La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une pathologie de la cellule souche hématopoïétique caractérisée par la présence de la translocation chromosomique t(9 :22) conduisant à l’expression de la kinase BCR-ABL responsable de la maladie. Un inhibiteur de l’activité de BCR-ABL a été identifié, l’Imatinib (IM). L’IM a révolutionné la prise en charge de la LMC en bloquant sélectivement la croissance des cellules tumorales, conduisant à la rémission des patients. Cependant, une majorité d’entre eux subissent des récidives en cas d’arrêt du traitement, et environ 15% développent des résistances à l’inhibiteur. BCR-ABL active de multiples voies de signalisation parmi lesquelles figurent les facteurs de signalisation STAT5. Nous avons analysé les rôles respectives des deux facteurs STAT5, STAT5A et STAT5B, dans les cellules souches hématopoïétiques normales et de LMC, par une approche d’ARN interférence. Nos observations indiquent que l’activité des deux facteurs STAT5 permet la survie et le maintien à long terme des cellules souches de patients LMC au diagnostic. Nous avons de plus montré qu’indépendamment de son activité transcriptionnelle, STAT5A aide les cellules normales et leucémiques à limiter leur stress oxydatif. Nous avons aussi pu observer que les cellules de patients présentant des résistances secondaires à l’IM, sans mutations ni surexpression de BCR-ABL, manifestent une dépendance caractéristique vis-à-vis de l’activité STAT5A. Pour mieux comprendre les mécanismes d’action des facteurs STAT5, nous avons recherché les gènes cibles de STAT5 par une approche transcriptomique et avons identifié le récepteur tyrosine kinase Axl dont l’expression est augmentée par STAT5A. L’inhibition d’Axl dans les cellules LMC sensibles à l’IM n’a aucun effet sur leur survie, alors qu’elle diminue fortement la survie des cellules LMC résistantes à l’IM. De plus, Axl contrôle le niveau des réactifs oxygénés dans les cellules de patients LMC. Nous avons analysé l’expression d’un des activateurs d’Axl, le ligand Gas6, et avons observé que son expression diminue fortement dans les cellules primaires de LMC par rapport aux contrôles sains. Ces résultats suggèrent que le tandem Gas6/Axl pourrait participer au processus leucémique de la LMC à différents niveaux. De manière globale, nos travaux montrent que les facteurs STAT5 favorisent le maintien des cellules souches de LMC, leur résistance au stress oxydatif et aux traitements thérapeutiques Ces deux dernières activités sont au moins en partie liées à l’activité d’une nouvelle cible de STAT5, le récepteur Axl, par ailleurs déjà impliqué dans la résistance aux traitements thérapeutiques. Les facteurs STAT5 représentent donc des nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans l’éradication de la maladie résiduelle. / The Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a clonal hematopoietic stem cell disorder characterized by the t(9:22) genetic translocation and expression of the oncogenic tyrosine kinase BCR-ABL . A first BCR-ABL Tyrosine Kinase Inhibitor (TKI), Imatinib (IM), was identified that inhibits proliferation of BCR-ABL expressing hematopoietic cells and leads to disease remission. However, BCR-ABL mRNA remains detectable in the most immature HSCs and discontinuation of IM results in clinical relapse. STAT5 factors play a crucial role in the CML pathogenesis of human primary CML cells. However, the contribution of the two related STAT5 genes, STAT5A and STAT5B, was unknown. We used an RNAinterference based strategy to analyze STAT5A or STAT5B roles in normal and CML cells. We showed that STAT5A/5B double knock-down (KD) triggers normal and CML cell apoptosis and suppressed long-term clonogenic potential of immature hematopoietic stem and progenitor cells known to be resistant to TKI treatment and responsible for residual disease. STAT5A loss alone was ineffective at impairing growth of both normal and CML cells under standard conditions. In contrast, STAT5A loss was sufficient to enhance Reactive Oxygen Species (ROS) which correlated with enhanced DNA damages in both normal and leukemic cells. We reported that STAT5A regulates oxidative stress through unconventional mechanisms, in a non-transcriptional-dependent manner. We further showed that, in contrast to primary cells at diagnosis, IM-resistant cells exhibited enhanced STAT5A dependence, by being sensitive to STAT5A single KD. To investigate the molecular basis of STAT5A activity in TKI-resistance and oxidative stress, we performed a transcriptomic analysis of STAT5 regulated genes. We identified Axl, which encodes a receptor tyrosine kinase, recently shown to be crucial in TKI-resistant CML cells. Specifically, Axl expression is enhanced by STAT5A. We investigated the role of Axl and we found that Axl KD did not affect survival of IM-sensitive CML cells. However, Axl KD decreased survival of IM-resistant cells, miming the activity of STAT5A. Moreover, Axl loss increased ROS levels in CML cells, promoting STAT5A anti-oxidant activity. We further sought to determine the expression of the Axl ligand, Gas6. Gas6 expression is dramatically reduced in CML primary cells at diagnosis compared to healthy cells. The strong and consistent down-regulation of Gas6 in CML cells suggested a possible role in the pathophysiology. Collectively, our findings highlight the pro-survival, stress protection and drug resistance roles of STAT5 factors, providing new understanding for medical treatment of CML patients. We suggest that STAT5A acts in synergy with Axl to face exogenous insults and propose a new mechanism by which CML cells increase their proliferation and reduce their motility by down-regulating Gas6 expression.

L'ozone troposphérique est un polluant secondaire majeur. Outre son rôle de gaz à effet de serre direct, l'ozone fait partie des polluants atmosphériques les plus toxiques et la pollution qu’elle engendre, affecte aussi bien la santé humaine que la productivité végétale. Les travaux présentés dans cette thèse porte sur l’étude du rôle des canaux ioniques de la membrane plasmique en réponse à une forte exposition à l’ozone ainsi que leurs interactions avec les évènements de signalisation mis en place lors du processus de PCD induit par ce stress sur des cellules en culture d’A. thaliana. Nous avons montré que cette mort cellulaire génétiquement contrôlée est caractérisée par une plasmolyse semblable à « l’Apoptosis Volume Decrease » (AVD) décrit en animal. Ce processus est promu par des cascades de signalisation où, dans un premier temps, les canaux anioniques sont très précocement activés potentiellement par l’acide oxalique issu de la dégradation de l’ascorbate par l’O3. Les données suggèrent une interconnexion entre les courants anioniques, l’influx cacique et une génération de ROS dépendante de la NADPH oxydase. Dans un deuxième temps, des canaux K+ rectifiants sortants sont activés de manière retardée et participent à la PCD. Cette activation retardée pourrait être due à une régulation post-transcriptionnelle des canaux GORK induite par l’O2•-. Enfin, nous avons également mis en évidence des activités enzymatiques de type caspase, au niveau cytoplasmique et nucléaire. Ces activités enzymatiques semblent être corrélées à la baisse de la teneur vacuolaire en ions K+, mais des données complémentaires sont nécessaires afin de comprendre les mécanismes sous-jacents. Ce travail souligne l’importance et la complexité de la régulation des canaux anioniques et potassiques et ce, dans les processus de signalisation et la mécanistique menant à la mort cellulaire programmée chez les plantes. / Tropospheric ozone is a major secondary pollutant. In addition to its role in greenhouse effect gas, ozone is one of the most toxic air pollutants, and its pollution affects both human health and crop productivity. The work presented in this thesis concerns the role of ion channels in the plasma membrane in response to acute exposure to ozone and their interactions with signaling events leading to O3-induced PCD in A. Thaliana cultured cells. We have shown that cell death was genetically controlled and characterized by cell shrinkage similar to the mechanism of "Apoptosis Volume Decrease" (AVD) described in animal. This process is initially promoted by an early activation of a plasma membrane anion channel, amongst which ascorbate-derived oxalic acid production potentially participates to this activation. Our data further suggests an interplay between anion channel with well known plant responses to O3, Ca2+ influx and NADPH-oxidase generating reactive oxygen species (ROS) in mediating the oxidative cell death. In a second step, K+ outwards rectifying currents are activated in a delayed manner and participate to PCD. This delayed activation could be due to O2•- post-transcriptional regulation of GORK channels. Finally, we also demonstrated caspase-like activities in the cytoplasm and the nucleus. These enzyme activities appear to be correlated with the decrease in vacuolar K+ ion content, but require additional data to understand the underlying mechanisms. This work highlights the importance and the complexity of ion channels regulation in the signaling pathway and the mechanistic processes leading to programmed cell death in plants.

La spleen tyrosine kinase (Syk) est une protéine kinase cytoplasmique qui intervient dans la signalisation immunitaire. Notre équipe a montré pour la première fois que Syk est exprimée aussi dans les cellules épithéliales mammaires et que son expression est perdue au cours de l’acquisition d’un phénotype invasif/métastatique. Syk agit comme un suppresseur de tumeurs et de métastases dans des modèles de xénogreffes de cancer du sein. Ces observations ont été étayées par des études cliniques qui montrent que la perte d’expression de Syk correspond à un risque accru de développement de métastases (facteur de mauvais pronostic) dans le cancer du sein et d’autres carcinomes. Par une approche de phospho-protéomique quantitative (SILAC), nous avons pu identifier de nouveaux substrats potentiels de Syk dans les cellules de cancer du sein. De façon intéressante, ressortent de nombreuses protéines impliquées dans l'adhésion intercellulaire (E-cadhérine/caténines) et la polarisation épithéliale (eg ZO3, occludine, claudine-3). Ces protéines, qui se localisent aux jonctions d'adhésion et d'occlusion, sont connues comme composants plate-formes de signalisation et exercent souvent une fonction de suppresseur de tumeur.Dans ce travail de thèse je me suis focalisé principalement sur :(i) le rôle de l’activité kinase de Syk dans la régulation du complexe E-cadhérine/caténines et(ii) les conséquences de l’invalidation conditionnelle de Syk dans la glande mammaire murine (développement mammaire et tumorigenèse).Par une approche de phosphorylation in vitro, nous avons montré que la E-cadhérine et différentes caténines sont des substrats directs de Syk. Les résidus tyrosines phosphorylés dans ces protéines ont été identifiés par spectrométrie de masse et les anticorps phospho-spécifiques correspondants ont été générés. En immunofluorescence, Syk endogène colocalise avec la E-Cadhérine au niveau des jonctions adhérentes et la surexpression de Syk stimule la phosphorylation de la E cadhérine et différentes caténines au niveau des jonctions intercellulaires. Des expériences d’immunoprécipitation montrent que les protéines E-cadhérine et caténines phosphorylées restent associées dans un complexe au niveau des jonctions adhérentes. L’extinction de Syk par shRNA dans une lignée de cancer de sein inhibe partiellement la ré-agrégation intercellulaire (2D/3D) et augmente l’invasion et la migration cellulaires et la croissance en 3D dans le Matrigel. Inversement, la surexpression de Syk inhibe la migration et l’invasion et favorise l'adhérence intercellulaire. Syk semble par la phosphorylation du complexe E-cadhérine/caténines consolider leurs interactions renforçant ainsi les jonctions intercellulaires et l’intégrité de l’épithélium, ce qui pourrait révéler un mécanisme majeur responsable de son activité anti-invasive. Leurs mécanismes moléculaires ont été explorés.Ces modèles cellulaires in vitro ont ensuite été étendus vers un modèle intégré murin. L'invalidation homozygote du gène SYK étant létale, nous avons développé un modèle d’invalidation conditionnelle de Syk dans la glande mammaire (Syk-flox:WAP-Cre). Ce modèle nous a permis tout d’abord d’étudier le rôle de Syk dans le développement et la physiologie de la glande mammaire au cours de la lactation et de l’involution, les glandes Syk-négatives montrant des défauts de développement. Il permet à plus long terme également d’évaluer l'implication de Syk dans la formation et la progression du cancer du sein chez des souris cKO Syk, après croisement ou non avec des souris transgéniques exprimant l’oncogène MMTV-Neu/Her2.Déterminer si Syk est un bona fide suppresseur de tumeurs est crucial car un inhibiteur de Syk est en cours d’étude clinique pour le traitement de l’arthrite rhumatoïde. L’identification des voies de signalisation gouvernées par Syk pourrait ultérieurement déboucher sur le développement de nouvelles thérapies ciblant ces protéines et bloquant l'évolution cancéreuse. / The spleen tyrosine kinase (Syk) is a cytoplasmic protein kinase involved in immune-response signaling. Our team showed for the first time that Syk is also expressed in mammary epithelial cells and that its expression is lost during acquisition of an invasive/metastatic phenotype. Syk acts as a tumor and metastasis suppressor in breast cancer xenograft models. Clinical studies corroborated that loss of Syk expression is correlated with a decreased survival and an increased risk of metastasis development (poor prognosis) in breast cancer and other carcinomas. Using a quantitative phospho-proteomic SILAC approach in breast cancer cells, our group identified new potential Syk substrates. Interestingly, many proteins are involved in intercellular adhesion (E-cadherin/catenin) and epithelial polarization (eg ZO3, occludin, claudin-3). These proteins are localized at the adherens and tight junctions and are known as signaling platforms and components often presenting a tumor suppressor function.In this thesis I mainly focused on:(i) the role of the Syk kinase activity in the regulation of the E-cadherin/catenin complex and(ii) the consequences of the conditional Syk knockout in the mouse mammary gland on breast development and tumorigenesis.Using in vitro kinase assays, we demonstrated that E-cadherin (E-Cdh) and different catenins are direct Syk substrates. The phosphorylated tyrosine residues were identified by mass spectrometry and corresponding phospho-specific antibodies were generated. By immunofluorescence, we observed that endogenous Syk and E-Cdh colocalize at adherens junctions (AJ) and that Syk overexpression stimulates Syk-dependent phosphorylation of E-cadherin and different catenins at AJ. Immunoprecipitation experiments indicate phosphorylated E-cadherin and catenin proteins are associated in a complex. Using functional tests, Syk knockdown by shRNA in breast cancer cells partially inhibited intercellular re-aggregation (2D/3D) and increased cell invasion, migration and 3D-growth in Matrigel. Conversely, Syk overexpression inhibited migration and invasion and promoted intercellular adhesion. Thus, Syk seems to strengthen the intercellular junctions and the integrity of the epithelium via the phosphorylation of the E-cadherin/catenin complex of which its molecular mechanisms were explored. This could be a major mechanism responsible for its anti-invasive activity.These in vitro observations were subsequently extended to an integrated mouse model. As the homozygous SYK gene knockout is lethal; we developed a conditional Syk deletion model in the murine mammary gland (Syk-flox:WAP-Cre).This model allowed us to study the role of Syk in the development and physiology of the mammary gland during lactation and involution, the Syk-negative glands showing developmental defects. On a long-term basis, it also allows to assess the involvement of Syk in the formation and progression of breast cancer in aging cKO Syk mice, bred or not with transgenic mice expressing the MMTV-Neu / Her2 oncogene.Whether Syk is a bona fide tumor suppressor is a crucial issue as Syk inhibitors are being evaluated in clinical studies for the treatment of rheumatoid arthritis. Identification of the signaling pathways governed by Syk could lead to the development of new therapies targeting these proteins and blocking tumor development and progression.

Les lymphomes B non-Hodgkiniens sont caractérisés par des altérations génétiques à l’origine du syndrôme néoplasique. Dans ce travail, nous démontrons que l’association dans les microdomaines rafts de la membrane de Lyn, une kinase de la famille Src, avec l’adaptateur PAG, participe également au processus néoplasique. Dans les cellules B non-néoplasiques, Lyn et PAG sont des molécules impliquées dans la signalisation du récepteur des cellules B en réponse à une stimulation antigénique. Dans ce contexte, l’adaptateur PAG est décrit comme un inhibiteur de l’activité kinase de Lyn. Au contraire, dans les rafts des lymphomes B non-Hodgkiniens, nous avons mis en évidence que PAG retient la kinase Lyn sous une conformation active. Au sein des rafts, la kinase Lyn semble responsable de l’activation oncogénique de la voie de signalisation PI3K/Akt et de la voie de signalisation STAT3. L’inhibition pharmacologique et génétique de la kinase Lyn induit l’apoptose et l’inhibition de la prolifération de lignées cellulaires dérivées de lymphomes B non-Hodgkiniens. Ce résultat est révélateur d’une dépendance des lignées cellulaires à l’association oncogénique de Lyn avec PAG. Le ciblage thérapeutique du complexe Lyn/PAG constitue donc une opportunité pour le traitement des lymphomes B non-Hodgkiniens. / Non Hodgkin B lymphomas are caracterized by genetic alerations that condition their neoplastic development. In this work, we demonstrate that an association between the Src family kinase Lyn and the PAG adaptor in rafts is also involved in the neoplastic phenotype. In normal B cells, Lyn and PAG contribute to BCR signalling, where PAG functions as a Lyn kinase inihibitor. In contrast, we demonstrate that Lyn remains active when associated with PAG in B non Hodgkin lymphomas rafts. In those rafts, the Lyn kinase participates in the oncogenic activation of the PI3K/Akt and STAT3 signaling pathways. Pharmacologic and genetic inhibition of the Lyn kinase leads to apoptosis induction and proliferation inhibition of B non Hodgkin lymphoma cell lines. Our results reveal the dependence (or addiction) of these cell lines to the Lyn and PAG complex in rafts. The Lyn/PAG complex therefore constitutes an appropriate therapeutic target in certain non Hodgkin B lymphoma treatment.

Chez les mammifères, le glutamate est un neuromédiateur bien connu au niveau du système nerveux central et plus récemment un rôle immunomodulateur lui a été reconnu. Le glutamate est le ligand de récepteurs ionotopiques (iGluRs) qui sont des récepteurs-canaux perméables à divers cations dont le calcium (non-selective cation channels, NSCC). Chez Arabidopsis thaliana, une famille de 20 gènes de iGluRs homologues des iGluRs de mammifères a été identifiée et leur implication dans divers processus biologiques est suggérée. Dans ce travail où nous utilisons des suspensions de cellules de tabac (Nicotiana tabacum var Xanthi), divers arguments suggèrent que ces iGluR sont fonctionnels dans le tabac : influx de calcium et élévation rapide et transitoire de la concentration en calcium cytosolic libre en réponse à l’addition de glutamate, inhibition de ces effets par 4 antagonistes de iGluRs animaux (compétitifs ou non compétitifs), désensibilisation, et pH dépendance des effets. Pour la première fois chez les plantes nous montrons que le glutamate induit la production de NO très vraisemblablement via l’activation de iGluRs. De plus, nous démontrons que ce(s) iGluRs sont impliqués dans le mode d’action, via les flux de calcium, de la cryptogéine une protéine de 10 kDa de Phytophthora cryptogea, éliciteur des réactions de défense chez le tabac. Néanmoins, à ce niveau, les iGluRs ne sont pas impliqués dans la plupart des événements calcium-dépendants induits par la cryptogéine dont l’activation des MAPKs et de canaux anioniques, la production de H2O2 (activation de la NADPH-oxydase) et la réponse hypersensible. En revanche, ils sont tout ou partiellement responsables de la production de NO décrite pour la première fois par le passé en réponse à la cryptogéine. Ces résultats suggèrent que différents types de canaux calciques activés par divers médiateurs, génèrent, via le calcium, des messages spécifiques décodés par des protéines associées à chacun de ces types de canaux et impliquées dans des réponses biologiques différentes. Dans le mode d’action de la cryptogéine, nous démontrons que l’activation des iGluRs est possible grâce à l’exocytose de glutamate dans l’apoplaste, induite par la cryptogéine. Ainsi, ce travail est la première démonstration du rôle de iGluRs potentiels dans la défense chez les plantes et de leur implication dans la production de NO. Nos résultats sont un argument supplémentaire à la conservation des mécanismes de la défense dans le monde vivant et posent le problème du rôle du glutamate dans la signalisation chez les plantes. / Glutamate is recognized as the primary excitatory neurotransmitter in the mammalian central nervous system (CNS) but recent studies have shown that glutamate has an important additional immunomodulator role. Glutamate is the ligand of ionotropic glutamate receptors (iGluRs), which are non-selective cation channels (NSCC), permeable to calcium. In plants, animal iGluR homologs were found that were involved in many developmental processes. Here we demonstrate the involvement of putative iGluRs in calcium signalling in response to cryptogein which is a 10 kDa protein secreted by the oomycete Phytophthora cryptogea and is an elicitor of defence in tobacco. Using transformed tobacco cell suspensions expressing aequorin in the cytosol or in the nucleus, our results have shown that glutamate induces a strong and transient [Ca2+]cyt elevation without [Ca2+]nuc changes. Glutamate-induced [Ca2+]cyt elevation was a result of calcium influx from the extracellular medium and was inhibited by different GluR inhibitors. This data suggest the presence of functional calcium channels of GluRs-type in tobacco. Nevertheless, glutamate does not induce some of the calcium-dependent characteristic events of the defence pathways, which are H2O2 production, MAPK activation and hypersensitive response, but promoted NO production. Further, Ca2+ influx,[Ca2+]cyt elevation and NO production induced by cryptogein were shown to be partially inhibited by the glutamate receptor inhibitors, suggesting that cryptogein treatment could activate a calcium channel of the GluR-type leading to plant defense signalling through NO production. We have also demonstrated that cryptogein induces an efflux of glutamate in the apoplast by the process of exocytosis thus activating the GluRs in tobacco. This is the first demonstration for a potential GluR(s) involvement in plant defense signalling, furthermore by mechanisms that showed homology with glutamate effect on neuronal cells.

Ce travail de thèse avait pour objectif d’étudier la régulation de l’expression des gènes du métabolisme intermédiaire par les acides aminés alimentaires dans le foie de truite arc-en-ciel. Ces études ont permis de caractériser, pour la première fois dans le foie de truite, les principaux acteurs de la voie de signalisation Akt/TOR et leurs régulations. Nos résultats in vitro montrent qu’un mélange d’acides aminés, seul ou avec l’insuline, est capable de réguler l’expression de nombreux gènes impliqués dans la lipogenèse, la néoglucogenèse et la glycolyse. Les régulations observées en présence conjointe d’un mélange d’acides aminés et d’insuline semblent être, pour la plupart, dépendantes de la voie TOR. Par la suite, nous avons étudié l’effet de certains acides aminés comme la leucine (connue pour son effet « signal ») ainsi que la lysine et la méthionine (souvent ajoutées dans les aliments piscicoles riches en matières premières végétales afin d’atteindre l’équilibre en acides aminés). En présence d’insuline, la leucine, contrairement à la lysine et la méthionine, active la voie de signalisation TOR et régule l’expression de certains gènes (néoglucogenèse et lipogenèse) de façon similaire à un mélange d’acides aminés. Parallèlement, in vivo, nous avons étudié la régulation de l’expression des gènes du métabolisme intermédiaire lors d’un remplacement partiel ou total des huiles et farines de poisson par des produits végétaux dans l’aliment piscicole. Cette expérimentation a montré que, ni les voies de signalisation Akt/TOR, ni l’expression des gènes cibles ne sont affectés par ces nouveaux aliments. En conclusion, ces travaux ont montré que les acides aminés semblent jouer un rôle important dans la régulation de l’expression des gènes hépatiques du métabolisme intermédiaire chez la truite arc-en-ciel. / The objective of my PhD was to characterize the regulation of the intermediary metabolism related gene expression by dietary amino acids in the liver of rainbow trout. This work allowed us to characterize, for the first time in the liver of trout, the main proteins of the Akt/TOR signalling pathway and their regulations. In vitro results showed that a mixture of amino acids, in the presence or absence of insulin, is able to regulate the expression of numerous genes involved in lipolysis, gluconeogenesis and glycolysis. Such regulations induced by an amino acid mix together with insulin appear to be, at least partly, TOR-dependent. Afterwards, I studied the effect of specific amino acids known to be a signalling molecule (leucine) or having potential application as supplements to reach essential amino acid balance in plant ingredients-rich diet (lysine and methionine). In the presence of insulin, leucine, in contrast to lysine and methionine, is able to activate the TOR signalling pathway and regulate the expression of several genes involved in gluconeogenesis and lipogenesis in the same way as a mixture of amino acids. Furthermore, we studied in vivo, the effect of partial or total replacement of fish oil and fish meal by plant products in fish feed on .the regulation of intermediary metabolism related gene expression. This study showed that neither Akt/TOR signalling pathway nor the expression of the target genes were affected by such diets. In conclusion, these studies showed that amino acids seem to play an important role in the hepatic regulation of intermediary metabolism gene expression in the rainbow trout.

Les Glioblastomes (GBM, grade IV selon l’OMS) sont les tumeurs cérébrales primaires les plus agressives et sont caractérisées par une néovascularisation importante associée à l’hypoxie et à la nécrose. L’origine cellulaire des GBM est controversée, mais des sous-populations de cellules multipotentes ont été identifiées au sein des tumeurs, et seraient responsables de la radio/chimiorésistance des GBM. Ces cellules souches de glioblastome (GSC) contrôlent activement la vascularisation tumorale par leur interaction étroite avec les cellules vasculaires composant les niches tumorales. La voie Notch est une signalisation canonique essentielle au développement et à l’homéostasie du système nerveux central et son réseau vasculaire associé. Dans le contexte des GBM, cette cascade serait nécessaire à la gliomagénèse, par le maintien du réservoir de GSC au sein de la niche périvasculaire. Cependant, le mode d’action moléculaire de Notch dans les GBM reste encore à démontrer, du fait de résultats divergents observés dans plusieurs études. Dans la première partie de mon travail de thèse, j’ai contribué à l’exploration de la signalisation Notch1 dans des cultures de GSC établies et caractérisées au sein du laboratoire. Le niveau basal d’activation de Notch1 étant faible dans nos GSC, l’approche a été d’activer constitutivement cet axe par transduction lentivirale. Suite à cette activation forcée, les GSC subissent un changement phénotypique majeur et se différencient en cellules périvasculaires ou cellules « pericyte-like ». Cette transition neurovasculaire des GSC promeut la vascularisation active des tumeurs par la normalisation du réseau vasculaire in vivo. Par la suite, j’ai posé la question des mécanismes moléculaires en aval de Notch1 ; par l’étude des facteurs de transcription TAL1 et SLUG, deux candidats potentiels au contrôle de cette plasticité neurovasculaire. Dans ce but, j’ai examiné leur contribution au phénotype vasculaire des GSC dans un modèle in vitro de la niche périvasculaire ; et in vivo par l’analyse d’échantillons humains de GBM. Enfin, j’ai également observé que l’activation de Notch1 module l’activité de la machinerie du protéasome, ce qui pourrait contribuer activement à la transition moléculaire observée dans les GSC. Ces travaux mettent en avant la plasticité phénotypique des GSC: une meilleure compréhension de ces processus pourrait mener à la conception de thérapies ciblant efficacement les GSC et leur vascularisation associée. / Glioblastomas (GBM, WHO grade IV) are highly aggressive brain tumors in which extensive vascularization is associated with hypoxia and necrosis. GBM cell of origin is controversial; however multipotent stem-like subpopulations have been identified within tumors, and could account for GBM radio/chemoresistance. These glioblastoma stem-like cells (GSC) actively promote tumoral vascularization processes by closely interacting with vascular cells composing tumoral niches. The Notch cascade is a canonical signaling pathway required during developmental stages and adult homeostasis of the central nervous system and the associated vascular network. In the context of GBM, this molecular axis could induce gliomagenesis by promoting GSC maintenance in the perivascular niche. However, Notch-induced molecular mechanisms controlling GBM progression still remain elusive, due to divergent results observed in numerous reports. During the first part of my thesis work, I contributed to the assessment of Notch1 functions in GSC cultures isolated and characterized in our lab. Given a low Notch1 basal activation status in our GSCs, our approach was to constitutively activate this axis via lentiviral transduction. Following this forced activation, GSCs undergo drastic phenotypic changes and differenciate into perivascular-like or “pericyte-like” cells. This neurovascular transition of GSCs induces active tumoral vascularization by promoting normalization of the vascular network in vivo. Consequently, I questioned the molecular mechanisms downstream of Notch1 by focusing on TAL1 and SLUG transcription factors, two potential candidates controlling this neurovascular plasticity. For this purpose, I examined their contribution to the GSC vascular-like phenotype in an in vitro model of the perivascular niche; and in vivo by analyzing human GBM samples. Finally, I also observed that Notch1 activation modulates the activity of the proteasomal machinery, which could actively contribute to the molecular transition occurring in GSCs. This work highlights GSC phenotypic plasticity: a better understanding of these processes could lead to the design of therapies efficiently targeting GSCs and their associated vasculature.

Les "Bone Morphogenetic Proteins" (BMPs) jouent un rôle clef dans la régulation de cellules précurseurs du muscle prénatal et de cellules souches musculaires adultes dénommées "cellules satellites". Les objectifs principaux de ma thèse étaient d'une part de déterminer si la signalisation BMP joue un rôle pendant la phase de croissance du muscle postnatale/juvénile dépendante des cellules satellites, et d'autre part d'investiguer si cette voie est impliquée dans la maintenance de la masse musculaire squelettique adulte. J'ai trouvé que les composants de cette voie de signalisation sont exprimés dans les cellules satellites de souris néonatales, juvéniles et adultes. Par ailleurs, j'ai utilisé des lignées de souris transgéniques pour surexprimer, de manière conditionnelle, l'inhibiteur Smad6 de la cascade de signalisation BMP dans les cellules satellites ou dans le muscle squelettique. J'ai pu ainsi démontrer que cette signalisation est requise pour une prolifération correcte des cellules satellites et pour leur différentiation en myonuclei, assurant que les fibres musculaires en croissance atteignent une taille finale normale. Par ailleurs, mes travaux révèlent que le nombre final de cellules satellites est établis pendant la phase de croissance postnatale/juvénile et que celle-ci dépend de la cascade de signalisation BMP. Enfin, je fournis des preuves montrant que la signalisation BMP est un puissant signal hypertrophique dans le muscle squelettique adulte et que sa présence est indispensable pour le maintien du tissu musculaire. En résumé, mes résultats de recherche démontrent que les BMPs sont des facteurs de croissance essentiels pour le muscle squelettique postnatal. / Bone Morphogenetic Proteins (BMPs), a subfamily of TGF-β growth factors, have been shown to be key signals that regulate embryonic and fetal muscle precursors during prenatal myogenesis, as well as the stem cells of adult muscle, termed ‘satellite cells’, when activated during muscle regeneration. The main aims of my thesis were to elucidate whether BMP signaling plays a role during postnatal/juvenile satellite cell-dependent muscle growth as well as for maintenance of adult muscle mass. I found that components of BMP signaling pathway are expressed in muscle satellite cells of neonatal, juvenile and adult mice. I used transgenic mouse lines to conditionally overexpress the BMP signaling cascade inhibitor Smad6 in muscle satellite cells and in differentiated skeletal muscle. I show that BMP signaling is required for correct proliferation of muscle satellite cells and their differentiation into myonuclei, thereby ensuring that the growing muscle fibers reach the correct final size. Moreover, I demonstrated that the final number of muscle stem cells is established during the postnatal/juvenile growth phase and this also depends on the BMP signaling cascade. Finally, I provide evidence that BMP signaling is a strong hypertrophic signal for the adult skeletal muscle and its presence is indispensable for muscle tissue maintenance. In summary, my findings demonstrate that BMPs are essential growth factors for postnatal skeletal muscle.

La transplantation de cellules souches de muscle possède un grand potentiel pour la réparation à long terme du muscle dystrophique. Cependant, la croissance ex vivo des cellules souches musculaires réduit de manière significative l'efficacité de leur greffe puisque le potentiel myogénique est considérablement réduit lors de la mise en culture. La voie de signalisation Notch a émergé comme un régulateur majeur des cellules souches musculaires (MuSCs) et il a également été décrit que la sur-activation de Notch est crucial pour le maintien du caractère souche des MuSC. Cette découverte pourrait être traduite comme un bénéfice thérapeutique potentiel. Des MuSCs murines ont été fraîchement isolées et ensemencées sur des boîtes de culture recouverte de Dll1-Fc, le domaine extracellulaire de Delta-like-1 est fusionné au fragment Fc humain, afin d'activer la voie de signalisation Notch et avec un IgG hu-main comme contrôle. Nous avons utilisé le rAAV afin d’exprimer le Dll1 spécifique-ment dans les muscles de souris. Les souris P3 ont été traitées avec de l’AAV pendant 3 semaines et 6 semaines afin d’étudier l'effet de Dll1 au cours du développement postnatal. Afin d’étudier le processus de régénération, l'AAV a également été injecté dans les muscles de souris mdx alors que les souris de type sauvage ont été utilisées comme contrôle. Un potentiel caractère souche supérieur (marquée avec le Pax7) est observé dans les cultures des MuSCs qui sont recouverte de Dll1-Fc par rapport à leurs homologues contrôles, par contre le taux de proliférer est réduit. Au cours du développement postnatal, la sur-activation de la voie de signalisation Notch par Dll1 sur les fibres musculaires a été en mesure d'élargir le pool des cellules Pax7+, cependant elle entraîne une diminution de la masse musculaire avec réduction de la taille des fibres et ceci sans affecter l'accumulation des myonuclei. Dans les MuSCs quiescentes (de type sauvage), la sur-activation de la voie de signalisation Notch ne présente pas de réel effet. La surexpression de Dll1 dans le muscle mdx a diminué la masse musculaire et agrandit le pool de cellules souches musculaires, ce-pendant le taux de régénération n'a pas été affecté. L’augmentation des MuSCs est attribuée à une différenciation entravée des cellules souches musculaires. En étudiant la stimulation de la voie de signalisation Notch dans les MuSCs à la fois in vitro et in vivo, nous démontrons que sur-activation de Notch préserve le caractère souche des cellules via l’inhibition de la prolifération et de la différenciation myogénique des MuSCs. / Muscle stem cell transplantation possesses great potential for long-term repair of dys-trophic muscle. However expansion of muscle stem cells ex vivo significantly reduces their engraftment efficiency since the myogenic potential is dramatically lost in culture. The Notch signaling pathway has emerged as a major regulator of muscle stem cells (MuSCs) and it has recently been discovered that high Notch activity is crucial for maintaining stemness in MuSCs. This feature might be exploited and developed into a novel therapeutic approach.Murine MuSCs were freshly isolated and seeded on culture vessels coated with Dll1-Fc, which fused Delta-like-1 extracellular domain with human Fc, to activate Notch sig-naling and with human IgG as a control. The rAAV gene delivery system was em-ployed to express Dll1 in murine muscles. P3 mice were treated with AAV for 3 weeks and 6 weeks to investigate the effect of Dll1 during postnatal development. To investi-gate the regeneration process, AAV were injected into mdx muscles whereas wild-type mice were used as control.Higher potential stemness (marked by Pax7 positivity) was observed in MuSCs grow-ing on a Dll1-Fc surface as compared to their counterparts on the control surface, while their proliferation rate was reduced. During postnatal development, overstimulation of Notch signaling by Dll1 on the mus-cle fibers was able to enlarge the Pax7+ cell pool, while also resulting in decreased muscle mass and smaller muscle fibers without affecting the accretion of myonuclei into the fiber. In quiescent (wild-type) MuSCs, overstimulation of Notch signaling did not have any discernible effect. Overexpression of Dll1 in mdx muscle decreased the muscle mass and enlarged the muscle stem cell pool, while muscle regeneration re-mained unaffected. By investigating Notch stimulation in MuSCs both in vitro and in vivo, we demonstrate that high Notch activity preserves stemness via inhibition of MuSCs proliferation and myogenic differentiation. Our findings point out that the Dll1 molecule, as a canonical Notch ligand, might have a therapeutic potential in cell-based therapies against muscu-lar dystrophies.

La néphronophtise (NPH) est une néphropathie tubulo-interstitielle chronique de transmission autosomique récessive. Elle représente la cause génétique la plus fréquente des insuffisances rénales terminales de l’enfant et du jeune adulte (5 à 10%). Elle se caractérise au niveau histologique par des anomalies des membranes basales tubulaires, une fibrose interstitielle massive et par l’apparition tardive de kystes à la jonction cortico-médullaire. Dans 40% des cas, la NPH est associée à des atteintes extra-rénales, notamment oculaires, cérébelleuses ou osseuses, définissant de nombreux syndromes (Senior Løken, Joubert, Jeune, etc). Sur la quinzaine de gènes responsables de la maladie, sept ont été identifiés au laboratoire : NPHP1, NPHP4, NPHP8/RPGRIP1L, NPHP11/MKS3, NPHP12/TTC21B, NPHP13/WDR19 et IFT140. Les protéines codées par ces gènes forment des complexes moléculaires principalement localisés au niveau des jonctions cellulaires et du cil primaire des cellules épithéliales rénales, classifiant la NPH et les syndromes associés dans le groupe des "ciliopathies". Mes travaux de thèse se sont intégrés au projet de recherche de l'équipe, centré sur l'étude des mécanismes pathophysiologiques à l'origine des lésions observées dans la NPH. Pour cela, nous avons développé des modèles de cellules tubulaires rénales (MDCK, IMCD et HEK293), et des modèles animaux (souris et poisson zèbre en collaboration avec l'équipe de Sylvie Schneider-Maunoury UMR7622). Je me suis particulièrement intéressé à l'analyse des phénotypes cellulaires et à la caractérisation des voies de signalisation perturbées dans les cellules épithéliales rénales invalidées pour les gènes NPHP1, NPHP4 et NPHP8/RPGRIP1L. Les protéines codées par ces gènes forment un complexe au niveau du cil primaire et des jonctions cellulaires. J'ai participé à définir le rôle crucial de ces protéines dans l’établissement des jonctions serrées par leur interaction avec les protéines de polarité, la morphogénèse épithéliale en culture 3D et la ciliogenèse. De plus, j'ai mis en évidence que l'absence de ces protéines entraîne des anomalies de migration et d'adhésion cellulaires s’accompagnant d’une activation anormale des protéines Rho GTPases (Cdc42, Rac1 et RhoA) et d’une réorganisation du cytosquelette d’actine. J'ai par ailleurs montré que le complexe NPHP4/inversine/RPGRIP1L régule finement l'expression et la localisation de Dishevelled, élément clé des voies Wnt canonique et Wnt/PCP, dans les cellules rénales. Ceci est en accord avec les défauts de polarité planaire observés dans le pronéphros du poisson zèbre et dans le rein de la souris, après invalidation des gènes Nphp4 ou Rpgrip1l. L'ensemble de ces résultats a permis de mieux comprendre le rôle moléculaire et cellulaire des néphrocystines et les mécanismes pathophysiologiques aboutissant aux altérations retrouvées chez les patients telles que la fibrose interstitielle rénale et la formation de kystes. / Nephronophthisis, a hereditary nephropathy characterized by interstitial fibrosis and cyst formation, is caused by mutations in NPHP genes encoding the ciliary proteins called nephrocystins. We investigate the function of nephrocystin-1, -4 and -8, in vitro and in vivo in mammalian kidney cells and in zebrafish respectively. Depletion of either NPHP1 (N1-KD), NPHP4 (N4-KD) or RPGRIP1L (RPGRIP1L-KD) by shRNA-mediated knockdown in MDCK cells led to abnormal ciliogenesis, delay in tight junction formation and disorganized structures in 3D culture. Moreover NPHP4 modulates the Wnt pathways during morphogenesis of the zebrafish pronephros and in mammalian kidney cells in which NPHP4 interacts with inversin and dishevelled, regulating its stability and its subcellular localization. Rpgrip1l is required for dishevelled stabilization at the cilium base and is necessary for polarized positioning of motile cilia of the zebrafish floor plate and sensory hair cells of the mouse cochlea. In either N1-KD or N4-KD cells, we also showed an over activation of Cdc42 and RhoA, downstream targets of dishevelled. This was accompanied by actin cytoskeletal disorganization, enhanced spreading on collagen, over-activation of proteins that regulate focal adhesion structures i.e p130cas-Pyk2 and increased cell migration. Interestingly, the stable expression of dominant negative form of Cdc42 in knockdown cells rescued the migration and the 3D phenotypes. In parallel, we observed that loss of Nphp4 in mice caused cystic tubular dilatation after subtotal nephrectomy correlated with alteration of ciliogenesis and over activation of Cdc42 and RhoA. Our data show a role of nephrocystins in epithelial cell organization and kidney morphogenesis in particular in regulation of focal adhesion, tight junction, ciliogenesis via dishevelled stability.