Texte remanié de: th. doct.--zoology--Göteborg university, 2002. / Bibliogr. en fin de chap.

Chez les Mammifères, le succès de la fécondation et d’un développement embryonnaire viable résident principalement dans la qualité des cellules reproductrices : les gamètes mâles (spermatozoïdes) et femelles (ovocytes) apportant chacun la moitié du patrimoine génétique du futur individu. Dès lors que ce patrimoine génétique est endommagé par différents processus tels que les attaques radicalaires communément appelées stress oxydant, cela peut compromettre la qualité des gamètes et par conséquent le succès de la reproduction. En effet, les dommages oxydants à l’ADN spermatique sont une des causes d’infertilité masculine fréquemment associés aux échecs reproductifs dans le cadre de conception naturelle ou artificielle chez l’homme. Afin de mieux appréhender l’impact des dommages oxydants sur la qualité des spermatozoïdes, notre équipe a généré des modèles murins présentant des atteintes oxydantes de l’ADN associées à des échecs reproductifs. Dans un de ces modèles nous avons pu montrer que tout le noyau spermatique n’était pas concerné de la même façon par les altérations oxydantes. De même, à l’échelle des chromosomes murins les investigations de l’équipe suggéraient que tous n’étaient concernés de la même façon. Dans ce travail de thèse, j’ai développé et mis en œuvre des protocoles d’hybridation in situ en fluorescence (FISH) permettant de montrer que la susceptibilité des chromosomes à l’oxydation est déterminée par la position des chromosomes dans le noyau spermatique murin. En parallèle de cette étude, je me suis intéressé à l’épigénome spermatique et plus particulièrement à la méthylation de l’ADN en conditions de stress oxydant. Les résultats préliminaires montrent qu’un environnement post-testiculaire pro-oxydant peut altérer le profil épigénétique spermatique. Dans un développement pré-clinique du sujet, j’ai contribué à montrer qu’une supplémentation orale antioxydante permettait de corriger les dommages oxydants à l’ADN, en modifiant la réponse antioxydante globale du tissu épididymaire des animaux. / In Mammals, the success of fertilization and embryonic development, are associated to the quality of the reproductive cells: male gametes (spermatozoa) and female gametes (oocytes); each bringing half of the genetic heritage of the future individual. This genetic heritage may be compromised by various processes a very common one being radical attacks in cases of oxidative stress, it could diminish the quality of gametes and therefore the success of reproduction. It is well described that sperm DNA oxidative damage (SDOD) is one of the causes of male infertility frequently associated with reproductive failures in the context of natural or artificial conception in humans. To better understand the impact of oxidative damage on the quality of sperm, our team generated mouse models with SDOD. Characterization of these transgenic mice has shown that SDOD alone was associated with increased embryo defects, miscarriages and perinatal mortality. The team also brought forward that SDOD concerns preferentially specific regions of the sperm nucleus. In addition, the team suggested that sperm chromosomes were not identically susceptible to oxidative damage.In this thesis work, I developed and implemented fluorescence in situ hybridization (FISH) protocols to study chromosome positioning in the mouse sperm. I confirmed that susceptibility of chromosomes to oxidation is determined by their position in the murine sperm nucleus. In parallel, I addressed the question whether the sperm epigenome (particularly DNA methylation) was modified in a situation of post-testicular oxidative stress. Preliminary results seem to show that SDOD disturbs the sperm epigenetic profile.In parallel, in a pre-clinical approach, I contributed to show that an oral antioxidant supplementation can correct SDOD by modifying the antioxidant response of the epididymal tissue of the treated animals.

Chez l’Homme, les succès de la fécondation et d’un développement embryonnaire aboutissant à la naissance d’un enfant en bonne santé résident principalement dans la qualité des cellules reproductrices. Les dommages oxydants de l’ADN spermatique sont une cause majeure d’infertilité masculine. Afin de permettre une prise en charge thérapeutique optimale et adaptée, j’ai tout d’abord mis au point et validé un test diagnostique de l’oxydation de l’ADN spermatique par immunodétection du 8-hydroxy-2'-desoxyguanosine (8-OHdG), adduit majeur de l'oxydation nucléaire. Ce travail de thèse a déterminé, pour la première fois, un seuil d’oxydation de l’ADN spermatique en relation avec les paramètres conventionnels spermatiques. Dans un second temps, je me suis focalisée sur les atteintes de la chromatine et de l’ADN spermatique les plus fréquentes en cas d’infertilité masculine, à savoir les anomalies de condensation de la chromatine, la fragmentation et l’oxydation de l’ADN spermatique. Une corrélation entre l’oxydation de l’ADN, tout particulièrement la moyenne d’intensité de fluorescence, et le pourcentage de spermatozoïde fragmenté a été mise en évidence. Pour objectiver l’impact de ces dommages nucléaires spermatiques en pratique clinique, j’ai étudié, après cryopréservation, les effets bénéfiques d’une supplémentation en hypotaurine des milieux de sélection et de congélation/décongélation des échantillons. Une baisse de la cryocapacitation et du pourcentage de spermatozoïde fragmenté et décondensé ont été retrouvées ainsi qu’une amélioration de la vitalité et de la mobilité progressive spermatique. Enfin, comme le spermatozoïde a pour but ultime de participer à la genèse d’un nouvel individu, j’ai mis en évidence que la fragmentation et l’oxydation de l’ADN spermatique avaient un impact à des moments clés de la cinétique du développement embryonnaire précoce suite à une ICSI sans pour autant modifier l’obtention de blastocystes de bonne qualité. Ce travail de thèse a permis de mieux comprendre la physiopathologie de l’infertilité masculine et de mettre en évidence de nouveaux biomarqueurs spermatiques en lien avec un développement embryonnaire normal. / In humans, the success of fertilization and embryonic development leading to the birth of ahealthy child lies mainly in the quality of reproductive cells. Oxidative damage to sperm DNAis a major cause of male infertility. In order to provide optimal and appropriate therapeuticmanagement, I first developed and validated a diagnostic test for sperm DNA oxidation byimmunodetection of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG), a major adduct of nuclearoxidation. This thesis work determined, for the first time, a threshold for the oxidation ofsperm DNA in relation to conventional sperm parameters. In a second step, I focused on themost common chromatin and sperm DNA disorders in male infertility, namely chromatincondensation anomalies, sperm DNA fragmentation and oxidation. A correlation betweenDNA oxidation, particularly the mean fluorescence intensity, and the percentage offragmented sperm was found. To objectify the impact of this nuclear sperm damage inclinical practice, I studied, after cryopreservation, the beneficial effects of hypotaurinesupplementation to the selection and freeze/thaw media of seed samples. A decrease incryocapacitation and the percentage of fragmented and decondensed sperm has beenfound, as well as an improvement in sperm vitality and progressive mobility. Finally, sincethe ultimate goal of the sperm cells is to participate in the genesis of a new individual, I haveshown that the fragmentation and oxidation of sperm DNA has an impact at key moments inthe kinetics of early embryonic development following ICSI without modifying the obtainingof good quality blastocysts. This thesis work has led to a better understanding of thepathophysiology of male infertility and the identification of new sperm biomarkers related tonormal embryonic development.

La thèse intitulée Proust et Platon se fonde principalement sur les affinités qui unissent les deux génies. Bien qu’il y ait un écart temporel considérable entre eux, on essaie d’élaborer un rapprochement à trois temps. Une première partie est consacrée à l’étymologie et la philosophie du langage, à savoir à l’effort de Proust et de Platon afin d’établir la rectitude du nom par rapport à la chose qu’il représente. Dans un tout premier temps, on met pour lors le langage à l’épicentre de notre analyse, en s’efforçant de localiser les différentes tendances –cratylisme, hermogénisme, naturalisme, conventionnalisme– dans un dialogue capital : le Cratyle. En deuxième lieu, c’est l’étymologie qui ranime toute cette effervescence linguistique, en représentant un sujet pivotal chez Proust et chez Platon : elle questionne l’emploi des mots et des noms, ainsi que leur relevance avec la chose qu’ils représentent. L’autre grande théorie linguistique proposée est l’hermogénisme, dû à la théorie d’Hermogène chez Cratyle. Il prétend mettre en avant la thèse centrale du disciple de Socrate qui soutient que les noms sont justes en fonction d’une convention entre les interlocuteurs qui les utilisent. Dans un deuxième temps, c’est l’amour dans toutes ses manifestations qui prend le relais. Il est question de l’œuvre la plus délectable de Platon, le Banquet. On va commencer en mettant en avant le propre rôle du banquet en tant qu’institution dans l’antiquité. Là on trouve sans aucun doute le champ le plus fécond afin de parler d’éros adolescent, de l’androgyne, mais aussi d’ἀγάπη. Mais le Banquet a aussi son côté aristophanesque : en attribuant au grand comédien l’articulation de son mythe le plus célèbre, Platon a voulu peut-être mettre en lumière le côté le plus parodique de l’éros. Toutefois, ce mythe paradisiaque déclenche aussi l’examen de bien des thèmes qui concerne l’homosexualité en Grèce d’antan. La partie proustienne sur l’amour se consacre dans un premier temps à l’importance du banquet mondain, lieu d’apprentissage social, érotique et artistique pour le narrateur. Ensuite, il repose sur les différentes manifestations de l’ἒρως et de l’ἀγάπη dans la Recherche : amitié, inversion, procréation artistique. La dernière étape de la deuxième partie est vouée à la mort et l’au-delà dans l’antiquité grecque et les trois narrations de descentes à l’enfer dans le corpus platonique. On va constater que la mort constitue au même titre que l’amour le leitmotiv incontournable de la Recherche également. Pour la partie finale, on a choisi un titre sans doute déconcertant : Δεύτερος πλοῦς, seconde navigation. Par là, on voudrait souligner l’effort de Platon et de Proust d’atteindre les vérités les plus inabordables en empruntant des sentiers iconoclastes : pour Platon, il s’agirait de la réminiscence, de l’esthétique idéale et du mythe, tandis que la section proustienne est axée sur le temps et la mémoire, l’esthétique et les diverses techniques narratives de la Recherche. On espère qu’à la fin de cette recherche les reflets contigus mis en évidence dans les œuvres de Platon et de Proust se seraient convertis en éclats miroitants. / The thesis entitled Proust and Plato is mainly based on the affinities between the two great figures of universal scope. Although there is a significant time gap between them, we have tried to develop an approximation in three distinct parts. The first part is devoted to etymology and philosophy of language, namely the effort of Proust and Plato to establish the correctness of the name against the thing it represents. At first, we put the language at the epicenter of our analysis, in an effort to locate the various tendencies, –cratylism, hermogenism, naturalism, conventionalism –, in a critical dialogue: the Cratylus. Secondly, it is etymology that revives the linguistic effervescence, representing a pivotal topic in both Proust and Plato: it questions the use of words and names, as well as their relevance with the thing they represent. The other great linguistic theory proposed is hermogenism, named after the theory of Hermogenes in the Cratylus, who argues that the names have been invented on the basis of an agreement between the people who use them. Secondly, it is love in all its manifestations that takes over: the focus is on the most delightful work of Plato, the Banquet. We will start by highlighting the role of the banquet as an institution in antiquity. These are without a doubt the mostappropriate surroundings to talk about pederasty, the androgyne, but also ἀγάπη. Nevertheless, the Banquet also has its Aristophanian side: by assigning to the great comedy writer the articulation of his most famous myth, Plato perhaps wanted to highlight the more satirical side of eros. However, this idyllic myth also triggers the review of many themes concerning homosexuality in ancient Greece. The Proustian part on love is dedicated initially to the importance of the aristocratic banquet, place of the social, romantic and artistic initiation of the Narrator. It is furthermore based on the different manifestations of ἒρως and ἀγάπη in the novel:friendship, homosexuality, artistic procreation. The last stage of the second part is dedicated to death and the beyond in Greek Antiquity and the three tales of nekyia in the Platonic corpus. We will underline the existence of it as a leitmotiv in the Proustian novel as well. The final section has a rather disconcerting title: Δεύτερος πλοῦς, a second navigation. Here, we would like to emphasize the effort of Plato and Proust to reach the most unfathomable truths by taking iconoclastic paths: for Plato, it would be reminiscence, Ideal aesthetics and myth, while the Proustian segment focuses on time and memory, aesthetics and the narrative techniques of the novel. We hope that at the end of this study the contiguous reflections highlighted in the works of Plato and Proust will have turned into dazzling sparkles.

La valeur sélective (succès reproducteur) du mâle se traduit par son nombre d'accouplements et sa descendance obtenue par accouplement (Dewsbury, 1982; Simmons, 2001). Le succès reproducteur d'un mâle dépend essentiellement du nombre de ses spermatozoïdes qui réussissent la fécondation des œufs. En situation de compétition, un mâle doit maximiser son succès reproducteur par rapport à ses rivaux. Chez les insectes, lors des accouplements multiples de la femelle, il peut y avoir une compétition spermatique entre les éjaculats de différents mâles au sein de l'un (des) organe(s) de stockage. Le principal outil d'étude de la compétition spermatique est le suivi de la paternité des descendants. Un mutant récessif du caractère de la couleur des yeux (yeux rouges) a été utilisé pour étudier les différences dans la capacité d'accouplement et de fertilisation chez les mâles Anisopteromalus calandrae (Hymenoptera, Chalcidoidea, Pteromalidae). Ce travail de laboratoire a porté sur l'étude du succès reproducteur des mâles en relation avec leur réserve de spermatozoïdes disponible. Notre étude a porté dans un premier temps sur la quantification du stock de spermatozoïdes des mâles en fonction de différents traits d'histoire de vie (âge, expérience sexuelle) et de leur phénotype. Dans un second temps, l'étude du succès reproducteur des mâles en relation avec leur nombre de spermatozoïdes disponibles a été réalisée lors d'accouplements simples, d'accouplements multiples et en situation de compétition entre deux mâles. Les conséquences des accouplements doubles de la femelle sur la paternité des descendants des mâles de statuts différents (vierges 1 jour, vierges 21 jours, ou sexuellement expérimentés) ont été identifiées par l'utilisation du marqueur génétique de paternité (la couleur des yeux).<br />Les résultats montrent que (1) les mâles aux yeux rouges (R) et les mâles aux yeux foncés (W) sont différents dans leur capacité d'accouplement mais que les femelles R s'accouplent indifféremment avec les mâles des deux phénotypes. (2) Le comptage des spermatozoïdes dans les vésicules séminales des mâles vierges de 1 jour montre que les mâles R ont environ 1,46 fois plus de spermatozoïdes que les mâles W (4545 vs 3116). Les mâles expérimentés ont seulement 15% à 25% du stock initial d'un mâle vierge du même âge. Un mâle vierge de 21 jours a environ 1,8 fois plus de spermatozoïdes qu'un mâle vierge de 1 jour dans les deux morphes. (3) Après un accouplement simple des mâles, les nombres moyens de spermatozoïdes stockés dans la spermathèque des femelles ne sont pas différents entre eux (en moyenne 143 spermatozoïdes). (4) Les femelles réalisant des accouplements doubles n'augmentent pas leur stockage spermatique (193 spermatozoïdes pour deux accouplements vs 161 pour un), ni leur fécondité (respectivement 130 vs 108 descendants). (5) Un accouplement est suffisant pour assurer leur fécondité durant la vie reproductive des femelles et la sex-ratio est biaisée en faveur des femelles (environ 0,79). Les femelles accouplées avec les deux mâles de morphes différents produisent des descendants des deux phénotypes durant leur vie reproductive, quel que soit l'ordre des mâles dans la séquence de copulation. (6) Après une compétition entre deux mâles différents par leur phénotype, par leur âge ou par leur expérience sexuelle, c'est toujours le mâle ayant le plus de spermatozoïdes dans les vésicules séminales qui est le plus représenté dans la descendance quelle que soit la combinaison d'accouplement. Ces résultats concernant la paternité des descendants après une compétition entre deux mâles correspondent parfaitement à une loterie honnête, « fair raffle » proposée par Parker en 1990. (7) Quant à la quantité de spermatozoïdes transférés à la femelle, aucune augmentation ni diminution n'a été mise en évidence contrairement à ce qui est prédit par les théories concernant le risque de compétition spermatique ou l'intensité de compétition spermatique.

Depuis plus de 30 ans, de nombreuses publications se sont attachées à expliquer la physiopathologie des anomalies morphologiques du spermatozoïde humain et ont mis en évidence des corrélations entre le pourcentage de formes normales et certaines anomalies fonctionnelles et des relations avec certains facteurs d'exposition. Le caractère physiologique de la plupart des " traits " morphologiques du spermatozoïde humain rend très difficile l'interprétation du spermocytogramme en dehors des syndromes d'anomalies monomorphes. A ces difficultés d'interprétation, viennent se rajouter le manque cruel de fiabilité analytique des techniques actuelles pour l'évaluation de la morphologie du spermatozoïde humain rendant très difficile l'utilisation de seuil décisionnel pour le choix d'une technique d'Assistance Médicale à la Procréation. Cette morphologie est classiquement observée sur lame après coloration (de Schorr le plus souvent). Il a récemment été développé une technique d'observation des spermatozoïdes mobiles associant un contraste interférentiel de Nomarski et un fort grossissement numérique et optique de x6000 au total permettant de mieux déceler certaines anomalies et notamment des vacuoles au niveau de la tête des spermatozoïdes. Cette technique est appelé MSOME (Motile Sperm Organelle MorphologyExamination). L'origine de ces vacuoles reste controversée, sont-elles d'origine nucléaire ou acrosomique ? Certains auteurs ont mis en évidence une relation entre la présence de larges vacuoles et des anomalies de condensation de la chromatine. De plus, beaucoup de questions subsistent quant au réel intérêt diagnostic du MSOME. Au cours d'un premier travail j'ai essayé d'amener un argument supplémentaire à l'origine des vacuoles. J'ai étudié le cas de deux patients atteints de globozoospermie totale (patients porteurs de spermatozoïdes sans acrosome confirmé par microscopie électronique). Au cours de ce travail, outre l'analyse morphométrique des vacuoles avec le MSOME, j'ai utilisé des techniques d'immunofluorescence (lectines PNA et anticorps anti-CD46) pour analyser le statut acrosomique et des techniques TUNEL (terminal deoxynucleotidyltransferase-mediateddUTPnick-end labelling assay) et SCSA (spermchromatin structure assay) pour le statut nucléaire du spermatozoïde. Les deux patients avaient un nombre et une surface vacuolaire (6,3% et 5%) très similaires à celles de 12 témoins fertiles (5%) permettant d'exclure une origine acrosomique de la plupart de ces vacuoles. Je me suis ensuite intéressé à l'impact de la congélation du sperme (très utilisé en pratique clinique) sur l'apparition de ces vacuoles. Après analyse morphométrique précise à l'aide d'un logiciel d'analyse d'image de plus de 2000 spermatozoïdes avant et après congélation (27 individus) je n'ai retrouvé aucune différence statistiquement significative en termes de nombre, surface et position de ces vacuoles entre avant et après congélation. De nombreux auteurs plaident en faveur d'une utilisation en pratique clinique de cette évaluation des vacuoles à fort grossissement sans qu'il n'y ait aucune donnée sur la présence de ces vacuoles dans une population de référence (témoins fertiles). J'ai donc réalisé une analyse morphométrique précise de ces vacuoles dans une population de 50 témoins fertiles. La très grande fréquence de ces vacuoles (95,8 %) dans cette population souligne le caractère physiologique de la plupart d'entre elles. / For over 30 years, many publications have sought to explain the pathophysiology of human sperm morphological abnormalities and showed correlations between the percentage of normal forms and functional defect and some relationships with some exposure factors. The physiological nature of most of the "features" of human sperm morphology makes the interpretation of human sperm morphology very difficult except for monomorphic defects. To these difficulties of interpretation, come to add the lack of analytical reliability of current techniques for assessing human sperm morphology making very difficult the use of threshold of normal forms for the choice of medical treatment of infertile couple in Assisted Reproductive Treatment. Recently a new aspect of sperm morphology, the head vacuoles, has shown to be of interest. The vacuoles can be easily observed using Nomarski interference contrast microscopy at high magnification: ×6000 to 10000 (optical magnification ×1000 associated with digital enhancements that achieves a final magnification up to 6000) even on motile spermatozoa (MSOME: Motile Sperm Organellar Morphology Examination). The origin of these vacuoles raises many questions. Several studies have found a link between chromatin condensation defects and the presence of sperm head vacuoles and clinical interest of MSOME is still somewhat debated. To add new arguments concerning the origin of the sperm-head vacuoles observed under high magnification with interference contrast microscopy, we carried out in two patients with total globozoospermia confirmed using transmission electron microscopy (TEM), a detailed sperm morphometric analysis with MSOME, an acrosomal status analysis (using fluorescent labelling with peanut agglutinin (PNA) lectins and anti-CD46 antibodies) and a nuclear status analysis (using terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labelling assay TUNEL, sperm chromatin structure assay SCSA and aniline blue staining). Our two patients with globozoospermia had relative sperm vacuole areas of 6.3% and 5%, similar to those observed in a reference population of 12 fertile men (5.9%). This study provides further information on the non-acrosomal origin of the sperm-head vacuoles. Since the development of MSOME for observing the cephalic vacuoles at high magnification, no study as yet assessed the effect of cryopreservation on these vacuoles, although sperm freezing-thawing procedures are known to affect sperm quality. In 27 sperm samples from fertile men, morphological analysis at high magnification (·6000) using image analysis software was performed before freezing and after thawing, there was no evidence for any difference in any vacuolar criteria (relative vacuole area, total vacuole area, vacuole area in the anterior, median and basal parts of the head, percentage of spermatozoa with a vacuole area < 6.5% and percentage of spermatozoa with a vacuole area >13%). Freezing-thawing procedures have no effect on human sperm vacuoles. In order to establish reference values concerning sperm vacuoles and to know if the assessment of sperm vacuoles at high magnification can contribute to the explanation of idiopathic infertility, I investigated the number, position and area of sperm head vacuoles using an image analysis software in 50 fertile men and 50 infertile men were within couples who had unexplained infertility and were consulting in our centre. After analysis, the characteristics of sperm head vacuoles (number, area, position) are no different between fertile controls and patients with unexplained infertility.

L’infertilité est considérée actuellement par l’organisation mondiale de la santé (OMS) comme une préoccupation majeure de santé affectant plus de 50 millions de couples dans le monde. Dans les pays occidentaux, la majorité des couples infertiles ont recours aux techniques d’assistance médicale à la procréation (AMP) pour obtenir une grossesse. Malgré le succès de ces techniques, près de la moitié des couples qui ont recours à l’AMP sortent du parcours de soin sans enfant. Une partie de ces échecs est expliquée par l’altération de la gamétogenèse. Chez l’homme, la spermatogenèse fait interagir des centaines de gènes spécifiquement exprimés dans le testicule. L’abondance de ces gènes suggère que les troubles de la spermatogenèse présentent une forte composante génétique. Récemment, les avancées techniques ont favorisé l’identification de gènes responsables de ces anomalies mais la grande majorité des cas d’infertilité masculine reste classée comme idiopathique. L’objectif de la thèse est d’identifier de nouvelles causes génétiques responsables d’infertilité masculine et d’élucider les mécanismes physiopathologiques associés à ces anomalies.Au cours de ma thèse j’ai participé avec l’équipe GETI (génétique, épigénétique et thérapies de l’infertilité) à l’exploration génétique et moléculaire de deux phénotypes distincts d’anomalies spermatiques liés à des défauts post-méiotiques de la spermatogenèse : une forme rare d’azoospermie non obstructive (ANO) et le phénotype d’anomalies morphologiques multiples du flagelle spermatique (AMMF). Enfin j’ai joué un rôle important dans la création et l’analyse de modèles murins pour caractériser la pathogénie de ces anomalies.L’analyse génétique de deux frères infertiles nés de parents consanguins et présentant une ANO idiopathique associée à un arrêt post-méiotique de la spermatogenèse nous a permis d’identifier un variant homozygote délétère dans le gène SPINK2 qui code pour un inhibiteur de sérine-protéases. L’étude des souris KO pour ce gène nous a permis d’observer que les souris mâles adultes sont infertiles et miment parfaitement les phénotypes spermatique et testiculaire observés chez nos patients. Nous avons montré que la protéine codée par ce gène est exprimée dans l’acrosome à partir du stade de spermatide ronde. En l’absence de Spink2, l’activité protéolytique non-neutralisée des protéases cibles qui transitent par le Golgi cause sa fragmentation et bloque la spermiogénèse au stade de spermatide ronde. Nous avons également pu observer que les spermatozoïdes provenant de patients et de souris hétérozygotes présentent un taux élevé d’anomalies morphologiques et une baisse de la mobilité progressive conduisant à une hypofertilité à expressivité variable. Ces résultats montrent pour la première fois que l’oligo-tératozoospermie et l’azoospermie peuvent constituer un continuum pathologique dû à une même pathogénie.Nous avons également réalisé le séquençage exomique complet d’une cohorte de 78 individus AMMF non apparentés et avons identifié chez 49 sujets des mutations bi-alléliques délétères dans 11 gènes candidats dont DNAH1, CFAP43, CFAP44, WDR66 et FSIP2, soit un rendement diagnostique de 63%. Ces résultats confirment l’hétérogénéité génétique du phénotype MMAF et l’efficacité diagnostique du séquençage haut débit dans son exploration. Nous avons également validé l’implication de certains gènes candidats (n=4) dans ce phénotype chez le modèle murin knock-out créé par la nouvelle technologie d’édition du génome, CRISPR/Cas9.Dans son ensemble, ce travail montre l’intérêt et l’efficacité de la combinaison du séquençage exomique et de la technique de CRISPR/Cas9 pour étudier les troubles de la spermatogenèse et l’infertilité masculine. / Infertility is currently considered by the World Health Organization (WHO) as a major health concern affecting more than 50 million couples worldwide. In western countries, the majority of infertile couples seek assisted reproductive technologies (ART) to achieve a pregnancy. Despite the success of these techniques, almost half of these couples fail to obtain a child. Part of these failures are explained by the alteration of gametogenesis. In humans, spermatogenesis involves hundreds of genes specifically expressed in the testis. The abundance of these genes suggests that spermatogenic defects are associated with a strong genetic component. Recently, technical advances have led to the identification of numerous causative genes, but the vast majority of male infertility cases remain idiopathic. The aim of the present thesis is to identify new genetic causes responsible for male infertility and to elucidate the physiopathological mechanisms associated with these anomalies.During my thesis, I participated with the team GETI (genetics, epigenetics and therapies of infertility) in the genetic exploration of two phenotypes of male infertility related to post-meiotic defects of spermatogenesis: a rare form of non-obstructive azoospermia and the phenotype of multiple morphological abnormalities of the sperm flagella (MMAF). I have also played a key role in creation and analysis of transgenic mice to better characterize the pathogeny of the identified genetic causes in Human.Genetic analyses performed on two infertile brothers born form consanguineous parents and presenting an-idiopathic non-obstructive azoospermia associated with a post-meiotic arrest of spermatogenesis allowed us to identify a homozygous variant in the SPINK2 gene that encodes a serine-protease inhibitor. Phenotypic analysis of Spink2-/- adult male mice showed that they are infertile and perfectly mimic the sperm and testicular phenotypes observed in our patients. We showed that Spink2 protein is expressed from the round spermatid stage and localized in the acrosome, a lysosomal-like vesicle rich in proteases that play a key role during fertilization. When Spink2 is absent, the deregulated proteolytic activity of the targeted proteases such as acrosin leads to the fragmentation of the Golgi apparatus and arrest of spermiogenesis at the round spermatid stage. We also showed that sperm from heterozygous human and mice present a high level of morphological abnormalities and a decrease of progressive motility leading to a variable subfertility. These results showed for the first time that oligo-teratozoospermia and azoospermia could present a pathological continuum due to the same pathogeny.We also performed exome sequencing in a cohort of 78 non related MMAF subjects and identified in 49 cases deleterious bi-allelic mutations in a total of 11 candidate genes including DNAH1, CFAP43, CFAP44, WDR66 and FSIP2 giving a genetic diagnosis yield of 63%. These results confirm the genetic heterogeneity of MMAF and the efficiency of high throughput sequencing in genetic exploration of this phenotype. We also demonstrated the pathogenic implication of certain candidate genes (n=4) using knock-out mice created by the new technology of genome editing, CRISPR/Cas9.Overall, this work demonstrates the interest and effectiveness of combining exome sequencing and CRISPR/Cas9 system to study spermatogenesis disorders and male infertility.

Les biotechnologies de la reproduction sont aujourd’hui largement utilisées dans le contrôle de la fertilité animale et humaine. Ces techniques présentent cependant des rendements faibles et font actuellement l’objet de nombreuses recherches. Ce travail de thèse s’inscrit dans ce contexte et se focalise sur la recherche de nouvelles molécules pro-fertilité dans l’espèce bovine, et s’articule autour de deux axes : le premier consiste à tester les propriétés pro-fertilité d’une enzyme du métabolisme lipidique sur la maturation ovocytaire, la fécondation et le développement embryonnaire préimplantatoire in vitro, et le deuxième à découvrir des molécules permettant d’améliorer la fécondance des spermatozoïdes. Nous démontrons ici que l’application de l’enzyme améliore de manière significative le nombre et la qualité des embryons au stade blastocyste. Un savoir-faire quant à l’utilisation de cette enzyme (fenêtre de traitement, concentration,…) a été développé. Cette thèse a également permit de caractériser différents composés avec des propriétés différentes dont une molécule originale permettant d’augmenter la vitesse des spermatozoïdes. Ce composé est prometteur car il est aussi actif sur des spermatozoïdes issus du testicule, de l’épididyme ou de l’éjaculat, avant ou après congélation. / The reproductive biotechnologies are now widely used in control of animal and human fertility. However, these technics have low yields and are currently the subject of much research. In this context, the present thesis focuses on the search for new pro-fertility molecules in cattle, organized around two axis : the first one is to test the pro-fertility properties of an enzyme from lipid metabolism on maturation, fertilization and preimplantation embryo development in vitro, and the second one is to discover molecules to improve sperm fertilizing ability. Here, we show that application of the enzyme significantly improve the number and quality of embryos at the blastocyst stage. Expertise in the use of this enzyme (time of treatment, concentration, etc.) was developed. This thesis also allowed the characterization of different compounds with different properties. Among them, one original molecule increase sperm velocity. This compound is promising because it works on sperm from the testis, epididymis or ejaculate before or after freezing.

La baisse de la fertilité masculine mondiale ces dernières décennies est devenue préoccupante. Ainsi, un homme sur quinze est subfertile. Si les causes de la baisse de fertilité semblent être essentiellement liés à l'environnement et au mode de vie, il est essentiel de comprendre tous les mécanismes qui régulent le pouvoir fécondant du spermatozoïde afin d'optimiser les techniques de procréation médicalement assistée. Le développement de nouveaux axes de recherche, expérimentaux et théoriques, pour identifier les mécanismes sous-jacents de l'infertilité masculine est indispensable. C'est dans ce contexte, de développement de nouvelles stratégies expérimentales que se situe ce travail de thèse. La stratégie que j'ai employée ici est la recherche de nouveaux outils pharmacologiques à partir de venin d'animaux par des tests d'activités biologiques. Cette recherche nous a permis de mettre en évidence une nouvelle voie de régulation de la physiologie spermatique : la voie des phospholipases A2 secrétées. Ainsi, nous avons montré pour la première fois que les phospholipases A2 secrétées, régulent 4 étapes clé de la fécondation : la capacitation, la mobilité spermatique, la réaction acrosomique et l'interaction gamétique.

Pour les mâles, non seulement la reproduction est une activité particulièrement couteuse, mais les ressources dont ils disposent pour y faire face s’avèrent souvent largement contraintes. En effet, la production de l’éjaculat (sperme et substances non gamétiques) peuvent générer des couts énergétiques substantiels, voire être limités au cours de la vie des mâles. Par ailleurs, les traits impliqués dans l’attraction des femelles ou la compétition entre mâles rivaux peuvent également être liés à d’importantes dépenses énergétiques et/ou des risques de dommages physiques. Enfin, la sélection sexuelle post-éjaculat (compétition spermatique et choix femelle cryptique) peut fortement affecter leurs chances de paternité. Sous ces conditions, il est attendu que les mâles allouent stratégiquement leurs ressources reproductives au regard (i) des opportunités d’accouplement présentes et futures, (ii) de la qualité reproductive de la femelle et (iii) du risque et/ou de l’intensité de la compétition spermatique. Toutefois, la nature des allocations stratégiques chez les mâles et les contraintes qui influencent leur évolution restent encore mal comprises, en particulier parce que les interactions potentielles entre sélection sexuelle pré- et post-copulatoire peuvent soumettre les mâles à des épisodes sélectifs plus complexes que ceux existants chez les femelles. / Contrasting with a long assumed assumption, reproduction is particularly costly for males. Not only can ejaculate production (sperm and other non gametic materials) induce substantial energetic costs and be drastically limited along males’ life, but the traits involved in mate attraction or competition between rival males might further incur energetic cost and/or risks of injuries. In addition, post-copulatory mechanisms such as sperm competition and cryptic female choice might strongly bias male’s chances of paternity. Under these conditions, males are expected to strategically allocate their reproductive resources according to i) present and future mating opportunities, ii) the female reproductive quality and iii) the risk or intensity of sperm competition. However, the means by which males allocate their reproductive resources as well as the factors affecting their evolution remains poorly understood, in particular because potential interactions between pre and post-copulatory sexual selection makes the selective episodes in males often far more complex than those existing in females. Therefore, during my PhD, I investigated the strategic allocations of male reproductive resources in two insect species: the moth Achroia grisella and the bushcricket Ephippiger diurnus.