O aminoácido glutamato é o principal neurotransmissor excitatório do SNC de mamíferos e participa de funções importantes como cognição, memória, aprendizagem e plasticidade neuronal. Porém, excessiva estimulação dos receptores glutamatérgicos pode resultar em morte celular, processo este denominado excitotoxicidade e que está associado à processos neurodegenerativos. A remoção do glutamato da fenda sináptica, que ocorre através de transportadores dependentes de sódio de alta afinidade, localizados principalmente nos astrócitos, é o principal mecanismo modulatório das ações glutamatérgicas e responsável pela manutenção de concentrações extracelulares abaixo dos níveis neurotóxicos. O Ácido quinolínico (AQ), um agonista NMDA, é uma potente neurotoxina endógena, cujo acúmulo no cérebro parece estar envolvido na etiopatologia das convulsões. Entretanto, apesar do seu envolvimento em muitas doenças, os mecanismos moleculares e danos cerebrais ainda não são perfeitamente elucidados. Os derivados da guanina com funções extracelulares, sejam os nucleotídeos GTP, GDP ou GMP, e o nucleosídeo guanosina mostraram exercer ações tróficas em células neurais, bem como modular o sistema glutamatérgico. Os resultados demonstram que vários sistemas de transporte de glutamato são afetados pela ação do ácido quinolínico, e que os nucleotídeos da guanina podem exercer ação modulatória destas respostas. Nos estudos in vitro, o AQ estimulou a liberação de glutamato em sinaptossomas e inibiu a captação de glutamato por astrócitos. Observou-se ainda que o AQ inibiu a captação vesicular de glutamato, porém os nucleotídeos da guanina foram capazes de prevenir esta inibição, indicando uma possível modulação neste tranportador. Nos estudos in vivo, usando um modelo experimental de indução de convulsão por AQ, observou-se que a liberação sinaptossomal glutamatérgica também está estimulada, porém este efeito foi completamente abolido pela guanosina, quando este nucleosídeo foi capaz de prevenir a convulsão. AQ também estimula a captação vesicular de glutamato e inibe a captação vesicular de GABA; da mesma forma, os nucleotídeos da guanina exercem seus efeitos modulatórios, já que tanto a inibição quanto o aumento de captação retornaram aos níveis do controle quando houve prevenção da convulsão. Adicionalmente, estas alterações na captação vesicular de glutamato parecem ser relacionadas ao AQ, já que em outros modelos (picrotoxina, cainato, cafeína, PTZ ou eletrochoque transcorneal) não foram observadas alterações. Nossos resultados sugerem que os nucleotídeos da guanina exercem importante função como neuromoduladores e ainda neuroprotetores. / Glutamate is the main excitatory neurotransmitter in mammalian CNS, involved in processes such as plasticity, learning and memory, and neural development. However, an excessive glutamate receptors activation can induce intracellular events which lead to the neural death through excitotoxic events, wich are associated to the etiology of neuodegeneratives disorders. The removal of glutamate from the synaptic cleft, which occurs by high affinity of sodium-dependent transporters, located mainly in astrocyte membranes, is the major mechanism for modulating of glutamate actions, responsible for maintaining its extracellular concentrations below neurotoxic levels. Quinolinic acid (QA), an NMDA agonist, is a potent endogenous neurotoxin. Accumulation of QA in the brain seems to be involved in the ethiopatogeny of convulsions. However, in spite of its involvement in many diseases, the molecular mechanisms linking QA and brain damage are far from understood. Extracellular guanine-based purines (GBPs), namely the nucleotides GTP, GDP, GMP and the nucleoside guanosine have been shown to exert trophic effects on neural cells, as well as to modulate of the glutamatergic system. The results demonstrate that various systems of glutamate transport are affected by action of QA, and guanine nucleotides exert modulatory effect. In in vitro studies, QA stimulates glutamate release in synaptosomes and inhibits the glutamato uptake by astrocytes. We observed that QA inhibits glutamate vesicular uptake, however guanine nucleotides prevent this inhibition, indicating a possible modulation of this transporter. In in vivo studies, using a experimental model of QA-induced seizures, we observed that synaptosomal glutamate release is stimulated, and this effect was completely abolished by guanosina. QA stimulates the glutamate uptake and inhibits the GABA uptake, and guanine nucleotides exert modulatory effect, because both effects are abolished when animals not displaying seizures. Additionally, this alterations in vesicular glutamate uptake appears are related with QA, because in other models of seizure (picrotoxin, kainate, caffeine, PTZ or maximal transcorneal electroshock) we do not observed any alterations. Our results suggest that guanine nucleotides exert an important role as neuromodulators and neuroprotectors.

Diversos trabalhos têm relacionado a fisiopatogenia da acidemia glutárica tipo I (GA I) com a excitotoxicidade glutamatérgica. Ainda que sob intenso debate, a maioria desses trabalhos se baseia na semelhança estrutural existente entre o glutamato e os principais ácidos orgânicos acumulados na GA I, os ácidos glutárico (GA) e 3-hidroxiglutárico (3-OHGA). Tendo em vista a janela de vulnerabilidade cerebral dos pacientes afetados pela GA I durante os primeiros anos de vida e o distinto padrão de expressão e propriedades de receptores e transportadores glutamatérgicos ao longo do desenvolvimento, o presente trabalho teve por objetivo investigar os efeitos dos ácidos GA e 3-OHGA sobre a ligação de glutamato a seus receptores e transportadores de membrana plasmática e sobre a captação de glutamato por fatias e preparações sinaptossomais de córtex cerebral e estriado de ratos de 7 a 60 dias de vida. Nossos resultados demonstraram que o 3-OHGA inibiu a ligação de glutamato a seus receptores e transportadores de membrana em córtex cerebral de ratos de 30 dias de vida. Observamos ainda que esse ácido parece interagir com receptores do tipo NMDA, agindo como um fraco agonista desses receptores por aumentar a ligação de MK-801 em receptores de membrana e o influxo de Ca2+ em fatias de córtex cerebral de ratos. Através do estudo ontogenético da ligação de glutamato a seus receptores e transportadores de membrana plasmática de ratos na presença de GA e 3-OHGA, verificamos que o GA inibe a ligação de glutamato a seus receptores de membrana em córtex cerebral e estriado de ratos de 7 e 15 dias de vida. A utilização de antagonistas glutamatérgicos juntamente com a inibição da ligação de cainato a seus receptores na presença de GA indicaram que os efeitos desse ácido sobre a ligação de glutamato a seus receptores parecem envolver receptores do tipo não- NMDA, possivelmente do tipo cainato. O ácido 3-OHGA inibiu a ligação de glutamato somente a transportadores de membrana de estriado de ratos de 7 dias de vida. Os estudos de captação de glutamato mostraram que o GA inibe o transporte desse neurotransmissor apenas em fatias de córtex cerebral de ratos de 7 dias de vida. Esse efeito não foi devido à morte celular e foi prevenido por pré-administração de N-acetilcisteína sugerindo o envolvimento de dano oxidativo na presença do GA. Além disso, o efeito do GA parece envolver os transportadores glutamatérgicos do tipo GLAST, expressos nos estágios iniciais de desenvolvimento cerebral. Em contraste, o ácido 3-OHGA não afetou a captação de glutamato por fatias de córtex cerebral e estriado de ratos. Observamos também que os ácidos GA e 3-OHGA não afetaram a captação de glutamato por preparações sinaptossomais de cérebro de ratos. Os efeitos detectados no presente estudo pelos ácidos GA e 3-OHGA em períodos específicos do desenvolvimento e também nas distintas estruturas cerebrais estudadas podem estar relacionados com a expressão diferenciada de receptores e transportadores glutamatérgicos no cérebro de ratos. Apesar de não explicarem a janela de vulnerabilidade estriatal, tais resultados podem auxiliar na elucidação dos mecanismos fisiopatogênicos envolvidos no dano neurológico ocorrido durante os primeiros anos de vida dos pacientes com GA I. / The role of excitotoxicity in the cerebral damage of glutaric acidemia type I (GA I) is under intense debate. Several studies relate the excitotoxic actions of the major metabolites accumulating in GA I, glutaric (GA) and 3-hydroxyglutaric acids (3-OHGA), based on the chemical structural similarity between these organic acids and glutamate. Considering that GA I patients present a window of cerebral vulnerability during the first years of life and the variable ontogenetic pattern of glutamate receptors and transporters expression and properties, the objective of the present work was to investigate the effects of GA and 3-OHGA on glutamate binding to receptors and transporters from synaptic plasma membranes and on glutamate uptake by slices and synaptosomal preparations from cerebral cortex and striatum during rat brain development. Our results demonstrated that 3-OHGA inhibited glutamate binding to receptors and transporters from plasma membranes of cerebral cortex of 30-day-old rats. Moreover, its effect on glutamate receptors seems to be directed towards NMDA receptors and suggests that 3-OHGA acts as a weak agonist of these receptors by increasing the MK-801 binding to membrane receptors and Ca2+ influx into cerebral cortex slices of rats. The ontogenetic study of glutamate binding to receptors and transporters in the presence of GA and 3- OHGA revealed that GA decreased the glutamate binding to receptors from plasma membranes of cerebral cortex and striatum of 7- and 15-day-old rats. In addition, by using glutamate antagonists and kainate binding assay, we verified that this effect involved non-NMDA receptors, probably kainate receptors. On the other hand, 3-OHGA inhibited glutamate binding to transporters from plasma membranes of striatum of 7-day-old rats. The glutamate uptake studies showed that GA decreased glutamate transport only in cerebral cortex slices of 7-day-old rats. Furthermore, this effect was not due to cellular death and was prevented by N-acetylcysteine preadministration suggesting the involvement of oxidative damage. Moreover, immunoblot analysis and glutamate uptake assays in the presence of GA and dihydrokainate (DHK) revealed that GA effect seems to involve GLAST transporters, which are expressed in early stages of rat brain development. In contrast, 3-OHGA did not affect glutamate uptake by brain slices. We also observed that both GA and 3-OHGA did not affect glutamate uptake by synaptosomal preparations from rat brain. Concluding, the effects provoked by GA and 3-OHGA at specific ages of development and also in distinct cerebral structures may possibly be explained by the differential ontogenetic and regional specific expression of the glutamate receptors and transporters in rat brain. Although these results can not explain the window of striatal vulnerability, they may contribute to elucidate the mechanisms of the neurological damage occurred during the first years of life in GA I patients.

O metotrexato (MTX) é um antagonista do ácido fólico amplamente utilizado no tratamento de doenças neoplásicas e não neoplásicas. Entretanto, o uso terapêutico desse fármaco pode levar à neurotoxicidade que pode se manifestar na forma aguda, subaguda e crônica, abrangendo os seguintes sintomas: cefaléia, sonolência, confusão, edema cerebral, convulsões, encefalopatia, coma e prejuízo das funções cognitivas. Os achados neuropatológicos consistem de astrogliose reativa, desmielinização, dano axonal e necrose da substância branca. Em nível celular, o MTX parece afetar primeira e seletivamente os astrócitos, quando comparados com os neurônios.O exato mecanismo neurotóxico do MTX continua não esclarecido, e parece ser multifatorial. Visando ampliar os conhecimentos a respeito dos efeitos do MTX no SNC, foram desenvolvidos dois trabalhos com diferentes modelos em animais, nos quais foram estudados os possíveis mecanismos de ação tóxica desse fármaco, como também propomos a utilização do marcador bioquímico S100B na detecção de injúrias cerebrais associadas ao tratamento. A partir dos resultados obtidos nos experimentos de captação de glutamato in vitro, verificamos que o MTX interfere na remoção do glutamato da fenda sináptica, podendo levar à excitotoxicidade. Também, o aumento da proteína S100B auxilia no entendimento dos mecanismos de ação do MTX, pois sugere que os astrócitos estão respondendo a um insulto na tentativa de neuroproteção Além disso, a S100B, aliada a outros marcadores neuroquímicos e técnicas de diagnóstico por imagem, seria muito importante no monitoramento terapêutico, pois poderia detectar alterações celulares sutis e ajudaria a prevenir a neurotoxicidade pelo MTX. Os resultados que obtivemos nos experimentos de convulsões induzidas pelo MTX demonstraram a participação do sistema glutamatérgico na neurotoxicidade desse fármaco. Especificamente, evidenciamos o envolvimento dos receptores inotrópicos glutamatérgicos na patogênese das convulsões. Porém, neste modelo experimental, a captação de glutamato possivelmente diminuiu em decorrência das manifestações das convulsões e não por uma ação direta, ou indireta, do MTX. O entendimento dos mecanismos de ação é muito importante para a clínica médica, pois permite que novas ferramentas sejam criadas no intuito de prevenir os danos tóxicos induzidos por fármacos. Assim, mais estudos devem ser realizados para tentar desvendar os mecanismos de neurotoxicidade do MTX, como também para estudar potenciais marcadores bioquímicos de injúria cerebral que auxiliem no monitoramento terapêutico.

A evolução da vida na terra foi possível graças ao desenvolvimento de mecanismos temporais precisos capazes de ajustar processos fisiológicos que ocorriam no interior do organismo com os ciclos ambientais, promovendo assim, ganhos na capacidade adaptativa e comportamental desses indivíduos. A retina exerce função de suma importância nesse processo através da percepção da informação fótica que possibilita o ajuste dos ritmos circadianos. Nesse tecido, o glutamato apresenta um importante papel tanto na transmissão da informação fótica direcionada ao processo de formação de imagem quanto nos ajustes dos relógios biológicos. O objetivo desse trabalho foi avaliar como o glutamato, aplicado por períodos diferentes (6 e 12h), é capaz de modular a expressão dos genes de relógio na retina de Gallus gallus. Através de diferentes protocolos que envolveram a administração de glutamato na concentração de 100μM por 6 e 12 horas e em diferentes repetições (1 e 3 pulsos) avaliou-se através de PCR quantitativo a expressão dos genes Clock, Per2 e Bmal1. Os diferentes genes de relógio na retina de Gallus gallus apresentam diferentes respostas frente às trocas de meio e frente ao tratamento com o glutamato. O gene Clock responde com ativação da transcrição para ambos os tratamentos, de forma dependente da repetição dos estímulos. Já para o gene Per2 o tratamento com glutamato impõe uma oscilação de expressão com um ritmo ultradiano, enquanto que as trocas de meio não determinam alterações na transcrição. A expressão do gene Bmal1 não é afetada nem por trocas de meio, nem por glutamato. Novos estudos devem ser fomentados no sentido de se elucidar as vias pelas quais o glutamato leva ao perfil de oscilação observado e qual o mecanismo pelo qual a repetição de trocas de meio atua como sinalizador para o estabelecimento da sincronização celular / The evolution of life on earth was possible thanks to the development of precise temporal mechanisms to adjust physiological processes to environmental cycles, thus promoting gains in the individual adaptive and behavioral ability. The retina plays a very important role of paramount importance in this process through the perception of photic information that allows the adjustment of circadian rhythms. In this tissue, glutamate functions in the transmission of photic information directed to both image formation and biological clock entrainment. The aim of this study was to evaluate how glutamate, applied for different periods (6 and 12h), is able to modulate the expression of the clock genes in the retina of Gallus gallus. Using different protocols involving the administration of 100μM glutamate for 6 and 12 hours and with different repetitions (1 and 3 pulses) the expression of Clock, Per2 and Bmal1 genes was evaluated by quantitative PCR. Clock gene responds with activation of transcription to both treatments depending on the repetition of the stimulus. As for Per2 gene, glutamate treatment imposes an oscillation with an ultradian expression rhythm, whereas medium changes do not affect its transcription. The expression of Bmal1 gene is not affected by either medium changes or glutamate. Further studies should be encouraged in order to elucidate the pathways by which glutamate leads to observed oscillation profile, and which mechanism triggered by the repetition of medium changes acts as signal to establish cell synchronization

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Methylmercury (MeHg) is a highly toxic environmental contaminant that can be accumulated on several tissues, inducing cellular dysfunction on various organs, especially in the central nervous system (CNS). The mechanisms involved in the uptake, accumulation and toxicity of mercury (Hg) remain unclear. However, it has been suggested that the neurotoxicity mediated by MeHg induces changes in both glutamatergic system and calcium homeostasis. Indeed, the literature reports that calcium per se is able in inducing cellular damage. Thus, mercury and calcium can exert distinct or linked toxic effect that lead to mitochondrial and cellular dysfunction. The purpose of this study was to analyze the mechanisms of uptake and accumulation of mercury on liver slices exposed to MeHg or MeHg-Cysteine complex, as well as to compare the mitochondrial and cellular toxicity caused by both forms of MeHg. Moreover, this work examined the role of glutamatergic system on the toxicity mediated by MeHg in slices of cerebral cortex from rats and the effects of calcium exposure in mitochondria sustained with different energetic substrates. Our results showed that the mercury uptake was higher in the slices exposed to the MeHg-Cys complex that MeHg exposed slices. Indeed, the pretreatment with methionine (Met) (for 15 min.) reduced Hg uptake in liver slices. Likewise, mitochondria isolated of liver slices showed similar effect on Hg uptake. Parameters as free radical generation; oxygen consumption and mitochondrial function/Cell viability were more affected by MeHg-Cys complex than MeHg alone. Met pre-treatment was effective in preventing the MeHg or MeHg-Cys-induced toxicity in both liver slices and mitochondria. In cortical brain slices, the neurotoxicity induced by MeHg was verified only at higher concentration tested and after 2 or 5 hours of exposure. In addition, compounds that potentially modulate glutamatergic system (MK-801, guanosine, organo selenium compounds) were effective in preventing the MeHg-induced free radical generation. In mitochondria isolated from liver, Ca2+ caused an inhibition on the complex I activity; however, calcium did not alter the mitochondrial complex II activity. At low concentration, calcium exposure caused a small decrease in the mitochondrial membrane potential (ΔΨm) in Malate/Glutamate (Ma/Glu) and Succinate (Succ)-supported mitochondria. On the order hand, higher calcium levels were associated with a total ΔΨm loss in both Mal/Glu and Succ-oxidizing mitochondria. The mitochondrial redox state (NADP(H) and GSH pool) and oxygen consumption were extremely affected by calcium exposure only in Succ-supported mitochondria. Indeed, calcium caused an increase in free radical generation in mitochondria sustained with complex II substrate when compared to Mal/Glu-supported mitochondria. Taken together, our data collaborate to understanding the molecular mechanisms involved on the toxicology of mercury and calcium and consequently provide basis for further investigations on the role of Ca2+ and mercury in mitochondrial dysfunctions. In addition, the results obtained here may contribute to the discovery of new therapeutic agents capable of preventing or minimizing the damage induced by MeHg intoxication. / O metilmercúrio (MeHg) é um contaminante ambiental altamente tóxico que pode ser bioacumulado em diferentes tecidos e consequentemente induzir disfunções celulares em diversos órgãos, especialmente no sistema nervoso central (SNC). Os mecanismos pelos quais o mercúrio (Hg) entra nos tecidos, se acumula e causa toxicidade em células e organelas ainda não se encontram totalmente elucidados. No entanto, estudos têm sugerido que a neurotoxicidade mediada pelo MeHg envolve alterações no sistema glutamatérgico e na homeostase do cálcio. Por outro lado, sabe-se que o cálcio (Ca2+) per se causa efeitos tóxicos nas células e principalmente em mitocôndrias. Assim o Hg e o Ca2+ podem induzir efeitos distintos ou interligados, os quais geralmente culminam com disfunção mitocondrial e morte celular. Com base nestes parâmetros, o presente trabalho visa elucidar os possíveis mecanismos moleculares envolvidos na captação e no acúmulo de Hg em fatias hepáticas expostas a forma livre de MeHg+ ou à forma complexada MeHg-Cisteína (MeHg-Cys), bem como, relacionar estes aspectos com a toxicidade celular e mitocondrial causada por ambas as formas de MeHg. Também foi alvo deste estudo a investigação do papel do sistema glutamatérgico na toxicidade mediada pelo MeHg em fatias de córtex cerebral de ratos e os efeitos do cálcio em mitocôndrias isoladas e sustentadas com diferentes substratos energéticos. Com relação à captação de Hg, nossos resultados mostram que fatias expostas ao complexo MeHg-Cys acumulam mais Hg que fatias expostas ao MeHg sozinho. Também foi observado que o pré-tratamento (15 min) com metionina (Met) reduziu significativamente a captação e o acúmulo de Hg nas fatias. Resultados similares foram verificados em mitocôndrias isoladas dessas fatiais. Nos parâmetros bioquímicos: geração de radicais livres, consumo de oxigênio e viabilidade celular/atividade mitocondrial, o complexo MeHg-Cys causou efeitos mais tóxicos quando comparado com o MeHg sozinho. O pré-tratamento com Met foi efetivo em prevenir as alterações mediadas por ambas as formas de mercúrio testadas. Os efeitos neurotóxicos do MeHg em fatias de córtex cerebral foram observados apenas nas maiores concentrações usadas e após 2 ou 5 horas de exposição. A utilização de compostos que possivelmente modulam a homeostase glutamatérgica (MK-801, guanosina e compostos orgânicos de selênio) preveniram os efeitos induzidos por MeHg na geração de radicais livres. Os efeitos do cálcio foram analisados em mitocôndrias isoladas e sustentadas com o substrato energético do complexo mitocondrial I: Malato/Glutamato (Mal/Glu) e do complexo II Succinato (Succ). Os resultados obtidos mostram que o cálcio inibiu a atividade complexo I; mas não alterou a atividade complexo II. Em baixas concentrações o cálcio causou uma pequena diminuição no potencial de membrana (ΔΨm) nas mitocôndrias sustentadas com Mal/Glu ou Succ. Por outro lado, uma perda total do potencial foi observada quando as mitocôndrias, sustentadas com ambos os substratos, foram expostas a altas concentrações de cálcio. A exposição ao cálcio causou uma redução no potencial redox (conteúdo NADP(H) e GSH) e no consumo de oxigênio nas mitocôndrias sustentadas com Succ quando comparado com as que receberam Mal/Glu. A geração de radicais livres foi aumentada em mitocôndrias expostas ao cálcio e sustentadas com Succ quando comparadas com as mitocôndrias sustentadas com substrato do complexo I. De forma geral, nossos resultados colaboram para a elucidação dos mecanismos moleculares envolvidos na citotoxicidade induzida por MeHg e por cálcio, bem como para um melhor entendimento sobre o papel destes elementos na indução de disfunção mitocondrial. Além disso, os resultados obtidos poderão contribuir para a descoberta de novos agentes terapêuticos usados para prevenir ou minimizar danos teciduais associados à intoxicação humana por MeHg.

Os mecanismos envolvidos nas atividades toxicológicas e/ou farmacológicas dos compostos orgânicos de selênio são pouco conhecidos. Os compostos orgânicos de selênio (disseleneto de difenila e ebselen) e organotelúrio (ditelureto de difenila) foram alvo dos trabalhos realizados“in vitro”, neste estudo. Os compostos organocalcogênios apresentaram efeitos diversos sobre o influxo de 45Ca2+ medido em sinaptossomas de cérebro de rato, dependendo das condições e agentes despolarizantes usados. Ebselen, (PhSe)2 e (PhTe)2 alteram a captação de 45Ca2+ de maneira distinta quando expostos a aminopiridina ou KCl. Enquanto (PhTe)2 inibe a captação de cálcio em todas as condições experimentadas, (PhSe)2, apresenta este efeito apenas quando incubado em condições basais ou sob a ação de aminopiridina. Ebselen, por sua vez, aumenta a captação de cálcio em altas concentrações em condições basais e sob a ação de aminopiridina, porém, apresenta efeito inverso quando os sinaptossomas são despolarizados por KCl. Ebselen evitou a inibição da captação de 45Ca2+ “in vitro” provocada por cloreto de mercúrio(HgCl) em sinaptossomas de cérebro de rato em condições basais do ensaio, no entanto, ebselen não afetou a inibição da captação de glutamato “in vitro” por HgCl, indicando que ebselen pode atuar dependendo das proteínas-alvo consideradas.Os compostos de mercúrio, MeHg e HgCl, inibiram a captação de glutamato em córtex cerebral de ratos de 17 dias e ebselen reverteu somente o efeito do MeHg porém, não, o do HgCl. Disseleneto de difenila não alterou os parâmetros avaliados na exposição de ambos os compostos de mercúrio.Os compostos de mercúrio estudados provocaram a morte celular das fatias de córtex, porém, ebselen protegeu as fatias dos efeitos lesivos provocados por MeHg e não pelo HgCl.

O presente estudo tem por objetivo investigar a influência da privação dietética de ácidos graxos ω3 no sistema glutamatérgico no hipocampo de ratos Wistar em parâmetros ontogenéticos e relacionados à neuroproteção. Os ratos foram alimentados, desde a gestação até a vida adulta, com duas dietas diferentes: uma dieta contendo ácidos graxos ω3 (grupo controle, C) e outra deficiente nestes ácidos graxos (grupo deficiente, D). Nos experimentos ontogenéticos, foram avaliados os imunoconteúdos das subunidades de receptores glutamatérgicos ionotrópicos do tipo NMDA (NR2 A/B) e AMPA (GluR1), bem como da isoforma alfa da cinase dependente de cálcio e calmodulina do tipo II (αCaMKII). Também foram avaliados a capacidade do glutamatode ligar-se a seus receptores e a captação de [3H]glutamato em fatias de hipocampo. Para investigar o efeito da privação de ácidos graxos ω3 na resposta cerebral frente à injúria isquêmica, fatias de hipocampo foram submetidas à privação de glicose e oxigênio (OGD), um modelo de isquemia in vitro. O grupo D apresentou imunoconteúdo reduzido de todas as proteínas avaliadas aos 02 dias de vida, o que foi sendo normalizado aos 21 dias (exceto pela αCaMKII) e aos 60 dias. O mesmo padrão foi observado na capacidade de ligação do glutamato aos seus receptores. Porém a captação de [3H]glutamato não foi afetada pelas dietas. Nos experimentos de OGD, o grupo D apresentou maior dano celular e uma queda na captação de [3H]glutamato mais acentuada que o grupo controle. Ainda, a privação de ácidos graxos ω3 influenciou a resposta celular anti-apoptótica após OGD, afetando a fosforilação das proteínas GSK3β e ERK1/2, mas não a fosforilação da Akt. Estes resultados sugerem que os ácidos graxos ω3 são importantes para o desenvolvimento do sistema glutamatérgico e para a proteção celular após dano isquêmico, além de ser importante para ativação de rotas de sinalização anti-apoptóticas. / The effect of dietary deprivation of essential omega-3 fatty acids on parameters of the glutamatergic system related to brain ontogeny and neuroprotection was investigated in this study. Rats were fed with two different diets: omega-3 diet (control group) and omega-3 deprived-diet (D group). In ontogeny experiments, it was evaluated the hippocampal immunocontent subunits of the of ionotropic glutamatergic receptor NMDA and AMPA (NR2 A\B and GluR1, respectively) and the alfa isoform of the calcium-calmodulin protein kinase tipe II (αCaMKII), as well as the binding and uptake of [3H]glutamate. To assess the influence of omega-3 fatty acids deprivation on brain responses to ischemic insult, hippocampal slices were submitted to oxygen and glucose deprivation (OGD), a model of in vitro ischemia. The D group showed lower immunocontent of all proteins analyzed at 02 days of life (P2) than the control group, and it was normalized at P21 (except for αCaMKII) and P60. The same pattern was found for [3H]glutamate binding, while [3H]glutamate uptake was not affected. In the OGD studies, the D group showed higher cell damage and stronger decrease in the [3H]glutamate uptake. Moreover, omega-3 deprivation influenced anti-apoptotic cell response after OGD, affecting GSK-3beta and ERK1/2, but not Akt phosphorylation. Taken together, these results suggest that omega-3 fatty acids are important for the glutamatergic development and cell protection after ischemia, and also seem to play an important role on activation of anti-apoptotic signaling pathways.

Os objetivos da presente tese de doutorado foram os de investigar o papel dos derivados da guanina na nocicepção e compreender os mecanismos responsáveis pelos efeitos extracelulares desses compostos. Os resultados desta tese estão divididos em três partes, de acordo com sua natureza, em revisão da literatura (parte um), experimental (parte dois) e clínica (parte três). Para o desenvolvimento da primeira parte, uma extensa revisão da literatura em relação ao papel extracelular das purinas foi realizada e um novo sistema guanosinérgico foi proposto. Na segunda parte desta tese, procedimentos experimentais em animais demonstraram que a guanosina é antinociceptiva em diversos modelos de dor. A administração sistêmica de guanosina causou um aumento significativo nos níveis de guanosina no líquido cefalorraquiano (LCR), demonstrando que este composto penetra ativamente no sistema nervoso central. Diversos testes comportamentais e neuroquímicos demonstraram o baixo potencial de toxicidade apresentado pela guanosina. A seguir, os mecanismos de ação envolvidos nos efeitos antinociceptivos da guanosina foram investigados através de métodos neuroquímicos e farmacológicos. Guanosina foi escolhida porque tem demonstrado interagir com o sistema glutamatérgico - sabidamente envolvido na transmissão da dor - por estimular a recaptação de glutamato. Guanosina atenuou o comportamento doloroso induzido pela injeção intratecal de glutamato e seus agonistas (AMPA, cainato, trans-ACPD) e hiperalgesia induzida por altas doses de MK-801, um efeito provavelmente relacionado à diminuição das concentrações de glutamato e aspartato no LCR. Guanosina também foi testada em um método para avaliar a captação de glutamato em fatias de cérebro e medula. Nossos resultados demonstraram que a guanosina não alterou a captação basal de glutamato. Entretanto, a guanosina atenuou os efeitos da dor sobre a captação de glutamato. Baseado nestes dados, não é possível estabelecer uma relação causal entre os dados da captação e o comportamento doloroso. Entretanto, podemos argumentar que os efeitos da guanosina sobre a captação de glutamato foram provavelmente produzidos pela modulação do estímulo doloroso e não correspondem a um mecanismo de ação responsável por estas alterações. Também demonstramos que o alopurinol, um derivado das purinas e inibidor da xantina oxidase normalmente utilizado para o tratamento de hiperuricemia, também produziu efeitos antinociceptivos em camundongos. Este efeito está provavelmente relacionado ao acúmulo de adenosina e guanosina no meio extracelular. Apesar da utilização clínica das purinas ser demasiadamente precoce, podemos inferir que a utilização de alopurinol poderia ser uma excelente estratégia para testar nossas hipóteses, pois demonstra a vantagem de estar aprovado para uso comercial, apresentar boa tolerabilidade e baixo custo. A terceira parte desta tese demonstra trabalhos sobre o sistema purinérgico em humanos. Estes estudos investigaram a correlação entre a concentração de purinas no LCR e dor aguda ou crônica em humanos. Os resultados demonstram que adenosina, guanosina e inosina correlacionaram-se significativamente com a dor em humanos. Os resultados apresentados nesta tese ratificam o papel das purinas nos mecanismos de transmissão da dor e um novo papel para a guanosina é proposto: a modulação da dor. Guanosina e outras purinas são alvos para desenvolvimento de novos fármacos e podem ser úteis no tratamento de dor relacionada a hiperestimulação do sistema glutamatérgico. / The main aims of this work were the investigation of the role of guanine-based purines on nociception and the understanding of the mechanism of action leading to extracellular effects of these compounds. The results obtained are presented in three distinct parts based on their nature, namely, literature review (part one), experimental (part two) and clinical (part three). For the development of the first part, an extensive review of the literature regarding the extracellular roles for the purinergic system was performed and a guanine-based purinergic system was proposed. In the second part, experimental procedures in animals demonstrated that guanosine is antinociceptive in several acute or chronic pain models in rodents. Systemic administration of guanosine significantly increased cerebrospinal fluid (CSF) guanosine levels, showing that this compound actively penetrates in the central nervous system. Several behavioral tasks and neurochemical approaches demonstrated that guanosine presents minimal toxic effects. After that, the mechanisms of action underlying the antinociceptive effects of guanosine were investigated, by using pharmacological and neurochemical means. Guanosine was chosen because it has been shown to interact with the glutamatergic system - which is known to be involved in the mechanisms of pain transmission - by promoting astrocytic glutamate reuptake. Guanosine attenuated nociceptive behavior induced by intrathecal administration of glutamate and its receptor agonists (AMPA, kainate, trans-ACPD) and hyperalgesia induced by high-dose MK-801, an effect that seems to be related with the reduction of glutamate and aspartate accumulation in the CSF. Guanosine was tested in a model of glutamate uptake by brain and spinal cord slices from rats and mice. Our results demonstrated that guanosine did not alter basal glutamate uptake at both brain and spinal cord. However, guanosine attenuated effects on glutamate uptake induced by pain behavior in animals. It is not possible to establish whether the changes in the spinal cord glutamate uptake were responsible for nociceptive behavior or it caused the changes. However, we may argue that the changes in the glutamate uptake induced guanosine were probably produced by modulation of nociceptive stimuli rather than an underlying mechanism of action. In the second part of this work, we demonstrated that allopurinol, a purine derivative and xanthine oxidase inhibitor commonly used to treat hyperuricemia, also produced consistent antinociception in mice. This effect was probably related to the accumulation of extracellular adenosine and guanosine. It was therefore concluded that, although is early to propose the use of purines in a clinical setting, allopurinol could be an excellent alternative to test this hypothesis since shows the advantage of be already approved for commercial use, presenting well tolerability and very low cost. The third part of this work presents some results derived from the human models of pain. These studies investigated the correlation between the CSF concentration of purines and acute or chronic pain in humans. Our results show that adenosine, guanosine and inosine were significantly correlated with pain in humans. Altogether these results further demonstrate the role of purines in pain mechanisms and provide a new role for guanosine: pain modulation. Guanosine and other purines presents as a new target for future drug development and might be useful for treat pain related to overstimulation of the glutamatergic system.

A espécie redox ativa resveratrol (3,5,4’-trihidroxi-trans-estilbeno), uma fitoalexina encontrada nas uvas e no vinho tinto, apresenta importantes efeitos biológicos como atividade antioxidante, anti-inflamatória, antitumoral e cardioprotetora. O sistema nervoso central (SNC) também é alvo do resveratrol que por sua vez pode atravessar a barreira hematoencefálica e exercer efeito neuroprotetor, modulando importantes funções neurogliais. Fisiologicamente os astrócitos controlam importantes funções cerebrais, principalmente, relacionadas ao metabolismo glutamatérgico, à plasticidade sináptica e neuroproteção; e em situações neuropatológicas, relacionadas ao estresse oxidativo. Assim, neste estudo nós investigamos o efeito do resveratrol sobre importantes parâmetros gliais em células C6 frente a dois modelos de insulto oxidativo: (I) 1 mM de H2O2/0,5 h e (II) 0,1 mM de H2O2/6 h. Avaliamos, nessas condições, o perfil das principais defesas antioxidantes enzimáticas celulares, a genotoxicidade celular e possíveis vias de sinalização que possam contribuir para o melhor entendimento do mecanismo de ação do resveratrol no SNC. Nós demonstramos que o resveratrol modula a captação de glutamato; a atividade da enzima glutamina sintetase; os níveis intra e extracelulares de glutationa; a secreção da proteína S100B; as enzimas SOD, CAT e GPx; a peroxidação lipídica; a frequência de micronúcleos; as enzimas heme oxigenase 1 e iNOS e o fator de transcrição NFκB, de maneira dependente das condições oxidativas do meio e do ambiente redox celular. Dessa forma, nossos resultados mostram que o resveratrol apresenta comportamentos anti e pró-oxidante e que sua ação neuroprotetora pode estar relacionada a modulação da atividade glial e da heme oxigenase 1. Enfim, o resveratrol pode representar um potencial agente terapêutico em patologias que envolvam déficits no sistema glutamatérgico associado ao estresse oxidativo. / The redox active compound, resveratrol (3,5,4 '-trihydroxy-trans-stilbene), a phytoalexin, found in grapes and red wine, has a wide range of biological effects, such as, antioxidant, antiinflammatory, anticancer and cardioprotective. The central nervous system (CNS) is also the target of resveratrol which is able to trespass the blood-brain barrier and exerts neuroprotective effects by modulating important glial parameters. Physiologically, astrocytes control important brain functions, mainly related to glutamatergic metabolism, synaptic plasticity and neuroprotection; and in neurophatology events related to oxidative stress. In this study, we investigated the effect of resveratrol on important parameters in C6 astoglial cells against oxidative insult in two models: (I) 1 mM H2O2/0.5 h and (II) 0.1 mM H2O2/6 h. We evaluated under these conditions, the activity of the major cellular enzymatic antioxidant defenses, the possible genotoxicity and cell signaling pathways that may contribute to better understanding the mechanism of resveratrol in the CNS. Resveratrol modulates glutamate uptake; glutamine synthetase activity; intracellular and extracellular levels of glutathione; S100B secretion; the enzymes SOD, CAT and GPx; lipid peroxidation; the frequency of micronuclei; the enzymes heme oxygenase 1 and iNOS and the transcription factor NFκB depending upon the oxidant conditions of the milieu and the cellular redox environment. Thus, our results show that resveratrol presents anti and pro-oxidant effects and their neuroprotective action may be related to modulation of glial function and heme oxygenase 1. Finally, resveratrol can represent a potential therapeutic agent against pathologies associated to glutamatergic system and oxidative stress.

O presente estudo tem por objetivo investigar a influência da privação dietética de ácidos graxos ω3 no sistema glutamatérgico no hipocampo de ratos Wistar em parâmetros ontogenéticos e relacionados à neuroproteção. Os ratos foram alimentados, desde a gestação até a vida adulta, com duas dietas diferentes: uma dieta contendo ácidos graxos ω3 (grupo controle, C) e outra deficiente nestes ácidos graxos (grupo deficiente, D). Nos experimentos ontogenéticos, foram avaliados os imunoconteúdos das subunidades de receptores glutamatérgicos ionotrópicos do tipo NMDA (NR2 A/B) e AMPA (GluR1), bem como da isoforma alfa da cinase dependente de cálcio e calmodulina do tipo II (αCaMKII). Também foram avaliados a capacidade do glutamatode ligar-se a seus receptores e a captação de [3H]glutamato em fatias de hipocampo. Para investigar o efeito da privação de ácidos graxos ω3 na resposta cerebral frente à injúria isquêmica, fatias de hipocampo foram submetidas à privação de glicose e oxigênio (OGD), um modelo de isquemia in vitro. O grupo D apresentou imunoconteúdo reduzido de todas as proteínas avaliadas aos 02 dias de vida, o que foi sendo normalizado aos 21 dias (exceto pela αCaMKII) e aos 60 dias. O mesmo padrão foi observado na capacidade de ligação do glutamato aos seus receptores. Porém a captação de [3H]glutamato não foi afetada pelas dietas. Nos experimentos de OGD, o grupo D apresentou maior dano celular e uma queda na captação de [3H]glutamato mais acentuada que o grupo controle. Ainda, a privação de ácidos graxos ω3 influenciou a resposta celular anti-apoptótica após OGD, afetando a fosforilação das proteínas GSK3β e ERK1/2, mas não a fosforilação da Akt. Estes resultados sugerem que os ácidos graxos ω3 são importantes para o desenvolvimento do sistema glutamatérgico e para a proteção celular após dano isquêmico, além de ser importante para ativação de rotas de sinalização anti-apoptóticas. / The effect of dietary deprivation of essential omega-3 fatty acids on parameters of the glutamatergic system related to brain ontogeny and neuroprotection was investigated in this study. Rats were fed with two different diets: omega-3 diet (control group) and omega-3 deprived-diet (D group). In ontogeny experiments, it was evaluated the hippocampal immunocontent subunits of the of ionotropic glutamatergic receptor NMDA and AMPA (NR2 A\B and GluR1, respectively) and the alfa isoform of the calcium-calmodulin protein kinase tipe II (αCaMKII), as well as the binding and uptake of [3H]glutamate. To assess the influence of omega-3 fatty acids deprivation on brain responses to ischemic insult, hippocampal slices were submitted to oxygen and glucose deprivation (OGD), a model of in vitro ischemia. The D group showed lower immunocontent of all proteins analyzed at 02 days of life (P2) than the control group, and it was normalized at P21 (except for αCaMKII) and P60. The same pattern was found for [3H]glutamate binding, while [3H]glutamate uptake was not affected. In the OGD studies, the D group showed higher cell damage and stronger decrease in the [3H]glutamate uptake. Moreover, omega-3 deprivation influenced anti-apoptotic cell response after OGD, affecting GSK-3beta and ERK1/2, but not Akt phosphorylation. Taken together, these results suggest that omega-3 fatty acids are important for the glutamatergic development and cell protection after ischemia, and also seem to play an important role on activation of anti-apoptotic signaling pathways.