Trois nouvelles classes de stéroïdes triaromatiques ont été identifiés dans les roches et les pétroles du bassin de Paris par comparaison avec des substances synthétiques. Ces composés sont à la base du développement d'un nouvel indice de maturité dont l'application a été utile pour des problèmes de corrélation pétrole-roche mère.<br /><br />La synthèse de stéroïdes triaromatiques méthylés en position 2 (C21), 3 (C21, C27, C29) ou 6 (C21) a été effectué en plusieurs étapes à partir de la prégnénolone, du cholestérol ou du stigmastérol. Les structures des stéroïdes triaromatiques ont été confirmées par des expériences de découplage ou de corrélations spatiales par effet nucléaire Overhauser en RMN-1H à 200 MHz.<br /><br />Les stéroïdes triaromatiques méthylés en position 2, 3 ou 6 ont été identifiés dans les roches et les pétroles du bassin de Paris par comparaison de leurs données chromatographiques (CG) et spectrales (SM) avec les substances de synthèse. Leur formation dans le sous-sol à partir de précurseur stéroïdes triaromatiques (ou monoaromatique dans le cas du 6-méthyl) ne devient effective qu'à partir d'un certain degré de maturité. Elle est vraisemblablement due pour les composés 2-méthyl et 3-méthyl à une migration du groupement méthyle opérant sur l'isomère 4-méthyl et catalysée par les sites acides de la matrice minérale (argiles notamment). Toutefois une origine à partir de précurseurs comportant une fonction carbonée en position 2 ou 3 n'est pas exclue.<br /><br />Trois pétroles (Dogger, Domérien, Trias) et les extraits organiques de treize roches (Toarcien, Hettangien) du bassin de Paris ont été fractionnés par chromatographie (CC, CCM, CG, CLHP). Les fractions "alcanes", "alcanes ramifiés et/ou cycliques", "alcènes" et "aromatiques" ont été analysées par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CG-SM). La détection sélective de stéranes de même masse et de fragmentation analogue a été conduite par fragmentométrie de masse des transitions métastables. L'étude de la distribution des marqueurs biologiques présents dans les fractions organiques a donné plusieurs indications sur la nature de l'environnement de dépôt, la maturité des sédiments et la migration du pétrole de la roche-mère vers le réservoir. A cet égard un nouveau paramètre de maturité, l'indice des méthylstéroïdes triaromatiques (IMST), s'est avéré très utile pour établir des corrélations roches-roches ou roches-pétroles.

Cette thèse s’inscrit dans le cadre de la thématique du laboratoire de Pharmacognosie de l’UFR Santé, au sein de l’Université de Bourgogne. Elle vise essentiellement la recherche de molécules d’origine végétale issue de la biodiversité tropicale dotées d’une activité antitumorale et immuno-modulatoire dont principalement les saponines. Ce sont des glycosides triterpéniques ou stéroïdiques connus pour leurs nombreuses propriétés pharmacologiques. L’étude de 4 espèces végétales appartenant à 3 familles à savoir Dracaena marginata L., Dracaena fragrans Ker Gawl (Asparagaceae), Allium flavum L. (Amaryllidaceae) et Weigela stelzneri (Caprifoliaceae),a conduit à l’isolement et à la caractérisation de 26 glycosides naturels. Il s’agit de 22 saponines stéroïdiques parmi lesquelles 6 sont de structure nouvelle ainsi que 4 saponines triterpéniques dont 3 nouvelles. Les structures ont été élucidées principalement par l’utilisation de la RMN 2D ainsi que la spectrométrie de masse. 10 des 26 molécules isolées ont été testées en vue d’évaluer leurs activités cytotoxiques sur deux lignées cellulaires cancéreuses (SW480 et EMT-6), et 3 pour l’étude de la modulation de la production d’une cytokine pro-inflammatoire, l’interleukine IL-1β sur cellules PBMC stimulées par le LPS. Nos résultats montrent que 6 d’entre elles possèdent une activité cytotoxique modérée sur les deux lignées cancéreuses. En revanche, deux saponines triterpéniques de type oléanane exercent les plus fortes cytotoxicités sur les deux lignées cancéreuses comparées à celles des références internes (Etoposide et Methotrexate). De plus elles révèlent un important effet de modulation de la production de l’interleukine IL-1β sur cellules PBMC et de ce fait, un fort potentiel anti-inflammatoire. Des relations structure/activité ont été ainsi proposées. / This thesis was carried out in the Laboratory of Pharmacognosy, in health department of the University of Burgundy. The principal theme of this Laboratory is the research of natural compounds from tropical biodiversity, mainly saponins with antitumoral and immunomodulatory activities. These molecules are triterpenic or steroidic glycosides, well known for their various pharmacological activities. The study of 4 species belonging to 3 different families: Dracaena marginata L., Dracaena fragrans Ker Gawl (Asparagaceae), Allium flavum L. (Amaryllidaceae) et Weigela stelzneri (Caprifoliaceae), led to the isolation and characterization of 26 natural glycosides. Among them, 22 were steroidic saponins with 6 new structures and 4 were triterpenic saponins with 3 new structures. The spectral analysis was achieved using mainly 2D NMR and mass spectrometry. The cytotoxic activities of 10 isolated compounds were evaluated on 2 strains cancer cells (SW480 and EMT-6), and 3 compounds for studying the modulatory effect of the production of pro-inflammatory cytokine, interleukin IL-1β on PBMCs stimulated with LPS. Our results show that six of them have moderate cytotoxic activity on both cancer cell lines. However, two oleanane-type triterpene saponins exert the strongest cytotoxicity on both cancer cell lines compared to internal references (Etoposide and Methotrexate). Moreover they show a significant effect of modulating the production of interleukin IL-1β on PBMCs and thereby a strong anti-inflammatory potential. Structure / activity relationships have been proposed.

Plusieurs variables biologiques, psychologiques, ainsi que des différences culturelles, ont été mises en cause afin d'expliquer la différence de perception de la douleur existante entre les hommes et les femmes. Il est connu que les hormones gonadiques influencent la réponse nociceptive chez l’animal et chez l’humain. Le cerveau a aussi la capacité de synthétiser ses propres "hormones sexuelles", les neurostéroïdes. L'objectif de cette thèse était: 1) évaluer les facteurs physiologiques et psychologiques influençant de perception de la douleur chez les hommes et les femmes, 2) évaluer l'implication des androgènes et du cortisol sur les symptômes cliniques et la perception de la douleur chez des sujets atteints de fibromyalgie et sains, et 3) évaluer l'implication des hormones gonadiques et de leurs métabolites 3α5α-réduits dans la transmission et la modulation de la douleur chez animaux les mâles et les femelles par l'utilisation de modèles de douleur comportementaux. / Several biological, psychological, and cultural differences can explain the difference in pain perception between men and women. It is known that gonadal hormones influence the nociceptive response in animals and humans. The brain also has the ability to synthesize its own "sex hormones", also named neurosteroids. The aims of this thesis were: 1) to assess the physiological and psychological factors influencing the difference in pain perception between men and women, 2) to relate the levels of androgens and cortisol with clinical symptoms and pain perception in healthy volunteers and patients with fibromyalgia, and 3) to evaluate the involvement of gonadal hormones and of their 3α5α-reduced metabolites in the transmission of pain and the effectiveness of descending pain modulation systems (DPMS) in males and females using behavioral pain model in rats and mice.

L'accumulation spécifique de graisse à l'intérieur de la cavité abdominale, appelée obésité viscérale, est associée à plusieurs altérations métaboliques et à un risque accru de diabète de type 2 et de maladies cardiovasculaires. Il est proposé que les hormones stéroïdiennes, telles que les glucocorticoids et les androgènes, sont impliquées dans la distribution des graisses chez l'humain. Les glucocorticoids actifs, générés par la 11 β-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 1 (11β-HSDl), induisent l'adipogenèse et stimulent l'accumulation de lipides dans le tissu adipeux. Inversement, les androgènes inhibent l'adipogenèse et la lipogenèse. Il est suggéré que l'inactivation locale des androgènes par l'activité 3α-réductase permet la régulation de l'exposition du tissu adipeux à cette hormone. La cellularité des tissus adipeux abdominaux semble aussi être un déterminant important du développement de complications métaboliques chez les individus obèses. L'objectif des travaux présentés dans cette thèse est de caractériser les déterminants cellulaires et hormonaux de la distribution des graisses chez la femme. Les conversions locales de glucocorticoids et d'androgènes et la morphologie des adipocytes ont été caractérisées en relation avec l'accumulation de graisse viscérale à partir d'échantillons de tissus adipeux sous-cutané et omental prélevés chez des femmes admises en chirurgie gynécologique élective. Les résultats obtenus confirment que la réactivation des glucocorticoïdes dans le tissu adipeux omental est associée à une accumulation préférentielle de graisse viscérale chez la femme. Ils démontrent aussi que les glucocorticoïdes actifs stimulent l'inactivation des androgènes par l'activité 3α-réductase de TAKR1C2, et ce, particulièrement dans les préadipocytes provenant du tissu adipeux d'individus obèses. Les résultats supportent aussi l'hypothèse que EAKR1C2 permet la régulation de l'action anti-adipogénique des androgènes. Une autre étude révèle un patron divergent dans l'expression des gènes GLUT4 et IRS-1 qui reflète la capacité des tissus adipeux à répondre à l'insuline. Finalement, les résultats démontrent que l'hypertrophie des adipocytes omentaux prédit le risque d'hypertriglycéridémie indépendamment de la composition corporelle et de la distribution des graisses chez la femme. En conclusion, les résultats suggèrent que le métabolisme des glucocorticoïdes et des androgènes ainsi que la morphologie des adipocytes sont des déterminants importants de la distribution des graisses et des complications métaboliques chez la femme.

Les nucléotides cycliques sont des seconds messagers intracellulaires possédant une grande importance dans la signalisation cellulaire du follicule ovarien. Les niveaux intracellulaires en nucléotides cycliques tel que l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) dépendent de leur synthèse, assurée par l'adenylyl-cyclase (AC) ainsi que leur dégradation par les phosphodiéstérases (PDE). Ces dernières appartiennent à la superfamille des métalophosphohydrolases, elles hydrolysent le groupement phosphate en 3' des nucléotides cycliques pour produire un nucléotide 5' phosphate. Dans les cellules ovariennes, plusieurs familles de PDE ont été identifiées, agissant comme modulateurs des taux intracellulaires de nucléotides cycliques. Dans le présent projet, nous nous attarderons à étudier la signalisation cellulaire chez les cellules ovariennes impliquant l'AMPc. La régulation de ses concentrations intracellulaires affecte plusieurs processus physiologiques. Le projet s'intéresse particulièrement à une famille d'enzyme de dégradation de l'AMPc, la phosphodiestérase8A (PDE8A). Nous voulons donc valider la présence fonctionnelle de la famille de PDE8A dans les cellules ovariennes ainsi que la mitochondrie afin de comprendre l'implication de cette enzyme dans la physiologie cellulaire en s'attardant à la stéroïdogenèse, étant donné que les mitochondries sont un organite cellulaire essentiel pour la stéroïdogenèse parce qu'elles représentent le site de synthèses de plusieurs hormones stéroïdiennes. En effet, des récents travaux ont montré la famille PDE8 comme un régulateur de la stéroïdogenèse dans les cellules de Leydig. Dans cette étude, nous avons montré que le transcrit de PDE8A ainsi que sa protéine étaient exprimés dans les cellules de la granulosa, les cellules du cumulus et l'ovocyte chez le porc. Ainsi, la protéine PDE8a a été détectée par western blot dans des mitochondries isolées à partir des cellules de granulosa et des complexe ovocyte-cumulus (COC). Une co-localisation entre le signal immunoréactive de la PDE8A et le marquage réalisé par mitotracker a été observée dans les cellules de granulosa et des mitochondries isolées. De plus, la présence fonctionnelle de la PDE8 mesurée en tant qu'activité AMPc-PDE sensible au PF-04957325 a été détectée dans des cellules de la granulosa et des mitochondries isolées supportant la présence fonctionnelle de la PDE8A dans les mitochondries isolées. De ce fait, cette observation soutient encore la localisation fonctionnelle mitochondriale de la PDE8A. Une association entre la mitochondrie et la PDE8A a aussi été démontrée par immunomicroscopie électronique qui a confirmé l'ancrage de la protéine sur la membrane mitochondriale externe. Pour évaluer l'implication de la mitochondrie dans la stéroïdogenèse, l'effet de PDE8A sur la production de progestérone a été mesuré dans les complexes ovocyte-cumulus en utilisant le PF-04957325 comme un inhibiteur spécifique de PDE8. Lorsque les COC sont cultivés sans FSH, un niveau basal de progestérone est mesuré. Par contre en présence de FSH une augmentation significative de sécrétion de progestérone est observée. En utilisant un inhibiteur spécifique de la PDE8 (PF-04957325) avec la FSH nous avons obtenu une augmentation encore plus importante de la sécrétion de progestérone. Ces résultats démontrent la présence fonctionnelle de PDE8A dans les cellules de la granulosa et les complexes ovocyte-cumulus. Puisque les mitochondries sont l'une des localisations de PDE8A, l'effet de l'inhibiteur spécifique de PDE8 sur la sécrétion de progestérone soutient la contribution mitochondriale de PDE8 dans la stéroïdogenèse.

Pendant la grossesse, les hormones stéroïdes jouent un rôle indispensable dans la régulation des principales manifestations physiologiques telles que la reconnaissance maternelle de la gestation, la réceptivité de l'endomètre, le début du développement embryonnaire ainsi que le maintien de la gestation. Cependant, on sait très peu sur la production de ces hormones et les principaux facteurs des voies intracellulaires impliqués dans le processus de stéroïdogenèse dans le placenta bovin pendant les stades initiaux et plus avancés de la gestation. Par ailleurs, certaines anomalies du placenta chez les bovins suite à une mauvaise production de stéroïdes n'ont pas encore été démontrées. Les objectifs de cette thèse étaient donc de : 1) déterminer la présence et la localisation des principales protéines stéroïdiennes dans le placenta de bovins provenant de gestations de 50 à 120 jours, 2) comparer l'expression placentaire d'une série de gènes et de protéines stéroïdiennes entre une gestation impliquant un transfert de noyaux de cellules somatiques (SCNT) et une gestation non-clonale; 3) étudier l'impact des hormones trophiques et des seconds messagers sur la stéroïdogenèse dans le placenta bovin à 140 +10 jours de gestation. L’utilisation de techniques d’immunohistochimie, d’immunobuvardage et de PCR quantitatif nous a permis d’évaluer la présence d'un large éventail de gènes stéroïdiens (STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1 et SCARB1) qui participent au transport du cholestérol et dans la production de différents types de stéroïdes. Dans cette thèse, nous avons démontré la capacité du placenta bovin d’initier la stéroïdogenèse au début de la gestation et nous avons également déterminé les principales cellules impliquées dans ce processus. Nous avons constaté que les tissus maternels expriment les principaux marqueurs de stéroïdogenèse suggérant une plus grande capacité stéroïdogénique que les tissus fœtaux. En outre, un modèle d'expression des protéines complémentaires stéroïdogéniques entre la caroncule et le cotylédon a été observé, indiquant que la stéroïdogenèse placentaire exige une communication cellule à cellule entre les cellules de la mère et du fœtus. Après avoir démontré les principales cellules impliquées dans la synthèse des hormones stéroïdiennes dans le placenta bovin en début de gestation, nous avons ensuite étudié les modifications possibles de la stéroïdogenèse dans les tissus SCNT cotylédonaires à 40 jours de gestation. Nous avons identifié d'importantes modifications dans l'expression des gènes STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1, et SULT1E1. Conséquemment, nous postulons que l'expression réduite des gènes stéroïdiens peut provoquer une insuffisance de la biosynthèse des hormones stéroïdiennes, ce qui pourrait contribuer à un développement anormal du placenta et du fœtus dans les gestations SCNT à court ou long terme. Finalement, nous avons développé un modèle efficace de culture d’explants de placentome qui nous a permis d'explorer les mécanismes sous-jacents spécifiques à la stéroïdogenèse placentaire. Nous avons exploré l'effet stimulant des hormones trophiques et différents messagers secondaires sur l'expression de différentes protéines stéroïdogéniques ainsi que le taux de progestérone (P4) dans les explants de placentome. En utilisant les techniques de RIA et de PCR quantitatif, nous avons constaté que même si les analogues de l'hormone lutéinisante (hCG) ont un effet stimulant sur plusieurs gènes stéroïdiens, le calcium ionophore est le principal modulateur dans la synthèse de la P4. Ces résultats suggèrent que dans le placenta bovin, la synthèse de la P4 est modulée principalement par l'afflux de calcium intracellulaire, et apparemment les nucléotides cycliques ne semblent pas contrôler ce processus. En conclusion, cette étude contribue de manière significative à une meilleure compréhension des mécanismes d'entraînement de la synthèse des stéroïdes placentaires au début de la gestation et permet aussi d’apporter de nouveaux éclairages sur l'importance des stéroïdes placentaires dans la régulation du développement du placenta et du fœtus. / During pregnancy, steroid hormones have essential roles in regulating key physiological events such as maternal recognition, endometrial receptivity, early embryonic development, and maintenance of pregnancy. However, very little is known about the production of these hormones nor about the principal factors and intracellular pathways implicated in the steroidogenic process in bovine placenta, during early and advanced pregnancy. In addition, placental abnormalities in cattle following an improper steroid production in bovine placenta have not been yet demonstrated. The aims of this thesis were to: 1) determine the occurrence and localization of the principal steroidogenic proteins in bovine placenta from day 50 to day 120 of pregnancy; 2) compare the placental expression of a series of steroidogenic genes and proteins between somatic cell nuclear transfer (SCNT) pregnancies and non-SCNT gestations; 3) investigate the impact of trophic hormone, and second messengers on steroidogenesis in bovine placenta at 140 +10 days of gestation. Using immunohistochemistry, western blot and qPCR techniques, we evaluated the presence of a wide range of steroidogenic genes (STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1 and SCARB1), that participate in the cholesterol transport and in the production of different types of steroids. In this thesis, we demonstrated the capability of the early bovine placenta to initiate steroidogenesis, and we also determined the principal cells implicated in this process. We found that maternal tissue expresses the principal steroidogenic markers suggesting it has a greater steroidogenic capacity compared to fetal tissue. Moreover, a complementary pattern of steroidogenic protein expression between the caruncle and the cotyledon were found, indicating that placental steroidogenesis requires cell to cell communication between the maternal and fetal cells. Having shown the principal cells involved in the synthesis of steroid hormones in bovine placenta during early pregnancies, we then studied possible alterations in steroidogenesis in cotyledonary tissue in SCNT at 40 days of pregnancy. We identified significant alterations in the expression of STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1 and SULT1E1 transcripts. Therefore, we postulate that reduced expression of steroidogenic genes may cause an insufficient local biosynthesis of steroid hormones, which might contribute to the abnormal placental and fetal development in SCNT gestations at short or long term. Finally, we developed an efficient placentome explants culture model that allowed us to explore the specific mechanisms underlying placental steroidogenesis. We explored the stimulatory effect of trophic hormones and different second messengers on the expression of various steroidogenic proteins and the progesterone levels in placentome explants. By RIA and qPCR techniques, we found that although LH-like hormones (hCG), had a stimulatory effect on multiple steroidogenic genes, the calcium ionophore was the principal modulator in the synthesis of progesterone. These results suggest that in bovine placenta, the synthesis of progesterone is modulated principally by intracellular calcium influx, and cyclic nucleotides do not seem to be controlling this process. In conclusion, these studies significantly contribute to a better understanding of the driving mechanisms of placental steroid synthesis in early gestations and also provide new insights into the importance of placental steroids in the regulation of placental and fetal development.

Les stéroïdes sexuels ne sont pas impliqués uniquement dans la reproduction, ils sont également actifs dans le système nerveux où ils exercent des effets neuroprotecteurs. La mitochondrie a un rôle central dans la synthèse de l’énergie cellulaire et le contrôle du stress oxydant. Ces fonctions mitochondriales seraient une cible potentielle des effets des stéroïdes sexuels dans le cerveau. Deux approches ont été développées au cours de ce travail de thèse : une approche physiologique avec l’étude de l’influence des stéroïdes endogènes sur la fonction mitochondriale cérébrale et une approche thérapeutique en utilisant le modèle expérimental de l’ischémie cérébrale et du traitement par la progestérone. Pour analyser l’influence des stéroïdes endogènes, nous avons comparé le fonctionnement de la phosphorylation oxydative (consommation d’oxygène ou « respiration » et activités enzymatiques) ; le niveau du stress oxydant (pool de glutathion mitochondrial et inactivation oxydative de l’aconitase mitochondriale) et les taux cérébraux de stéroïdes dans des groupes de souris mâles et femelles soit jeunes adultes intactes ou gonadectomisées (3 mois) ; soit âgées (20 mois). Nous avons montré que la respiration NADH-dépendante est plus importante et que le stress oxydant mitochondrial est moins important chez les femelles que chez les mâles jeunes. Cette différence n’existe plus chez les souris âgées et est abolie après ovariectomie mais pas après orchidectomie, ce qui démontre l’influence des stéroïdes ovariens. Les taux cérébraux importants de prégnènolone et de progestérone chez les souris jeunes femelles par rapport aux jeunes mâles pourraient être impliqués dans le dimorphisme sexuel observé.Les modifications de la respiration mitochondriale induites par l’ischémie cérébrale sont également différentes entre les mâles et les femelles dans notre modèle. La respiration NADH-dépendante est diminuée dans les deux sexes, mais la respiration FADH2-dépendante est diminuée spécifiquement chez les femelles. Le stress oxydant mitochondrial est augmenté dans les deux sexes. L’administration de progestérone permet de restaurer la respiration FADH2-dépendante chez les femelles et la respiration NADH-dépendante ainsi que le pool de glutathion mitochondrial dans les deux sexes. Ce travail a permis de mettre en évidence des différences de fonctionnement mitochondrial cérébral chez les souris mâles et femelles jeunes et d’identifier la phosphorylation oxydative et le stress oxydant mitochondrial comme cibles d’action des effets neuroprotecteurs de la progestérone lors de l’ischémie cérébrale. / Besides the reproduction control, sex steroids also act on nervous system and exert neuroprotective effects. The mitochondria are centrally involved in cellular energy synthesis and oxidative stress regulation and constitute a potential target of steroids effects on brain. The aim of our study was twofold: (1) to study the influence of endogenous steroids on brain mitochondrial function in physiological conditions ; (2) to determine the effects of progesterone on mitochondrial function when used as therapeutic agent in an experimental model of cerebral ischemia. To analyze the influence of endogenous sex steroids, the oxidative phosphorylation system (oxygen consumption or “respiration” and enzymatic activities) and mitochondrial oxidative stress (glutathione pool and mitochondrial aconitase oxidative inactivation) were analyzed in brain mitochondria of young adult male and female mice (3-month-old), intact and after gonadectomy, and of aged male and female mice (20-month-old). Our results showed that young adult females have lower oxidative stress and a higher NADH-linked respiration rate as compared to young adult males. This sex difference was suppressed by ovariectomy but not by orchidectomy and no longer existed in aged mice. Concomitant analysis of brain steroids suggest that the major male/female differences in brain pregnenolone and progesterone levels may contribute to the sex differences observed in brain mitochondrial function.We have also shown that the decrease of brain mitochondrial respiration induced by ischemia is different according to sex in our experimental model. The NADH-linked respiration decreased after ischemia in males and female but a decrease of FADH2-linked respiration only occurred in females. Ischemia induced oxidative damages in both males and females. Progesterone restored NADH-linked respiration in both sexes and FADH2-linked respiration in females. Progesterone also preserved mitochondrial glutathione pool in both sexes. Our findings point to a sex difference in brain mitochondrial function of young male and female mice and identify the oxidative phosphorylation system and the mitochondrial oxidative stress as targets of the neuroprotective effects of progesterone.

Les contaminations fécales d'origine humaine ou animale contribuent à la dégradation des écosystèmes et affectent la qualité de l'eau avec des risques pour la santé publique par l'exposition à des agents pathogènes. Afin de réduire ces risques et d'améliorer la qualité de l'eau, il est nécessaire de développer des outils capables d'identifier les sources de contaminations fécales. Cet enjeu est exacerbé en Europe par le durcissement des directives sur les eaux de baignade et les eaux conchylicoles et l'obligation de procéder à l'identification et à la hiérarchisation des sources de contaminations. Cette thèse s'est attachée à valider l'utilisation des stéroïdes en tant que traceurs des sources de contaminations fécales des eaux de surface. La méthode utilisée est basée sur une analyse en composante principale de six stanols fécaux. L'approche scientifique a été menée en trois étapes, de l'échelle moléculaire à l'échelle du bassin versant. La spécificité des stéroïdes et l'homogénéité des sources ont été étudiées sur des déjections bovines, porcines et sur des influents, effluents et boues de stations d'épuration domestiques. Puis, la conservation et la persistance des empreintes stéroïdes ont été évaluées au cours du transport des échantillons sources vers le milieu naturel récepteur par des expérimentations en conditions contrôlées. Enfin, la méthode développée a été validée à l'échelle de deux bassins versants sujets à des contaminations fécales récurrentes multi-sources. L'ensemble des résultats obtenus au cours de ce travail permettent de valider l'utilisation des stéroïdes en tant que traceurs opérationnels de l'origine des contaminations fécales.

Pendant la grossesse, les hormones stéroïdes jouent un rôle indispensable dans la régulation des principales manifestations physiologiques telles que la reconnaissance maternelle de la gestation, la réceptivité de l'endomètre, le début du développement embryonnaire ainsi que le maintien de la gestation. Cependant, on sait très peu sur la production de ces hormones et les principaux facteurs des voies intracellulaires impliqués dans le processus de stéroïdogenèse dans le placenta bovin pendant les stades initiaux et plus avancés de la gestation. Par ailleurs, certaines anomalies du placenta chez les bovins suite à une mauvaise production de stéroïdes n'ont pas encore été démontrées. Les objectifs de cette thèse étaient donc de : 1) déterminer la présence et la localisation des principales protéines stéroïdiennes dans le placenta de bovins provenant de gestations de 50 à 120 jours, 2) comparer l'expression placentaire d'une série de gènes et de protéines stéroïdiennes entre une gestation impliquant un transfert de noyaux de cellules somatiques (SCNT) et une gestation non-clonale; 3) étudier l'impact des hormones trophiques et des seconds messagers sur la stéroïdogenèse dans le placenta bovin à 140 +10 jours de gestation. L’utilisation de techniques d’immunohistochimie, d’immunobuvardage et de PCR quantitatif nous a permis d’évaluer la présence d'un large éventail de gènes stéroïdiens (STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1 et SCARB1) qui participent au transport du cholestérol et dans la production de différents types de stéroïdes. Dans cette thèse, nous avons démontré la capacité du placenta bovin d’initier la stéroïdogenèse au début de la gestation et nous avons également déterminé les principales cellules impliquées dans ce processus. Nous avons constaté que les tissus maternels expriment les principaux marqueurs de stéroïdogenèse suggérant une plus grande capacité stéroïdogénique que les tissus fœtaux. En outre, un modèle d'expression des protéines complémentaires stéroïdogéniques entre la caroncule et le cotylédon a été observé, indiquant que la stéroïdogenèse placentaire exige une communication cellule à cellule entre les cellules de la mère et du fœtus. Après avoir démontré les principales cellules impliquées dans la synthèse des hormones stéroïdiennes dans le placenta bovin en début de gestation, nous avons ensuite étudié les modifications possibles de la stéroïdogenèse dans les tissus SCNT cotylédonaires à 40 jours de gestation. Nous avons identifié d'importantes modifications dans l'expression des gènes STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1, et SULT1E1. Conséquemment, nous postulons que l'expression réduite des gènes stéroïdiens peut provoquer une insuffisance de la biosynthèse des hormones stéroïdiennes, ce qui pourrait contribuer à un développement anormal du placenta et du fœtus dans les gestations SCNT à court ou long terme. Finalement, nous avons développé un modèle efficace de culture d’explants de placentome qui nous a permis d'explorer les mécanismes sous-jacents spécifiques à la stéroïdogenèse placentaire. Nous avons exploré l'effet stimulant des hormones trophiques et différents messagers secondaires sur l'expression de différentes protéines stéroïdogéniques ainsi que le taux de progestérone (P4) dans les explants de placentome. En utilisant les techniques de RIA et de PCR quantitatif, nous avons constaté que même si les analogues de l'hormone lutéinisante (hCG) ont un effet stimulant sur plusieurs gènes stéroïdiens, le calcium ionophore est le principal modulateur dans la synthèse de la P4. Ces résultats suggèrent que dans le placenta bovin, la synthèse de la P4 est modulée principalement par l'afflux de calcium intracellulaire, et apparemment les nucléotides cycliques ne semblent pas contrôler ce processus. En conclusion, cette étude contribue de manière significative à une meilleure compréhension des mécanismes d'entraînement de la synthèse des stéroïdes placentaires au début de la gestation et permet aussi d’apporter de nouveaux éclairages sur l'importance des stéroïdes placentaires dans la régulation du développement du placenta et du fœtus. / During pregnancy, steroid hormones have essential roles in regulating key physiological events such as maternal recognition, endometrial receptivity, early embryonic development, and maintenance of pregnancy. However, very little is known about the production of these hormones nor about the principal factors and intracellular pathways implicated in the steroidogenic process in bovine placenta, during early and advanced pregnancy. In addition, placental abnormalities in cattle following an improper steroid production in bovine placenta have not been yet demonstrated. The aims of this thesis were to: 1) determine the occurrence and localization of the principal steroidogenic proteins in bovine placenta from day 50 to day 120 of pregnancy; 2) compare the placental expression of a series of steroidogenic genes and proteins between somatic cell nuclear transfer (SCNT) pregnancies and non-SCNT gestations; 3) investigate the impact of trophic hormone, and second messengers on steroidogenesis in bovine placenta at 140 +10 days of gestation. Using immunohistochemistry, western blot and qPCR techniques, we evaluated the presence of a wide range of steroidogenic genes (STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1 and SCARB1), that participate in the cholesterol transport and in the production of different types of steroids. In this thesis, we demonstrated the capability of the early bovine placenta to initiate steroidogenesis, and we also determined the principal cells implicated in this process. We found that maternal tissue expresses the principal steroidogenic markers suggesting it has a greater steroidogenic capacity compared to fetal tissue. Moreover, a complementary pattern of steroidogenic protein expression between the caruncle and the cotyledon were found, indicating that placental steroidogenesis requires cell to cell communication between the maternal and fetal cells. Having shown the principal cells involved in the synthesis of steroid hormones in bovine placenta during early pregnancies, we then studied possible alterations in steroidogenesis in cotyledonary tissue in SCNT at 40 days of pregnancy. We identified significant alterations in the expression of STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1 and SULT1E1 transcripts. Therefore, we postulate that reduced expression of steroidogenic genes may cause an insufficient local biosynthesis of steroid hormones, which might contribute to the abnormal placental and fetal development in SCNT gestations at short or long term. Finally, we developed an efficient placentome explants culture model that allowed us to explore the specific mechanisms underlying placental steroidogenesis. We explored the stimulatory effect of trophic hormones and different second messengers on the expression of various steroidogenic proteins and the progesterone levels in placentome explants. By RIA and qPCR techniques, we found that although LH-like hormones (hCG), had a stimulatory effect on multiple steroidogenic genes, the calcium ionophore was the principal modulator in the synthesis of progesterone. These results suggest that in bovine placenta, the synthesis of progesterone is modulated principally by intracellular calcium influx, and cyclic nucleotides do not seem to be controlling this process. In conclusion, these studies significantly contribute to a better understanding of the driving mechanisms of placental steroid synthesis in early gestations and also provide new insights into the importance of placental steroids in the regulation of placental and fetal development.

La glycoprotéine P ou Pgp est une protéine de transport transmembranaire qui a pour rôle principal d'évacuer hors des cellules les xénobiotiques et les toxines. Elle agit comme une pompe à efflux et est surexprimée par certaines cellules cancéreuses. Ainsi, via ce mécanisme, les cellules tumorales peuvent devenir résistantes aux antitumoraux et conduire à l'échec des traitements lors de la chimiothérapie anticancéreuse. Aussi, la modulation de l'activité de cette protéine peut être un des moyens permettant l'amélioration des traitements anticancéreux. La Pgp possède plusieurs sites de fixation de substrats dont deux sont relativement proches spatialement : un site à stéroïdes et un site à ATP permettant d'hydrolyser l'ATP, source d'énergie nécessaire au fonctionnement de la Pgp. Notre objectif a été de synthétiser des modulateurs bivalents stéroïdes/bras/nucléosides. Pour cela, nous avons dans un premier temps préparé des analogues de bases puriques et plus particulièrement des didéazapurines, les 5- et 6-azaindoles et les trioxopyrrolopyridines correspondant puis effectué la glycosylation de ces derniers. Dans un second temps, des modulateurs stéroïdiens ont été synthétisés : plusieurs ont montré une bonne activité modulatrice de la Pgp. Enfin, des bras polyéthylènes glycols de longueurs variables ont été reliés à l'adénine pour être ensuite fixés aux stéroïdes via une fonction amide / P-glycoprotein Pgp is a transmembrane transporter protein that protects cells from potentially toxic exogenous compounds. This protein acts as a molecular pump and is overexpressed in cancer cells. So via that mechanism, tumor cells exhibit intrinsic or acquired cross-resistance to diverse chemotherapeutic agents, resulting in the failure of chemotherapy for some cancers. The modulation of the efflux activity of that protein can be one of the mean that could increase anticancer treatments efficiency. Pgp has different substrates sites, two of which are spatially close : the steroid site and the ATP site, the latter is in charge of ATP hydrolysis which give the required energy for the Pgp efflux activity. Our goal was to synthesize bivalent modulators steroids/linker/nucleosides. First we have obtained purine bases analogues and particularly didéazapurines such as 5- and 6-azaindoles and the corresponding trioxopyrrolopyridines, then we have carried out the glycosylation of those compounds. Then, steroids modulators have been synthesized : some of them have shown a good modulation activity toward Pgp. Finally, polyethylene glycols chains with different length have been grafted on adenine so that they could be attached to the steroids via an amide function