L’oncogène K-ras est une petite GTPase de la super famille RAS, fréquemment impliquée dans les cancers, en particulier celui du pancréas, l’un des plus mortels dans les pays occidentaux. Les mutations de l’oncogène K-ras sont considérées comme l’un des événements initiateurs de la cancérogenèse pancréatique et son activité oncogénique est un élément indispensable à la progression tumorale. Cependant, le ciblage thérapeutique de K-ras reste inefficace, à ce jour. Se focaliser sur les cibles précoces de son activité oncogénique semble ainsi être une stratégie alternative intéressante. La mucine membranaire MUC4 est une glycoprotéine de haut poids moléculaire fréquemment dérégulée dans les cancers. Dans le cancer du pancréas, MUC4 est néo-exprimée dès les stades prénéoplasiques et est impliquée dans les propriétés biologiques permettant la progression tumorale et la chimiorésistance. La régulation de MUC4 par K-ras dans la cancérogenèse pancréatique reste à décrypter. En utilisant le modèle murin de cancérogenèse pancréatique Pdx1-Cre; LStopL-K-rasG12D, nous avons mis en évidence que la néo-expression précoce de la mucine Muc4, dans les lésions pancréatiques prénéoplasiques intraépithéliales (PanINs) formées suite à la présence du K-ras muté, est corrélée avec l’activation des voies de signalisation ERK, JNK and NF-κB. In vitro, la transfection de mutants constitutivement activés de K-rasG12V dans les cellules tumorales humaines induit une augmentation de l’expression de MUC4. Cette activation intervient au niveau transcriptionel par le recrutement des facteurs de transcription AP-1 et NF-κB via les voies MAPK, JNK and NF-κB et au niveau post-transcriptionel par un mécanisme impliquant la RalB GTPase. Ensemble, ces résultats démontre que MUC4 est une cible transcriptionelle et post-transcriptionelle de l’activité oncogénique de K-ras dans le cancer du pancréas. Ces résultats ouvrent de nouvelles pistes pour développer des stratégies ciblant les étapes précoces de ce cancer. / K-ras oncogene is a small GTPase of the RAS superfamily, highly implicated in cancer, mainly in pancreatic cancer, one of the most deadly cancers in occidental countries. K-ras mutations are considered as an initiating event of pancreatic carcinogenesis and K-ras oncogenic activities are necessary components of cancer progression. However, K-ras clinical targeting remains ineffective until now. Focus on early downstream K-ras signalling may thus appear as an interesting strategy target in this cancer. The membrane-bound mucin MUC4 is a high molecular weight glycoprotein frequently deregulated in cancer. In pancreatic cancer, MUC4 is neo-expressed in the preneoplastic stages and thereafter is involved in cancer cell properties leading to cancer progression and chemoresistance. MUC4 regulation by K-ras in pancreatic carcinogenesis remains unknown. Using the Pdx1-Cre; LStopL-K-rasG12D mouse model of pancreatic carcinogenesis, we show that the in vivo early neo-expression of the mucin Muc4 in pancreatic intraepithelial neoplastic lesions (PanINs) induced by mutated K-ras is correlated with the activation of ERK, JNK and NF-ΚB signalling pathways. In vitro, transfection of constitutively activated K-rasG12V in human pancreatic cancer cells led to the transcriptional upregulation of MUC4. This activation was shown to be mediated at the transcriptional level by AP-1 and NF-ΚB transcription factors via MAPK, JNK and NF-ΚB pathways and at the post-transcriptional level by a mechanism involving the RalB GTPase. Altogether, these results identifies MUC4 as a transcriptional and post-transcriptional target of K-ras in pancreatic cancer. This opens avenues in developing new approaches to target the early steps of this deadly cancer.

Chez Cupriavidus metallidurans CH34, le complexe CnrYXH contribue à réguler l'expression des gènes de régulation et de résistance au cobalt et au nickel en fonction de la concentration environnementale de ces cations. La fixation de cobalt ou de nickel sur le domaine périplasmique senseur de CnrX induit des modifications conformationnelles à l'origine de la transduction du signal transmembranaire. Cela conduit à rendre le facteur sigma CnrH disponible pour sa liaison à l'ARN polymérase (ARNP) dans le cytoplasme. Le complexe CnrH:ARNP se fixe alors spécifiquement sur les promoteurs des gènes cnrY et cnrC pour initier la transcription des gènes de régulation (cnrYXH) et de résistance (cnrCBAT). Dans le but de déterminer la nature de ce signal, mon projet de thèse visait à cartographier les interactions protéine:protéine au sein du complexe CnrYXH dans les trois compartiments concernés : le périplasme, la membrane plasmique et le cytoplasme. La documentation des déterminants d'interaction entre CnrX, CnrY et CnrH a permis d'élaborer un modèle structural et fonctionnel pour le complexe CnrYXH et ses homologues soulevant des hypothèses nouvelles sur le fonctionnement du système Cnr. / The CnrYXH complex contributes to regulate the expression of the regulatory genes and resistance genes involved in cobalt and nickel resistance in Cupriavidus metallidurans CH34. The binding of nickel or cobalt to CnrX in the periplasm induces conformational modifications that could trigger transmembrane signal transduction. As a result, CnrH is made available in cytoplasm for binding to RNA polymerase. The CnrH:RNA polymerase complex binds specifically the cnr promoters and initiates transcription of both the regulatory genes (cnrYXH) and resistance genes (cnrCBAT). In order to delineate the mechanism of signal transduction through the membrane, I studied the interactions between the three partners in the different cellular compartments: periplasm, plasmic membrane and cytoplasm. The identification of the interaction determinants between CnrX, CnrY and CnrH allowed us to propose a structural and functional model for the CnrYXH complex and its homologues. This model brings up new hypothesis on the function of Cnr system.

L'invasion cellulaire est un processus basé sur la dynamique des invadosomes, qui sont desstructures acto-adhesives capables de dégrader localement la matrice extracellulaire. Lesinvadosomes sont composés d'un coeur riche en actine-F entouré par un assemblage desprotéines d'adhésion conduisant à la dégradation de la matrice extracellulaire par lerecrutement et la sécrétion des protéases. Les cellules MEF exprimantes la formeconstitutivement active de la kinase Src (SrcY527F) forment des invadosomes quis'organisent sous forme d'anneaux ou rosettes. Paxilline et hic-5 (une protéine homologue àla paxilline) ont des rôles spécifiques dans la morphologie cellulaire et la plasticité pendantl'invasion cellulaire. La structure de ces deux protéines se caractérise par la présence dedomaines LIM dans la partie C-terminale et de motifs LD dans la partie N-terminale. Cettesimilarité suggère que ces protéines peuvent avoir des fonctions redondantes. L'importance dela famille des protéines paxillines dans la formation des invadosomes a été examiné en tentantd'induire des invadosomes via l'expression de la forme constitutivement active de la kinaseSrc (SrcY527F) dans des cellules déplétées en paxilline et hic-5 (cellules pax-/- et déplétées enhic-5 par shRNA). La formation des invadosomes a été totalement bloquéequand l'expression de ces deux protéines a été diminuée de manière significativesimultanément indiquant leur redondance fonctionnelle. La ré-expression de nombreuxmutants de la paxilline dans ce contexte cellulaire a permis de montrer que les domaines LIMde paxilline n'étaient pas nécessaires pour la formation de l'anneau des invadosomes. Aucontraire, ces études de structure-fonctions ont permis de mettre en évidence le rôle essentieldes motifs LD3 et LD5 considérablement dans l'assemblage des rosettes. En outre, l'ordreprécis de chaque LD dans la molécule de paxilline est essentiel pour leur travail coopératifdans la régulation des invadosomes. Après avoir montré la redondance fonctionnelle entrepaxillin et hic-5, nous avons voulu déterminer leurs fonctions spécifiques. Pour cela,différents traitements siRNAs nous ont permis de diminuer spécifiquement l'expression depaxillin et/ou hic-5 dans des cellules formant des invadosomes. La déplétion rapide de lapaxilline a réduit la formation des rosettes alors que celle de hic-5 a affecté de manièreimportante la dégradation de la matrice extracellulaire. En effet, l'identification despartenaires spécifiques de paxilline et hic-5 à révélé que cette dernière interagissaitspécifiquement avec IQGAP1. Cette protéine est un facteur essentiel pour le recrutement del'exocyst, un complexe régulant la sécrétion locale de métalloprotéases dans lesinvadosomes. En conclusion, il apparaît que l'action complémentaire de la paxilline et hic-5 aun rôle essentiel dans la régulation des fonctions cellulaires assurées par les invadosomes. / Cellular invasion is based on invadosome dynamics where acto-adhesive machinery iscoupled with extracellular matrix proteolysis. Each invadosome unit is composed by a denseF-actin core surrounded by a ring of adhesion molecules that localizes intense ECMdegradation activity via the recruitment and secretion of lytic enzymes. Invadosomes in MEFstransformed with an activated form of the Src kinase (SrcY527F) auto-assemble into circularmeta-structures called rings or rosettes. Paxillin and the closely related family member hic-5(hydrogen peroxide inducible clone 5) have been recently identified as critical determinants ofcell morphology and plasticity during cell invasion with distinct signaling functions.However, the two proteins have a similar overall domain structure, including amino-terminalLD motifs and carboxyl-terminal LIM domains suggesting overlapping or redundantfunctions. We examined the importance of this class of proteins in invadosome formation, byexpressing SrcY527F in pax-/- cells depleted or not of hic-5. Only when the expression of bothproteins was significantly decreased, invadosome formation was blocked indicating theirfunctional redundancy. Importantly, LIM domain of paxillin was dispensable for ringformation whereas individual depletion of LD3 and LD5 motifs dramatically reducedinvadosome rosette assembly. Furthermore, the precise order of each LD in the paxillin'smolecule was necessary to allow their cooperativity during invadosome formation. Beyondtheir redundancy, their distinct roles in invadosomes were assessed via siRNA strategy aimingat the acute depletion of each molecule. Rapid depletion of paxillin reduced invadosome ringformation whereas hic-5 silencing dramatically affected extracellular matrix degradation. Hic-5 role in ECM degradation was enhanced by the fact that it was found to specifically interactwith IQGAP1, a CDC42- effector that is essential to recruit the exocyst complex ininvadosomes. In summary, the functional redundancy of paxillin and hic-5 suggests anextensive cross-talk between these two closely related proteins in the regulation ofinvadosome-based cellular functions.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) constitue l'hémopathie maligne la plus fréquente dans les pays occidentaux et résulte d’une accumulation de lymphocytes B (LB) monoclonaux matures porteurs de la glycoprotéine CD5. Les LB de LLC sont également caractérisées par une altération de l'homéostasie du calcium avec, d'une part, la mise en évidence de facteurs de survie contrôlés par le calcium tels que phospho-ERK, NFAT-2 et IL-10, et d'autre part par une progression de la maladie qui est associée à la réponse au calcium. Tout d'abord, afin de mieux comprendre l'impact de la molécule CD5 sur les dérégulations du calcium, il a été montré que l'introduction d'un plasmide d'expression pour CD5 dans les lignées de cellules B humaines s'accompagnait d'une entrée calcique à l’état basale. Ensuite, cette entrée, appelée entrée constitutive, a été recherchée dans les LB de LLC pour montrer qu'elle caractérisait les patients non traités en phase d'évolution. Comme pour les lignées de cellules B CD5, cette nouvelle voie d'entrée du calcium est autonome et indépendante de la voie classique de signalisation du LB de LLC : BCR-IP3R. L'étude des protéines responsables de cet influx a permis de mettre en évidence, premièrement trois partenaires STIM1, Orai1 et TRPC1, et deuxièmement l'importance de la fraction membranaire de STIM1 (STIMPM) puisque l'utilisation d'un anticorps monoclonal anti-STIM1 (Acm) est capable d’inhiber l'entrée constitutive du calcium qui à son tour agit sur la survie des LB, pour les patients STIMPM positifs, lorsque l'Acm anti-STIM1 est utilisé en association avec le rituximab, un Acm thérapeutique anti-CD20. Enfin, la modélisation de la partie Cterminale de STIM1 permet d'envisager plusieurs cibles potentielles pour le développement de nouveaux Acm anti-STIM1. En conclusion, la mise en place, par le clone malin de LLC, d'une entrée constitutive du calcium favorise son agressivité et constitue donc une nouvelle voie thérapeutique contrôlable par l'utilisation d’Acm anti-STIM1 ce qui ouvre de nouvelles perspectives comme outils diagnostiques et thérapeutiques. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common hematological malignancy in Western countries and is a result of the accumulation of mature monoclonal B lymphocytes (B-CLL) carrying the CD5 glycoprotein. The B-CLL are also characterized by an alteration of calcium homeostasis with, on the one hand, the demonstration of calcium-controlled survival factors such as phospho-ERK, NFAT- 2 and IL-10, and on the other hand by a progression of the disease which is associated with the response to calcium. Initially, in order to better understand the impact of the CD5 molecule on calcium deregulations, it has been shown that the introduction of an expression plasmid for CD5 into human B cell lines was accompanied by a calcium entry in the basal state. Then, this entry, called constitutive entry, was sought in the B-CLL to show that it characterized untreated patients in the evolution phase.As with CD5 B cell lines, this new calcium entry pathway is autonomous and independent of the classical B-CLL signaling pathway: BCR-IP3R. The study of the proteins responsible for this influx made it possible to highlight, firstly three partners (STIM1, Orai1 and TRPC1), and secondly the importance of the membrane fraction of STIM1 (STIMPM) since the use of a human monoclonal antibody (mAb) anti-STIM1 is able to inhibit the constitutive entry of calcium which in turn acts on the survival of B-CLL, for STIMPM positive patients, when the anti-STIM1 mAb was used in combination with rituximab, a therapeutic anti-CD20 mAb. Finally, the modeling of the C-terminal part of STIM1 makes it possible to envisage several potential targets for the development of new anti-STIM1 mAbs. In conclusion, the introduction by the CLL malignant clone of a constitutive entry of calcium favors its aggressiveness and thus constitutes a new therapeutic pathway controllable by the use of anti-STIM1 mAb, which opens new perspectives like diagnostic and therapeutic tools.

Le striatum dorsal et le noyau accumbens (NAc) jouent un rôle crucial dans la sélection et l’exécution de mouvements résultant de l’intégration de signaux dopaminergiques et d’informations glutamatergiques sensorielles. A ce jour, les mécanismes moléculaires à travers lesquels la dopamine (DA) régule la plasticité des neurones épineux moyens du striatum (MSNs) sont peu connus. La synthèse des protéines est un événement essentiel requis pour la plasticité synaptique et la mémoire à long terme. Dans de nombreuses régions cérébrales, l’initiation, étant l'étape limitante de la synthèse protéique, est contrôlée par la phosphorylation de facteurs d’initiation de la traduction (eIFs). Notre hypothèse est que la DA pourrait réguler la traduction d’ARNm dans le striatum à travers des mécanismes moléculaires similaires. La première partie de cette thèse visait à étudier le rôle de la DA dans la régulation de la machinerie de traduction dans les MSNs. Pour ce faire, nous avons analysé au niveau du striatum, la phosphorylation de différents eIFs en réponse à l’administration aigue ou répétée de d-amphetamine (d-amph), entraînant une augmentation transitoire ou de longue durée de la transmission dopaminergique, respectivement. Bien que l’administration de la d-amph est associée à une légère augmentation de pS209-eIF4E, l’état de phosphorylation de S1108-eIF4G reste inchangé. En revanche, une forte augmentation de p51-eIF2α a été observée après administration répétée d-amph. Nous démontrons que la phosphorylation de 51-eIF2α est corrélée à une diminution transitoire de la synthèse protéique globale dans le striatum. En outre, la d-amph induit également une importante augmentation de la phosphorylation de la protéine ribosomale S6 (rpS6). Cet effet se produit spécifiquement dans MSNs exprimant le récepteur D1 à la DA et implique la cascade de signalisation AMPc/PKA/DARPP-32, tout en étant indépendant des voies mTORC1/S6K et ERK. La phosphorylation de rpS6 est couramment utilisée pour marquer de l'activité neuronale bien que son rôle biologique dans le cerveau reste énigmatique. Compte tenu sa régulation significative par la DA, la deuxième partie de cette thèse a eu pour but d’acquérir de nouvelles connaissances sur la fonction de la phosphorylation de rpS6 en utilisant un modèle de souris rpS6 déficient de ses sites de phosphorylations, rpS6P-/-. Dans ces souris transgéniques la synthèse protéique globale est normale dans diverses régions du cerveau. Néanmoins, les souris rpS6P -/- présentent une altération de la traduction d'un sous-ensemble de ARNm, ceci sélectivement dans le NAc, suggérant le rôle potentiel de la phosphorylation de rpS6 dans la régulation de la traduction de transcrits bien spécifiques au sein de cette sous-région du striatum. Dans l'ensemble, les résultats présentés dans cette thèse permettent une meilleure compréhension des mécanismes engagés par DA pour contrôler la traduction d’ ARNm dans les MSNs du striatum. / The dorsal striatum and the nucleus accumbens (NAc) process dopamine (DA) signals in order to generate appropriate behavior in response to given glutamatergic sensory cues. The molecular mechanisms through which DA promotes long-lasting changes in striatal GABAergic medium-sized spiny neurons (MSNs) are still not fully understood. It is widely accepted that protein synthesis is an essential event required for several forms of synaptic plasticity and long-term memory. In various brain areas, initiation is the rate-limiting step of translation and is regulated through phosphorylation of translation initiation factors (eIFs). Whether DA could regulate mRNA translation in the striatum through similar mechanisms is yet poorly investigated. A first part of this thesis aimed to shed light on the role of DA in the regulation of the translational machinery in MSNs. Here, we measured the phosphorylation state of eIFs following single and repeated in vivo d-amphetamine (d-amph) administration, resulting in a transient or long-lasting increase of the dopaminergic transmission, respectively. Although d-amph exposure slightly enhances the striatal pS209-eIF4E, pS1108-eIF4G remains unchanged. In contrast, a strong increase in p51-eIF2α is observed after repeated d-amph administration. We demonstrate that d-amph-induced p51-eIF2α is associated to a transient decrease in generall striatal protein synthesis. In addition, d-amph markedly increases the striatal phosphorylation of the 40S ribosomal protein S6 (rpS6). This effect occurs selectively in D1 DA receptor (D1R)-expressing MSNs and requires the cAMP/PKA/DARPP-32 cascade but is independent of mTORC1/S6K and ERK signaling. rpS6 phosphorylation is commonly used as a marker for neuronal activity even though its biological role in the brain remains puzzling. Given the significant regulation of striatal rpS6 phosphorylation by DA, the second part of this thesis sought to gain new insights into the function of this post-translational event by using a phosphodeficient rpS6P-/- mouse model. We showed that rpS6P-/- mice display unaltered global protein synthesis in different brain regions. Nonetheless, rpS6P-/- mice exhibit impaired translation of a subset of mRNA selectively in the NAc, pointing to the potential role of rpS6 phosphorylation in the regulation of transcript-specific translation within this striatal sub-region. Overall, the results presented in this thesis provide a better understanding of the mechanisms engaged by DA to control mRNA translation in striatal MSNs.

C. elegans est infecté par divers agents pathogènes ; bactéries, champignons et virus. Lors d'une infection fongique, C. elegans surexprime de nombreux gènes codant pour des peptides antimicrobiens (AMP). Le principal objectif de ma thèse était de construire un réseau de régulation génique intégré représentant l'induction de ces gènes AMP pendant l'infection. Pour trouver les principales composantes du réseau de régulation, via un criblage ARNi du génome entier (Zugasti et al 2016), nous avons identifié 278 clones Nipi (pour "Absence d'induction de peptides antimicrobiens après infection") qui abrogent l’induction d’AMP. En utilisant "CloneMapper" (Thakur et al. 2014), nous avons identifié 338 gènes cibles pour ces clones. Nous avons montré que les voies de MAPK sont au cœur de l'induction des AMP. Parmi les 50 gènes arbitrairement sélectionnés et surexprimant les AMP, nous en avons validé 48 en utilisant Fluidigm. Pour attribuer des fonctions aux gènes identifiés dans ces études à haut débit, nous avons développé un outil d'enrichissement fonctionnel pour la communauté C.elegans (MS en préparation). Nous avons utilisé cet outil pour analyser les cibles du criblage ARNi sur le génome entier et sur d'autres bases de données concernant divers agents pathogènes. Nous avons fait une analyse de l'enrichissement fonctionnel des cibles ChIPseq de CEBP-1, un facteur de transcription lié à la régulation de la réponse immunitaire innée (Kim et al, Soumis). Enfin, pour mieux comprendre l'interaction entre l'hôte et le pathogène, nous avons séquencé, assemblé, annoté et analysé le génome de D. coniospora. Nous avons identifié plusieurs facteurs de virulence potentiels dans ce génome. / C. elegans is infected by diverse pathogens, including bacteria, fungi and viruses. Upon fungal infection, C. elegans up-regulates the expression of many antimicrobial peptide (AMP) genes. The main aim of my thesis was to build an integrated gene regulatory network representing the induction of these AMP genes upon infection. To find the main/backbone components of the regulatory network, through a genome-wide RNAi screen (Zugasti et al. 2016), we identified 278 Nipi (for “no induction of antimicrobial peptides after infection”) clones that abrogate AMP induction. Using “CloneMapper” (Thakur et al. 2014), we identified 338 target genes for these clones. We showed that MAPK pathways are central to the induction of AMPs. We also characterized the transcriptional changes provoked by infection using RNA-sequencing and identified more than 300 genes that are dynamically up-regulated after infection, including 13 AMPs. We validated 48 (96%) of 50 arbitrary selected up-regulated genes using Fluidigm. To assign functions to genes identified in these high-throughput studies, we developed a functional enrichment tool for C.elegans community (MS in preparation). We used this tool to analyse the genome-wide RNAi screen targets and other pathogen-related datasets. We did functional enrichment analysis of ChIPseq targets of CEBP-1, TF linked to the regulation of the innate immune response (Kim et al., submitted). Finally, to understand better the interaction between host and pathogen, we sequenced, assembled, annotated and analysed the D. coniospora genome (Lebrigand et al. 2016). We identified various potential virulence factors in the fungal genome.

Le cancer du poumon est la première cause de mortalité liée au cancer en France et dans le monde. Il s’agit d’un cancer de mauvais pronostique, diagnostiqué généralement aux stades tardifs III ou IV et avec une survie à 5 ans faible, respectivement de 6 et 1%. Ce cancer comprend différents types histologiques, parmi lesquels les adénocarcinomes sont les plus fréquents et comptent pour 40% des diagnostics. L’analyse génétique par séquençage des tumeurs des patients en stade IV permet de mettre en évidence des mutations récurrentes, et généralement mutuellement exclusives, au niveau des gènes KRAS, EGFR, BRAF et ALK. L’identification de ces mutations permet dans le cadre de tests compagnons de décider de l’éligibilité du patient aux thérapies ciblées lorsqu’elles sont disponibles.Bien que ces thérapies ciblées représentent une véritable révolution dans la prise en charge des patients, une majorité de patients ne peuvent bénéficier de ces traitements car ils ne présentent pas au niveau tumoral de mutation activatrices actionnables (absence de mutation EGFR, BRAF et ALK, présence d’une mutation KRAS…). De plus, dans l’éventualité où ils peuvent être traités par une molécule orale, le bénéfice observé reste malheureusement de courte durée et tous finiront à terme par échapper au traitement, c’est le cas par exemple lors de mutations de l’EGFR.Ainsi, afin de mieux comprendre quels sont les mécanismes moléculaires associés aux phénomènes de résistances thérapeutiques observés en clinique, et dans l’objectif de proposer de nouvelles voies thérapeutiques pour les patients non éligibles aux thérapies ciblées, j’ai étudié, au niveau protéique, l’impact des mutations sur les réseaux d’interactions protéiques en utilisant la technique du BioID (proximity-dependent biotinylation identification). Plus particulièrement, je me suis intéressé aux mutations activatrices de l’EGFR, KRAS, BRAF et ALK. Les protéines de la famille RAS (HRAS, NRAS, KRAS) étant mutées dans plus de 30% des cancers, je me suis également intéressé aux réseaux d’interactions protéiques portés par ces trois isoformes afin de mettre en évidence des interactions protéiques spécifiques à l’isoforme KRAS.Au cours de ma thèse, j’ai montré que les réseaux d’interaction caractérisés par le BioID sont bien plus denses que ceux obtenus par la technique plus conventionnelle de purification par affinité, et qu’ils permettent de mettre en évidence des interacteurs spécifiquement dérégulés par l’apparition de mutations activatrices. Par ailleurs les modèles cellulaires HEK293 (cellules humaines embryonnaires de rein) et BEAS2B (cellules pulmonaires d’origine non-cancéreuses) ont montré un fort recouvrement des interacteurs identifiés, ce qui suggère que la stratégie employée est pertinente pour identifier des interacteurs spécifiques de mutations. Ce travail de thèse a permis d’identifier une série de plusieurs interacteurs spécifiques des formes mutante de KRAS, d’EGFR, de BRAF, de NRAS et de la fusion EML4-ALK. Treize interacteurs spécifiques de la forme mutée de KRAS ont été validés fonctionnellement dans des modèles cellulaires de cancers du poumon. Enfin, en utilisant les données de BioID, un modèle préliminaire de résistance de l’EGFR aux thérapies ciblées a pu être élaboré, lequel fait apparaitre les protéines CBL et IGF2R comme des protéines potentiellement impliquées dans l’acquisition des résistances aux thérapies ciblées.Ce travail de thèse propose ainsi de nouvelles perspectives quant à la détermination des mécanismes de résistance spécifiques aux thérapies ciblées et à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques chez les patients présentent des mutations activatrices. / Lung cancer is the leading cause of cancer-related death in France and in the world. It is a cancer of poor prognosis, diagnosed at the late stage III or IV, with a 5-years survival of 6% and 1%, respectively. This cancer encompass several histological types, and among them adenocarcinoma account for 40% of the diagnosis. Genetic sequencing of stage IV tumors highlights redundant mutations, and generally exclusives from each other’s, of KRAS, EGFR, BRAF and ALK genes. The identification of these mutations enable, within companion test, to make eligible patients for targeted therapies when molecules are available.Even though these targeted therapies represent a true revolution in patient’s care, the majority of them cannot benefit from these treatments because their tumors do not harbor activating mutations that are targetable (e.g. absence of EGFR, BRAF and ALK mutation, presence of KRAS mutation). Additionally, when they can be treated using an oral molecule, the benefit observed is unfortunately poor in terms of period of time, and all the patients will escape from the treatment. This is for example the case with EGFR mutations.To better understand the molecular mechanisms associated with the resistance events observed in the clinic, and to propose new therapeutics for patient not-eligible for targeted therapies, I studied at the proteome level, the impact these mutations on protein networks, using the BioID technology (proximity-dependent biotinylation identification). More particularly, I have been interested in the activating mutation of EGFR, KRAS, BRAF and ALK. Considering that proteins from the RAS family (HRAS, NRAS and KRAS) are mutated in around 30% of cancers, I have been also interested in the protein network of these proteins to highlight interaction specific to the KRAS isoform.During my thesis, I showed that the protein networks characterized using BioID are much more dense compared to those identified with the more conventional technic of AP-MS (Affinity-purification and mass spectrometry), and that they enable to identify interactors specifically deregulated upon activating mutation. Additionally, the HEK293 cell model (Human Embryonic Kidney) and BEAS2B cell model (non-cancerous lung cell line) showed a high overlapping degree of the interactors identified, suggesting that the strategy used is relevant to identify interactors specific to mutations. This thesis enabled to identify several interactors specific to the mutant KRAS, EGFR, BRAF, NRAS and EML4-ALk fusion. Thirteen interactors specific to the mutated-KRAS have been functionally validated in lung-cancer cell lines models. Finally, using BioID data I have been able to propose a model of EGFR resistance to targeted therapies. This model shows that CBL and IGH2R might be the EGFR partners responsible for therapeutic escape.Altogether, this thesis propose new perspective to determine resistance mechanisms and to identify new therapeutic targets for KRAS-mutated patients.

La peau est un excellent modèle d’étude du vieillissement général. En plus de facteurs environnementaux, les facteurs génétiques jouent un rôle majeur dans le vieillissement cutané. Dans le cadre de ma thèse, j’ai eu accès à une cohorte exceptionnelle de 502 femmes caucasiennes très bien caractérisées sur le plan cutané, pour effectuer deux études d’association « génome-entier ». La première étude a montré le rôle joué par le système immunitaire, et en particulier le gène HLA‑C, dans la sévérité des lentigines du visage. La seconde a mis en évidence une association entre le gène H2AFY2 et la sévérité de l’affaissement de la paupière supérieure. La recherche de voies de signalisation biologiques associées à différents indicateurs du vieillissement cutané a souligné le rôle de la mélanogénèse et des mécanismes de réparation de l’ADN.Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives dans la compréhension des mécanismes inhérents au vieillissement cutané et général. / The skin is an excellent model to study general ageing. In addition to environmental factors, genetic factors play a key role in skin ageing mechanisms. During my PhD, I have had access to a unique cohort of 502 Caucasian women very-well characterized regarding their facial features to perform two genome-wide association studies. The first one pointed to the role of the immune system, and especially the HLA‑C gene, in the severity of facial lentigines. The second one identified an association between the H2AFY2 gene and the severity of superior eyelid drooping. I also looked for associations between biological pathways and several skin ageing indicators which underlined the role of the melanogenesis and several mechanisms of DNA repair.Overall, these results lead to new insights in the understanding of the molecular mechanisms underlying skin and global ageing.

L'angiogenèse est un processus physiologique qui correspond à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir d'un réseau vasculaire préexistant et est régulée par l'équilibre entre les facteurs endogènes pro- et anti-angiogéniques. La rupture de cet équilibre est associée à de nombreuses pathologies dont l'ischémie, la rétinopathie ou encore la progression tumorale. Etant donné que les cellules endothéliales, principal type cellulaire composant les vaisseaux sanguins expriment les récepteurs à activité tyrosine kinase du facteur anticoagulant, la protéine S, Tyro3, Axl et Mer et produisent de la protéine S, l'objectif de ce travail est d'étudier le rôle, de la protéine S dans l'angiogenèse. Dans la première partie de ce travail, nous avons montré in vivo que la protéine S inhibe l'angiogenèse induite par les facteurs pro-angiogéniques (VEGFA et FGF2). Parallèlement, nous avons observé in vitro une inhibition par la protéine S de la prolifération et de la migration des cellules endothéliales induites par le VEGFA. Cet effet est corrélé à l'inhibition par la protéine S des voies de signalisation des MAP-Kinases et de la phosphatidylinositol 3-kinase (PIK3) induites par le VEGFA. Nous avons ensuite mis en évidence, par l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques et de petits ARNs interférents, que la protéine S inhibe, via l'activation du récepteur Mer et le recrutement de la protéine phosphatase SHP2, l'activation du VEGFR2, le principal récepteur du VEGFA. Dans la deuxième partie, nous avons montré de manière intéressante que le rôle joué par la protéine S lors de l'angiogenèse est plus complexe, puisqu'elle est capable d'activer directement la voie de signalisatio / Angiogenesis is a physiological process that leads to new blood vessel formation and is regulated by a balance between pro-and anti-angiogenic endogenous factors. Disruption of this balance leads to many pathologies such as ischemia, retinopathies or tumor growth. Because endothelial cells, the main cellular type composing blood vessels, produce the anticoagulant factor, protein S and express its tyrosine kinase receptors Tyro3, Axl and Mer, we investigated the implication of protein S in angiogenesis. In the first part of this work, we demonstrated that protein S inhibits pro-angiogenic factors (VEGFA and FGF2)-induced angiogenesis in vivo. We also observed an inhibition of VEGFA-dependent endothelial cell proliferation and migration induced by protein S. These effects were correlated with protein S induced inhibition of VEGFA-dependent MAP-Kinases (Erk1, Erk2) and phosphatidylinositol 3-kinase (PIK3) activation. Furthermore, we demonstrated, using pharmacological inhibitors and small interfering RNAs, that protein S inhibits VEGFA-induced VEGFR-2 activation through Mer receptor activation and SHP2 protein phosphatase recruitment. In the second part, we demonstrated that, protein S on its own, is able to induce MAP-kinases pathway activation and endothelial cells proliferation. These cellular and molecular effects involved Mer receptor and SHP2 protein activation and required protein kinase SRC recruitment. Our results describe for the first time that protein S is an endogenous regulator for angiogenesis both in vitro and in vivo and may form the framework for the use of protein S as part of an anti-angiogenic treatment.

A l’origine de l’hématopoïèse se trouve les cellules souches hématopoïétiques (CSH). Elles constituent un pool de cellules rares présentes dans la moelle osseuse aux niveaux de zones particulières de l’os appelées niche. Les cellules de la niche produisent des cytokines, telles que la thrombopoïétine (TPO), qui régulent les CSH en contrôlant leur quiescence et leur auto-renouvellement. Peu de choses sont connues sur les mécanismes mis en place par la CSH et son environnement pour faire face aux dommages de l’ADN, notamment induits lors de radio- ou chimio-thérapies. Durant cette étude, nous avons mis en évidence un nouveau rôle de la TPO et de son récepteur Mpl dans la réparation de l’ADN des CSH en réponse à des stress génotoxiques. Les CSH déficientes ou haplo-insuffisantes pour Mpl, ou les CSH sauvages et cultivées en absence de TPO, présentent un défaut de réparation et une instabilité génomique. En réponse à l’irradiation, la TPO potentialise l’activation de la voie NF-kB qui permet l’induction du gène précoce Iex-1. La TPO est également l’activateur majeur de la voie ERK dans les CSH. IEX-1 et pERK forment un complexe tripartite avec DNA-PK, une protéine clé de la voie Non Homologous End Joining (NHEJ). La DNA-PK est fortement activée par la TPO, ce qui augmente la fidélité et l’efficacité de la voie NHEJ et permet d’améliorer l’intégrité génomique des CSH. Par ailleurs, nous montrons qu’une simple injection de TPO ou de son agoniste Romiplostim, avant irradiation ou injection de doxorubicine, limite la mutagénèse des CSH et leur perte de fonction associée. Cet effet est spécifique de la TPO, d’autres cytokines comme le SCF et le Flt3-L, n’ont aucun effet sur la réparation. Ces résultats montrent que la TPO contrôle directement les voies de signalisation aboutissant à la réparation de l’ADN des CSH. Ils ouvrent des perspectives nouvelles pour l’utilisation des agonistes de la TPO comme adjuvant protecteur avant radio- ou chimiothérapie pour minimiser les risques de développement de leucémies aigües myéloïdes secondaires. L’expression de Mpl étant haploinsuffisante pour la fonction de réparation de l’ADN, ces résultats suggèrent que Mpl pourrait être tumeur suppresseur en réponse aux traitements chimio-ou radio-thérapeutiques. / Hematopoietic stem cells (HSC) are at the beginning of hematopoeisis. They constitute a pool of rare cells in bone marrow in specifics zones of bones called niche. Niche’s cells produce cytokines, like thrombopoietin (TPO). These cytokines regulates HSC by controlling quiescence and self-renewal. Few are known about mechanism used by HSC and its environment to prevent DNA damage, and especially those induced by radio- or chemo-therapies. In this study, we discover a new role of TPO and its receptor Mpl in DNA repair of HSC in response to genotoxic stress. HSC without Mpl, or wild type HSC cultured without TPO, show an important defect of DNA repair and genomic instability. In response to irradiation, TPO increases activation of NF-KB pathway that increases induction of IEX-1 early gene. TPO is also the major activator of ERK pathway in HSC. IEX-1 and p-ERK can form a tripartite complex with DNA-PK, a key protein of Non homologous end joining pathway (NHEJ). DNA-PK is fully activated by TPO which increase fidelity and efficacy of NHEJ pathway leading to better genomic integrity of HSC. We also show in this study that a simple injection of TPO or Romiplostim before irradiation or Doxorubicin injection, decrease mutagenesis of HSC and their loss of function associated. This effect of TPO is specific of TPO because other cytokines like SCF or Flt3-L have no effect on the DNA repair. These results show that TPO can directly control signaling pathway leading to repair of HSC’s DNA and open new avenues for TPO agonist using. They can be used to protect HSC before radio- or chemo-therapies and to minimize development of secondary acute myeloid leukemia. Expression of Mpl being haplo-insufficient for DNA repair functions, this result suggests that Mpl could be a tumor suppressor in response to radio- or chemo-therapies treatments.