Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-01-27T13:46:56Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Yves Mauro Fernandes Ternes - 2014.pdf: 5561765 bytes, checksum: 46838b1cfdd58678c8db3a46e445ce06 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-01-28T11:32:01Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Yves Mauro Fernandes Ternes - 2014.pdf: 5561765 bytes, checksum: 46838b1cfdd58678c8db3a46e445ce06 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-28T11:32:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Yves Mauro Fernandes Ternes - 2014.pdf: 5561765 bytes, checksum: 46838b1cfdd58678c8db3a46e445ce06 (MD5) Previous issue date: 2014-04-28 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Fundação de Apoio à Pesquisa - FUNAPE / 10-valent conjugate pneumococcal vaccine (PCV10) was introduced in the routine immunization at Goiania in June, 2010. The aims of this study were: (i) to evaluate the direct effect of PCV10 in preventing vaccine types nasopharyngeal/NP pneumococcal carriage in younger children according to different schedules; (ii) to investigate possible genetic changes that could interfere in the pneumococcal capsular typing. Methods: A cross-sectional population-based household survey was conducted in Goiania, Brazil, from December/2010-February/2011, targeting children aged 7-18 months. To evaluate PPCV10 effectiveness/VE, NP swabs, clinical and demographic data, and vaccination dates were collected from 1,287 children during home visits. Main outcome and exposure of interest were PCV10 vaccine-type (VT) carriage and dosing schedules (3p+0, 2p+0, and one catch-up dose), respectively. Pneumococcal carriage was defined by positivity in culture after of NP secretions in enrichment broth and isolates serotyping was performed by Quellung reaction. The nontypeable isolates were processed by conventional multiplex PCR (cmPCR). Rate ratio/RR was calculated as the ratio between the prevalence of VTs carriage in children vaccinated with different schedules (exposed) and not vaccinated to PCV10 (non-exposed). Adjusted RR was estimated using Poisson regression. VE on VT carriage was calculated as 1-RR*100. Results: The prevalence of pneumococcal carriage in a total of 1,287 children was 41.0% (95%CI: 38.4%-43.7%). Serotypes covered by PCV10 and PCV13 were 35.2% and 53.0%, respectively. Serotypes 6B (11.6%), 6A (9,8%), 23F (7.8%), 14 (6.8%), 19F (6.6%), and 19A (6,3%) were the most frequently observed. After adjusted for confounders, children who had received 2p+0 or 3p+0 dosing schedule presented a significant reduction on pneumococcal VT carriage, with PCV10 VE equal to 35.9% (95%CI: 4.2%-57.1%; p=0.030) and 44.0% (95%CI: 14.2%-63.5%; p=0.008), respectively, when compared with unvaccinated children. For children who received one catch-up dose, no significant VE was detected (p=0.905). We identified 13 samples with a genetic variation that underestimated the capsular typing for 19F by cmPCR. Conclusion: PCV10 was associated with high protection against vaccine-type carriage for children vaccinated before the second year of life, for 2p+0 and 3p+0 schedules. The identification of genetic variations (19Fv) allowed adapt the molecular technique (cmPCR) for capsular typing samples from Latin America. The continuous evaluation of carriage serotype is mandatory to evaluate the long-term effectiveness and impact of pneumococcal vaccine on serotypes reduction. / A vacina pneumocócica conjugada 10-valente (PCV10) foi introduzida no calendário básico de imunização em Goiânia em junho de 2010. Este estudo teve como objetivos: (i) Avaliar o efeito direto da PCV10 na redução de sorotipos vacinais de Streptococcus pneumoniae (pneumococo) na nasofaringe (NP) de crianças, de acordo com diferentes esquemas vacinais; (ii) investigar possíveis alterações genéticas que possam interferir na tipagem capsular dos pneumococos isolados. Métodos: Um estudo de corte transversal aninhado a um inquérito domiciliar de base populacional foi conduzido em Goiânia, de dezembro/2010 a fevereiro/2011, em crianças de 7-18 meses. Para avaliar a efetividade da PCV10 (VE), swabs de NP, dados clínicos e demográficos e datas da administração da vacina foram obtidos de 1.287 crianças durante as visitas domiciliares. As variáveis de desfecho e de exposição foram portador (colonização) por tipos vacinais (VTs) da PCV10 e esquemas vacinais (3p+0, 2p+0 e dose única – catch-up), respectivamente. A colonização pelo pneumococo foi definida pela positividade à cultura das secreções de NP em caldo enriquecido, e a sorotipagem dos isolados foi realizada pela reação de Quellung. Os isolados não tipáveis foram submetidos à PCR multiplex convencional (cmPCR). A razão de prevalência (rate ratio/RR) foi calculada como a razão entre a prevalência de VTs em crianças vacinadas com diferentes esquemas vacinais (expostas) e não vacinadas pela PCV10 (não expostas). A RR ajustada foi estimada utilizando a regressão de Poisson. A VE no estado de portador por VTs foi calculada como (1-RR) x 100. Resultados: A prevalência de portador pelo pneumococo no total de 1.287 crianças foi 41,0% (IC95%; 38,4-43,7). Os sorotipos presentes na PCV10 e PCV13 foram 35,2% e 53,0%, respectivamente. Os sorotipos mais frequentes foram 6B (11,6%), 6A (9,8%), 23F (7,8%), 14 (6,8%), 19F (6,6%) e 19A (6,3%). Após ajustar pelas variáveis de confusão, crianças que receberam os esquemas 2p+0 ou 3p+0 apresentaram uma redução significativa dos VTs, com VE igual a 35,9% (IC95%: 4,2-57,1; p=0,030) e 44,0% (IC95%: 14,2-63,5; p=0,008), respectivamente, quando comparado com crianças não vacinadas. Crianças que receberam dose única catch-up não apresentaram VE significante (p=0.905). Foram identificadas 13 amostras que apresentaram uma variação gênica que subestimava a tipagem capsular do 19F pela técnica cmPCR. Conclusões: a PCV10 foi associada a uma proteção significativa contra colonização nasofaringeana de VTs crianças menores de um ano, quando utilizados os esquemas vacinais 3p+0 ou 2p+0. A identificação de variações genéticas do sorogrupo 19 (19Fv) permitiu adequar a técnica de cmPCR para tipagem de amostras da América Latina. O monitoramento contínuo de sorotipos no portador é fundamental na avaliação da efetividade a longo prazo e o impacto da vacinação na redução dos sorotipos vacinais.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-03-29T19:34:49Z No. of bitstreams: 1 brunofariafernandes.pdf: 1082641 bytes, checksum: 63a37643d4eb9ed5cb93b5bbfdfe5f62 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-03-30T11:25:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 brunofariafernandes.pdf: 1082641 bytes, checksum: 63a37643d4eb9ed5cb93b5bbfdfe5f62 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-30T11:25:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 brunofariafernandes.pdf: 1082641 bytes, checksum: 63a37643d4eb9ed5cb93b5bbfdfe5f62 (MD5) Previous issue date: 2009-08-31 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A importância da preservação esplênica pela técnica do implante autógeno de tecido esplênico ou autotransplante esplênico é justificada pela alta incidência de infecção fulminante após esplenectomia (IFPE). Aproximadamente 80% dos casos relatados de IFPE, são causados pelo Streptococcus pneumoniae, também denominado pneumococo, é um coco Gram-positivo que tem como habitat a nasofaringe de seres humanos e é considerado o principal causador de otites media, meningite e pneumonia. Neste estudo buscamos investigar a capacidade de animais submetidos a esplenectomia e ao implante autógeno de baço em responder à infecção por S. pneumoniae. Foi avaliado a imunidade humoral e celular em camundongos BALB/c divididos em três grupos: Autotransplantado (AT), Esplenectomizado (SP) e Controle Sham (CT). A contagem do número de unidades formadoras de colônia (UFC) no fígado e nos pulmões mostrou que os camundongos do grupo SP apresentaram maior número de bactérias em ambos os órgãos além de uma resposta imune humoral insatisfatória, sendo identificado os menores níveis séricos de IgM, IgG1 e IgG2a anti- S. pneumoniae nesse grupo. A presença do fragmento esplênico induz a produção de IL-17A e o recrutamento de neutrófilos no fígado e nos pulmões dos camundongos autotransplantados, porém os camundongos esplenectomizados apresentavam os menores níveis de IL-17 A. Esses dados podem ser relacionados o UFC nos pulmões e fígado dos animais. Os resultados obtidos sugerem que o implante autógeno de baço restaura a capacidade de camundongos esplenectomizados de combater a infecção por S. pneumoniae. / The importance of the technique of autogenous implant of splenic tissue or splenic autotransplant is justified by the high incidence of overwhelming postsplenectomy infection (OPSI). Approximately 80 % of the reported cases of OPSI, are caused by Streptococcus pneumoniae, also called pneumococcus, which is a Gram-positive coccus having the human nasopharynx as habitat and considered the principal cause of otitis media, meningitis and pneumonia. In this study we investigate the capacity of animals having undergone splenectomy and autogenous implant of spleen for responding to infection by S. pneumoniae. Humoral and cellular immunity were evaluated in BALB/c mice divided into three groups: Autotransplanted (AT), Splenectomized (SP) and Sham (CT). The count of the number of colony forming units (CFU) in the liver and in the lungs showed that the mice of the SP group presented a greater number of bacteria in both organs aside from lower serum levels of IgM, IgG1 and IgG2a anti - S. pneumoniae. The presence of splenic fragment induces the production of IL-17A and the recruitment of neutrophils to the liver and lungs of the autotransplanted mice, however the splenectomized mice presented the lowest levels of IL-17A. These data can be related to the CFU in the lungs and liver of the animals. The results obtained suggest that the autogenous implant of spleen restores the splenectomized mouse's capacity for fighting infection with S. pneumoniae.

La transformation naturelle est la capacité de certaines bactéries à incorporer et à recombiner activement de l’ADN extra-cellulaire. Ce procédé majeur augmente la plasticité et l’adaptabilité des bactéries à Gram positif et négatif en réalisant des échanges génétiques intra- et inter-espèces. S. pneumoniae est un pathogène majeur de l’Homme. Cette bactérie est responsable d’infections sévères telles que des pneumonies, des méningites et des septicémies. Dans cette espèce, la transformation naturelle est corrélée au phénomène de changement de capsule et à la baisse d’efficacité des vaccins. La plupart des bactéries à Gram positif naturellement transformables possèdent un opéron comG, semblable aux opérons codant pour la famille des pili de type IV, extrêmement répandus chez les bactéries à Gram négatif. Il a été proposé que l’opéron comG est responsable de la formation d’un petit filament, nommé pseudo- pilus. Cependant, un tel filament n’a jamais été observé. Par des techniques de mutagenèse, de caractérisation biochimique, de microscopie optique et électronique, nous sommes parvenus à identifier des filaments de plusieurs micromètres de long à la surface de bactéries S. pneumoniae compétentes. Nous avons confirmé l’appartenance de ces filaments à la famille des pili de type IV. Par conséquent, nous avons infirmé l’hypothèse de la formation d’un pseudo-pilus par l’opérons comG chez S. pneumoniae. De plus, nous avons montré que les pili se lient à l’ADN et qu’ils sont requis pour la capture de l’ADN extra-cellulaire. Ces résultats apportent des informations cruciales concernant les premières étapes de capture de l’ADN durant la transformation naturelle. Nous proposons un nouveau modèle dans lequel le pilus agirait comme un « piège à ADN », capturant l’ADN à la surface des bactéries compétentes pour le guider jusqu’au pore d’entrée dans la cellule. / Natural transformation is the ability of bacteria to actively take up and recombine extracellular DNA. This crucial process increases genome plasticity and adaptability of Gram-negative and Gram-positive bacteria through intra- and inter-species genetic exchange. S. pneumoniae is a major human pathogen responsible for severe diseases such as pneumonia, meningitis and septicemia. In this species, transformation has been linked to capsular serotype switching and reduced vaccine efficiency. Most transformable Gram-positive bacteria carry a comG operon that resembles operons encoding a widespread family of pili in Gram-negative bacteria, the type IV pili. It has been commonly proposed that the comG operon is responsible for the formation of a short pseudo-pilus filament. However, such an appendage had never been visualized in any bacterium. By mutagenesis, biochemical characterization, optical and electron microscopy techniques we were able to identify long, micrometer-sized appendages protruding from the surface of competent S. pneumoniae. We confirmed the Type IV pili nature of these appendages, we showed that they bind DNA, and are absolutely required for DNA uptake. We consequently overthrew the pseudopilus hypothesis at least in S. pneumoniae, and provided crucial information concerning the initial step of DNA uptake. We propose a revised model in which the transformation pilus acts as a “DNA trap” capturing DNA at the surface of competent cells, guiding it to the translocation channel.

A colonização da mucosa respiratória é a primeira etapa na patogênese de Streptococcus pneumoniae, bactéria causadora de pneumonia, meningite, e otite média, responsável por mais de um milhão de mortes por ano no mundo. As proteínas de superfície PsaA e PspA têm sido investigadas como candidatos vacinais para estas doenças. CTB é a porção não tóxica da toxina colérica (CT), responsável pela ligação da toxina ao receptor celular GM1 e descrita como adjuvante de mucosas. Neste trabalho, estes genes de S. pneumoniae foram clonados em pAE, um vetor de expressão de E. coli, que utiliza o promotor T7, ou a 3\' de ctxB no plasmídeo pAE-ctxB. As proteínas recombinantes CTB, PsaA, CTB-PsaA, PspA1, CTB-PspA1, PspA3 e CTB-PspA3 foram expressas em E. coli BL21 (SI) e purificadas através de coluna carregada com níquel. Ensaios de ligação ao receptor GM1 mostraram que CTB e a porção CTB das proteínas de fusão foram obtidas na forma funcional. Imunização por via intranasal com CTB-PsaA e, por via intranasal e intradérmica com CTB-PspA1 e CTB-PspA3 induziu a produção de IgG no soro. Em compensação, somente a imunização com a fusão CTB-PsaA induziu produção de IgA nas secreções de mucosa. Ensaios de colonização da nasofaringe de camundongos BALB/C e C57BL/6 mostraram que a imunização intranasal com CTB-PsaA resulta em diminuição de colonização por S. pneumoniae. Desafios letais com linhagem virulenta de S. pneumoniae mostraram que a imunização intradérmica com CTB-PspA3, ao contrário da imunização intranasal, é capaz de proteger os animais. Uma vez que estas proteínas de fusão induziram resposta imune protetora, estas deverão ser investigadas como componentes de uma nova vacina para infecções causadas por S. pneumoniae. / The colonization of the respiratory mucosa is the first step in the pathogenesis of Streptococcus pneumoniae, bacterium that causes pneumonia, meningitis and otitis media. It is responsible for more than one million deaths per year worldwide. The surface proteins PsaA and PspA have been investigated as vaccine candidates against these diseases. CTB is the non-toxic portion of cholera toxin (CT), responsible for the toxin binding to the cellular receptor GM1 and described as mucosal adjuvant. In this study, these genes from S. pneumoniae were cloned in pAE, an E. coli expression vector that uses T7 promoter, or downstream to ctxB gene in the pAE-ctxB plasmid. The recombinant proteins CTB, PsaA, CTB-PsaA, PspA1, CTB-PspA1, PspA3 and CTB-PspA3 were expressed in E. coli BL21 (SI) and purified through a chelating resin charged with nickel. GM1 binding assays showed that CTB and CTB portion of the fusion proteins were functional. Intranasal immunization with CTB-PsaA and, intranasal and intradermal administration of CTB-PspA1 and CTB-PspA3 induced IgG production in the serum. On the other hand, only CTB-PsaA fusion protein induced IgA in the mucosal secretions. Nasopharyngeal colonization assays in BALB/C and C57BL/6 mice showed that intranasal immunization with CTB-PsaA results in a decrease of colonization by S. pneumoniae. Lethal challenges with S. pneumoniae virulent strains indicated that intradermal immunization with CTB-PspA3, in contrast to the intranasal immunization, is able to protect mice. Since the fusion proteins induced a specific immune response, they should be further investigated as components of a new vaccine against infections caused by S. pneumoniae.

Em trabalhos anteriores o nosso grupo mostrou que a vacina celular pertussis (wP) apresenta atividade adjuvante quando combinada a proteína A da superfície de Streptococcus pneumoniae (pneumococo), PspA, A formulação PspA5-wP induz altos níveis de anticorpos e proteção em camundongos após desafio com pneumococo. Neste trabalho foram avaliados os mecanismos da ação adjuvante e os componentes de B. pertussis responsáveis por este efeito. A imunização de camundongos com PspA em combinação a mutantes de B. pertussis ou componentes desta bactéria purificados mostrou que a presença da toxina pertussis (PT) capaz é essencial para induzir altos níveis de anticorpos anti-PspA e proteção significativa contra o desafio letal com pneumococo. Este efeito não foi dependente da atividade enzimática. Anticorpos anti-PspA e as proteínas do sistema complemento foram essenciais para a proteção conferida por PspA-wP. As vacinas celulares BCG e DTP combinadas a PspA, também apresentaram atividade adjuvante, induzindo anticorpos anti-PspA e proteção contra o desafio invasivo por pneumococo. / Previously our group showed that the pneumococcal surface protein A from Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), PspA, when combined with cellular pertussis vaccine (wP) as adjuvant, induce high levels of antibodies and mice protection on pneumococcal challenge. In this work were used mutants and purified components derived from B. pertussis for investigate the components responsible for this adjuvant effect, through of mice immunizations in combination with the PspA5 (Clade 5 PspA) antigen. Pertussis toxin (PT) was able to inducing the higher levels of PspA5 specific antibodies and significative protection against the pneumococcal lethal challenge, independently of its enzymatic effect. Was observed that in the protection conferred by the PspA5-wP formulation thus as the anti-PspA5 antibodies, the complements proteins are essentials. Lastly, prime-boost experiments showed that the cellular vaccines BCG and DTP when combined to PspA5, induced high levels of anti-PspA5 antibodies and protection against invasive challenge with pneumococcus.

Streptococcus pneumoniae é o patógeno causador de diversas doenças com alta mortalidade e morbidade, como meningite e pneumonia. As vacinas disponíveis baseiam-se na resposta contra o polissacarídeo capsular (PS), porém possuem elevado custo e cobertura limitada aos sorotipos vacinais. O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia da imunização nasal com PspAs recombinantes de família 1 (rPspA1 e rPspA2) e de família 2 (rPspA3, rPspA4 e rPspA5) em um modelo de cocolonização da nasofaringe de camundongos, utilizando isolados que expressam diferentes PspAs (PspA1 ao PspA4). Esse modelo visa analisar a eficácia da vacinação frente à exposição a diferentes pneumococos, uma situação comum, especialmente em crianças. Os experimentos deste projeto avaliaram a colonização com misturas de isolados dos sorotipos 6B e 23F e expressando PspA1, PspA2, PspA3 ou PspA4, mostrando uma análise ampla da cobertura vacinal contra pneumococo das diferentes formulações contendo as variantes do antígeno PspA e a importância desse antígeno para o desenvolvimento de uma nova vacina. / Streptococcus pneumoniae is the cause of several diseases with high mortality and morbidity, such as meningitis and pneumonia. The available vaccines are based on the response against the capsular polysaccharide (PS), but they have a high cost and coverage restricted to the vaccine serotypes. The purpose of this study was to evaluate the efficacy of nasal immunization with recombinant PspAs from family 1 (rPspA1 and rPspA2) and from family 2 (rPspA3, rPspA4 and rPspA5) in a model of co-colonization of the mouse nasopharynx, using isolates expressing different PspAs (PspA1 to PspA4). This model aims to analyze the effectiveness of vaccination upon exposure to different pneumococci, a common situation, especially in children. The experiments in this project assessed colonization with mixtures of isolates of serotypes 6B and 23F, expressing PspA1, PspA2, PspA3 or PspA4, showing a wide vaccination coverage analysis of different formulations containing the PspA variants against pneumococcus and the importance of this antigen to the development of a new vaccine.

Background: S. pneumoniae is a major cause of meningitis, pneumonia and sepsis in children. In 2006 universal pneumococcal vaccination was recommended in Germany for all children up to their second birthday. We have compared the prevalence and outcome of IPD at a single hospital before and after the introduction of vaccination. Findings: 55 cases of IPD were identified over an 11 year period. Almost half of the patients were younger than 2 years of age. Most of the children were affected by pneumonia. The second highest incidence seen was for meningitis and sepsis. 17 patients exhibited additional complications. Significant pre-existing and predisposing disorders, such as IRAK 4 defect, ALPS or SLE were identified in 4 patients. Complete recovery was seen in 78% of affected children; 11% had a fatal outcome and 11% suffered from long term complications. Only 31% overall had been vaccinated. The most common serotype was 14. Serotypes not covered by any of the current vaccines were also found. Antibiotic treatment commenced with cephalosporins in over 90%. Conclusion: Frequency of IPD in our hospital did not decrease after initiation of the pneumococcal vaccination. This might be due to vaccinations not being administered satisfactorily as well as to poor education about the need of the vaccination. Pre-existing diseases must be monitored and treated accordingly and rare deficiencies taken into account when IPD takes a foudroyant course. In addition, antibiotic stewardship has been initiated at this hospital centre as a consequence of the high cephalosporin use detected in this study.

Streptococcus pneumoniae é causa de doenças como pneumonia, otite, meningite e sepse. As vacinas hoje disponíveis têm cobertura limitada porque são baseadas no polissacarídeo capsular, que varia com os mais de 90 sorotipos da bactéria, além de levarem à substituição de sorotipos na população por outros não presentes nas formulações. Visando reduzir o custo e aumentar a cobertura, têm-se estudado vacinas baseadas em proteínas que ofereceriam proteção independente de sorotipo. Este trabalho teve por objetivo a obtenção, avaliação da estabilidade e da resposta imune em camundongos de híbridos de duas proteínas de S. pneumoniae: a proteína de superfície do pneumococo (PspA) e a pneumolisina geneticamente detoxificada (PdT), sem ou com espaçadores moleculares, rígido ou flexível, entre as moléculas. Os genes dos híbridos com espaçadores foram clonados através da técnica de overlap extension PCR. O gene das proteínas foi expresso em E. coli e as proteínas obtidas foram reconhecidas por anticorpos produzidos contra a célula inteira de pneumococo através de Western Blot. A purificação dos híbridos foi feita utilizando homogeneizador de alta pressão, precipitação de impurezas com detergente catiônico CTAB e diferentes etapas cromatográficas. A estabilidade foi analisada periodicamente através de SDS-PAGE e Western Blot. O híbrido sem espaçador mostrou-se instável, por isso a presença de atividade proteolítica foi investigada através de diversos ensaios para detecção dessas enzimas, mostrando que a instabilidade não decorreu de hidrólise por proteases. Os fragmentos resultantes da quebra tiveram a porção N-terminal sequenciada para identificar o sítio de clivagem, que estava localizado na junção das duas proteínas. Esse sítio foi retirado das construções seguintes e espaçadores moleculares foram incluídos entre os dois antígenos. A molécula com espaçador flexível foi obtida na forma solúvel durante o cultivo, porém durante a purificação ocorreu precipitação irreversível. O clone para produção do híbrido com espaçador rígido permitiu a obtenção da proteína, que foi purificada e teve a estabilidade avaliada periodicamente à 4° C e -20° C por Western Blot empregando anticorpos contra célula inteira de pneumococo, indicando que a introdução do espaçador rígido aumentou a estabilidade do híbrido em relação à molécula sem espaçador. Além disso, diferentes concentrações de estabilizantes foram avaliadas, mostrando que em presença de trealose 1M ou glicerol 50% o híbrido com linker rígido permaneceu estável por pelo menos 4 meses a 4° C. A molécula com espaçador rígido produziu níveis de anticorpos em camundongos comparáveis aos níveis obtidos com a molécula sem espaçador, que foram capazes de proteger 100% dos animais em ensaio de desafio letal intranasal e inibir a atividade hemolítica da pneumolisina. O aumento de estabilidade do híbrido alcançado com a inserção do linker rígido juntamente com a retirada do sítio de clivagem e com a presença de estabilizantes permitem que esta molécula seja utilizada numa vacina pneumocócica proteica. Como estudos vêm demonstrando que seria necessário mais de uma proteína para formular esta nova vacina, a produção deste híbrido traz a grande vantagem de obtenção de dois antígenos em um único processo de produção, o que pode resultar em uma diminuição do custo da dose. / Streptococcus pneumoniae is cause of diseases like pneumonia, otitis, menngitis and sepsis. The vaccines available nowadays has limited coverage because they are based on the capsular polysaccharyde, which varies among the more than 90 bacteria serotypes and they lead to serotype substitution on the population for others not present on the vaccine formulations. In order to reduce the cost and increase the coverage, vaccines based on pneumococcal proteins that would offer serotype independent protection have been studied. The objective of this thesis was the obtainment, stability evaluation and immune response evaluation in mice of hybrids composed of two proteins of S. pneumoniae: pneumococcal surface protein A (PspA) and genetically detoxified pneumolysin (PdT), with or without molecular linkers, rigid and flexible, between the molecules. The genes with molecular linkers were cloned using the overlap extension PCR technique. The genes were expressed in E. coli and the proteins were recognized by anti pneumococcal whole cell in Western Blot. The hybrids were purified using high pressure homogeneizer, precipitation of impurities using cationic detergent CTAB and different chromatography steps. The stability was periodically analyzed through SDS-PAGE and Western Blot. The hybrid without linker was unstable and the presence of proteolytic activity was investigated through several methods for protease activity detection, showing that instability was not due to protease hydrolysis. The N-terminal portion of the degraded protein fragments was sequenced in order to identify the cleavage site, which was localized exactly between the two proteins. This site was removed from the other hybrids and molecular linkers were included between the two antigens. The molecule with flexible linker was obtained on the soluble form during expression, but during purification it precipitated irreversibly. The molecule with rigid linker were expressed, purified and had its stability analyzed periodically at 4° C and -20° C by Western Blot using anti pneumococcal whole cell, indicating that the insertion of the rigid linker increased the hybrid stability when compared with the hybrid without linker. Besides that, different stabilizers in different concentrations were evaluated and it was found that the presence of trehalose 1 M or 50% glycerol stabilized the hybrid with rigid linker for at least 4 months at 4 ° C. The molecule with rigid linker produced levels of antibodies in mice comparable to the hybrid without linker. These antibodies were able to protect 100% of animals from lethal intranasal challenge and inhibit the haemolytic activity of pneumolysin. The stability increase due to the rigid linker together with the removal of the cleavage site and the stabilizers presence allow this hybrid molecule to be used on a novel pneumococcal vaccine. Since studies have shown that it would be necessary more than one protein to formulate this new vaccine, the production of this hybrid brings the great advantage of producing two antigens in one single process, which can decrease the dosage cost.

Vesículas de membrana externa, OMV, são formadas a partir de evaginações da membrana externa de bactérias Gram-negativas e têm ganhado interesse em suas funções biológicas por serem uma alternativa ao desenvolvimento de novas estratégias e combinações vacinais. OMV da bactéria comensal Neisseria lactamica induzem anticorpos que possuem reatividade cruzada com N. meningitidis e podem ser, além de antígeno para a doença meningocócica, um potencial adjuvante de mucosa. O objetivo deste trabalho é estabelecer condições de cultivo de N. lactamica para a obtenção de OMV e avaliar a função adjuvante destas OMV em combinação com o antígeno de superfície, PspA5, de Streptococcus pneumoniae. Foram realizados cultivos descontínuos em biorreatores de 5L por 10-15h. O meio de Catlin, MC, teve a concentração do substrato fonte de carbono (lactato) e aminoácidos modificada, além do acréscimo de extrato de levedura. Foram monitorados temperatura, pH, agitação e oxigênio dissolvido. Amostras foram coletadas a cada hora para análise de biomassa, consumo de nutrientes, produção de ácidos e concentração das OMV. Foram determinados os parâmetros cinéticos de produtividade máxima de células (ProdXmáx) e de produto (ProdPmáx), fatores de conversão (Yx/s, Yp/s e Yp/x) e velocidade de crescimento (Xmáx). O meio MC3LA2AA2YE (12h), com 18,0 g/L de lactato e o dobro da concentração original dos aminoácidos do MC foi o melhor, quando comparado aos demais para a obtenção de OMV. N. lactamica, cultivada nesta condição, apresentou produtividade máxima de OMV de 30,66 mg OMV/L.h, e concentração de OMV de 340,43 mg/L, na 11ª hora de cultivo. Os ensaios imunológicos foram realizados com a formulação de OMV puras ou OMV tratadas com detergente, para a retirada de parte do lipooligossacarídeo (LOS), em combinação com a proteína PspA5 de S. pneumoniae. O esquema de imunização foi de duas doses via intranasal, em modelo murino. Foram avaliados a indução de anticorpos IgG anti-PspA5 e o potencial protetor das formulações. Os grupos vacinais com adjuvante apresentaram indução de anticorpos IgG anti-PspA5 de aproximadamente 105ng/mL e sobrevivência de 100%, 75% e 66,7%, respectivamente, para PspA5-OMVp, PspA5-OMVt0,5%, e PspA5-OMVt0,3% Os resultados evidenciam atividade adjuvante determinante das OMV em combinação com a proteína heteróloga PspA5 e proteção contra o desafio de Streptococcus pneumoniae em modelo murino. / Outer membrane vesicles, OMV, are formed and released from all Gram-negative bacteria´s outer membrane. Those vesicles have gained interest from scientific community due to their biological functions, as they can be a potential alternative to the development of new vaccine strategies and formulations. OMV from the commensal bacteria Neisseria lactamica induce antibodies that present cross reactivity with N. meningitidis and may be a potential mucosal adjuvant in addition to antigen for a meningococcal disease. The objective of this work is to define culture conditions of N. lactamica in order to obtain OMV, and evaluate the adjuvant function of their OMV in combination to the surface antigen, PspA5, from Streptococcus pneumoniae. Discontinuous batches cultures were carried out in 5L bioreactors for 10-15h. Catlin medium, MC, had its carbon substrate concentration (lactate) and its amino acids concentration modified according to each experiment, plus the addition of yeast extracts. Temperature, pH, agitation and dissolved oxygen were monitored. Samples were collected hourly for analysis of biomass, nutrient consumption, acid production and OMV yield. Maximal cell production products (ProdXmáx) and product (ProdPmáx), conversion factors (Yx/s, Yp/s e Yp/x) and growth rate (Xmáx) were obtained. The MC3LA2AA2YE medium (12h), with 18.0 g / L lactate and double the original MC amino acid concentrations, was the best formulation to obtain OMV. N. lactamica, cultivated in this condition, presented maximum OMV productivity of 30.66 mg OMV/L.h and OMV concentration of 340.43 mg/L, at the 11th hour of cultivation. Immunological assays were performed with formulations with native OMV or OMV treated with detergent to remove part of the lipooligosaccharide (LOS), in combination with S. pneumoniae PspA5 protein. Two-dose of intranasal immunization were administered in mice. An induction of anti-PspA5 IgG antibodies and the protective potential of the formulations were evaluated. Adjuvanted vaccine groups showed induction of anti-PspA5 IgG antibodies of approximately 105 ng/mL and 100%, 75% and 66.7% survival, respectively for PspA5-OMVp, PspA5-OMVt0,5%, e PspA5-OMVt0,3%. The results obtained in this project show a significant adjuvant activity of Neisseria lactamica OMV in combination with heterologous protein PspA5 and protection against Streptococcus pneumoniae challenge in mice model.

O Streptococcus pneumoniae (pneumococo) constitui um dos mais importantes patógenos bacterianos do trato respiratório, podendo causar infecções invasivas e não invasivas, levando a altas taxas de morbimortalidade, particularmente em crianças menores de cinco anos de idade. A bactéria ganha acesso ao hospedeiro através da colonização da nasofaringe, que representa um importante reservatório para a transmissão deste patógeno na comunidade, contribuindo para a disseminação horizontal de pneumococo entre os indivíduos de uma população. As doenças respiratórias causadas por pneumococo constituem em uma das prioridades atuais em Saúde Pública, recebendo atenção destacada das organizações internacionais da área da saúde, como a Organização Mundial da Saúde. No presente trabalho procura-se conhecer e avaliar a ocorrência da pneumonia adquirida na comunidade (PAC) antes e após a implantação no Calendário Vacinal da Vacina Pneumocócica-10 Valente Conjugada em 2010, na área de abrangência da Superintendência Regional de Saúde (SRS) de Alfenas/MG. Foi realizado um estudo ecológico com componente temporal que incluiu registros de crianças menores que um ano de idade, vacinadas e não vacinadas com a vacina antipneumocócica 10-valente conjugada, no período pré e pós inclusão da vacina no PNI nos municípios da Superintendência Regional de Saúde (SRS) de Alfenas/MG, sendo a vacinação o fator de exposição e a ocorrência de PAC o desfecho, utilizando dados anuais secundários por município para cálculo da cobertura vacinal e das taxas de morbidade por pneumonia em menores de um ano no período de 2007 a 2013. Considerando se os 26 municípios da SRS de Alfenas, houve redução significativa do número de casos de PAC em crianças abaixo de um ano de idade, cuja Razão de Prevalência foi de 0,81 (IC95%: 0,74 0,89; p<0,05). Mesmo com um tempo reduzido de uso, a vacina pneumocócica conjugada 10 valente apresentou um impacto relevante na redução de PAC em crianças, ajustada por cobertura vacinal no período pós vacinação (2011-2013), sendo estatisticamente significativa na maioria dos municípios, o que sugere a efetividade da vacina PCV-10 na prevenção de casos da doença em crianças menores de um ano de idade. / The Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is one of the most important bacterial pathogens of the respiratory tract, may cause invasive and non-invasive infections, leading to high morbidity and mortality rates, particularly in children under five years of age. The bacteria gain access to the host through the nasopharyngeal colonization, which is an important reservoir for the transmission of this pathogen in the community, contributing to the horizontal spread among individuals in a population. Respiratory diseases caused by pneumococcus are in one of the current priorities in Public Health, receiving outstanding attention of international organizations in the health field, such as the World Health Organization. In the present study we aimed to understand and evaluate the occurrence of community acquired pneumonia (CAP) before and after implantation in 10- valent pneumococcal conjugate vaccine in 2010, on the coverage area of the Regional Health Service (SRS) of Alfenas / MG. An ecological study with temporal component was conducted which included records of children under one year old, vaccinated and not vaccinated with 10-valent pneumococcal conjugate vaccine, before and after period inclusion of the vaccine in PNI, in the municipalities of SRS of Alfenas / MG, with vaccination the exposure factor and the occurrence of CAP the outcome, using annual data side by municipality to calculate vaccination coverage and pneumonia morbidity in children under one year old, in the period 2007 to 2013. Considering the 26 municipalities of SRS Alfenas, there was a significant reduction in the number of CAP cases in children under one year old. The prevalence ratio was 0.81 (95%CI: 0.74 - 0.89; p<0.05). Even with a short period of use, the 10-valent pneumococcal conjugate vaccine had a significant impact on the reduction of CAP in children, adjusted for immunization coverage in the post vaccination period (2011-2013) and was statistically significant in most municipalities, which suggests the effectiveness of PCV-10 vaccine in preventing cases of the disease in children under one year of age.