Apesar de representarem cerca de 50% de todas as células do encéfalo humano, as células da glia foram negligenciadas pela Doutrina do Neurônio, no início do século XX, por não serem excitáveis e por não se comunicarem como os neurônios. Durante um longo período, os estudos sobre os astrócitos se restringiam a suas funções de suporte do SNC. Atualmente se sabe que os astrócitos expressam receptores para uma variedade de neurotransmissores, como por exemplo, receptores colinérgicos nicotínicos, sugerindo possíveis mecanismos de resposta aos sinais enviados pela atividade neuronal, de modo variável e dinâmico, espontaneamente ou dependente da atividade neuronal e ativado pela alteração dos níveis intracelulares de Ca2+. Entretanto, os mecanismos específicos que explicam como essas células podem ser ativadas e qual sua contribuição para funcionamento do SNC ainda não estão totalmente esclarecidos. A secreção da proteína trófica S100B pelo astrócito pode ser um exemplo de comunicação celular, bem como também marcador biológico para diversas doenças. O nosso grupo já mostrou o envolvimento de diversos sistemas neuronais na modulação da secreção da proteína S100B. Um outro exemplo de comunicação é a liberação de gliotransmissores e a influência aguda astrocítica na transmissão sináptica. O objetivo dessa tese foi investigar se ativação do sistema colinérgico modula a secreção da proteína S100B em culturas primárias de astrócitos. Ainda, investigamos o uso da optogenética para o estudo da gliotransmissão em fatias de hipocampo. As culturas foram tratadas com inibidores da acetilcolinesterase (huperzina-A e tacrina), agonistas (acetiltiocolina, nicotina e carbacol) e antagonistas (mecamilamina e escopolamina) colinérgicos incubados durante 1 e 24 h. Os estudos em optogenética partiram primeiramente da caracterização do sistema cre/lox através da análise da expressão das proteínas de interesse, seletiva para astrócitos, por imunohistoquímica. Os resultados do primeiro estudo mostraram que a huperzina-A aumentou a secreção de S100B em culturas primárias de astrócitos, assim como o tratamento com nicotina; no segundo, discutiu-se as limitações metodológicas quanto a especificidade das proteínas e alteração da fisiologia dos astrócitos. Os resultados obtidos nessa tese ressaltam para a importância do conhecimento da fisiologia do astrócito, contribuindo para o entendimento de um possível mecanismo de ativação colinérgico dos astrócitos em promover secreção de S100B. Também é preciso ressaltar a relevância de novas metodologias que ajudam a descrever melhor o papel dos astrócitos na atividade sináptica. / Although about half of the brain cells are glial cells, the Neuron Doctrine has neglected them, at the beginning of 20th century, because they were not excitable and also, they were unable to communicate as neurons. For a long time, the studies about astrocytes functions were limited to trophic and metabolic support to neurons by which providing for the homeostasis of the nervous system. A variety of studies have been shown the expression of different neurotransmitters receptors in astrocytes, for instance, nicotinic receptors, suggesting the possibility of astrocytic response to neuronal activity. This response is variable and dynamic and mostly can be activated by changes at the intracellular calcium levels. However, the specific mechanisms of astrocytic Ca2+ excitability and how this process could contribute to CNS functioning are still unclear. The S100B secretion could be an example of cellular communication, as well as biomarker for diverse diseases. S100B is calcium binding protein, produced and secreted mainly by astrocytes. Our group has already demonstrated the relevance of various neuronal systems mediating the S100B secretion. Another astrocytic form of communication could be the release of gliotransmitters and the acute influence at synaptic transmission. The aim of this thesis was to investigate whether cholinergic system activation could modulate S100B secretion in primary astrocytes cultures. Moreover, we investigated the optogenetic properties as a tool for gliotransmission studies in hippocampal slices. The astrocytes cultures were treated with acetylcolinesterase inhibitors (huperzine-A and tacrine), agonists (acetylthiocholine, nicotine and carbachol) and antagonists (mecamylamine and scopolamine) for 1 and 24h. The optogenetic studies were conducted, firstly, from the cre/lox characterization of protein expression, selectively for astrocytes, by immunohistochemistry. The first study results showed that huperzine-A increased S100B secretion, as well as nicotine; in the second study, we have discussed the main methodological limitations concerning the protein specificity and astrocytes physiology changes. These results raise the importance of astrocytes functions investigations, especially S100B secretion, contributing for the first time to the understanding of astrocytes excitability likely trough nicotinic system activation. In addition, it is worthy to note that new methodologies are relevant and can help us in a better description of astrocytes role during synaptic activity and brain functioning.

Nesta tese foi descrito e sistematizado a distribuição e território das artérias cerebrais média e caudal, artéria cerebroetmoidal e artéria cerebelar ventral caudal na superfície do encéfalo de 30 avestruz ((Struthio camelus), 17 machos e 13 fêmeas, jovens e adultos. Os 30 espécimes foram injetados com látex corado em vermelho através das artérias (Aa.) carótidas internas. As artérias carótidas do cérebro e seus ramos foram sistematicamente descritas. A artéria (a.) cerebral caudal foi, à direita, dupla (73,4%), tripla (23,3%) e quádrupla (3,3%); à esquerda, dupla (76,7%), tripla (20%) e quádrupla (3,3%). A a. tectal mesencefálica dorsal foi ímpar em 96,7% e originada como ramo colateral da a. cerebral caudal. A a. tectal mesencefálica dorsal originou a a. cerebelar dorsal à direita (40%) e à esquerda (63,3%). Os ramos hemisféricos occipitais mediais foram quatro (46,7%) e três (20%) à direita e, quatro (30%) e três (26,7%) à esquerda. A a. pineal foi dupla (50%), única (23,3%), tripla (20%) e quádrupla (6,7%) à direita e, dupla (50%), única (23,3%), tripla (16,7%) e quádrupla (10%) à esquerda. A a. diencefálica esteve presente à direita (40%) e à esquerda (60%). A a. inter-hemisférica esteve presente à direita (60%) e à esquerda (40%), lançando quatro (40%) troncos hemisféricos dorsais, três (40%), dois (10%), cinco (6,7%) e um (3,3%) e, um único ramo hemisférico dorsal (26,7%). As Aa. cerebrais caudais foram classificadas em: tipo I (56,7%) com subtipos IA (36,7%) e IB (20%), tipo II (40%) com subtipos IIA (20%) e IIB (20%) e exceção no tipo III (3,3%). A artéria (a.) cerebral média, um vaso sempre único e de grosso calibre, lançou, à direita, dois ramos hemisféricos mediais desenvolvidos (46,6%), três (26,7%) e um (26,7%); à esquerda, um (36,7%), dois (33,3%) e três (30%). A a. cerebral média emitiu, à direita, oito ramos hemisféricos laterais desenvolvidos (40%), nove (20%), sete (16,7%), onze (6,7%), dez (6,7%), 12 (3,3%), seis (3,3%) e cinco (3,3%); à esquerda, sete (46,7%), nove (13,3%), oito (13,3%), seis (10%), cinco (10%) e dez (6,7%). Ramos perfurantes diretos da a. cerebral média foram emitidos, à direita, dois (33,3%), quatro (20%), três (20%), um (16,7%) e cinco (10%); à esquerda, três (33,3%), dois (30%), um (13,4%), seis (10%), quatro (10%) e cinco (3,3%). A artéria cerebroetmoidal, foi um vaso único de grosso calibre, que se projetou rostromedialmente, emitindo logo após sua formação a artéria cerebral rostral. A a. cerebral rostral foi um vaso único (90%) e duplo (10%) à direita e, único (96.7%) e duplo (3,3%) à esquerda. A a. etmoidal foi sempre um vaso único, de médio a grosso calibre, sendo a continuação natural da artéria cerebroetmoidal, logo após a emissão da artéria cerebral rostral. A artéria (a.) tectal mesencefálica ventral, um vaso sempre único e de médio calibre, foi, à direita, ramo colateral do ramo caudal da a. carótida do cérebro (53,4%), ramo direto da a. carótida do cérebro (43,3%) e ramo direto da a. basilar (3,3%) e, à esquerda, ramo colateral do ramo caudal da a. carótida do cérebro (66,7%), ramo direto da a. carótida do cérebro (30%) e ramo direto da a. basilar (3,3%). Vascularizava apenas a hemiface ventral do lobo óptico, não participando da vascularização do cerebelo à direita (93,3%) e à esquerda (80%) e, estendeu-se até os lóbulos mais ventrorrostrais do cerebelo vascularizando-os à direita (6,7%) e à esquerda (20%). A a. cerebelar ventral caudal foi um vaso único em à direita (96,7%) e à esquerda (93,3%). Seu primeiro ramo foi um tronco comum: espinal dorsal-cerebelar caudal à direita (60%) e à esquerda (56,6%). Seu segundo ramo foi a a. cerebelar caudal à direita (76,7%) e á esquerda (86,7%). Seu terceiro ramo foi o segundo componente da a. cerebelar caudal à direita (6,7%) e à esquerda (3,3%). O mesencéfalo foi vascularizado pelas Aa. tectal mesencefálica dorsal e tectal mesencefálica ventral. A primeira supre a hemiface dorsal e, a segunda a hemiface ventral do lobo óptico. O cerebelo foi vascularizado pelas ramificações da a. cerebelar ventral caudal, que suprem toda a extensão da face rostral do vérmis, flóculo até os lóbulos mais ventrocaudais; e pela a. cerebelar dorsal, que suprem a face rostral e os lóbulos mais ventrorrostrais. / This theses was described and systematized the distribution and territory of the middle and caudal cerebral arteries, cerebroethmoidal and caudal ventral cerebellar arteries at the surface of the brain of 30 young and adult ostrich (Struthio camelus), 17 males and 13 females. The brain specimens from 30 ostriches were injected with red-dyed latex via the internal carotid arteries. The carotid arteries of the brain and their branches were systematically described. On the right side, the caudal cerebral artery was double-, triple- and quadruple-branched in 73.4%, 23.3% and 3.3% of cases, respectively; on the left side, it was double-, triple- and quadruple-branched in 76.7%, 20% and 3.3% of cases, respectively. The dorsal tectal mesencephalic artery appeared as a single vessel in 96.7% of cases, emerging as a collateral branch of the caudal cerebral artery. The dorsal mesencephalic tectal artery originated from the right dorsal cerebellar artery in 40% of cases and from the left side in 63.3% of cases. On the right side, there were four and three medial occipital hemispheric branches in 46.7% and 20% of cases, respectively; on the left side, there were four and three branches in 30% and 26.7% of cases. On the right side, the pineal artery was double-, single-, triple- and quadruple-branched in 50%, 23.3%, 20% and 6.7% of cases, respectively; on the left side, this artery was double-, single-, triple- and quadruple-branched in 50%, 23.3%, 16.7% and 10% of cases, respectively. The diencephalic artery was on the right side in 40% of cases and on the left side in 60% of cases. The interhemispheric artery was on the right side in 60% of cases and on the left side in 40% of cases; four, three, two five and one dorsal hemispheric trunks branched off of the interhemispheric artery in 40%, 40%, 10%, 6.7% and 26.7% of cases, respectively. The caudal cerebral artery was classified as type I in 56.7% of cases (subtype IA in 36,7% of cases and IB in 20% of cases), type II in 40% of cases (subtype IIA in 20% of cases and IIB in 20% of cases) and type III in 3.3% of cases. The middle cerebral artery, a single vessel of large-caliber, launched, the medial hemispheric branches developed, on the right side, was two-, three-, one-branches in 46.6%, 26.7% and 26.7% respectively; on the left side, one-, two-, three-branches in 36.7%, 33.3% and 30%, respectively. The middle cerebral artery, launched, the lateral hemispheric branches developed, on the right side, was eight-, nine-, seven-, eleven-, ten-, twelve-, six- and five-branches in 40%, 20%, 16.7%, 6.7%, 6.7%, 3.3% and 3.3%, respectively. On the left side, seven-, nine-, eight-, six-, five- and ten-branches in 46.7%, 13.3%, 13.3%, 10%, 10% and 6.7% respectively. Direct perforating branches of the middle cerebral artery was launched, on the right side, two-, four-, three-, one-, five-branches in 33.3%, 20%, 20%, 16.7% and 10% respectively. On the left side, three-, two-, one-, six-, four-, five-branches in 33.3%, 30%, 13.4%, 10%, 10% and 3.3% respectively. The cerebroetmoidal artery was a single vessel large-caliber, which was designed rostromedialmente, launching shortly after its formation the rostral cerebral artery. The cerebral rostral artery appeared as a single vessel in 90% of cases on the right side and 96.7% on the left side, as a double vessel in 10% of cases on the right side and 3.3% on the left side. The ethmoidal artery was always a single vessel, medium to large-caliber, being the natural continuation of cerebroetmoidal artery, immediately after issuance of the rostral cerebral artery. The ventral tectal mesencephalic artery, one vessel always single, medium to large-caliber, was, on the right side, collateral branches of caudal branches of cerebral carotid artery in 53.4% of cases, direct branches of cerebral carotid artery in 43.3% and direct branches of basilar artery in 3.3%. On the left side, collateral branches of caudal branches of cerebral carotid artery in 66.7% of cases, direct branches of cerebral carotid artery in 30% and direct branches of basilar artery in 3.3%. Irrigated only hemiface ventral optic lobe, not participating in the vascularization of the cerebellum, on the right side in 93.3% and on the left side in 80% of cases, extended up to the most ventrorrostrais lobes of the cerebellum vascularizing them, on the right side in 6.7% and on the left side in 20%. The caudal ventral cerebelar artery was a single vessel on the right side in 96.7% of cases and on the left side in 93.3%. His first branch was one common trunk: dorsal espinal-caudal cerebelar on the right side in 60% of cases and on the left side in 56.6%. His second branch was the caudal cerebelar artery in 76.6% of cases on the right side and 86.7% on the left side. His third component was the second component of the caudal cerebral artery in 6.7% of cases on the right side and 3.3% on the left side. The midbrain was vascularized by dorsal tectal mesencephalic arteries and ventral tectal mesencephalic arteries. The first vascularize the dorsal hemiface and the second the ventral hemiface of the optic lobe. The cerebelum was vascularized by ramification of caudal ventral cereblar artery, providing whole length of the cerebellar vermis, flóculo, until even the most ventrocaudal wolves, and by dorsal cerebelar artery, that supply the rostral face and more ventrorrostrais lobes.

O consumo de bebidas energéticas cresce a cada ano e atinge um grupo cada vez maior de adolescentes e adultos jovens, porém, o impacto destas bebidas no desenvolvimento e na saúde ainda não tem resultados concretos. Diante do aumento no consumo de bebidas energéticas, principalmente associadas ao álcool, e considerando que o impacto toxicológico deste consumo excessivo é desconhecido, este trabalho teve por objetivo fazer uma avaliação da neurotoxicidade induzida por bebida energética, e seus principais componentes, cafeína e taurina em ratos Wistar machos. Os animais (n= 5/grupo) foram tratados em dose única para avaliação da toxicidade aguda (OECD 420) em dois experimentos. Experimento 1: os animais foram tratados por via oral com soluções contendo: água, bebida energética nas doses de 5 mL/kg (ED 5), 7,5 mL/kg (ED 7,5) e 10 mL/kg (ED 10), cafeína 3,2 mg/kg, taurina 40 mg/kg e associação de cafeína 3,2 mg/kg e taurina 40 mg/kg. Foram observados comportamentos indicativos de atividade depressora ou estimulante do SNC e manifestações autonômicas. Durante 14 dias a variação de massa corporal e letalidade foram observadas. Ao fim deste período todos os animais foram anestesiados, eutanasiados e necropsiados, sendo determinada a massa relativa dos órgãos. Os resultados revelaram sinais de toxicidade pelo aumento da ambulação, taquipnéia e alguns comportamentos associados à ansiedade, principalmente nas doses intermediárias do energético (ED 7,5). Experimento 2: Os ratos foram tratados por via oral com soluções contendo: água, energético (ED 10), álcool 20% (2 g/kg e álcool 20% (2 g/kg) associado à energético (ED 10), cafeína 3,2 mg/kg, taurina 40 mg/kg e associação de cafeína 3,2 mg/kg mais taurina 40 mg/kg. A avaliação da toxicidade aguda foi realizada conforme descrito anteriormente. Entretanto, neste protocolo os animais foram anestesiados, eutanasiados, necropsiados 24h após os tratamentos. A massa relativa dos órgãos foi determinada. Os resultados mostraram que quando o álcool foi associado ao energético ou a taurina e cafeína, os sinais de toxicidade observados foram mais intensos. Dando continuidade à avaliação da neurotoxicidade, procedeu-se a avaliação da toxicidade subcrônica dos energéticos e dos padrões(cafeína e taurina) (OECD 407). Os animais (n= 10/grupo) foram tratados por via oral durante 28 dias com ED 5, ED 7,5, ED 10, cafeína 3,2 mg/kg, taurina 40 mg/kg e a associação de cafeína 3,2 mg/kg + taurina 40 mg/kg. Demonstrou-se que nos testes de memória (OX Maze e reconhecimentos de objetos) os grupos tratados com cafeína e taurina isoladamente ou em associação tiveram um melhor desempenho nos parâmetros avaliados. Estes resultados são independentes de alterações na atividade locomotora, avaliada através do teste de Rota Rod e atividade locomotora espontânea. No 290 dia após o início dos tratamentos os animais foram eutanasiados e medidos os biomarcadores do estresse oxidativo (atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e a produção de espécies reativas através da medida de diclorofluoresceína (DCFH) e conteúdo de tióis) nas estruturas córtex pré-frontal, hipocampo e estriado. Os resultados obtidos com a associação de cafeína e taurina foram os mais relevantes demonstrando que houve diminuição da atividade de enzimas antioxidantes com consequências. Em todos os testes foi evidente que a associação de cafeína e taurina, mesmo nas concentrações presentes na maior dose de energético, diferiu dos efeitos da administração apenas do energético. Considerando que os efeitos dos energéticos são normalmente associados à presença de cafeína e taurina, sugere-se que os resultados podem estar relacionados com a presença de outros componentes nos energéticos, que interferem na modulação dos efeitos causados apenas pela associação de cafeína e taurina. / Consumption of energy drinks is growing every year and reaches a growing number of teenagers and young adults, however, the impact of these drinks in the development and health does not have concrete results. Due to the increase in the consumption of energy drinks, mainly associated with alcohol, and considering that the toxicological impact of this excessive consumption is unknown, to aim of this study was to evaluate the neurotoxicity induced by energy drink, and its main components, caffeine and taurine in male Wistar rats. The animals (n= 5/group) were treated in a single dose for evaluation of acute toxicity (OECD 420) in two experiments. Experiment 1: The animals were treated by oral route with water (control), energy drink in doses of 5 mL/kg (ED 5), 7.5 mL/kg (ED 7,5) and 10 mL/kg (ED 10), caffeine 3.2 mg/kg, taurine 40 mg/kg and the combination of 3.2 mg/kg caffeine and 40 mg/kg taurine. It were observed indicative behaviors of depressant or stimulant activity of the CNS and autonomic manifestations. During 14 days the body weight change and mortality were observed. At the end of this period all animals were anesthetized, euthanized and necropsied, and determined the relative organ weights. The results showed signs of toxicity by increased ambulation, tachypnea, and some behaviors associated with anxiety, especially in intermediate energy dose (ED 7.5). Experiment 2: The rats were orally treated with water (control), energy (ED 10), 20% alcohol (2 g/kg) and ethanol 20% (2 g/kg) associated with the energy drink (ED 10), caffeine 3.2 mg/kg, taurine 40 mg/kg and the combination of 3.2 mg/kg caffeine and 40 mg/kg taurine. The assessment of acute toxicity was performed as described above. However, in this protocol, the animals were anesthetized, euthanized, necropsied 24 after the treatments. The relative organ weights were determined. The results showed that when ethanol was associated to the energy drink or taurine and caffeine, the signs of toxicity were more intense. Continuing evaluation of neurotoxicity was carried out to evaluate subchronic toxicity of energy drink and components (caffeine and taurine) (OECD 407). The animals (n= 10/group) were treated orally for 28 days with ED 5, ED 7,5, ED 10, caffeine 3,2 mg/kg , taurine 40 mg/kg, and the combination of caffeine 3,2 mg/kg + taurine 40 mg/kg. It has been shown that in the memory tests (OX Maze and recognition of objects), the groups treated with caffeine and taurine alone or in combination had a best performance in the evaluated parameters. These results are independent of changes in locomotor activity as measured by Rota Rod test and spontaneous locomotor activity. In 29th day after the start of treatment, the animals were euthanized and oxidative stress biomarkers such as the activity of antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), the total thiol content and the production of reactive species were measured in the prefrontal cortex, hippocampus and striatum. The results obtained with the combination of caffeine and taurine were the most relevant, demonstrating that there was decreased activity of antioxidant enzymes. In all tests it was evident that caffeine and taurine mixture, even at the same concentration present in the largest amount of energy drink, differed from the effects of the administration of energy drink only. Whereas the effects of energy are usually associated with the presence of caffeine and taurine, it is suggested that these results may be related to the presence of other components in energy drink, which interfere with the modulation of the effects caused by the combination of caffeine and taurine only.

A eficiência da transmissão sináptica no sistema nervoso central está associada com a densidade na concentração de canais iônicos operados por ligantes na membrana pós-sináptica. A gefirina, uma proteína de 93 kDa, é um elemento importante na organização dos receptores inibitórios pos-sinápticos, funcionando como uma plataforma de múltiplas interações proteína-proteína, promovendo agrupamento de receptores, de proteínas do citoesqueleto e de proteínas de sinalização efetoras na região da sinapse. A organização estrutural da gefirina compreende três domínios principais denominadas G, E e C. A interação entre gefirina e o receptor de glicina (GlyR) envolve o domínio E da gefirina e a alça citoplasmática localizada entre os seguimentos transmembrana 3 e 4 da subunidade β de GlyR. A associação de mecânica quântica e mecânica molecular no estudo da associação de gefirina-GlyR irá aumentar a compreensão de detalhes anatômicos. Assim, para investigar as características eletrônicas relacionadas aos mecanismos de ancoramento de GlyR pela gefirina nós utilizamos abordagens teóricas de bioquímica quântica. Avaliamos a contribuição energética de cada resíduo de aminoácido na interface molecular do ancoramento entre gefirina e GlyR. As maiores contribuições decorrentes da análise de 34 interações foram, em ordem decrescente: -32,09 kcal mol-1, observado entre os resíduos Asp729 (gefirina) e Ser403 (GlyR); -24,04 kcal mol-1 entre Arg653 (gefirina) e Phe398 (GlyR) e -23,50 kcal mol-1 entre Asp327(gefirina) e Ser399 (GlyR). A menor interação foi de -1,78 kcal mol-1 entre os resíduos de aminoácido Ile656 (gefirina) e Ser399 (GlyR). Todas as interações observadas neste estudo mostraram interação de atração e a soma das contribuições individuais indica uma energia de ligação total de -343,49 kcal/mol. Pela análise da contribuição individual de cada resíduo foi possível determinar a relevância de Asp729 (gefirina) / Ser403 (GlyR), seguido de Arg653 (gefirina) / Phe398 (GlyR), Asp327 (gefirina) / Ser399 (GlyR) e Phe330 (gefirina) / Ile400 (GlyR), entre outros. Estes resultados contribuem para a maior compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na estabilização/ruptura de GlyR na membrana sináptica. / In the central nervous system, a high concentration of ligand-gated ion channels is necessary at the postsynaptic membrane to display efficient synaptic transmission. Gephyrin, a 93 kDa protein, is an important element in the organization of the inhibitory synaptic receptors, as a platform for multiple protein-protein interactions, bringing receptors, cytoskeletal proteins and downstream signaling proteins into close spatial proximity. This protein consists of three major domains named G, E and C. The interaction between gephyrin and the glycine receptor (GlyR) involves the E-domain of gephyrin and a cytoplasmic loop located between transmembrane segments 3 and 4 of the GlyR β subunit. Combined quantum-mechanics and molecular-mechanics in the gephyrin-GlyR association studies increase the understanding of atomic details. In order to investigate the electronic features involved in the mechanism of the GlyR anchoring by gephyrin we have employed theoretical approaches of quantum biochemistry. The energy contribution of each individual amino acid residues within the molecular interface of the anchorage between gephyrin and GlyR were evaluated. The largest contributions in the analysis of 34 interactions were, in descending order: -32.09 kcal mol-1, observed between residues Asp729 (gephyrin) and Ser403 (GlyR); -24.04 kcal mol-1 between Arg653 (gephyrin) and Phe398 (GlyR) and -23.50 kcal mol-1 between Asp327 (gephyrin) and Ser399 (GlyR). The smaller interaction was -1.78 kcal mol-1 between the amino acid residues Ile656 (gephyrin) and Ser399 (GlyR). All interactions observed in this study showed attractive interaction, and the sum of individual contributions indicate a total binding energy of -343.49 kcal/mol. After the analysis of the individual contribution of each residue we could determine the relevance of Asp729 (gephyrin) / Ser403 (GlyR), followed by Arg653 (gephyrin) / Phe398 (GlyR), Asp327 (gephyrin) / Ser399 (GlyR) and Phe330 (gephyrin) / Ile400 (GlyR), among others. These results increase the understanding of the molecular mechanisms involved in the stabilization/disruption of GlyR in the synaptic membrane.

O uso de culturas de células do Sistema Nervoso Central é extensivamente aplicado na compreensão dos mecanismos celulares, moleculares e bioquímicos do cérebro, sendo que a maioria dos protocolos utilizados faz uso de animais neonatos para a obtenção das células. Neste estudo, propomos e caracterizamos um protocolo de obtenção de cultura de astrócitos corticais de ratos Wistar adultos, de 90 dias de idade. Para a elaboração da cultura, os cérebros foram cuidadosamente dissecados e o córtex foi dissociado mecanicamente e enzimaticamente com tripsina e papaína. As células foram cultivadas com DMEM/F12 (10% SFB) nas duas primeiras semanas e DMEM/F12 (20% SFB) nas últimas semanas. Ao final deste período, as células apresentavam morfologia poligonal caracteristicamente astrocitária, extensiva marcação para a Proteína Glial Fibrilar Ácida (GFAP) e para a Glutamina Sintetase (GS), ambas importantes marcadores gliais. Também foi avaliada a captação de glutamato, a atividade da GS e o conteúdo de glutationa (GSH). Ainda, verificamos a expressão de outras proteínas características de astrócitos, como vimentina, S100B e ALDH1L1, além dos transportadores glutamatérgicos GLAST e GLT-1. Sob exposição ao H2O2 e Zn2+, podemos verificar que os astrócitos são suscetíveis ao estresse oxidativo, o qual pode causar alterações morfológicas e funcionais. Também, verificamos que estas células são suscetíveis a estímulos inflamatórios. Assim, concluímos que o protocolo proposto é efetivo para gerar uma cultura funcional e caracteristicamente astrocitária, utilizando-se ratos adultos, os quais já têm conexões celulares estabelecidas, ao contrário dos neonatos, que estão ainda no processo de formação das células e conexões. Isto pode representar um importante modelo de estudo para doenças neurodegenerativas, neurotoxicidade e neuroproteção, visto que astrócitos adultos cultivados in vitro apresentam características mais similares ao cérebro adulto in vivo, e podem ser usados para se obter respostas mais fidedignas aos estímulos aos quais serão submetidos. / The use of cell cultures of central nervous system is extensively applied to understand the cellular, molecular and biochemical mechanisms of the brain, and most part of the protocols makes use of newborns to obtain cells. In this study we have characterized a protocol to obtain astrocyte cultures of adult Wistar rats, 90 days old. For the preparation of culture, brains were carefully dissected and the cortex was dissociated mechanically and enzymatically with trypsin and papain. The cells were cultured with DMEM/F12 (10% FBS) in the first two weeks and DMEM/F12 (20% FBS) until it reaches confluence. Thereafter, the cells presented typical polygonal morphology of astrocytes, extensive marking for glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Glutamine Synthetase (GS), both important glial markers. We also evaluated glutamate uptake, GS activity and intracellular levels of glutathione (GSH). We observed the expression of other characteristic proteins of astrocytes, such as vimentin, S100B, ALDH1L1 and, in addition, the main glutamate transporters in the brain, GLT-1 and GLAST. Upon exposure to H2O2 and Zn2+, we found that astrocytes are susceptible to oxidative stress, which may cause morphological and functional changes. Also, we found that these cells are susceptible to inflammatory stimuli. Thus, we conclude that the proposed protocol is effective to generate a functional and characteristic astrocytic culture, using adult rats, which already have established neural connections compared to newborns. This may represent an important study model for neurodegenerative diseases, neuroprotection and neurotoxicity, as adult astrocytes cultured in vitro have similar characteristics to the adult brain in vivo, and can be used to obtain more reliable responses to stimuli to which they will be exposed.

O diabetes mellitus (DM) é um importante problema de saúde pública em todo o mundo, já tendo atingido 12 milhões de brasileiros, podendo ser classificado como tipo 1 ou tipo 2, de acordo com a sua etiologia. Em ambos os casos o resultado final é a hiperglicemia¸ que por sua toxicidade promove o surgimento de comorbidades, como doenças cardiovasculares, retinopatia, nefropatia e neuropatia periférica. A toxicidade da hiperglicemia é mediada pela produção de espécies reativas, promovendo aumento do estresse oxidativo. Embora a retina, os rins e os nervos periféricos sejam os tecidos mais sensíveis à hiperglicemia, inúmeros outros órgãos e tecidos também são afetados pela mesma, tais como fígado¸ músculo esquelético, pâncreas, vasos sanguíneos e até o mesmo o cérebro. Uma vez que os maiores efeitos deletérios do excesso de glicose são mediados por estresse oxidativo a busca por novos compostos e moléculas antioxidantes que sirvam como opção terapêutica ou adjuvante para o DM é foco de inúmeros trabalhos científicos da atualidade. Grande parte direciona-se à compostos bioativos presentes em plantas e alimentos, chamados de fitoquímicos. Alguns fitoquímicos já demonstraram atenuar alterações do DM, retardá-lo e até mesmo preveni-lo enquanto outros ainda estão sendo avaliados. O sulforafano (SFN) é um destes fitoquímicos; trata-se de um glicosídeo sulfurado presente em vegetais crucíferos, com alta capacidade antioxidante, indutor de enzimas de fase 2. Em razão de suas características, o objetivo desta tese foi avaliar os efeitos do SFN em dois modelos de indução de DM (por dieta e por estreptozotocina) e também sobre parâmetros metabólicos do sistema nervoso central de ratos. No modelo por dieta hiperpalatável os animais foram tratados concomitantemente com 1mg/kg de SFN, via gavagem diária durante 4 meses, para testar seu efeito na prevenção da resistência à insulina. Os animais tratados com o fitoquímico tornaram-se mais hiperglicêmicos e houve uma tendência à diminuição da expressão do transportador de glicose 3 (GLUT-3) no córtex e no hipotálamo dos mesmos, embora perfil lipídico, provas de função hepática e renal não tenham sido afetados. Em decorrência das alterações na glicemia e na expressão do GLUT 3 dois novos estudos foram desenhados. Um deles objetivou caracterizar os efeitos de uma curva de concentração de SFN (0 a 10 M) sobre a viabilidade celular, produção de CO2, síntese proteica e lipídica em córtex cerebral de ratos jovens e adultos. Nenhuma alteração na viabilidade foi encontrada, entretanto os valores mais baixos da curva (0,25 and 0,5 M) aumentaram a oxidação de leucina e a síntese proteica nos animais jovens, enquanto as concentrações mais altas (5 e 10 M) diminuíram estes mesmos parâmetros. Nenhuma alteração pode foi observada no córtex cerebral de animais adultos. A partir das alterações apresentadas pelos animais jovens também avaliamos neste trabalho de caracterização a atividade das enzimas Na+,K+-ATPase e glutamina sintetase, além da produção de radicais livres por oxidação de DCFH e pudemos constatar que as concentrações de SFN 5 e 10 M aumentaram a atividade da Na+,K+-ATPase e tem uma tendência a aumentar a glutamina sintetase e a produção de radicais livres, o que não ocorre nas concentrações 0.25 and 0.5 M. Concluímos desta forma que, de acordo com a concentração, o SFN pode estimular o consumo de ATP via Na+,K+-ATPase, diminuindo a liberação de CO2, e diminuir a conversão de glutamato a glutamina, o que associado à uma menor síntese proteica aumenta a possibilidade de uso de aminoácidos para produção de glutamato e posterior acúmulo do mesmo, promovendo excitotoxicidade. O outro estudo desenhado avaliou diferentes doses de SFN (0,1, 0,25 e 0,5 mg/kg) na prevenção da indução do DM por estreptozotocina. Todas as doses tiveram sucesso na prevenção da indução e na preservação do glicogênio hepático comparadas com o grupo diabético que não recebeu SFN. Entretanto, foram observadas elevação do colesterol total e diminuição da ureia plasmática. Para ampliar o espectro de efeitos, decidimos testar uma das doses utilizadas neste trabalho (5 mg/kg) pós indução de DM por estreptozotocina, administrada via intraperitoneal por 21 dias sobre glicemia, lipídios e defesas antioxidantes. Observamos que a sensibilidade à insulina é maior nos animais diabéticos que receberam SFN, além do perfil lipídico ser similar ao de animais não diabéticos. Entretanto, o SFN não exerceu nenhum efeito sobre a atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase e catalase, tampouco sobre os grupamentos sulfidril. Concluímos com este conjunto de dados que o fitoquímico SFN pode exercer efeitos de prevenção do DM induzido por estreptozotocina e da dislipidemia secundária a ele, bem como ser estimulador do metabolismo energético e da síntese proteica em córtex de ratos jovens, de acordo com a dose/concentração utilizada. Corrobora com isso os efeitos deletérios observados na glicemia, expressão de GLUT3, diminuição do metabolismo energético e síntese proteica observados com a doses/concentrações mais altas. Consideramos como maior contribuição deste trabalho a confirmação do o tênue limite existente entre benefício e malefício de compostos antioxidantes, determinado apenas pela dose utilizada. / Diabetes mellitus (DM) is an important health problem around the world, that already reached 12 million brazillian, and according the etiology can be classified as type 1 or type 2. In both cases the result is hyperglycemia and its toxicity promotes comorbidities such as cardiovascular disease, retinopathy, nephropathy and peripheral neuropathy. Hyperglycemia toxicity is mediated by production of reactive species and increase oxidative stress. Although eyes lens, kidneys and peripheral nerves are the tissues most sensitive to hyperglycemia, several organs and tissues also are affected by high glucose, like liver, muscle, pancreas, blood vessels and even the brain. Because major deleterious effects of excessive glucose are mediated by oxidative stress the search for new antioxidant compounds and molecules that acts as terapeuthical or adjuvant options are the aim of recent scientific works. Most of them focus on bioactive compounds present in plants and food, called phytochemicals. Some phytochemicals have been shown to ameliorate, delay and even prevent some DM complications, while others still are under evaluation. Sulforaphane (SFN) is one of them; it is a glycoside sulphide found in cruciferous vegetables, which have antioxidant properties by induce phase 2 detoxification enzymes. Due this, the aim of this thesis was to evaluate SFN effects on two models of DM induction (by diet and by streptozotocin) and also on metabolic parameters of rats central nervous system. In the model of induction with a highly palatable diet, the animals were concomitantly treated with SFN 1mg/kg by daily gavage during 4 months, to test the compound effects on prevention of insulin resistance. Animals treated with SFN became more hyperglicemic and also had a trend to decrease glucose transporter 3 (GLUT3) expression on brain cortex and hypothalamus. However lipid profile, hepatic and kidney markers were not affected. Because of glycemic and GLUT 3 alterations observed we decided to design two other studies. One of the aimed to characterize the effects of dose response curve of SFN (0 a 10 M) on cellular viability, CO2 production, protein and lipid synthesis in brain cortex of young and adult rats. No alteration in cellular viability was found, however lower SFN concentrations (0,25 and 0,5 M) increased CO2 production and protein synthesis in young animals, while higher concentrations (5 e 10 M) decreased same parameters. None of this alterations were observed in brain cortex of adult animals. Considering the results of young animals we also evaluated in this characterization work the activity of Na+,K+-ATPase and glutamine syntethase enzymes, besides free radical production by DCFH oxidation. We could inferred that SFN 5 e 10 M increased Na+,K+- ATPase activity and also there is a trend to increase glutamine syntethase activity and free radicals production. But the same results do not occur under SFN 0.25 and 0.5 M. we conclude that SFN can stimulate ATP consumption by Na+,K+-ATPase, decreasing CO2 production and reduce glutamate conversion to glutamine, which associated to a lower protein synthesis drives more aminoacids to glutamate production and its subsequent accumulation, promoting excitotoxicity. The other designed study tested different SFN doses (0.1, 0.25 e 0.5 mg/kg) on prevention of DM induction by streptozotocin. All tested doses succeed on the prevention and preservation of hepatic glycogen levels compared to the diabetic group who not received SFN. However, we observed elevation of total cholesterol and decrease of serum urea in the same animals. To expand the spectrum of effects, we decided to evaluate one of the doses used in this work (5 mg/kg) injected intraperitoneally during 21 days post-induction of DM by streptozotocin, on glycemia, lipids levels and antioxidant defenses. We noted that insulin responsiveness is better on diabetic animals who received SFN besides they showed lipid profile similar to non-diabetic. Unfortunately, SFN did not exert any effect on antioxidant enzymes superoxide dismutase and catalase, neither on sulfydril groups. With this set of information we conclude that the phytochemical SFN can act on DM prevention induced bu streptozotocin and the consequent dyslipidemia, the same way that can stimulate energetic metabolism and protein synthesis on brain cortex of young rats according to the dose/concentration used. Corroborates with this the deleterious effects found in glycemia, GLUT 3 expression, decrease in energetic metabolism and protein synthesis observed under the higher doses/concentrations. We consider as major contribution of this work the confirmation of the subtle limit between beneficial and harmfulness of antioxidant compounds, determined only by the dose used.

A saúde mental dos adultos mais velhos é uma prioridade para a saúde pública devido a sua vulnerabilidade aos transtornos mentais. Pelo menos em parte, essa vulnerabilidade tem sido atribuída às diversas mudanças que ocorrem no cérebro durante o envelhecimento. Sabe-se também que algumas destas mudanças podem aumentar a vulnerabilidade do cérebro ao estresse oxidativo, um importante fator fisiopatológico em diversos transtornos mentais. Por sua vez, sabe-se que inúmeros fatores podem induzir estresse oxidativo no cérebro, incluindo o consumo de micronutrientes em quantidades inadequadas. Embora a vitamina A seja um micronutriente essencial para a manutenção da homeostase no cérebro, nesta tese demonstramos que a suplementação crônica com palmitato de retinol para ratos durante a meia-idade induz um estado emocional alterado e estresse oxidativo no encéfalo. Além disso, demonstramos que a suplementação com B-caroteno pode ser uma alternativa mais segura ao palmitato de retinol, induzindo modulações antioxidantes no plasma sem exercer efeitos pró-oxidantes no encéfalo de ratos. / The mental health of older adults is a priority for public health because of their vulnerability to mental disorders. At least in part, this vulnerability has been attributed to the various changes that occur in the brain during aging. It is also known that some of these changes may increase the vulnerability of the brain to oxidative stress, an important pathophysiological factor in many mental disorders. In turn, it is known that many factors can induce oxidative stress in the brain, including the intake of micronutrients in inadequate quantities. Although Vitamin A is an essential micronutrient for the maintenance of homeostasis in the brain, this thesis demonstrated that the chronic supplementation with retinyl palmitate to rats during middle age induces an altered emotional state and oxidative stress in the brain. Furthermore, we have demonstrated that suplementation with B-carotene may be a safer alternative to retinol palmitate, inducing antioxidant modulations in plasma without exerting prooxidant effects in the brain of rats.

Insulina e o fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1) afetam positivamente as funções cerebrais. O exercício físico é um mediador de adaptações do SNC, enquanto o envelhecimento pode ser considerado um fator de risco para o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas. Neste trabalho investigamos o efeito do exercício físico, dieta hiperpalatável e envelhecimento no sistema insulina/IGF-1 em hipocampo de roedores. No trabalho onde utilizamos uma dieta hiperpalatavel, para mimetizar o estilo de vida ocidental, causou uma diminuição na passagem de IGF-1 pela barreira sangue cérebro devido ao aumento nos níveis de triglicerídeos séricos. Os trabalhos onde utilizamos camundongos/ratos envelhecidos para verificar os efeitos do sistema insulina/IGF-1no SNC mostraram que, apesar de ocorrer uma compensação do cérebro em aumentar o transporte de IGF-1 pela barreira sangue cérebro e aumento dos receptores em hipocampo, ocorreu uma diminuição da sinalização pós-receptor, assim como perda da melhora cognitiva induzida pela insulina em animais jovens que induziu a produção de fatores tróficos. Nossos resultados apontam que exercício físico aumenta a sensibilidade à insulina no hipocampo por aumentar a translocação e ativação do receptor de insulina e ativação nas proteínas intracelulares. Os resultados apontam para um efeito antioxidante da insulina em preparações de sinaptossoma de ratos quando estimulamos a respiração mitocondrial com succinato. Estes resultados demonstram que fatores ambientais afetam profundamente a ação de hormônios responsáveis pela manutenção da homeostasia cerebral. / Insulin and insulin like growth factor-1 (IGF-1) affect the brain function. Physical exercise is proposed as a neurotrophic factor, while aging is considered a key factor to neurodisease. In our work we analyze the effect of physical exercise, high palatable diet and aging in insulin/IGF-1 system in hippocampus of the mice. High palatable diet decreased the transport of IGF-1 in blood brain barrier (BBB) by increased in the serum levels of triglycerides. Aged mice/rats had decrease in insulin/IGF-1 system in brain. Aged mice try to compensate this impair in IGF-1 signaling by increase the transport of hIGF-1 in BBB and increased the levels of IGF-1 receptor in hippocampus, however the intracellular signaling were decreased in aged mice. Aged rats showed resistance to benefits effect of insulin in cognition. Physical exercise increases the insulin sensitivity in hippocampus by increase the translocation and activation of intracellular proteins. Moreover insulin showed an antioxidant effect in synaptossome of the rats. Our results pointing to environmental factors modulated the insulin/IGF-1 system and affect the brain function.

No início da década de 50 foi primeiramente descrito que mamíferos apresentam um período de hiporresponsividade ao estresse, durante o qual estímulos normalmente estressores não elicitam uma resposta clássica, com aumento de glicocorticóides circulantes. Desde então, tem-se estudado intervenções nesse período e efeitos na idade adulta. Algumas intervenções, consideradas severas, conseguem induzir resposta ao estresse, como separação maternal repetida (mais de 30 minutos por dia) e privação materna (separação da mãe por 24h ou mais). No entanto, intervenções moderadas, como a manipulação neonatal (separação acompanhada de manipulação gentil durante 1 a 10 minutos por dia), não desencadeiam resposta ao estresse, mas levam a uma série de alterações morfofuncionais e comportamentais, indicando que algum tipo de resposta às variações ambientais está presente. Existem muitos trabalhos descrevendo os efeitos a curto e longo prazo da manipulação neonatal, no entanto pouco se sabe sobre os mediadores de tais alterações. As citocinas imunológicas vêm sendo descritas como de grande importância para o funcionamento do sistema nervoso central (SNC), tanto em processos patológicos quanto fisiológicos. Estão presentes durante a formação e desenvolvimento do SNC desempenhando funções como indução da proliferação, migração e diferenciação celular. Nesse contexto, ao estudarmos o perfil citocinérgico no hipocampo de ratos manipulados até o 5º dia de vida pós-natal, encontramos aumento nos níveis de interleucina 1 beta (IL-1b) e redução nos níveis de interleucina 6. A IL-1b tem sido descrita como um importante indutor de neurogênese hipocampal em animais jovens e adultos, enquanto a interleucina 6 apresenta efeito oposto. Juntos, o aumento de IL-1b e a redução de IL-6 podem estar criando um ambiente favorável à proliferação celular hipocampal que, por sua vez, pode estar envolvido nas alterações cognitivas e de regulação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal encontradas em animais manipulados no período neonatal.

O exercício físico moderado e regular é considerado uma estratégia neuroprotetora promissora. Os mecanismos pelos quais o exercício físico altera a função cerebral não foram completamente esclarecidos. Nossa hipótese de trabalho foi que estas propriedades neuroprotetoras estejam relacionadas com o remodelamento da cromatina, especificamente alterando os níveis de acetilação de histonas através da modulação da atividade das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC). O objetivo do estudo foi investigar o efeito do exercício na atividade da Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) em hipocampo de ratos em diferentes tempos após o treinamento. Ratos Wistar machos adultos foram distribuídos em um grupo não-exercitado (sedentário) e um grupo exercitado em diferentes protocolos: sessão única de exercício (corrida de 20 min) e treinamento crônico de exercício (corrida de 20 min, uma vez por dia, durante duas semanas). Os efeitos do exercício na atividade da Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) foram mensurados imediatamente, 1 h e 18 h após a sessão única ou após a última sessão do treinamento crônico de exercício, utilizando kits ELISA específicos. A sessão única de exercício reduziu a atividade da Histona Desacetilase (HDAC) e aumentou a atividade da Histona Acetiltransferase (HAT), bem como aumentou o balanço HAT/HDAC em hipocampos de ratos, imediatamente e 1 h após o exercício, indicando um estado de hiperacetilação de histonas. O treinamento crônico não alterou a atividade das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC). As atividades das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) foram influenciadas pelo ritmo circadiano, uma vez que o balanço HAT/HDAC foi significativamente menor durante o período da manhã em comparação ao período da tarde. O exercício físico alterou a atividade das enzimas Histona Acetiltransferase (HAT) e Histona Desacetilase (HDAC) em hipocampos de ratos Wistar, apresentando efeito de curta duração. / Regular and moderate exercise has been considered a promising neuroprotective strategy. The mechanisms by which physical exercise alters brain function are not completely clear. Our work hypothesis was that these neuroprotective properties could be related to chromatin remodeling, specifically altering the histone acetylation levels through modulation of Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzyme activities. The aim of the work was to investigate the effect of exercise on Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) activities in rat hippocampus at different times after treadmill exercise. Adult male Wistar rats were assigned to a non-exercised (sedentary) group and an exercised group on different protocols: a single session of exercise (running for 20 min) and a chronic treadmill exercise (running once daily for 20 min, for 2 weeks). The effects of exercise on Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) activities were measured immediately, 1 h and 18 h after the single session or the last session of chronic treadmill exercise using specific ELISA kits. The single session of exercise reduced the Histone Desacetylase (HDAC) activity and increased the Histone Acetyltransferase (HAT) activity, as well increased the HAT/HDAC balance in rat hippocampus, immediately and 1 h after exercise, indicative of histone hyperacetylation status. The chronic treadmill did not alter the Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzymes activity. The Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzymes activities were influenced by the circadian rhythm, since the HAT/HDAC ratio was significantly decreased in the early morning when compared to the afternoon. The physical exercise altered the Histone Acetyltransferase (HAT) and Histone Desacetylase (HDAC) enzymes activities in Wistar rats hippocampus, presenting short term effects.