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Development of a novel method for time-resolved-diffusion detection of protein reactions and its application / 時間分解拡散観測手法を利用したタンパク質反応検出法の開発とその適用Takaramoto, Shunki 23 March 2021 (has links)
京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(理学) / 甲第23031号 / 理博第4708号 / 新制||理||1675(附属図書館) / 京都大学大学院理学研究科化学専攻 / (主査)教授 寺嶋 正秀, 教授 林 重彦, 教授 渡邊 一也 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Science / Kyoto University / DGAM
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Stanovení kinetiky polymerace propenu na Zieglerových-Nattových katalyzátorech metodami násadové polymerace a Stopped-Flow za průmyslových podmínek / Determination of propene polymerization kinetics on Ziegler-Natta catalysts by methods of batch and Stopped-Flow polymerization performed under industrial conditionsTvrdý, Michal January 2019 (has links)
This thesis is focused on the determination of the propene polymerization kinetics on phthalate and nonphthalate diester Ziegler-Natta MgCl2-supported catalysts under the industrial conditions. The kinetic profiles were determined by various laboratory techniques for propene polymerization. For assessing the profiles were utilized batch gas and liquid polymerization modes in 2-litre and 4-litre reactors. Finally, the results were complemented with the runs performed in a unique Stopped-Flow apparatus, which allows polymerization of liquid propene at very short polymerization times. The kinetics profiles of both catalysts were determined and compared by combination of experimental data of these techniques. The basic properties of the synthesized polymeric powders were measured, such as the melt flow index, bulk density and amount of polypropene fraction soluble in cold xylene.
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Studies toward the mechanism of allosteric activation in phenylalanine hydroxylaseSoltau, Sarah Rose 22 January 2016 (has links)
Phenylalanine hydroxylase (PAH, EC: 1.14.16.1) is a non-heme iron tetrahydropterin-dependent monooxygenase that maintains phenylalanine (L-Phe) homeostasis via conversion of L-Phe to L-Tyr. PAH is an allosteric enzyme that converts from an inactive T-state to an active R-state upon addition of substrate, L-Phe. Allosteric activation is correlated with physical and structural changes within the enzyme and a large activation energy. Crystal structures of PAH have not identified the location of the allosteric effector binding site. Herein, we report computational protein mapping efforts using the FTmap algorithm and experimental site-directed mutagenesis studies designed to define and screen possible L-Phe allosteric binding sites. Mass spectroscopic analysis of PAH proteolytic fragments obtained after photo-crosslinking with 2-azido-3-phenylpropanoate overlapped with one computationally derived allosteric binding pocket containing residues 110-120 and 312-317. Ligand docking studies, fluorescence measurements, binding affinity and activity assays on wild-type and mutant enzymes further characterized the shape and specificity of this pocket.
Thermodynamic studies using surface acoustic wave (SAW) biosensing determined the affinity of L-Phe for the allosteric site. Two L-Phe binding sites were observed upon SAW titrations, corresponding to the active and allosteric sites respectively ( K D,app^on 113 ± 12 µM active site, K D,app^on 680 ± 20 µM allosteric site). Site-directed mutagenesis was performed to prepare mutant enzymes containing a single tryptophan (L-Trp) residue. The fluorescence signatures of each of the three native L-Trp residues in PAH were determined by titrations with L-Phe. Trp187 primarily reports L-Phe induced allosteric conformational changes, while Trp120 reports active site L-Phe binding. Trp326 reports small signals of both active and allosteric site changes.
Variable temperature stopped-flow fluorescence kinetic studies elucidated a working mechanism for L-Phe allosteric activation of PAH. Fluorescent signals from wild-type, single, and double L-Trp PAH mutants have been used to build kinetic mechanisms for the L-Phe binding in each subunit and subsequent active site reorganization or allosteric conformational change. In these mechanisms, the enzyme has reduced activity (1-2% of wtPAH) until both L-Phe induced active and allosteric site conformational changes have occurred. Failure of either activation step prevents enzyme turnover and is the chemical-based cause of the metabolic condition phenylketonuria.
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Folding of the Prion ProteinApetri, Constantin Adrian 31 March 2004 (has links)
No description available.
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Insight into the Fidelity of Two X-Family Polymerases: DNA Polymerase Mu and DNA Polymerase BetaRoettger, Michelle P. 29 July 2008 (has links)
No description available.
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Etude du mécanisme d’activation de l’oxygène par les NO-Synthases / Study of oxygen activation mechanism by nitric-oxide synthasesBrunel, Albane 30 November 2012 (has links)
Le monoxyde d'azote est exclusivement synthétisé chez les mammifères par une famille d’hémoprotéines, les NO-Synthases. Le cœur de l’activité des NO-Synthases est l’activation de l’oxygène c'est-à-dire l’activation de l’intermédiaire réactionnel FeIIO2. Cette étape est contrôlée par la réactivité intrinsèque du fer, par les transferts de proton et les transferts d’électron. Elle doit être parfaitement maîtrisée car elle contrôle le chemin catalytique emprunté et la nature du produit final. Comprendre l’étape d’activation de l’oxygène est essentiel à la compréhension du rôle biologique et/ou pathologique de la NO-Synthase de mammifère. Cette question s'étend aux NO-Synthases bactériennes pour lesquelles on ne connait ni le mécanisme moléculaire ni la fonction biologique. Ce manuscrit propose une analyse approfondie de l’étape d’activation de l’oxygène de la NO-Synthase. Dans un premier temps, nous avons étudié l’influence de l’environnement proximal sur la réactivité intrinsèque du fer et l’activation de l’oxygène. Nous avons généré des protéines mutées qui modifient les propriétés électroniques de la liaison proximale de l’hème. Ces protéines mutées ont été caractérisées par différentes spectroscopies (résonance paramagnétique électronique, Raman de résonance). Dans un second temps nous avons directement étudié le complexe FeIIO2, en présence d’analogues de substrat, grâce à des analyses de cinétique rapide en flux continu et en flux arrêté (stopped-flow). Dans un troisième temps, le rôle du cofacteur tetrahydrobioptérine dans le transfert de proton et d’électron a été étudié par une méthode de piégeage à des temps très courts : le freeze-quench. L'ensemble de nos résultats montrent que l’activation de l’oxygène est régulée par les propriétés électro-donneuses du ligand proximal et par le réseau de liaisons H distal. Nous mettons en évidence des différences dans le rôle redox du cofacteur tetrahydrobioptérine entre la NO-Synthase de mammifère et la NO-Synthase bactérienne. La difficulté majeure pour comprendre l’étape d’activation de l’oxygène de la NO-Synthase réside dans la complexité et la rapidité de la réaction catalytique. Dans ce contexte, nous avons cherché à adapter une méthodologie qui a prouvé son efficacité dans le cas des cytochromes P450 : la cryo-réduction couplée à des sauts en température. / Nitric oxide is exclusively synthesized by NO-Synthases in mammals. The heart of the NO-synthase activity is oxygen activation, which corresponds to the activation of the FeIIO2 intermediate. This step depends on the heme electronic properties and on the electron and proton transfers. Oxygen activation has to be well mastered to control exactly the nature of the end-product. Understanding the oxygen activation step is necessary to better understand the biological/pathological role of the mammalian NO-Synthases. Furthermore, bacterial NO-Synthases function and oxygen activation mechanism are unknown. This PhD work proposes a deep analysis of the oxygen activation step in NO-Synthases. First, proximal environment has been studied with mutated proteins. These mutations impact the electronic properties of the heme proximal bond. Spectroscopic analyses of these mutants have been done by electron paramagnetic resonance and resonance Raman. Then, we have studied the FeIIO2 intermediate with substrate analogs which has necessitated continuous flow and stopped-flow analyses. Finally, the role of the tetrahydrobiopterin cofactor in the electron and proton transfer has been studied and clarified thanks to a very fast trapping method : the freeze-quench. Our results show that the oxygen activation step is elaborately controlled by the proximal bond electron donation and the distal H bond network. At the same time we show some differences between mammalian and bacterial NO-Synthases concerning the redox role of the tetrahydrobiopterin cofactor. The major obstacle to understand the oxygen activation step resides in the complexity of the active site chemistry and the rate of catalytic reactions. For this reason, we propose to adapt an already successful protocol to trap some intermediates in the cytochromes P450 mechanism : cryo-reduction coupled with temperature jumps.
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NMR Studies of Colloidal Systems in and out of EquilibriumYushmanov, Pavel V. January 2006 (has links)
The Thesis describes (i) the development of add-on instrumentation extending the capabilities of conventional NMR spectrometers and (ii) the application of the designed equipments and techniques for investigating various colloidal systems. The new equipments are: Novel designs of stopped-flow and temperature–jump inserts intended for conventional Bruker wide-bore superconductive magnets. Both inserts are loaded directly from above into the probe space and can be used together with any 10 mm NMR probe with no need for any auxiliary instruments. A set of 5 mm and 10 mm 1H – 19F – 2H NMR probes designed for heteronuclear 1H – 19F cross-relaxation experiments in Bruker DMX 200, AMX 300 and DMX 500 spectrometers, respectively. A two–stage low-pass filter intended for suppressing RF noise in electrophoretic NMR experiments. The kinetics of micellar dissolution and transformation in aqueous solutions of sodium perfluorooctanoate (NaPFO) is investigated using the stopped-flow NMR instrument. The sensitivity of NMR as detection tool for kinetic processes in micellar solutions is clarified and possible artefacts are analysed. In the NaPFO system, the micellar dissolution is found to proceed faster than 100 ms while surfactant precipitation occurs on the time scale of seconds-to-minutes. The kinetics of the coil-to–globule transition and intermolecular aggregation in a poly (Nisopropylacrylamide) solution are investigated by the temperature-jump NMR instrument. As revealed by the time evolution of the 1H spectrum, the T2 relaxation time and the self-diffusion coefficient D, large (>10 nm) and compact aggregates form in less than 1 second upon fast temperature increase and dissolve in less than 3 seconds upon fast temperature decrease. The intermolecular 1H – 19F dipole-dipole cross-relaxation between the solvent and solute molecules, whose fast rotational diffusion is in the extreme narrowing limit, is investigated. The solutes are perfluorooctanoate ions either in monomeric or in micellar form and trifluoroacetic acid and the solvent is water. The obtained cross-relaxation rates are frequency-dependent which clearly proves that there is no extreme narrowing regime for intermolecular dipole-dipole relaxation. The data provide strong constraints for the dynamic retardation of solvent by the solute. / QC 20100929
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Etude du mécanisme d'activation de l'oxygène par les NO-SynthasesBrunel, Albane 30 November 2012 (has links) (PDF)
Le monoxyde d'azote est exclusivement synthétisé chez les mammifères par une famille d'hémoprotéines, les NO-Synthases. Le cœur de l'activité des NO-Synthases est l'activation de l'oxygène c'est-à-dire l'activation de l'intermédiaire réactionnel FeIIO2. Cette étape est contrôlée par la réactivité intrinsèque du fer, par les transferts de proton et les transferts d'électron. Elle doit être parfaitement maîtrisée car elle contrôle le chemin catalytique emprunté et la nature du produit final. Comprendre l'étape d'activation de l'oxygène est essentiel à la compréhension du rôle biologique et/ou pathologique de la NO-Synthase de mammifère. Cette question s'étend aux NO-Synthases bactériennes pour lesquelles on ne connait ni le mécanisme moléculaire ni la fonction biologique. Ce manuscrit propose une analyse approfondie de l'étape d'activation de l'oxygène de la NO-Synthase. Dans un premier temps, nous avons étudié l'influence de l'environnement proximal sur la réactivité intrinsèque du fer et l'activation de l'oxygène. Nous avons généré des protéines mutées qui modifient les propriétés électroniques de la liaison proximale de l'hème. Ces protéines mutées ont été caractérisées par différentes spectroscopies (résonance paramagnétique électronique, Raman de résonance). Dans un second temps nous avons directement étudié le complexe FeIIO2, en présence d'analogues de substrat, grâce à des analyses de cinétique rapide en flux continu et en flux arrêté (stopped-flow). Dans un troisième temps, le rôle du cofacteur tetrahydrobioptérine dans le transfert de proton et d'électron a été étudié par une méthode de piégeage à des temps très courts : le freeze-quench. L'ensemble de nos résultats montrent que l'activation de l'oxygène est régulée par les propriétés électro-donneuses du ligand proximal et par le réseau de liaisons H distal. Nous mettons en évidence des différences dans le rôle redox du cofacteur tetrahydrobioptérine entre la NO-Synthase de mammifère et la NO-Synthase bactérienne. La difficulté majeure pour comprendre l'étape d'activation de l'oxygène de la NO-Synthase réside dans la complexité et la rapidité de la réaction catalytique. Dans ce contexte, nous avons cherché à adapter une méthodologie qui a prouvé son efficacité dans le cas des cytochromes P450 : la cryo-réduction couplée à des sauts en température.
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Étude des événements cinétiques initiaux du repliement de l'apomyoglobine.Weisbuch, Sébastien 07 January 2005 (has links) (PDF)
Un polypeptide néosynthétisé est capable de trouver rapidement le chemin vers sa structure tri-dimensionnelle finale, en passant par des intermédiaires partiellement structurés. L'acquisition d'information sur le rôle et l'importance de ces intermédiaires est rendue difficile parce qu'ils se forment très rapidement pendant la réaction de repliement et que cette période de temps n'est pas accessible aux appareils de mélange usuels.<br />L'objet de cette thèse était de caractériser les évènements cinétiques initiaux du repliement des protéines, notamment de l'apomyoglobine (apoMb), en utilisant des appareils de mélange ultra-rapide. Un appareil de type stopped-flow équipé d'une micro-cuve a permis de diminuer le temps mort de ce type de mélangeur. Une réaction bimoléculaire (NATA et NBS), à permis d'évaluer le temps mort à 400±10 µs, dans un mode d'utilisation permettant de suivre simultanément le signal de fluorescence et le signal de dichroïsme circulaire dans l'UV lointain. L'apoMb est une protéine particulièrement intéressante pour l'étude des évènements précoces du repliement des protéines. Le stopped-flow ultra rapide, a permis de suivre des cinétiques (k jusqu'à 1500 s-1) et montré que chaque étape précédemment identifiée, conduisant l'apoMb de sa forme dépliée à sa forme native (soit les réactions UIa, IaIb, et IbN), présente les caractéristiques typiques d'une réaction à deux états, hautement coopérative.<br />Nous avons étudié l'effet d'osmolytes sur les cinétiques et sur la stabilité à l'équilibre des formes U, I et N de l'apoMb. Des études cinétiques en présence de sucrose ont permis d'observer le comportement de la réactions UIa. Ces résultats indiquent que le sucrose déstabilise de manière relative la forme U et l'état de transition de la réaction UIa, par rapport à la forme Ia. L'étape limitante ne correspondrait donc pas à une compaction de la chaîne peptidique. Dans les mêmes conditions, l'étude de la transition IbN permet d'observer que l'état de transition présente des caractéristiques proches de Ib. Ces résultats, décrivant l'effet osmophobique sur l'intermédiaire I, ainsi que des résultats préliminaires de l'effet d'encombrement moléculaire sur le repliement du cytochrome C, sont discutés dans ce mémoire.
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Structural and functional analysis of catalase-peroxidasesWiseman, Benjamin 08 April 2010 (has links)
Catalase-peroxidases (KatGs), responsible for the activation of the anti-tubercular prodrug isoniazid (INH), are unusual members of the class I plant peroxidase family that possess strong catalase activity as well as peroxidase activity. Due to their strong catalase activity and their ability to activate INH, KatGs have been the subject of intense study for many years, and thus the goal of this work is to further characterize this enzyme in the hope of gaining a better understanding into these unusual reactions. Recent successful crystallization of a few representative KatGs revealed a unique covalent Met-Tyr-Trp cross-link joined to the conserved tryptophan in the heme active site, along with a nearby arginine that is in ionic association with the cross-linked tyrosine. Using the KatG from Burkholderia pseudomallei (BpKatG) as a model, site-directed mutagenesis to these residues revealed that they were essential for catalase, but not peroxidase activity. Structural and kinetic analysis revealed that Arg426 acts as a molecular switch, moving between 2 conformations, favoring heme oxidation when not in association with Tyr238 and favoring heme reduction when in association with Tyr238 by imparting its influence on the heme through the cross-link. Analysis of the reaction with peroxyacetic acid using stopped-flow spectrophotometry revealed an initial, rapidly formed enzyme-substrate complex before the formation of the oxoferryl compound I. Kinetic characterization revealed that formation of both the enzyme-substrate complex and the oxoferryl species were dependent on peroxyacetic acid concentration implying that 2 molecules of peroxyacetic acid are required to form the oxoferryl compound I intermediate. Successful co-crystallization with INH and its co-substrate, NAD+ has revealed their binding sites for the first time in a KatG. The NAD+ binding site is 20 Å from the entrance to the heme cavity, involving interactions primarily with the ADP portion of the molecule. The best defined INH binding site is located in a funnel shaped channel on the opposite side of the protein from the entrance channel that requires the movement of a glutamate residue for binding. The structures suggest that once INH is cleaved to the isonicotinoyl radical it diffuses to the NAD+ binding site to form the final active antimicrobial compound, IN-NAD, in a non-enzymatic reaction enhanced by the enzyme’s ability to bind NAD+.
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