Le transport actif de sodium par les cellules épithéliales alvéolaires est le principal mécanisme impliqué dans la régulation du niveau de liquide dans le poumon distal. Le canal épithélial sodique (ENaC) exprimé par les cellules épithéliales alvéolaires est essentiel à la résorption du liquide des poumons à la naissance ainsi que la résolution de l'œdème pulmonaire chez l'adulte. L'activité et l'expression du canal ENaC sont modulées par de nombreux stress pathophysiologiques. L'inflammation pulmonaire constitue un facteur important dans l'inhibition de l'expression du canal ENaC et pourrait favoriser la formation d'œdème pulmonaire. Nous avons précédemment démontré que différentes cytokines pro-inflammatoires, ainsi que les lipopolysaccharides (LPS) de Pseudomonas aeruginosa, inhibent l'expression de l'ARNm αENaC par des mécanismes de régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle. Ces résultats suggèrent que les mécanismes qui modulent la stabilité des ARNm αENaC pourraient jouer un rôle important dans la régulation du niveau d’expression du transcrit en condition inflammatoire. Le principal objectif de mes travaux était de caractériser les mécanismes de modulation de l’ARNm αENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires lors de différents stress pathophysiologiques et déterminer si cette modulation pouvait s’expliquer en partie par une régulation de la stabilité du transcrit. Mes travaux montrent que les LPS et la cycloheximide inhibent l’expression de l’ARNm αENaC de façon similaire via l’activation des voies de signalisation des MAPK ERK1/2 et p38. Cependant, les mécanismes de modulation de l’expression de l'ARNm αENaC sont différents puisque les LPS répriment la transcription du gène, alors que la cycloheximide diminuerait la stabilité du transcrit via des mécanismes post-transcriptionnels impliquant la région 3' non traduite (3'UTR) de l'ARNm αENaC. Pour mieux étudier le rôle du 3'UTR dans ce processus, nous avons développé un modèle Tet-Off nous permettant de mesurer la demi-vie de l’ARNm αENaC indépendamment de l’utilisation d’un inhibiteur de la transcription comme l'actinomycine D (Act. D). Nous avons montré que la demi-vie de l’ARNm αENaC était de 100min, un temps beaucoup plus court que celui rapporté dans la littérature. Nous avons démontré que l’Act. D a un effet stabilisateur important sur l’ARNm αENaC et qu’il ne peut être utilisé pour évaluer la stabilité du transcrit. À l’aide de différents mutants de délétion, nous avons entrepris de déterminer la nature des régions du 3’UTR impliquées dans la modulation de la stabilité du transcrit. Nous avons trouvé que le 3’UTR joue un rôle à la fois de stabilisation (région 3’UTR proximale) et de déstabilisation (région 3’UTR distale) du transcrit. Notre système nous a finalement permis de confirmer que la diminution de l’ARNm αENaC observée en présence de TNF-α s’expliquait en partie par une diminution importante de la stabilité du transcrit induite par cette cytokine. Enfin, nous avons identifié la nature des protéines pouvant se lier au 3’UTR de l’ARNm αENaC et déterminé lesquelles pouvaient moduler la stabilité du transcrit. Des trois protéines candidates trouvées, nous avons confirmé que la surexpression de DHX36 et TIAL1 diminue le niveau de transcrit par un mécanisme impliquant la stabilité du messager. Les travaux présentés ici montrent la complexité des voies de signalisation induites par différents stress sur les cellules épithéliales alvéolaires et montrent comment la stabilité de l’ARNm αENaC et en particulier, les séquences du 3’UTR jouent un rôle important dans la modulation du niveau de transcrit. Le modèle Tet-Off que nous avons développé permet d’estimer le temps de demi-vie réel de l’ARNm αENaC et montre que le 3’UTR du messager joue un rôle complexe dans la stabilisation du messager en condition de base ainsi qu’en condition pro-inflammatoire. Enfin, nous avons identifié deux protéines liant l’ARNm qui pourraient jouer un rôle important dans la modulation de la stabilité du transcrit. / The epithelial sodium channel (ENaC) expressed in alveolar epithelial cells plays a major role for lung liquid clearance at birth and lung edema resorption in adulthood. The expression and activity of ENaC are inhibited by many pathophysiological stress that could have an impact in the clinical outcome of acute respiratory distress syndrome (ARDS). Pulmonary inflammation is an important factor in this inhibition that may promote or sustain pulmonary edema. We have previously shown that pro-inflammatory cytokines and lipopolysaccharide (LPS) from Pseudomonas aeruginosa inhibit αENaC mRNA expression by transcriptional and post-transcriptional mechanisms, suggesting that a modulation of αENaC mRNA stability could play a role in this process. The main objective of the present work was to characterize how different pathophysiological stress affect αENaC mRNA expression in alveolar epithelial cells and determine whether this modulation could be explained in part by regulating the stability of the transcript. Our study shows that LPS and cycloheximide decrease the level of αENaC mRNA with a similar time course and via the activation of the MAPK ERK1/2 and p38 signaling pathways. Despite similarities, there were important differences in the mechanisms involved in the modulation of αENaC mRNA expression. While LPS repress αENaC mRNA transcription, cycloheximide triggers post-transcriptional mechanisms involving the 3' untranslated region (3'UTR) of αENaC mRNA. To further study the role of αENaC 3'UTR in this process, we developed a Tet-Off model that allows us to measure the half-life of αENaC mRNA regardless of the use of a transcription inhibitor such as actinomycin D (Act. D). Using this system, we showed a 100 min half-life for αENaC mRNA, a much shorter time then the one reported for this mRNA using Act. D. We showed that Act. D has an important stabilizing effect on αENaC mRNA and cannot be used to assess the stability of the transcript. Using deletion mutants of the αENaC 3'UTR region, we determined how different portions of 3'UTR were important in modulating stability of the transcript. We found that the 3'UTR has dual functions, with portions important to promote stabilization (proximal 3'UTR) and others that strongly destabilize (distal 3'UTR) the transcript. Our system also allowed us to confirm that the decreased expression of αENaC mRNA induced by TNF-α results in part by a decreased stability of the mRNA. Finally, we identified several RNA-binding proteins that interact specifically with αENaC 3'UTR and determined if these proteins had an impact on transcript stability. Surexpression of two of these proteins in alveolar epithelial cells, DHX36 and TIAL1 was able to decrease the level of αENaC mRNA via a downregulation of mRNA stability. The work presented here shows the complexity of the signal transduction pathways elicited by different pathological stress conditions in alveolar epithelial cells and is the first to show that αENaC mRNA stability elicited by sequences in 3’UTR plays an important role in modulating the level of the transcript. The Tet-Off model that we developed allows to accurately estimate the half-life of αENaC mRNA and shows that the 3’UTR portion of the mRNA plays a complex role in the modulation of transcript stability in basal and pro-inflammatory conditions. Finally, we identified two putative RNA-binding proteins able to specifically recognize αENaC 3’UTR and modulate the transcript stability.

No description available.

The Tumor Necrosis Factor derived-TIP peptide is a small 17 amino acids cyclic peptide with lectin-like activity, that possesses several therapeutically relevant biological activities, among which is activation of alveolar liquid clearance in both healthy and injured lungs in vivo. Accumulation of fluid in the lungs? alveoli and interstitial spaces is a life-threatening condition called pulmonary edema. The mortality rate due permeability pulmonary edema, accompanied by a dysfunction of the alveolar/capillary barrier, is high because no effective treatment lacking side effects exists nowadays. It is known that the TIP peptide is able to activate vectorial Na+ transport ? which mediates lung liquid clearance. However, the mechanism of action of remains elusive. The aim of this thesis was to investigate the initial steps of interaction between the TIP peptide and airway epithelial cells. Numerous novel methods and single-molecule techniques were used to unravel: (i) how the TIP peptide interacts with the molecules on the apical side of the lung epithelial cells; (ii) whether the TIP peptide need to be internalized inside of the cells to trigger its effects; (iii) the nature of the interaction between the TIP peptide and its putative receptor(s); (iv) the putative receptor(s) for the TIP peptide on the apical surface of the lung epithelial cells.

I. DESCRIPTION DE PROJET DE RECHERCHE<p><p>Le canal sodium épithélial bloquable par l’amiloride (ENaC) est une protéine intégrale de la membrane apicale des épithéliums impliqués dans l’absorption du sodium. Deux fonctions majeures sont directement liées au fonctionnement d’ENaC. D’une part, la régulation de la balance sodée par le rein et donc de la pression artérielle et d’autre part, la clairance du fluide alvéolaire pulmonaire.<p>Le transport vectoriel de sel et d’eau à travers ces épithéliums à jonctions serrées repose sur un transport actif de sodium entraînant un flux osmotique d’eau. Ce transport de sodium s’effectue en deux étapes: l’entrée apicale, par diffusion, facilitée via ENaC, et la sortie basolatérale, active, par les pompes Na+/K+ ATPases.<p><p>Ces dernières années, un intérêt grandissant est porté sur les acides gras polyinsaturés à longues chaînes de type oméga 3 (PUFAs) et leurs implications dans divers processus physiologiques. Entre autres effets, les PUFAs modulent différents types de canaux ioniques (canaux Na+ dépendant du voltage, Ca++ L-type, K+).<p>Les études in vivo impliquant un effet à long terme des PUFAs décrivent des mécanismes inhibiteurs. Cependant, lors d’une étude précédente, axée sur la composition lipidique des membranes de cellules rénales en culture et l’influence de l’ajout d’acides gras saturés et insaturés sur le transport du sodium, nous avons constaté que les acides gras polyinsaturés à longues chaînes de type oméga 3 augmentaient la réabsorption du sodium. Ces résultats pourraient être intéressants, car les canaux sodiques de l’épithélium alvéolaire sont en contact direct avec le surfactant, dont la composition lipidique varie en fonction de l’apport alimentaire en PUFAs. Chez les prématurés humains, le syndrome de détresse respiratoire est une des causes les plus fréquentes de mortalité. Dans un certain nombre de cas, on peut restaurer une fonction pulmonaire satisfaisante par l’administration de surfactant.<p><p>Dans ce travail, nous avons opté pour une approche fondamentale des mécanismes de régulation du canal sodium épithélial par l’acide eicosapentanoïque (EPA, C 20:5, n-3). Des études électrophysiologiques, biochimiques et d’imagerie cellulaire ont été réalisées sur la lignée cellulaire A6 de rein d’amphibien, qui sert d’épithélium modèle pour l’étude d’ENaC depuis plus de 25 ans. Cette lignée exprime des canaux sodiques très sélectifs et possède des propriétés électrophysiologiques facilitant l’étude de leur régulation.<p><p>Ce travail nous a permis de mettre en évidence de nouveaux mécanismes fondamentaux dont la pertinence physiologique et /ou clinique ne pourra être établie qu’en transposant cette étude sur un modèle in vivo, comme nous le proposons dans les perspectives.<p><p>Dans le présent travail, nous avons étudié :<p><p>1.\ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

[ES] Las enfermedades cardiovasculares siguen siendo la principal causa de muerte en Europa. Las arritmias cardíacas son una causa importante de muerte súbita, pero sus mecanismos son complejos. Esto denota la importancia de su estudio y prevención. La investigación sobre electrofisiología cardíaca ha demostrado que las anomalías eléctricas causadas por mutaciones que afectan a canales cardíacos pueden desencadenar arritmias. Sorprendentemente, se ha descubierto una gran variedad de fármacos proarrítmicos, incluidos aquellos que usamos para prevenirlas. Las indicaciones de uso de fármacos actuales intentaron solucionar este problema diseñando una prueba para identificar aquellos fármacos que podían ser peligrosos basado en el bloqueo de un solo canal iónico. El estudio de las interacciones fármaco-canal ha revelado la existencia no sólo de compuestos que bloquean múltiples canales, sino también una gran complejidad en esas interacciones. Esto podría explicar por qué algunos medicamentos pueden mostrar efectos muy diferentes en la misma enfermedad. Existen dos desafíos importantes con respecto a los efectos de los fármacos en la electrofisiología cardíaca. Por un lado, las empresas y entidades reguladoras están buscando una herramienta de alto rendimiento que mejore la detección del potencial proarrítmico durante el desarrollo de fármacos. Por otro lado, los pacientes con anomalías eléctricas a menudo requieren tratamientos personalizados más seguros. Las simulaciones computacionales contienen un poder sin precedentes para abordar fenómenos biofísicos complejos. Deberían ser de utilidad a la hora de determinar las características que definen tanto los efectos beneficiosos como no deseados de los fármacos mediante la reproducción de datos experimentales y clínicos. En esta tesis doctoral, se han utilizado modelos computacionales y simulaciones para dar respuesta a estos dos desafíos. El estudio de los efectos de los fármacos sobre la actividad cardíaca se dividió en el estudio de su seguridad y de su eficacia, respectivamente. Para dar respuesta al primer desafío, se adoptó un enfoque más amplio y se generó un nuevo biomarcador fácil de usar para la clasificación del potencial proarrítmico de los fármacos utilizando modelos del potencial de acción de células y tejidos cardíacos humanos. Se integró el bloqueo de múltiples canales a través de IC50 y el uso de concentraciones terapéuticas con el fin de mejorar el poder predictivo. Luego, se entrenó el biomarcador cuantificando el potencial proarrítmico de 84 fármacos. Los resultados obtenidos sugieren que el biomarcador podría usarse para probar el potencial proarrítmico de nuevos fármacos. Respecto al segundo desafío, se adoptó un enfoque más específico y se buscó mejorar la terapia de pacientes con anomalías eléctricas cardíacas. Por lo tanto, se creó un modelo detallado de la mutación V411M del canal de sodio, causante del síndrome de QT largo, reproduciendo datos clínicos y experimentales. Se evaluaron los posibles efectos beneficiosos de ranolazina, a la par que se aportó información sobre los mecanismos que impulsan la efectividad de la flecainida. Los resultados obtenidos sugieren que, si bien ambos fármacos mostraron diferentes mecanismos de bloqueo de los canales de sodio, un tratamiento con ranolazina podría ser beneficioso en estos pacientes. / [CA] Les malalties cardiovasculars continuen sent la principal causa de mort a Europa. Les arrítmies cardíaques són una causa important de mort sobtada, però els seus mecanismes són complexos. Això denota la importància del seu estudi i prevenció. La investigació sobre electrofisiologia cardíaca ha demostrat que les anomalies elèctriques que afecten a canals cardiacs poden desencadenar arrítmies. Sorprenentment, s'ha descobert una gran varietat de fàrmacs proarrítmics, inclosos aquells que utilitzem per a previndre-les. Les indicacions d'ús de fàrmacs actuals van intentar solucionar aquest problema dissenyant una prova per a identificar aquells fàrmacs que podien ser perillosos basada en el bloqueig d'un sol canal iònic. L'estudi de les interaccions fàrmac-canal ha revelat l'existència no sols de compostos que bloquegen múltiples canals, sinó també una gran complexitat en aquestes interaccions. Això podria explicar per què alguns medicaments poden mostrar efectes molt diferents en la mateixa malaltia. Existeixen dos desafiaments importants respecte als efectes dels fàrmacs en la electrofisiologia cardíaca. D'una banda, les empreses i entitats reguladores estan buscant una eina d'alt rendiment que millore la detecció del potencial proarrítmic durant el desenvolupament de fàrmacs. D'altra banda, els pacients amb anomalies elèctriques sovint requereixen tractaments personalitzats més segurs. Les simulacions computacionals contenen un poder sense precedents per a abordar fenòmens biofísics complexos. Haurien de ser d'utilitat a l'hora de determinar les característiques que defineixen tant els efectes beneficiosos com no desitjats dels fàrmacs mitjançant la reproducció de dades experimentals i clíniques. En aquesta tesi doctoral, s'han utilitzat models computacionals i simulacions per a donar resposta a aquests dos desafiaments. L'estudi dels efectes dels fàrmacs sobre l'activitat cardíaca es va dividir en l'estudi de la seva seguretat i la seva eficacia. Per a donar resposta al primer desafiament, es va adoptar un enfocament més ampli i es va generar un nou biomarcador fàcil d'usar per a la classificació del potencial proarrítmic dels fàrmacs utilitzant models del potencial d'acció de cèl·lules i teixits cardíacs humans. Es va integrar el bloqueig de múltiples canals a través d'IC50 i l'ús de concentracions terapèutiques amb la finalitat de millorar el poder predictiu. Després, es va entrenar el biomarcador quantificant el potencial proarrítmic de 84 fàrmacs. Els resultats obtinguts suggereixen que el biomarcador podria usar-se per a provar el potencial proarrítmic de nous fàrmacs. Respecte al segon desafiament, es va adoptar un enfocament més específic i es va buscar millorar la teràpia de pacients amb anomalies elèctriques cardíaques. Per tant, es va crear un model detallat de la mutació V411M del canal de sodi, causant de la síndrome de QT llarg, reproduint dades clíniques i experimentals. Es van avaluar els possibles efectes beneficiosos de ranolazina, a l'una que es va aportar informació sobre els mecanismes que impulsen l'efectivitat de la flecainida. Els resultats obtinguts suggereixen que, si bé tots dos fàrmacs van mostrar diferents mecanismes de bloqueig dels canals de sodi, un tractament amb ranolazina podria ser beneficiós en aquests pacients. / [EN] Cardiovascular disease remains the main cause of death in Europe. Cardiac arrhythmias are an important cause of sudden death, but their mechanisms are complex. This denotes the importance of their study and prevention. Research on cardiac electrophysiology has shown that electrical abnormalities caused by mutations in cardiac channels can trigger arrhythmias. Surprisingly, a wide variety of drugs have also shown proarrhythmic potential, including those that we use to prevent arrhythmia. Current guidelines designed a test to identify dangerous drugs by assessing their blocking power on a single ion channel to address this situation. Study of drug-channel interactions has revealed not only compounds that block multiple channels but also a great complexity in those interactions. This could explain why similar drugs can show vastly different effects in some diseases. There are two important challenges regarding the effects of drugs on cardiac electrophysiology. On the one hand, companies and regulators are in search of a high throughput tool that improves proarrhythmic potential detection during drug development. On the other hand, patients with electrical abnormalities often require safer personalized treatments owing to their condition. Computer simulations provide an unprecedented power to tackle complex biophysical phenomena. They should prove useful determining the characteristics that define the drugs' beneficial and unwanted effects by reproducing experimental and clinical observations. In this PhD thesis, we used computational models and simulations to address the two abovementioned challenges. We split the study of drug effects on the cardiac activity into the study of their safety and efficacy, respectively. For the former, we took a wider approach and generated a new easy-to-use biomarker for proarrhythmic potential classification using cardiac cell and tissue human action potential models. We integrated multiple channel block through IC50s and therapeutic concentrations to improve its predictive power. Then, we quantified the proarrhythmic potential of 84 drugs to train the biomarker. Our results suggest that it could be used to test the proarrhythmic potential of new drugs. For the second challenge, we took a more specific approach and sought to improve the therapy of patients with cardiac electrical abnormalities. Therefore, we created a detailed model for the long QT syndrome-causing V411M mutation of the sodium channel reproducing clinical and experimental data. We tested the potential benefits of ranolazine, while giving insights into the mechanisms that drive flecainide's effectiveness. Our results suggest that while both drugs showed different mechanisms of sodium channel block, ranolazine could prove beneficial in these patients. / This PhD thesis was developed within the following projects: Ministerio de Economía y Competitividad and Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) DPI2015-69125-R (MINECO/FEDER, UE): Simulación computacional para la predicción personalizada de los efectos de los fármacos sobre la actividad cardiaca. Dirección General de Política Científica de la Generalitat Valenciana (PROMETEU2016/088): “Modelos computacionales personalizados multiescala para la optimización del diagnóstico y tratamiento de arritmias cardiacas (personalised digital heart). Vicerrectorado de Investigación, Innovación y Transferencia de la Universitat Politècnica de València, Ayuda a Primeros Proyectos de Investigación (PAID-06-18), and by Memorial Nacho Barberá. Instituto de Salud Carlos III (La Fe Biobank PT17/0015/0043). / Cano García, J. (2021). Prediction of the effects of drugs on cardiac activity using computer simulations [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/164094

No / The ability of neurons to modulate synaptic strength underpins synaptic plasticity, learning and memory, and adaptation to sensory experience. Despite the importance of synaptic adaptation in directing, reinforcing, and revising the behavioral response to environmental influences, the cellular and molecular mechanisms underlying synaptic adaptation are far from clear. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is a prime initiator of structural and functional synaptic adaptation. However, the signaling cascade activated by BDNF to initiate these adaptive changes has not been elucidated. We have previously shown that BDNF activates mitogen- and stress-activated kinase 1 (MSK1), which regulates gene transcription via the phosphorylation of both CREB and histone H3. Using mice with a kinase-dead knock-in mutation of MSK1, we now show that MSK1 is necessary for the upregulation of synaptic strength in response to environmental enrichment in vivo. Furthermore, neurons from MSK1 kinase-dead mice failed to show scaling of synaptic transmission in response to activity deprivation in vitro, a deficit that could be rescued by reintroduction of wild-type MSK1. We also show that MSK1 forms part of a BDNF- and MAPK-dependent signaling cascade required for homeostatic synaptic scaling, which likely resides in the ability of MSK1 to regulate cell surface GluA1 expression via the induction of Arc/Arg3.1. These results demonstrate that MSK1 is an integral part of a signaling pathway that underlies the adaptive response to synaptic and environmental experience. MSK1 may thus act as a key homeostat in the activity- and experience-dependent regulation of synaptic strength.

No description available.