Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Le cancer du col utérin est la troisième néoplasie en importance chez la femme mondialement. Plusieurs études cliniques et épidémiologiques démontrent que le virus du papillome humain (HP V) est un agent étiologique impliqué, nécessaire au développement des néoplasies du col. Par contre, de plus en plus d'évidences suggèrent une interaction de multiples cofacteurs dans la progression vers le cancer. Nous avons démontré précédemment que des cellules cotransfectées par HPV-16 et la séquence Xho-2 du virus herpès simplex type 2 (HSV-2) induisaient des tumeurs dans des souris athymiques, contrairement à des cellules transfectées par HPV-16 ou HSV-2 seuls. Nous nous proposons d'étudier dans cette étude transversale le rôle de HSV-2, ainsi que de Chlamydîa trachomatis (CT) et du virus herpès humain type 6 (HHV-6) comme cofacteurs aux HPV dans la progression des lésions néoplasiques du col. Une cohorte de femmes a été recrutée consécutivement dans une clinique de colposcopie. Des cellules exfoliées du col ont été soumises à des tests PCR standardisés pour la présence de CT et de HHV-6. 27 génotypes de HPV ont été identifiés avec le Line Blot assay. La région transformante Bgl IIC de HSV-2 a été détectée par PCR. La région Xho-2 de HSV-2 a été détectée par une technique de détection par PCR déjà bien établie (PCR Xho-2) auparavant. Parmi les 439 femmes recrutées, 244 étaient normales, 80 avaient des lésions du col de bas grade (LSIL), 65 avaient des lésions de haut grade (HSIL) et 50 avaient im cancer du col. Des HP V à haut risque étaient détectées dans 93.3% des femmes avec HSIL et 20% des femmes normales. HPV-16 était le plus fréquemment détectés parmi les génotypes de HPV. Tous les spécimens étaient négatifs pour les régions transformantes Xho-2 et Bgl IIC de HSV-2. HHV-6 a été détecté dans 10 spécimens toutes lésions confondues. 3 spécimens de femmes avec un cancer étaient positifs pour CT, contrairement à aucun des spécimens de femmes sans lésions (p<0.031). En conclusion, notre étude a démontré que même si la séquence Xho-2 de HSV-2 transformes des cellules in vitro, elle n'a pas été détectée chez des femmes avec des lésions de haut grade du col. Cependant, C. trachomatis et HHV-6 ont été associés significativement avec les lésions de haut grade et cancer du col et pourraient être des cofacteurs aux HPV.

Les virus herpès simplex (VHS) possèdent une propriété biologique unique très importante, soit la neurovirulence. Les VHS peuvent ainsi atteindre le système nerveux central (SNC) et causer une encéphalite. Cette infection déclenche une réponse inflammatoire menant à l'infiltration de cellules immunitaires périphériques dans le SNC. De ce fait, l'encéphalite représente l'infection associée au VHS de type 1 (VHS-1) la plus dévastatrice et est la principale cause d'encéphalite sporadique virale, potentiellement fatale dans les pays développés. Bien que différents modèles animaux permettent l'étude de l'encéphalite, la complexité du SNC et de sa réponse immunitaire en limite encore notre compréhension. L'objectif de recherche principal de cette thèse est de mieux comprendre la réponse immunitaire innée impliquant différentes voies de signalisation associées à la reconnaissance du VHS-1. Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse de doctorat ont permis de démontrer le rôle clé de 1TFN-β, de la voie de signalisation des récepteurs Tolllike 3 (TLR3) et TLR9 ainsi que des protéines adaptatrices TRIF et IPS-1. Ainsi, le prétraitement des souris par un agoniste du TLR3 permet de créer un environnement proinflammatoire qui est néfaste à la replication virale initiale, permettant, à des temps plus tardifs, de diminuer la production de cytokines et de la charge virale. De plus, la stimulation de la voie du TLR9 est bénéfique avant l'infection, mais il est nécessaire de contenir celle-ci suite à l'infection. Comme il l'a déjà été suggéré, 1TFN-β peut exercer un effet bénéfique contre l'infection au VHS-1 mais le dosage et le temps d'administration après l'infection peuvent fortement influencer la replication virale et la survie. Enfin, les protéines adaptatrices TRIF et IPS-1 jouent un rôle très important au niveau de la réponse immunitaire innée en menant à la production d'IFN-β, bien que TRIF affecte davantage la replication virale précoce qu'IPS-1. Ainsi, au cours de ce doctorat, plusieurs modèles expérimentaux ont été développés pour mieux comprendre la réponse immunitaire innée au niveau du SNC au cours de l'encéphalite herpétique, le recrutement de différentes cellules immunitaires ainsi que pour mieux caractériser le rôle de l'IFN-β.

La résistance du virus herpes simplex (VHS) aux antiviraux, particulièrement chez des sujets immunosupprimés, et sa capacité d’envahir le système nerveux central soulèvent de nombreuses questions au niveau clinique. Des mutations au sein du gène de la thymidine kinase et de l’ADN polymérase virale sont responsables de la résistance aux traitements antiviraux. Il est donc important d’élucider davantage les différents mécanismes moléculaires à l’origine de ces évènements de résistance et de développer de nouvelles avenues thérapeutiques. De plus, le VHS est la cause la plus fréquente d’encéphalite sporadique et potentiellement fatale dans les pays de l’ouest. Ce type de pathologie est occasionné en partie par une intense réplication virale mais également par une réponse immunologique encore incomprise jusqu’à maintenant. Les travaux présentés dans cette thèse de doctorat ont pour but de développer de nouveaux modèles in vitro et in vivo permettant d’étudier ces deux facettes importantes du VHS. L’impact de certaines mutations et l’effet d’un nouveau traitement dans la résistance du VHS aux antiviraux ont été évalués. La réponse immunitaire innée cérébrale de même qu’une nouvelle approche thérapeutique en rapport avec une encéphalite à VHS ont également été caractérisées. / Herpes simplex virus (HSV) resistance to antiviral treatment is a real concern among immunocompromised population. Mutations localized in the thymidine kinase (TK) and/or the DNA polymerase (pol) genes are mainly responsible for those resistance issues. Thus, it is becoming important to increase knowledge in this area and to develop new therapeutic strategies. Also, HSV has this unique biological property to invade the nervous central system and causes encephalitis. During this type of infection, an important immunological process occurs. However, this inflammatory response is still very controversial and needs to be elucidated. The main objectives of this doctoral thesis consisted of: 1- the characterization of antiviral resistance and 2- the elucidation of the brain inflammatory response to HSV. The first part consisted in the development of an in vitro system allowing the characterization of several mutations in the TK and/or the DNA pol genes responsible for antiviral resistance and the elaboration of a new antiviral strategy. The second part was to characterize the inflammatory response following the induction of HSV-1 encephalitis in a mouse model and to develop an alternative immunomodulatory approache. Mutations localized in conserved and non-conserved regions of the TK are associated with ACV resistance. Hydroxyurea increases the activity of nucleoside (ACV) and nucleotide (CDV) analogues. A delayed glucocorticoid treatment is highly beneficial by decreasing the brain viral load as well as pro-inflammatory cytokine production in the brain of infected mice. TNF- and IL-1permit the initiation of an innate immune response allowing a control of the viral replication and an efficient transition to the adaptive immune response required for viral clearance during HSV-1 encephalitis. A prophylactic treatment with a TLR3 agonist significantly increases the mean life expectancy and survival rate of mice infected with HSV-1 compared to non-treated mice. The experimental models developed during this Ph. D. allow a better understanding of the molecular mechanisms of resistance and of the brain inflammatory response to the HSV.

L’infection du système nerveux central (SNC) par le virus herpès simplex 1 (VHS-1) peut mener au développement d’une encéphalite herpétique qui représente l’infection cérébrale sporadique la plus répandue dans les pays développés. Cette infection dévastatrice a une prévalence de 1/250 000 individus, et atteint un taux de mortalité de 30% malgré l’administration d’un traitement antiviral à base d’acyclovir. De plus, la majorité des patients qui survivent à l’infection conservent des séquelles neurologiques graves et permanentes. Il est suggéré, qu’en plus des dommages causés par la réplication virale, la réponse immunitaire inflammatoire induite par l’infection serait responsable de l’exacerbation de l’encéphalite herpétique. Cette réponse inflammatoire est initiée par les macrophages résidents du SNC, nommés microglies. Dans certains désordres neurologiques, Il est proposé qu’en plus des microglies, les monocytes sanguins pourraient infiltrer le SNC et participer à la réponse immunitaire. Les connaissances concernant le recrutement des monocytes périphériques au SNC et leur rôle dans l’élaboration de la réponse immunitaire durant l’encéphalite herpétique sont très limitées. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans cette réponse dirigée contre l’infection du cerveau par le VHS-1 pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et mener au développement de nouvelles stratégies combinant des antiviraux et des agents immunomodulateurs pour contrôler à la fois la propagation du virus et l'état inflammatoire dans le SNC. Les travaux présentés dans le cadre de cette thèse s’intéressent à l’implication des monocytes périphériques recrutés au niveau du cerveau dans la réponse immunitaire innée développée dans un modèle murin d’encéphalite herpétique. Pour atteindre nos objectifs, nous avons d’abord utilisé des souris chimériques dont les précurseurs myéloïdes dérivés de la moelle osseuse et les leucocytes sanguins expriment la protéine fluorescente verte (GFP pour «green fluorescent protein»). Ce modèle nous a principalement permis de distinguer les macrophages d’origine hématopoïétique des microglies résidentes du SNC car il n’existe aucun marqueur naturel permettant de différencier ces deux populations cellulaires. Cette stratégie nous a aidé à mieux caractériser la cinétique d’infiltration des monocytes, leur localisation dans le cerveau, et leur participation à la réponse immunitaire suite à l’infection du SNC par le VHS-1. La deuxième partie des travaux porte sur les mécanismes impliqués dans le recrutement de ces monocytes et dans le contrôle de l’état inflammatoire au niveau du SNC durant l’encéphalite herpétique. Plus précisément, les expériences réalisées s’intéressent aux rôles de la signalisation via les récepteurs de chimiokines CCR2 et CX3CR1, exprimés à la surface des monocytes sanguins et des microglies, dans la protection ainsi que dans le recrutement des deux sous-types de monocytes sanguins, soient les monocytes «inflammatoires» et «patrouilleurs», au cours de l’encéphalite herpétique. Nos résultats ont montré pour la première fois que les monocytes sanguins infiltraient le SNC pour donner naissance à des macrophages ayant le même profil que les microglies résidentes et que ces cellules participaient à la réponse immunitaire suite à l’infection par le VHS-1. Nous avons également démontré, en utilisant des souris chimériques ayant des déficiences compartimentées en récepteurs CX3CR1 et CCR2 au niveau du SNC au niveau du système hématopoïétique, que les voies de signalisation via CX3CR1 au niveau des cellules résidentes du cerveau et de CCR2 au niveau des cellules hématopoïétiques étaient importantes pour la survie des souris, pour le contrôle de la réplication virale ainsi que pour contenir la réponse inflammatoire cérébrale durant l’encéphalite herpétique expérimentale. / Herpes simplex virus 1 (HSV-1) is the main cause of sporadic viral encephalitis in developed countries with an annual incidence of 1/250 000 individuals per year. Despite the use of acyclovir that aimed at blocking virus replication, the mortality rate associated with HSV encephalitis (HSE) is still high (i.e., 30%), with the majority of surviving patients developing severe neurological sequelae. It is believed that the high mortality rate and neurological disorders attributable to HSE could involve both virally- and immune-induced damages of the central nervous system (CNS). The inflammatory response is initiated by the resident macrophages of the brain, namely microglia. In addition, blood leukocytes, particularly monocytes, are thought to infiltrate the CNS and contribute to the control of viral infection together with microglia. However, it is also argued that these cells may also amplify the inflammatory response, thereby contributing to brain damages. Knowledge concerning the recruitment of peripheral monocytes to the CNS and their role in the immune response during HSE is limited. A better understanding of the mechanisms involved in their dynamic of recruitment might lead to the identification of new therapeutic targets and the development of new strategies combining antiviral agents and immunomodulatory molecules to better control both HSV replication as well as the inflammatory environment in the CNS. The studies presented in this thesis are intended to better evaluate the involvement of monocytes-derived macrophages, together with microglia, in the cerebral innate immune response during experimental HSE. To achieve our goals, we first used chimeric mice in which bone marrow progenitor cells and blood leukocytes express the green fluorescent protein (GFP). This model allowed us to better characterize the kinetics of infiltration of blood monocytes into the CNS, their distribution in different anatomical areas of the brain and their involvement in the immune response during experimental HSE. The second part of the work focuses on the mechanisms involved in the recruitment of monocytes into the CNS and in the control of the inflammatory state in mouse brain following HSV-1 infection. More precisely, experiments aimed at characterizing the role of signaling pathways through chemokine receptors CCR2 and CX3CR1, expressed on the surface of blood monocytes and microglia, in protecting and modulating the recruitment of the two blood monocytes subtypes, namely the "inflammatory" and "patrolling" monocytes, during HSE. To achieve this aim, we used chimeric mouse models of CCR2- and CX3CR1-deficient animals, in which the lack of either receptor was restricted to the hematopoietic system (blood monocytes) or the CNS (microglia). Our results showed that blood monocytes are recruited to the CNS following HSV-1 infection and give rise to microglia-like macrophages. These cells are involved in the immune response together with microglia by performing immunological functions including phagocytosis and antigen presentation. Furthermore, we showed that CX3CR1 and CCR2 expressed on cells of the CNS and in the hematopoietic system, respectively, are important for mouse survival, viral replication control and in maintaining an appropriate inflammatory response during experimental HSE.

L’autophagie est un processus cellulaire catabolique qui a été conservé durant l’évolution de la levure à l’homme. Cet important mécanisme consiste en une dégradation des composants cytoplasmiques dans une structure lytique, le lysosome. Il existe trois types de l’autophagie : la microautophagie, l’autophagie médiée par les chaperones et la macroautophagie nommée « autophagie ». Il a été démontré que lors de l’autophagie, le matériel cytoplasmique (protéines cytosoliques et organites) est séquestré dans l’autophagosome qui finit par fusionner avec le lysosome, formant ainsi l’autophagolysosome. Le matériel séquestré et la membrane interne de l’autophagosome seront dégradés par les hydrolases lysosomales. Plusieurs études se sont focalisées sur la détermination de la machinerie moléculaire et les mécanismes de l’autophagie. Il a été démontré l’implication de 31 molécules Atg essentielles dans le processus de l’autophagie. L’identification de ces protéines a permis de déceler le rôle de l’autophagie non seulement dans le maintien de l’homéostasie cellulaire mais aussi dans la défense contre les agents pathogènes. En effet, l’autophagie joue un rôle important dans l’immunité innée conduisant à contrôler l’évasion des pathogènes dont les bactéries et les virus. Également, l’autophagie est impliquée dans l’immunité adaptative en favorisant la présentation des antigènes viraux par le CMH de classe II aux cellules T CD4+. De plus, une étude récente suggère que l’autophagie contribue à la présentation antigénique par le CMH de classe I aux cellules T CD8+ durant une infection virale par le virus HSV-1 (Herpes simplex type 1). Toutefois, certains virus y compris HSV-1 ont pu développer des mécanismes pour contourner et inhiber en partie le rôle protecteur de l’autophagie. Récemment, une étude dans notre laboratoire a mis en évidence, lors d’une infection virale par HSV-1 des cellules macrophages BMA, la présence d’une nouvelle structure autophagique dans une phase tardive de l’infection. Cette nouvelle structure est différente des autophagosomes classiques à double membrane et est caractérisée morphologiquement par quatre membranes dérivées de l’enveloppe nucléaire interne et externe. Peu de choses ont été rapportées sur cette nouvelle voie autophagique qui peut être un mécanisme de défense cellulaire quand l’autophagie classique dans le cytosol est inhibée par HSV-1. Il devient donc intéressant de caractériser les molécules impliquées dans la formation de ces autophagosomes issus du noyau par spectrométrie de masse. Pour ce faire, il était impératif d’établir un outil d’isolation des noyaux à partir de macrophages infectés par HSV-1 dans lesquels les autophagosomes issus des noyaux seront formés. La validation de cette méthode d’isolation a été effectuée en déterminant la pureté et l’intégrité des noyaux isolés à partir des cellules non infectées (contrôle) et infectées par HSV-1. La pureté des préparations de noyaux isolés a été caractérisée par l’absence de contaminants cellulaires et un enrichissement en noyaux. Également, il a fallu déterminer la cinétique de formation des autophagosomes issus des noyaux pour les deux lignées cellulaires de macrophages utilisées dans ce projet. Dans une perspective future, l’analyse protéomique à partir des échantillons purs des noyaux isolés (non infectés et infectés) mènera à identifier les protéines impliquées dans la formation des autophagosomes dérivés des noyaux, ce qui permettra ultérieurement d’effectuer des études sur les mécanismes moléculaires et les fonctions de cette nouvelle voie autophagique. / Autophagy is a catabolic cellular process that has been conserved during evolution from yeast to humans. More specifically, it consists of the degradation of cytoplasmic components within a lytic structure, the lysosome. There are at least three distinct types of autophagy; microautophagy, chaperone-mediated-autophagy, and macroautophagy wich often referred to simply as “autophagy” in the literature. It has been shown that during this type of autophagy, cytoplasmic material (cytosolic proteins and organites) are sequestrated in autophagosomes which fuse with lysosomes, forming autophagolysosomes where the sequestered material and the internal membrane of the autophagosomes are degraded by lysosomal hydrolases. Many studies have focused on understanding the molecular machinery and mechanism of autophagy. It has been shown that 31 autophagy proteins (Atg) are implicated and essential in the autophagic process. More importantly, the identification of these proteins has permitted the discovery of the role of autophagy not only in the maintenance of cellular homeostasis but also in host defense against pathogenic agents. Autophagy plays an important role in innate immunity by clearing and destroying intracellular pathogens like bacteria and viruses. Autophagy is also implicated in adaptive immunity, by promoting the presentation of viral antigens on CMH class II molecules to CD4+ T cells. A recent study has shown that autophagy also contributes to antigen presentation on CMH class I molecules to CD8+ T cells during infection with Herpes simplex virus type 1 (HSV-1). Certain viruses including herpes viruses have developed mechanisms to inhibit autophagy. Interestingly, a recent study in our lab revealed the presence of a new autophagic structure that occured during the late phase of viral infection of BMA macrophages with HSV-1. These structures are different from the classic double membrane autophagosomes, and are morphologically characterized by four membranes emerging from the inner and outer nuclear envelope. Very little was known about this novel nuclear-membrane autophagy pathway, which might function as a cellular defense mechanism when classic autophagy in the cytosol is inhibited by the virus. It is therefore of great interest to characterize the proteins involved in the formation of these autophagosomes from the nucleus by mass spectrometry. In order to do so, it was imperative to establish a protocol for the isolation of nuclei from HSV-1 infected macrophages which carry nuclear autophagosomes on their envelope. The validation of this isolation method was carried out by determining the purity of isolated nuclei in uninfected (mock) and infected macrophages. The purity of isolated nuclei was characterized by the absence of cellular contaminants derived from other cellular organites and enrichment in nuclei. Moreover, the kinetic of autophagosome formation on the nuclei during infection had to be determined for the two macrophage cell lines used during this project. As a future perspective, a proteomic analysis of pure samples of isolated nuclei (uninfected and infected) should identify proteins implicated in the formation of autophagosomes derived from the nuclei, and thus allow further studies of the molecular mechanism and functions of this novel autophagy pathway.

L’autophagie est une voie hautement conservée de dégradation lysosomale des constituants cellulaires qui est essentiel à l’homéostasie cellulaire et contribue à l’apprêtement et à la présentation des antigènes. Les rôles relativement récents de l'autophagie dans l'immunité innée et acquise sous-tendent de nouveaux paradigmes immunologiques pouvant faciliter le développement de nouvelles thérapies où la dérégulation de l’autophagie est associée à des maladies auto-immunes. Cependant, l'étude in vivo de la réponse autophagique est difficile en raison du nombre limité de méthodes d'analyse pouvant fournir une définition dynamique des protéines clés impliquées dans cette voie. En conséquence, nous avons développé un programme de recherche en protéomique intégrée afin d’identifier et de quantifier les proteines associées à l'autophagie et de déterminer les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l’autophagosome dans la présentation antigénique en utilisant une approche de biologie des systèmes. Pour étudier comment l'autophagie et la présentation antigénique sont activement régulés dans les macrophages, nous avons d'abord procédé à une étude protéomique à grande échelle sous différentes conditions connues pour stimuler l'autophagie, tels l’activation par les cytokines et l’infection virale. La cytokine tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) est l'une des principales cytokines pro-inflammatoires qui intervient dans les réactions locales et systémiques afin de développer une réponse immune adaptative. La protéomique quantitative d'extraits membranaires de macrophages contrôles et stimulés avec le TNF-alpha a révélé que l'activation des macrophages a entrainé la dégradation de protéines mitochondriales et des changements d’abondance de plusieurs protéines impliquées dans le trafic vésiculaire et la réponse immunitaire. Nous avons constaté que la dégradation des protéines mitochondriales était sous le contrôle de la voie ATG5, et était spécifique au TNF-alpha. En outre, l’utilisation d’un nouveau système de présentation antigènique, nous a permi de constater que l'induction de la mitophagie par le TNF-alpha a entrainée l’apprêtement et la présentation d’antigènes mitochondriaux par des molécules du CMH de classe I, contribuant ainsi la variation du répertoire immunopeptidomique à la surface cellulaire. Ces résultats mettent en évidence un rôle insoupçonné du TNF-alpha dans la mitophagie et permet une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la présentation d’auto-antigènes par les molécules du CMH de classe I. Une interaction complexe existe également entre infection virale et l'autophagie. Récemment, notre laboratoire a fourni une première preuve suggérant que la macroautophagie peut contribuer à la présentation de protéines virales par les molécules du CMH de classe I lors de l’infection virale par l'herpès simplex virus de type 1 (HSV-1). Le virus HSV1 fait parti des virus humains les plus complexes et les plus répandues. Bien que la composition des particules virales a été étudiée précédemment, on connaît moins bien l'expression de l'ensemble du protéome viral lors de l’infection des cellules hôtes. Afin de caractériser les changements dynamiques de l’expression des protéines virales lors de l’infection, nous avons analysé par LC-MS/MS le protéome du HSV1 dans les macrophages infectés. Ces analyses nous ont permis d’identifier un total de 67 protéines virales structurales et non structurales (82% du protéome HSV1) en utilisant le spectromètre de masse LTQ-Orbitrap. Nous avons également identifié 90 nouveaux sites de phosphorylation et de dix nouveaux sites d’ubiquitylation sur différentes protéines virales. Suite à l’ubiquitylation, les protéines virales peuvent se localiser au noyau ou participer à des événements de fusion avec la membrane nucléaire, suggérant ainsi que cette modification pourrait influer le trafic vésiculaire des protéines virales. Le traitement avec des inhibiteurs de la réplication de l'ADN induit des changements sur l'abondance et la modification des protéines virales, mettant en évidence l'interdépendance des protéines virales au cours du cycle de vie du virus. Compte tenu de l'importance de la dynamique d'expression, de l’ubiquitylation et la phosphorylation sur la fonction des proteines virales, ces résultats ouvriront la voie vers de nouvelles études sur la biologie des virus de l'herpès. Fait intéressant, l'infection HSV1 dans les macrophages déclenche une nouvelle forme d'autophagie qui diffère remarquablement de la macroautophagie. Ce processus, appelé autophagie associée à l’enveloppe nucléaire (nuclear envelope derived autophagy, NEDA), conduit à la formation de vésicules membranaires contenant 4 couches lipidiques provenant de l'enveloppe nucléaire où on retrouve une grande proportion de certaines protéines virales, telle la glycoprotéine B. Les mécanismes régissant NEDA et leur importance lors de l’infection virale sont encore méconnus. En utilisant un essai de présentation antigénique, nous avons pu montrer que la voie NEDA est indépendante d’ATG5 et participe à l’apprêtement et la présentation d’antigènes viraux par le CMH de classe I. Pour comprendre l'implication de NEDA dans la présentation des antigènes, il est essentiel de caractériser le protéome des autophagosomes isolés à partir de macrophages infectés par HSV1. Aussi, nous avons développé une nouvelle approche de fractionnement basé sur l’isolation de lysosomes chargés de billes de latex, nous permettant ainsi d’obtenir des extraits cellulaires enrichis en autophagosomes. Le transfert des antigènes HSV1 dans les autophagosomes a été determine par protéomique quantitative. Les protéines provenant de l’enveloppe nucléaire ont été préférentiellement transférées dans les autophagosome lors de l'infection des macrophages par le HSV1. Les analyses protéomiques d’autophagosomes impliquant NEDA ou la macroautophagie ont permis de decouvrir des mécanismes jouant un rôle clé dans l’immunodominance de la glycoprotéine B lors de l'infection HSV1. Ces analyses ont également révélées que diverses voies autophagiques peuvent être induites pour favoriser la capture sélective de protéines virales, façonnant de façon dynamique la nature de la réponse immunitaire lors d'une infection. En conclusion, l'application des méthodes de protéomique quantitative a joué un rôle clé dans l'identification et la quantification des protéines ayant des rôles importants dans la régulation de l'autophagie chez les macrophages, et nous a permis d'identifier les changements qui se produisent lors de la formation des autophagosomes lors de maladies inflammatoires ou d’infection virale. En outre, notre approche de biologie des systèmes, qui combine la protéomique quantitative basée sur la spectrométrie de masse avec des essais fonctionnels tels la présentation antigénique, nous a permis d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l'autophagie lors de la présentation antigénique. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettra de réduire les effets nuisibles de l'immunodominance suite à l'infection virale ou lors du développement du cancer en mettant en place une réponse immunitaire appropriée. / Autophagy is a highly conserved lysosomal-mediated protein degradation pathway that plays a crucial role in maintaining cellular homeostasis and contributes to antigen processing and presentation. The emerging roles of autophagy in both innate and adaptive immunity underpin novel immunological paradigms that may provide opportunities for the development of new therapies where impaired autophagy is associated with autoimmune diseases. However, the in vivo study of autophagic response is challenging in view of the limited number of analytical approaches that can provide a dynamic definition of the key proteins involved in this pathway. Accordingly, we developed an integrated proteomics research program to unravel the molecular machines associated with autophagy and to decipher the fine details of the molecular mechanisms governing the functions of the autophagosome in antigen presentation using a systems biology approach. To study how autophagy and antigen presentation are actively modulated in macrophages, we first conducted comprehensive, global proteomics studies under different conditions known to stimulate autophagy. Autophagy is modulated by cytokines as well as by viral infection in various ways. TNF-alpha is one of the major proinflammatory cytokines that mediate local and systemic responses and direct the development of adaptive immunity. Label-free quantitative proteomics analysis of membrane extracts from TNF-alpha activated and resting macrophages revealed that TNF-alpha activation led to the downregulation of mitochondrial proteins and the differential regulation of several proteins involved in vesicle trafficking and immune response. Importantly, we found that the downregulation of mitochondria proteins occurred through Atg5-dependent mitophagy, and was specific to TNF-alpha. Furthermore, using a novel antigen presentation system, we observed that the induction of mitophagy by TNF-alpha enabled the processing and presentation of mitochondrial antigens at the cell surface by MHC class I molecules, suggesting that TNF-alpha induced mitophagy contributes to the modification of the MHC class I peptide repertoire. These findings highlight an unsuspected role of TNF-alpha in mitophagy and expanded our understanding of the mechanisms responsible for MHC class I presentation of self-antigens. A complex interplay also exists between viral infection and autophagy. Recently, our lab provided the first evidence that macroautophagy can contribute to the presentation of viral proteins on MHC class I molecules during Herpes Simplex Virus type 1 (HSV1) infection. HSV1 are among the most complex and widespread human viruses. While the composition of viral particles has been studied, less is known about the expression of the whole viral proteome in infected cells. To comprehensively characterize the system, we analyzed the proteome of the prototypical HSV1 in infected macrophages by LC-MS/MS. We achieved a very high level of protein coverage and identified a total of 67 structural and non-structural viral proteins (82% of the HSV1 proteome) using LC-MS/MS on a LTQ-Orbitrap instrument. We also obtained a comprehensive map of 90 novel phosphorylation sites and ten novel ubiquitylation sites on different viral proteins. Interestingly all ubiquitylated proteins could either localize to the nucleus or participate in membrane fusion events, suggesting that ubiquitylation of viral proteins might affect their trafficking. Treatment with inhibitors of DNA replication induced changes of both viral protein abundance and modifications, highlighting the interdependence of viral proteins during the life cycle of the virus. Given the importance of expression dynamics, ubiquitylation and phosphorylation for protein function, these findings will serve as important tools for future studies on herpes virus biology. Interestingly, HSV1 infection in macrophages triggers a novel form of autophagy which remarkably differs in many ways from macroautophagy. This process, referred to as nuclear envelope-derived autophagy (NEDA), leads to the formation of 4-membrane layered vesicles originating from the nuclear envelope where some viral protein such as glycoprotein B are highly enriched. To which extent this process differs from macroautophagy and participates in the pathogenesis of HSV infection is still largely unknown. Using a novel antigen presentation assay we could show that NEDA is an Atg5-independent pathway that participates in the capture of viral proteins, and their processing and presentation on MHC class I molecules. To understand the involvement of NEDA in antigen presentation it is crucial to characterize the autophagosomal proteome in HSV1 infected macrophages. We developed a novel isolation method based on the loading of the lysosomal compartment with latex beads, a unique tool to obtain very pure cell extracts, upon autophagy induction. The transfer of HSV1 antigens into autophagosomes was monitored using quantitative proteomics. Nuclear enveloped-derived proteins were preferentially transferred to the autophagosome during HSV1 infection. Detailed proteomics characterization of autophagosomes formed during NEDA and macroautophagy led to the discovery of mechanisms that play a key role in glycoprotein B immunodominance during HSV1 infection. These analyses also revealed that various autophagic pathways can be induced to promote the capture of selective sets of viral proteins, thus actively shaping the nature of the immune response during infection. In conclusion, the application of quantitative proteomics methods played a key role in identifying and quantifying important regulators of autophagy in macrophages and allowed us to identify changes occurring during the remodeling of autophagosomes in response to disease and inflammatory conditions such as viral infections. Furthermore, our systems biology approach that combined mass spectrometry-based quantitative proteomics with functional screens such as antigen presentation assays revealed novel biological insights on the molecular mechanisms governing the functions of autophagy in antigen presentation. Harnessing the contribution of autophagy in antigen presentation has the potential to minimize the deleterious effects of immunodominance in viral infection and cancer by shaping an appropriate immune response.

Le Virus Herpès Simplex de type 1 (HSV-1) est un agent infectieux qui cause l’herpès chez une grande proportion de la population mondiale. L’herpès est généralement considéré comme une maladie bénigne dont la forme la plus commune est l'herpès labial (communément appelé « bouton de fièvre »), mais elle peut se révéler très sérieuse et causer la cécité et l’encéphalite, voir létale dans certain cas. Le virus persiste toute la vie dans le corps de son hôte. Jusqu'à présent, aucun traitement ne peut éliminer le virus et aucun vaccin n’a été prouvé efficace pour contrôler l’infection herpétique. HSV-1 est un virus avec un génome d’ADN bicaténaire contenu dans une capside icosaèdrale entourée d’une enveloppe lipidique. Treize glycoprotéines virales se trouvent dans cette enveloppe et sont connues ou supposées jouer des rôles distincts dans différentes étapes du cycle de réplication viral, incluant l'attachement, l'entrée, l’assemblage, et la propagation des virus. La glycoprotéine M (gM) qui figure parmi ces glycoprotéines d’enveloppe, est la seule glycoprotéine non essentielle mais est conservée dans toute la famille herpesviridae. Récemment, l’homologue de gM dans le Pseudorabies virus (PRV), un autre herpesvirus, a été impliqué dans la phase finale de l’assemblage (i.e. l’enveloppement cytoplasmique) au niveau du réseau trans-Golgi (TGN) en reconnaissant spécifiquement des protéines tégumentaires et d’autres glycoprotéines d’enveloppe ([1]). Toutefois, il a été proposé que cette hypothèse ne s’applique pas pour le HSV-1 ([2]). De plus, contrairement à la localisation au TGN dans les cellules transfectées, HSV-1 gM se localise dans la membrane nucléaire et sur les virions périnucléaires durant une infection. L’objectif du projet présenté ici était d’éclaircir la relation de la localisation et la fonction de HSV-1 gM dans le contexte d’une infection. Dans les résultats rapportés ici, nous décrivons tout abord un mécanisme spécifique de ciblage nucléaire de HSV-1 gM. En phase précoce d’une infection, gM est ciblée à la membrane nucléaire d'une manière virus ii dépendante. Cela se produit avant la réorganisation du TGN normalement induite par l’infection et avant que gM n’entre dans la voie de sécrétion. Ce ciblage nucléaire actif et spécifique de gM ne semble pas dépendre des plusieurs des partenaires d’interaction proposés dans la littérature. Ces données suggèrent que la forme nucléaire de gM pourrait avoir un nouveau rôle indépendant de l’enveloppement final dans le cytoplasme. Dans la deuxième partie du travail présenté ici, nous avons concentré nos efforts sur le rôle de gM dans l’assemblage du virus en phase tardive de l’infection et en identifiant un domaine critique de gM. Nos résultats mettent en valeur l’importance du domaine carboxyl-terminal cytoplasmique de gM dans le transport de gM du réticulum endoplasmique (RE) à l’appareil de Golgi, dans l’enveloppement cytoplasmique et la propagation intercellulaire du virus. Ainsi, l’export du RE de gM a été complètement compromis dans les cellules transfectées exprimant un mutant de gM dépourvu de sa région C-terminale. La délétion la queue cytoplasmique de gM cause une réduction légère du titre viral et de la taille des plaques. L'analyse de ces mutants par microscopie électronique a démontré une accumulation des nucléocapsides sans enveloppe dans le cytoplasme par rapport aux virus de type sauvage. Étrangement, ce phénotype était apparent dans les cellules BHK mais absent dans les cellules 143B, suggérant que la fonction de gM dépende du type cellulaire. Finalement, le criblage de partenaires d’interaction du domaine C-terminal de gM identifiés par le système de double-hybride nous a permis de proposer plusieurs candidats susceptibles de réguler la fonction de gM dans la morphogénèse et la propagation de virus. / Herpes Simplex Virus type 1 (HSV-1) is an infectious agent causing herpes, which affects a large population worldwide. Herpes is generally considered a benign disease whose most common form is oral herpes (commonly called "cold sores"), but it can be very serious and cause herpetic blindness and encephalitis, and even be lethal in some cases. The virus can persist throughout life in the body of its host. So far, no treatment can eliminate the virus and no vaccine has proven effective in controlling herpes infections. HSV-1 has a double-stranded DNA genome embedded in an icosahedral capsid surrounded by a lipid envelope. Thirteen viral glycoproteins are located in the envelope and are known or believed to play different roles in different stages of the viral replication cycle, including attachment, entry, assembly, and viral propagation. Among these envelope glycoproteins, glycoprotein M (gM) is the only nonessential glycoprotein but is conserved in all the herpesviridae family. Recently, the homologue of gM in Pseudorabies virus (PRV), another herpesvirus, has been implicated in the final phase of assembly (e.g. the cytoplasmic envelopment) at the trans-Golgi network (TGN) ([1]). However, it was suggested that this does not apply to HSV-1 ([2]). Moreover, unlike its TGN localization in transfected cells, HSV-1 gM localizes to the nuclear membrane and on the perinuclear virions during infection. The objective of the project presented here was to clarify the relationship of the location and function of HSV-1 gM in the context of an infection. In the results reported here, we first describe a specific and active mechanism of nuclear targeting of HSV-1 gM. In early phase of infection, gM is targeted to the nuclear membrane in a virus dependent manner. This occurs before the known reorganization of the TGN induced by the virus and before gM enters the secretory pathway. This active and specific nuclear targeting of gM seemingly does not depend on the functional interaction partners proposed in the literature. These data suggest that nuclear gM could have a new role independent of that in the final envelopment in the cytoplasm. In the second part of the work presented here, we focused iv our efforts on the role of gM in virus assembly in the late phase of infection and define an important functional domain within gM. Our results highlight the importance of the carboxyl-terminal domain of gM in the intracellular transport of gM from endoplasmic reticulum (ER) to Golgi apparatus, in the cytoplasmic envelopment of the capsids and the intercellular spread of the virus. Hence, gM ER export was completely compromised in transfected cells after deletion of its C-terminal tail. Deletion of the gM cytoplasmic tail in mutant viruses resulted in a slight reduction in viral titer and plaque size. The analysis of these mutants by electron microscopy showed an accumulation of nucleocapsids without envelope in the cytoplasm compared to wild-type virus. Interestingly, this phenotype is apparent in BHK cells but not in 143B cells, hinting that the importance of gM may be cell type specific. Finally, screening of interaction partners of C-terminal domain of gM identified by the two-hybrid system allowed us to propose several interesting candidates that may regulate the function of gM in the virus morphogenesis and propagation.

Le virus Herpès simplex de type 1 (HSV-1), agent étiologique des feux sauvages, possède une structure multicouche comprenant une capside icosaédrale qui protège le génome viral d’ADN, une couche protéique très structurée appelée tégument et une enveloppe lipidique dérivant de la cellule hôte et parsemée de glycoprotéines virales. Tous ces constituants sont acquis séquentiellement à partir du noyau, du cytoplasme et du réseau trans-golgien. Cette structure multicouche confère à HSV-1 un potentiel considérable pour incorporer des protéines virales et cellulaires. Toutefois, l’ensemble des protéines qui composent ce virus n’a pas encore été élucidé. De plus, malgré son rôle critique à différentes étapes de l’infection, le tégument demeure encore mal défini et ce, tant dans sa composition que dans la séquence d’addition des protéines qui le composent. Toutes ces incertitudes quant aux mécanismes impliqués dans la morphogenèse du virus nous amènent à l’objectif de ce projet, soit la caractérisation du processus de maturation d’HSV-1. Le premier article présenté dans cette thèse et publié dans Journal of Virology s’attarde à la caractérisation protéique des virus extracellulaires matures. Grâce à l’élaboration d’un protocole d’isolation et de purification de ces virions, une étude protéomique a pu être effectuée. Celle-ci nous a permis de réaliser une cartographie de la composition globale en protéines virales des virus matures (8 protéines de la capside, 23 protéines du tégument et 13 glycoprotéines) qui a fait la page couverture de Journal of Virology. De plus, l’incorporation potentielle de 49 protéines cellulaires différentes a été révélée. Lors de cette étude protéomique, nous avons aussi relevé la présence de nouveaux composants du virion dont UL7, UL23, ICP0 et ICP4. Le deuxième article publié dans Journal of General Virology focalise sur ces protéines via une analyse biochimique afin de mieux comprendre les interactions et la dynamique du tégument. Ces résultats nous révèlent que, contrairement aux protéines ICP0 et ICP4, UL7 et UL23 peuvent être relâchées de la capside en présence de sels et que les cystéines libres jouent un rôle dans cette relâche. De plus, cet article met en évidence la présence d’ICP0 et d’ICP4 sur les capsides nucléaires suggérant une acquisition possible du tégument au noyau. La complexité du processus de morphogenèse du virus ainsi que la mise en évidence d’acquisition de protéines du tégument au noyau nous ont incités à poursuivre nos recherches sur la composition du virus à un stade précoce de son cycle viral. Les capsides C matures, prémisses des virus extracellulaires, ont donc été isolées et purifiées grâce à un protocole innovateur basé sur le tri par cytométrie en flux. L’analyse préliminaire de ces capsides par protéomique a permis d’identifier 28 protéines virales et 39 protéines cellulaires. Les données recueilles, comparées à celles obtenues avec les virus extracellulaires, suggèrent clairement un processus séquentiel d’acquisition des protéines du tégument débutant dans le noyau, site d’assemblage des capsides. Finalement, tous ces résultats contribuent à une meilleure compréhension du processus complexe de maturation d’HSV-1 via l’utilisation de techniques variées et innovatrices, telles que la protéomique et la cytométrie en flux, pouvant être appliquées à d’autres virus mais aussi permettre le développement de meilleurs traitements pour vaincre l’HSV-1. / Herpes simplex virus type 1 (HSV-1), the etiological agent of cold sores, has a multilayered structure that includes an icosahedral capsid that protects the viral DNA genome, a highly structured proteinaceous layer called tegument and a host-derived lipid envelope studded with viral glycoproteins. All these constituents are sequentially acquired from the nucleus, the cytoplasm and the trans-Golgi network. This multilayered structure confers to HSV-1 a considerable potential to incorporate viral and cellular proteins; however, all the proteins that compose this virus have not yet been elucidated. Moreover, despite its critical role at different stages of infection, the tegument is still poorly defined both in its composition and its sequence of addition of proteins. All these uncertainties about the mechanisms involved in the morphogenesis of the virus lead us to the goal of this project, which is the characterization of the maturation process of HSV-1. The first article presented in this thesis and published in Journal of Virology focuses on the protein characterization of extracellular mature virus. After developing a protocol for the isolation and purification of these virions, a proteomics study was performed. It allowed us to map the global viral protein composition of mature virions (8 capsid proteins, 23 tegument proteins and 13 glycoproteins), which made the cover page of Journal of Virology. Moreover, the potential incorporation of 49 cellular proteins was revealed. During this proteomics study, we confirmed the incorporation of novel virion components including UL7, UL23, ICP0 and ICP4. The second article published in Journal of General Virology focuses on these viral proteins by using a biochemical analysis to better understand the interactions and dynamic of the tegument. Our results revealed that, unlike ICP0 and ICP4 proteins, UL7 and UL23 can be released from the capsid in the presence of salts and that free cysteines play a role in this release. Moreover, this article highlights the presence of ICP0 and ICP4 on the nuclear capsids suggesting a potential acquisition of tegument proteins in the nucleus. The complexity of the viral morphogenesis process and the discovery of the tegument acquisition in the nucleus led us to pursue our research on the virus composition at an early stage of its viral cycle. The nuclear C capsids, precursors to the extracellular virus, were isolated and purified with an innovative protocol based on fluorescence activated cell sorting (FACS). The preliminary analysis of these capsids by proteomics allows us to identify 28 viral proteins and 39 cellular proteins. The collected data, compared to those obtained with extracellular viruses, clearly suggest a sequential process of tegument proteins acquisition starting in the nucleus, the assembly site of HSV-1 capsids. Finally, all these results contribute to a better understanding of the complex process of HSV-1 maturation by using varied and innovative techniques such as proteomic and FACS, which can be applied to other viruses and allow the development of better treatments to fight HSV-1.

Comment obtenir des données anatomiques pendant une neurochirurgie ? a été ce qui a guidé le travail développé dans le cadre de cette thèse. Les IRM sont actuellement utilisées en amont de l'opération pour fournir cette information, que ce soit pour le diagnostique ou pour définir le plan de traitement. De même, ces images pre-opératoires peuvent aussi être utilisées pendant l'opération, pour pallier la difficulté et le coût des images per-opératoires. Pour les rendre utilisables en salle d'opération, un recalage doit être effectué avec la position du patient. Cependant, le cerveau subit des déformations pendant la chirurgie, phénomène appelé Brain Shift, ce qui altère la qualité du recalage. Pour corriger cela, d'autres données pré-opératoires peuvent être acquises, comme la localisation de la surface corticale, ou encore des images US localisées en 3D. Ce nouveau recalage permet de compenser ce problème, mais en partie seulement. Ainsi, des modèles mécaniques ont été développés, entre autres pour apporter des solutions à l'amélioration de ce recalage. Ils permettent ainsi d'estimer les déformations du cerveau. De nombreuses méthodes existent pour implémenter ces modèles, selon différentes lois de comportement et différents paramètres physiologiques. Dans tous les cas, cela requiert un modèle anatomique patient-spécifique. Actuellement, ce modèle est obtenu par contourage manuel, ou quelquefois semi-manuel. Le but de ce travail de thèse est donc de proposer une méthode automatique pour obtenir un modèle du cerveau adapté sur l'anatomie du patient, et utilisable pour une simulation mécanique. La méthode implémentée se base sur les modèles déformables pour segmenter les structures anatomiques les plus pertinentes dans une modélisation bio-mécanique. En effet, les membranes internes du cerveau sont intégrées: falx cerebri and tentorium cerebelli. Et bien qu'il ait été démontré que ces structures jouent un rôle primordial, peu d'études les prennent en compte. Par ailleurs, la segmentation résultante de notre travail est validée par comparaison avec des données disponibles en ligne. De plus, nous construisons un modèle 3D, dont les déformations seront simulées en utilisant une méthode de résolution par Éléments Finis. Ainsi, nous vérifions par des expériences l'importance des membranes, ainsi que celle des paramètres physiologiques. / The general problem that motivates the work developed in this thesis is: how to obtain anatomical information during a neurosurgery?. Magnetic Resonance (MR) images are usually acquired before the surgery to provide anatomical information for diagnosis and planning. Also, the same images are commonly used during the surgery, because to acquire MRI images in the operating room is complex and expensive. To make these images useful inside the operating room, a registration between them and the patient's position has to be processed. The problem is that the brain suffers deformations during the surgery, in a process called brain shift, degrading the quality of registration. To correct this, intra-operative information may be used, for example, the position of the brain surface or US images localized in 3D. The new registration will compensate this problem, but only to a certain extent. Mechanical models of the brain have been developed as a solution to improve this registration. They allow to estimate brain deformation under certain boundary conditions. In the literature, there are a variety of methods for implementing these models, different equation laws used for continuum mechanic, and different reported mechanical properties of the tissues. However, a patient specific anatomical model is always required. Currently, most mechanical models obtain the associated anatomical model by manual or semi-manual segmentation. The aim of this thesis is to propose and implement an automatic method to obtain a model of the brain fitted to the patient's anatomy and suitable for mechanical modeling. The implemented method uses deformable model techniques to segment the most relevant anatomical structures for mechanical modeling. Indeed, the internal membranes of the brain are included: falx cerebri and tentorium cerebelli. Even though the importance of these structures is stated in the literature, only a few of publications include them in the model. The segmentation obtained by our method is assessed using the most used online databases. In addition, a 3D model is constructed to validate the usability of the anatomical model in a Finite Element Method (FEM). And the importance of the internal membranes and the variation of the mechanical parameters is studied.

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