibiteurs pharmacologiques du NF-[kappa]B, nous avons constaté que l'inhibition du facteur de transcription NF-[kappa]B chez ces cellules diminue de beaucoup l'expression génique et la sécrétion de diverses cytokines et chimiokines (TNF-[alpha], IL-8 ou CXCL8, Mip-1[alpha]/[bêta] induites par des stimuli tels que TNF-[alpha] ou LPS. Nous montrons ensuite que le complexe IKK (IKK[alpha], IKK[bêta], et IKK[gamma]) est aussi partiellement localisé dans le noyau, alors que les kinases reliées à IKK (IKK[epsilon] et TBK-1) sont cytoplasmiques; la kinase NIK, quant à elle, est strictement nucléaire. Suite à une activation des neutrophiles, IKK[bêta] et IKK[gamma] deviennent transitoirement phosphorylées dans le cytoplasme et le noyau, alors qu'IKK[alpha] disparaît temporairement de ces deux compartiments cellulaires d'une manière qui semble dépendante de IKK[bêta]. Ces réponses s'accompagnent, dans les deux compartiments, de la dégradation d'I[kappa]B[alpha] et de la phosphorylation du RelA sur la sérine 536. Bien que les deux protéines puissent être des substrats de IKK, l'inhibition de ce dernier empêche la dégradation d'I[kappa]B[alpha], tandis que le niveau de phosphorylation du RelA est essentiellement inchangé. Nous apportons enfin une preuve que des isoformes de IKK nucléaires s'associent à la chromatine suivant l'activation des neutrophiles, ce qui suggère un rôle potentiel dans la régulation de gènes. Deuxièmement, nous rapportons que les neutrophiles expriment la MAP3K, TAK1, ainsi que ses partenaires associés, TAB1/2, dans le cytoplasme et le noyau. La kinase TAK1 est associée de façon constitutive aux protéines TAB1 et TAB2, ainsi qu'au complexe IKK[alpha]/[bêta] dans les neutrophiles au repos. Le niveau d'interaction de ces complexes demeure inchangé suite au traitement des neutrophiles avec le TNF-[alpha] ou le LPS. La kinase TAK1 devient rapidement et transitoirement activée suite à une stimulation des cellules avec le TNF-[alpha] ou le LPS. L'inhibition de l'activité kinase de TAK1 avec un inhibiteur hautement sélectif (5z-7-oxozeaenol) a empêché la phosphorylation d'IKK[alpha]/[bêta], de RelA, et la dégradation de I[kappa]B[alpha] dans les fractions cytoplasmiques et nucléaires, ainsi que la liaison à l'ADN du NF-[kappa]B dans des neutrophiles activés.En conséquence, l'expression et la sécrétion de cytokines inflammatoires induites par le TNF-[alpha] ou le LPS ont été profondément altérées suivant une inhibition de TAK1.En revanche, la phosphorylation de IKK[gamma] induite par le LPS n'a pas été affectée par l'inhibition de TAK1. Finalement, nos résultats indiquent que l'activation du NF-[kappa]B et les réponses cellulaires dépendantes du NF-[kappa]B sont indépendantes des ROS endogènes dans les neutrophiles humains primaires ou dans la lignée promyélocytaire PLB-985, qui peut être différenciée en granulocytes et se comporte comme les neutrophiles. Parallèlement, nous avons optimisé les conditions de transfection des PLB-985 différenciées, ce qui nous a permis de montrer pour la première fois l'activation de promoteurs [kappa]B-dépendants chez des granulocytes humains. Ces travaux rendent par ailleurs possibles les études portant sur l'activation des promoteurs chez les granulocytes. Dans leur ensemble, ces observations démontrent l'importance du NF-[kappa]B dans la génération inductible de cytokines et chimiokines par les neutrophiles. Il s'agit de la première étude qui montre la présence et l'activation (phosphorylation) du complexe IKK et la phosphorylation des protéines NF-[kappa]B/Rel dans les neutrophiles humains. Plus important encore, nos résultats dévoilent un mode d'activation de la cascade de signalisation IKK/I[kappa]B/NF-[kappa]B dans le noyau de cellules primaires. Nos données établissent également le rôle central de TAK1 dans le contrôle de la cascade de signalisation IKK/I[kappa]B/NF-[kappa]B cytoplasmique et nucléaire dans les neutrophiles primaires humains, ce qui pourrait représenter une cible prometteuse pour une intervention thérapeutique considérant le rôle critique des neutrophiles dans plusieurs conditions inflammatoires.

Les fonctions vasculaires sont régulées par diverses stimulations biochimiques ou mécaniques qui activent les différentes cellules composant les vaisseaux sanguins.Les réponses cellulaires qui en résultent peuvent impliquer une réorganisation du cytosquelette, des changements morphologiques, l'expression de protéines membranaires ou la libération de nombreux médiateurs. Tous ces événements sont susceptibles d'influencer les propriétés mécaniques des cellules. Ainsi, le but de la présente étude est de déterminer l'impact de l'activation de certains récepteurs au niveau des propriétés mécaniques des cellules, des modifications qui pourraient avoir de fortes implications au niveau vasculaire. Pour ce faire, nous avons utilisé deux approches expérimentales permettant d'évaluer des changements morphologiques et mécaniques de très faible amplitude : la microscopie à force atomique (AFM) et la résonance des plasmons de surface (SPR). Nous avons ainsi étudié les effets de l'activation des récepteurs de l'angiotensine II, la thrombine et la bradykinine sur la morphologie et les propriétés mécaniques de modèles cellulaires importants dans l'étude des fonctions vasculaires. Nous avons observé que l'activation du récepteur AT[indice inférieur 1] pour l'angiotensine II induit une réponse mécanique transitoire qui se traduit par une contraction du corps cellulaire, une augmentation du module d'élasticité de la cellule et une diminution de l'intégrité de l'épithélium. Quant à l'activation du récepteur PAR-1 pour la thrombine et du récepteur B[indice inférieur 2] pour la bradykinine, celle-ci provoque aussi une modification de la rigidité des cellules, mais de façon soutenue dans le temps. Ces deux agonistes augmentent aussi l'interaction entre la membrane et le cytosquelette, un phénomène observé par l'augmentation des forces requises pour l'étirement de la membrane cellulaire. Ainsi, la présente étude montre qu'une cellule peut subir des modifications importantes au niveau de ses propriétés mécaniques suivant son activation par différents agonistes, ce qui peut avoir des conséquences directes sur certaines fonctions physiologiques dépendantes des propriétés mécaniques des vaisseaux. En effet, ces changements observés au niveau de la cellule pourraient, entre autres, contribuer au contrôle du diamètre et de la compliance des capillaires, à l'adhésion des cellules inflammatoires ainsi que modifier la perception de stimuli mécaniques par les cellules endothéliales.

Résumé : La signalisation biaisée représente la capacité des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) d'engager des voies de signalisation distinctes avec des efficacités variables selon le ligand utilisé ou la mutation dans le récepteur. Un meilleur contrôle des voies activées ou inhibées par des médicaments pourrait permettre de réduire leurs effets indésirables. Malheureusement, les mécanismes structuraux impliqués dans la transmission du signal à travers la membrane plasmique par l'entremise des RCPG sont peu connus, ce qui limite le développement rationnel de nouvelles molécules ciblant des voies de signalisation particulières. Le récepteur de type 1 à l'angiotensine II (AT[indice inférieur 1]), un RCPG de classe A prototypique, peut activer différents effecteurs suite à sa stimulation par le ligand endogène angiotensine II (AngII), incluant la protéine G[indice inférieur q/11] et les β-arrestines. Il est suggéré que l'activation de ces deux voies de signalisation peut être associée à des conformations différentes du récepteur AT[indice inférieur 1]. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons utilisé des simulations de dynamique moléculaire afin d'explorer les interactions et les mouvements qui définissent le paysage conformationnel du récepteur AT[indice inférieur 1]. De plus, nous avons vérifié comment était modifié le paysage conformationnel par des mutations (N111G, N111W et D74N) et des ligands (AngII et [Sar[indice supérieur 1], Ile[indice supérieur 8]]AngII) ayant des profils signalétiques différents pour la voie de la protéine G[indice inférieur q/11] et la voie des β-arrestines. Les résultats obtenus nous éclairent sur le rôle d'un réseau de ponts hydrogène entre des résidus polaires conservés au coeur du récepteur dont font partie les résidus N111[indice supérieur 3.35] et D74[indice supérieur 2.50]. Les résultats révèlent la présence d'un groupe de résidus hydrophobes juste au-dessus du réseau de ponts hydrogène et adjacent à la pochette de liaison du récepteur qui semble important pour la stabilisation de l'état inactif du récepteur ainsi que pour son activation par un ligand. Dans l'ensemble, les résultats suggèrent que l'activation de la voie de la protéine G[indice inférieur q/11] est associée avec une transition conformationnelle spécifique stabilisée par l'agoniste alors que l'activation de la voie des β-arrestines est associée à une stabilisation de l'état de repos du récepteur. / Abstract: Biased signaling represents the ability of G protein-coupled receptors to engage distinct pathways with various efficacies depending on the ligand used or on mutations in the receptor. Having better control over the signaling pathways activated or inhibited by drugs could lead to fewer undesirable effects. Unfortunately, the structural mechanisms involved in the transmission of signal across the cell membrane through the receptors are poorly understood, which limits the rational development of new molecules targetting specific signaling pathways. The angiotensin-II type 1 (AT[subscript 1]) receptor, a prototypical class A G protein-coupled receptor, can activate various effectors upon stimulation with the endogenous ligand angiotensin-II (AngII), including the G[subscript q/11] protein and β-arrestins. It is believed that the activation of those two pathways can be associated with distinct conformations of the AT[subscript 1] receptor. To verify this hypothesis, microseconds of molecular dynamics simulations were computed to explore interactions and movements that define the conformational landscape of the AT[subscript 1] receptor. We have also verified how this conformational landscape is modified by mutations (N111G, N111W, D74N) and ligands (AngII, [Sar[superscript 1]Ile[superscript 8]]AngII) that have different signaling properties on the G[subscript q/11] pathway and the β-arrestin pathway. The results provide a better understanding of the role of a hydrogen bond network formed of conserved polar residues in the receptor core which include residues N111[superscript 3.35] and D74[superscript 2.50]. The results also reveal the existence of a cluster of hydrophobic residues located right above the hydrogen bonds network and adjacent to the binding pocket that appears important for the stabilization of the ground state of the receptor as well as its ligand-induced activation. As a whole, the results suggest that activation of the G[supbscript q/11] pathway is associated with a specific conformational transition stabilized by the agonist, whereas the activation of the β-arrestin pathway is linked to the stabilization of the ground state of the receptor.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'atrophie musculaire bulbo-spinale (SBMA) est une dégénérescence lente et progressive des motoneurones causée par l'élongation du triplet nucléotidique (CAG) dans le gène codant pour le récepteur aux androgènes (RA) localisé sur le chromosome X. Dans la SBMA, ce récepteur à extension polyglutaminique (polyQ) pathogène s'accumule de manière ligand dépendante dans le cytoplasme sous forme d'agrégats mais également dans le noyau y créant des corps d'inclusions nucléaires considérés comme la marque identitaire histologique, dont le caractère cytotoxique est aujourd'hui remis en question. Nous avons développé un modèle SBMA in vitro basé sur l'expression inductible d'un RA51Q dans la lignée hybride NSC34, qui est comparé au modèle normal NSC34 exprimant un RA contenant 20Q. Nous avons démontré que l'expression du RA51Q entraîne une diminution de la viabilité ainsi qu'une altération de la croissance neuritique sans formation d'agrégats insolubles dans le noyau ou le cytoplasme des cellules. Le RA en tant que membre de la superfamille des récepteurs nucléaires est un facteur de transcription mais peut également induire des voies de signalisation non génomiques via sa localisation membranaire. Après avoir montré une localisation du RA20Q et du RA51Q dans les « lipid rafts », nous avons corrélé la diminution de la viabilité et de la pousse neuritique induite par le RA51Q à une altération de la signalisation cellulaire non génomique. Les résultats obtenus mettent en évidence une dérégulation des voies de signalisation PI3K/Akt et JNK/c-jun induite par l'expression du RA muté dans notre modèle SBMA. / Spinal Bulbar Muscular Atrophy (SBMA) is a progressive inherited motoneuron disease caused by the expansion of a trinucleotide (CAG) repeat in the gene coding for the androgen receptor (AR) located on the X chromosome. This rare disease causes muscle weaknesses, hypotonia, hyporeflexia, fasciculations of facial muscles in male patients. The androgen-dependent formation of cytoplasmic aggregates and nuclear inclusions are pathological hallmarks of this polyglutamine disease but their potential neurotoxicity is still under debate. We developed a SBMA model based on a doxycycline-inducible AR51Q expression system in the NSC34 hybrid cell line. We have shown that the expression of the mutated AR leads to a reduced viability and to an alteration of neurite outgrowth compared to cells expressing the normal AR20Q. The AR belongs to the nuclear receptor superfamily of transcription factors. However, recent data have put in evidence a membrane localization of AR initiating non-genomic signaling pathways. Because we have not observed insoluble aggregates, reduced viability and neurite outgrowth could not be correlated to AR aggregation. We hypothesized that motoneuron death is not only due to aggregate formation but also to the alteration of AR signaling pathways. We focused on a correlation between the AR localization in lipid rafts and the observed phenotypes. Our results highlight the deregulation of PI3K/Akt and JNK/c-jun signaling pathways induced by the expression of AR51Q in our SBMA model.