Le projet de thèse à pour but de produire et caractériser un nouvel allergène de pollen d'ambroisie. Le projet est décliné en cinq axes: production d'une forme recombinante mature et en conformation native, caractérisation structurale, étude de la fonction enzymatique, étude de l'allergenicité et l'immunogénicité et évaluation du potentiel thérapeutique. / The goal of the thesis project is to product and caracterize a novel ragweed pollen allergen.The project have five axes: production of recombinant mature and native form,structurale caracterization, study of enzymatique function, study of allergenicity and immunogenicity and evaluation of therapeutic potential.

Les chaînes de glycosaminoglycanes (GAGs) des protéoglycanes (PGs) jouent un rôle majeur dans la régulation de multiples événements cellulaires et le maintien de l'architecture des tissus. Des perturbations de la synthèse des GAGs sont impliquées dans des pathologies d'origine dégénérative, tumorale et génétique, tel que le syndrome progéroïde d'Ehlers-Danlos (ED). Ce déficit résulte de mutations de la [bêta]1,4-galactosyltransférase 7 ([bêta]4GalT7) humaine associées à des atteintes sévères du système musculo-squelettique. En effet, cette enzyme catalyse une étape essentielle de l?initiation de la synthèse des GAGs à partir de la protéine "core" des PGs et de xylosides exogènes. Notre travail a porté sur l'étude structure-fonction de la [bêta]4GalT7 recombinante humaine. Nous avons associé des approches in vitro et ex vivo afin d?explorer le rôle des acides aminés des motifs 163DVD165, 221FWGWGREDDD230 et 257HLH259, strictement conservés au sein des [bêta]4GalTs. L'étude des conséquences de mutations systématiques sur les propriétés cinétiques et fonctionnelles de la [bêta]4GalT7 recombinante a permis d'identifier des acides aminés essentiels du site actif. Nous avons montré que les résidus D165 et H257 forment des liaisons de coordination avec le cation Mn2+ et proposé le rôle du résidu D228 dans la catalyse. Nous avons mis en évidence un rôle central du résidu W224 dans les interactions avec les substrats donneur et accepteur. Nous avons également établi les bases moléculaires des mutations de la [bêta]4GalT7 associées au syndrome ED. Enfin, l'étude de mécanismes de régulation épigénétique des voies de biosynthèse des GAGs dans les cellules H-EMC-SS de chondrosarcome humain a mis en évidence une hyperméthylation spécifique des gènes de la famille des 3-O-sulfotransférases, associée à un phénotype invasif. L'ensemble de ce travail ouvre des perspectives vers de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement des arthropathies / Proteoglycans (PGs) and their glycosaminoglycan chains (GAGs), play a major role in the architecture of extracellular matrices and are implicated in numerous cell events. The impairment of GAG synthesis and sulfation is involved in degenerative, tumor and genetic diseases, such as the progeroid form of Ehlers-Danlos (ED) syndrome. This inherited disorder is due to mutations of human [bêta]4GalT7 ([bêta]4GalT7) causing a defect in GAG synthesis, associated with severe musculo-skeletal alterations. Indeed, this enzyme catalyzes a key step in GAG synthesis linked to the core protein of PGs and from exogenous xylosides. Our work has been focused on the structural and functional characterization of human recombinant [bêta]4GalT7 enzyme. We combined in vitro and ex vivo approaches to explore the role of amino acids located in 163DVD165, 221FWGWGREDDD230 and 257HLH259 motifs, which are highly conserved within [bêta]4GalTs. The study of the consequences of site-directed mutations on kinetic and functional properties of the [bêta]4GalT7 enzyme allowed us to identify key active site amino acids. Our results indicate that D165 and H257 residues form coordination bonds with Mn2+ divalent cations. Furthermore, we suggested a catalytic role for D228 residue and highlighted a central role of W224 residue via interactions with the donor and acceptor substrates. We also determined the molecular basis of [bêta]4GalT7 mutations associated with ED syndrome. Finally, the study of epigenetic regulation mechanisms by DNA methylation of GAG biosynthesis in human chondrosarcoma cells (H-EMC-SS) revealed the specific hypermethylation of the 3-O-sulfotransferase gene family, associated with the invasive phenotype of these cells. Together, this work paves the way towards innovative strategies in the treatment of arthropathies

Les glycosyltransférases (GTs) sont une famille importante d’enzymes responsable de la biosynthèse des chaînes de glycosaminoglycane (GAG) des protéoglycanes, composants clés de la matrice extracellulaire et de la membrane plasmique cellulaire impliqués dans la communication, l'adhésion, la migration et la prolifération cellulaires. Les GTs jouent donc un rôle central dans de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques tels que les cancers ou encore les maladies dégénératives et génétiques. Parmi ces GTs, la ß1,4-galactosyltransférase 7 (ß4GalT7) est une cible thérapeutique potentielle puisqu'elle : i) catalyse une étape précoce et majeure de la biosynthèse des chaînes de GAG, ii) est impliquée dans une forme rare de maladie génétique des tissus conjonctifs, le syndrome d’Ehlers-Danlos, iii) prend en charge des xylosides exogènes modulant son activité in vitro et in vivo. Ce travail de thèse s'organise sur une étude structure/fonction de cette enzyme afin de cerner les résidus d'acides aminés clés dans l'interaction de l'enzyme avec un substrat modèle, le 4-methylombelliferyl-ß-D-xylose (4-MOX). Les résidus Y194, Y196 et Y199 ont ainsi été identifiés comme clés dans l'architecture du site de fixation du substrat accepteur et dans l'interaction de l'enzyme avec le xyloside. Au contraire, les résidus H195, R226 et le résidu R270, muté dans la forme progéroïde du syndrome d'Ehlers-Danlos, apparaissent comme des résidus « modulant » l'activité de l'enzyme, notamment du fait d'interactions moléculaires impliquant leur squelette peptidique pour H195 et R226 et une boucle flexible pour R270. Ces travaux ont permis de guider la synthèse d’analogues xylosidiques visant à inhiber l'activité de la ß4GalT7 humaine. Parmi les propositions, un dérivé fluoré du 4-MOX apparaît comme un inhibiteur efficace de la ß4GalT7 in vitro et in cellulo. Faiblement cytotoxique, ce dérivé réduit la prolifération des cellules de lignées cancéreuses SW1353 et MB MDA 231. Ces résultats ouvrent la perspective de nouvelles stratégies thérapeutiques utilisant les xylosides comme agents potentiels dans le traitement de cancers ou encore des maladies génétiques des tissus conjonctifs / Glycosyltransferases (GTs) are an important family of enzymes involved in the biosynthesis of glycosaminoglycan (GAG) chains of proteoglycans which are key components of cell plasma membranes and of the extracellular matrix, and are thus implicated in cell communication, adhesion, migration and proliferation. GTs are thus key players in numerous pathophysiological processes such as cancers, degenerative and genetic diseases. Among these GTs, ß1,4-galactosyltransférase 7 (ß4GalT7) is a potential therapeutic target since : i) it catalyzes a rate-limiting step in the early phase of the GAG chains biosynthesis, ii) it is implicated in a rare genetic connective tissue disorder (Ehlers-Danlos Syndrome), iii) its in vitro and in vivo activity can be modulated by exogenous xyloside molecules. This PhD work is focused on a structure/function study of the enzyme aiming to identify key amino acid residues that interact with 4-methylumbelliferyl-ß-D-xylose (4-MUX), taken as reference substrate. Y194, Y196 and Y199 have been identified as key residues for the architecture of the acceptor substrate binding site and establish interactions with 4-MUX. By contrast, H195, R226 and R270, a residue mutated in the progeroid form of Ehlers-Danlos Syndrome, should rather be considered as “modulating” residues towards the ß4GalT7 activity, H195 and R226 interacting with 4-MUX with their polypeptide backbone, and R270 via a flexible loop. This work guided the design of xylosidic compounds that would potentially inhibit the ß4GalT7 activity. Thus, a fluorinated derivative of 4-MUX appeared as an efficient in vitro and in cellulo inhibitor of the enzyme. Poorly cytotoxic, this compound also reduced the proliferation rate of cancer cells SW1353 and MB MDA 231. Altogether, these results offer new therapeutic strategies using xylosides as potential therapeutic agents in the treatment of cancer or rare genetic disorders

Dans cette thèse, nous nous intéressons à une classe particulière de modèles stochastique de croissance de plantes structure-fonction à laquelle appartient le modèle GreenLab. L'objectif est double. En premier lieu, il s'agit d'étudier les processus stochastiques sous-jacents à l'organogenèse. Un nouveau cadre de travail combinatoire reposant sur l'utilisation de grammaires formelles a été établi dans le but d'étudier la distribution des nombres d'organes ou plus généralement des motifs dans la structure des plantes. Ce travail a abouti à la mise en place d'une méthode symbolique permettant le calcul de distributions associées à l'occurrence de mots dans des textes générés aléatoirement par des L-systèmes stochastiques. La deuxième partie de la thèse se concentre sur l'estimation des paramètres liés au processus de création de biomasse par photosynthèse et de son allocation. Le modèle de plante est alors écrit sous la forme d'un modèle de Markov caché et des méthodes d'inférence bayésienne sont utilisées pour résoudre le problème.

Comme pour tout système complexe, la modélisation de la croissance des plantes peut être considérée à différentes échelles de temps et d'espace. Le modèle GreenLab se place à l'échelle spatiale du phytomère et à l'échelle temporelle du cycle de croissance. Si ces échelles sont pertinentes pour des plantes agronomiques, un tel niveau de description est difficile à atteindre en pratique pour des plantes branchées à structures complexes comme les arbres. La thèse propose donc une réflexion sur le problème de l'ajustement du modèle GreenLab et son analyse multi-échelle selon différents niveaux de simplification envisageables.<br /><br />Nous avons tout d'abord identifié les conditions sous lesquelles, dans la formulation actuelle du modèle, la production photosynthétique et l'allocation de biomasse dans la plante sont indépendantes de son architecture. Nous avons établi qu'en revanche cette interaction est forte pour certains processus comme la croissance radiale. Deux types de démarches ont été abordées pour répondre au problème soulevé: (1) le développement de modèles simplifiés, avec différents niveaux d'agrégation des variables et (2) l'ajustement du modèle complet sur des cibles simplifiées. Nous avons envisagé trois niveaux de simplification du modèle selon des critères basés sur les applications visées, la faisabilité du protocole expérimental associé et le type de données classiquement collectées pour les modèles forestiers. Pour chacun de ces trois niveaux, nous avons mené une étude théorique pour relier les paramètres du modèle complet à ceux des différents modèles simplifiés de manière à avoir conservation de certaines variables-clés du modèle (notamment le rapport de la production de biomasse sur la demande de la plante). Sur cette base, nous proposons des équations simplifiées régissant le comportement de la plante à l'aide de variables agrégées. <br /><br />En pratique, nous avons cependant souvent accès à certaines informations sur l'architecture de la plante, même si elles ne sont pas du niveau de détail des données issues de la simulation : ces informations peuvent provenir d'échantillonnages ou bien d'analyses botaniques préliminaires. En conséquence, nous avons étudié les méthodes permettant l'ajustement non seulement des paramètres fonctionnels de la plante mais également des paramètres contrôlant son développement topologique. Différentes méthodes sont proposées selon la version du modèle (déterministe, stochastique ou déterministe avec rétro-action de l'état trophique de la plante sur son développement) et selon la nature des données disponibles. Les applications de la thèse concernent principalement les arbres mais se sont également diversifiées à plusieurs types de plantes branchées.

Les mécanismes adhésifs jouent un rôle crucial en biologie. Les cadhérines classiques constituent une des principales familles de molécules d‟adhésion cellulaire dépendante du calcium. Ces glycoprotéines transmembranaires sont impliquées dans des interactions principalement homophiles. Ces interactions régulent des voies de signalisation impliquées dans de nombreux phénomènes biologiques. Cette thèse porte sur l‟étude comparative des dynamiques d‟interactions des cadhérines E- et -11, prototypes respectivement des cadhérines classiques de type I et II. Le ciblage d‟acides aminés particuliers de l‟interface adhésive nous a permis de montrer que pour les cadhérines de type I, l‟échange de brin beta avec le Trp2 ont un rôle clé ; pour les types II un mécanisme différent intervient. Nous avons aussi développé une chimie innovante pour contrôler l‟immobilisation orientée et covalente de protéines. Enfin une revue décrit une étude de l‟activation de voies de signalisation par engagement des cadhérines.

Au cours du cycle réplicatif des rétrovirus, l'ADN viral rétro-transcrit est intégré dans l'ADN de la cellule hôte par l'intégrase virale (IN). L'IN possède un rôle clé dans le cycle rétroviral et représente une cible thérapeutique majeure pour le traitement des infections par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). L'IN est constituée de trois domaines (N-terminal, central et C-terminal) connectés par des boucles flexibles, qui la rendent difficilement cristallisable. Le Dr. C. Ronfort (Equipe Rétrovirus et Intégration Rétrovirale) et le Pr. P. Gouet (Laboratoire de BioCristallographie) collaborent depuis 2002 sur l'IN du Rous Associated Virus type 1 (RAV-1). Mes travaux de thèse s'inscrivent dans le cadre de cette collaboration. Il s'agissait de mener une étude cristallographique et moléculaire du domaine central de l'IN du RAV-1 pour pouvoir, ensuite, modéliser des mutants d'intérêt identifiés par l'équipe du Dr. C. Ronfort. Pour ce faire, le fragment protéique a été surproduit et purifié. Sa structure cristallographique a été résolue à une résolution de 1,8 Å. L'examen de cette structure révèle que le dimère de l'IN du RAV-1 peut s'assembler suivant une nouvelle interface moléculaire stabilisée par trois paires d'hélices α. Cet assemblage se caractérise également par la présence d'un étroit sillon basique à sa surface. Par des expériences in vitro de biochimie et in silico de docking, nous avons montré que ce sillon était susceptible de fixer un brin d'ARN. D'autre part, nos données expérimentales permettent d'expliquer comment les conditions de cristallisation, ainsi que la substitution d'un acide aminé de surface, favorisent la formation soit de ce nouvel arrangement dimérique, soit de l'arrangement dimérique classique. Ainsi, l'ensemble des données obtenues au cours de cette thèse suggère que l'intégrase possède des propriétés structurales modulables, lui permettant d'intervenir dans plusieurs étapes du cycle rétroviral en présence d'ADNdb (intégration) ou d'ARNsb (rétro-transcription et/ou encapsidation du génome ARN viral)

Durant ma thèse, je me suis intéressé à deux ARN régulateurs procaryotiques. Le premier, l'ARNIII, est un ARN multifonctionnel qui régule l'expression des gènes de virulence chez Staphylococcus aureus. Le second, CopA, est un ARN strictement complémentaire à sa cible et régule le taux de réplication du plasmide R1. L'ARNIII réprime l'expression des facteurs d'adhésion et active la synthèse des toxines en fin de phase exponentielle de croissance. Nous avons montré que le domaine 3' de l'ARNIII est nécessaire et suffisant pour l'inhibition de l'expression de deux protéines au niveau post-transcriptionnel, la protéine A et SA1000. La fixation de l'ARNIII à ses cibles est initiée par un contact boucle-boucle qui est rapidement converti en un duplex étendu. Ce duplex est ensuite la cible de la RNase III pour induire la dégradation rapide de l'ARNm. Nous avons également montré que la protéine Hfq est un ligand de l'ARNIII. Cette protéine est généralement impliquée dans des mécanismes de régulation basés sur des ARN régulateurs. La fonction de cette interaction dans la virulence de S. aureus est en cours d'étude.<br />L'ARN antisens CopA régule le taux de réplication du plasmide R1 en contrôlant la synthèse de la protéine initiatrice de la réplication, RepA. La fixation de CopA à sa cible, l'ARNm repA, inhibe la traduction et favorise la dégradation de l'ARNm par la RNase III. L'interaction entre les deux ARN conduit à la formation d'un complexe irréversible. Ce complexe n'est pas un duplex étendu, mais contient une jonction à quatre hélices stabilisée par une longue hélice intermoléculaire, l'hélice C. Nous avons montré que les structures des deux ARN ont évoluées afin de bloquer la progression du complexe irréversible vers le duplex étendu. De plus, nous avons montré que au sein du complexe irréversible, l'hélice C est reconnue efficacement par la RNase III au niveau de sites préférentiels.

LE MODELE GREENLAB COMBINE LA MODELISATION DE L'ARCHITECTURE ET DU FONCTIONNEMENT DES PLANTES. BASE SUR DES OBSERVATIONS BOTANIQUES, DANS LA SUITE DES MODELES AMAP, IL EST ECRIT SOUS FORME D'UN SYSTEME DYNAMIQUE DISCRET.<br />LES TRAVAUX DE CETTE THESE VISENT A AMELIORER LA MODELISATION DE LA CROISSANCE EN INTEGRANT LES INTERACTIONS ENTRE LA CROISSANCE ET LE DEVELOPPEMENT. EN FONCTION DES CONDITIONS EXTERIEURES, LA PLANTE PRODUIT PLUS OU MOINS DE MATIERE, CE QUI A UNE INFLUENCE NON SEULEMENT SUR LE VOLUME DE SES ORGANES, MAIS AUSSI SUR LEUR NOMBRE (FEUILLES, FRUITS), SUR LA RAMIFICATION ET SUR LES CARACTERISTIQUES FONCTIONNELLES DE CERTAINS ORGANES. LA PRISE EN COMPTE DE CES PHENOMENES PERMET DE REPRESENTER LES DIFFERENTES PHASES DE CROISSANCE D'UN ARBRE OU LES CAPACITES D'ADAPTATION D'UNE PLANTE DANS SON ENVIRONNEMENT, CELA GRACE A L'EVOLUTION DYNAMIQUE DU RAPPORT DE L'OFFFRE SUR LA DEMANDE, VARIABLE DE CONTROLE DES DIFFERENTS EVENEMENTS DUS AUX INTERACTIONS ENTRE LA CROISSANCE ET LE DEVELOPPEMENT.<br />LA CROISSANCE DE LA PLANTE EST MODELISEE DE MANIERE DISCRETE. L'ECRITUTE DU SYSTEME DYNAMIQUE DISCRET CORRESPONDANT A L'AIDE D'UN FORMALISME ADAPTE PERMET DE MENER DES ETUDES DE COMPORTEMENT DU MODELE, ET DE TESTER LA SENSIBILITE AUX PARAMETRES.<br />CE MODELE CONCEPTUEL DE CROISSANCE DE PLANTES PEUT ETRE APPLIQUEE A DIFFERENTES PLANTES REELLES EN CHERCHANT DES JEUX DE PARAMETRES D'ENTREE DU MODELE PERMETTANT DE REPRODUIRE AU MIEUX LA CROISSANCE DE CES PLANTES.S

Les grandes propriétés interactives des HS dépendent de leur profil de sulfatation, finement régulé au cours de la biosynthèse du polysaccharide ainsi qu'à la surface cellulaire par l'action d'endosulfatases nommées Sulfs. Ces enzymes ôtent spécifiquement les groupements 6-O-sulfates d'un certain nombre de disaccharides trisulfatés, éléments clés de nombreuses interactions protéines/HS. Ainsi, ces enzymes sont impliquées dans de nombreux processus, autant physiologiques que pathologiques. En utilisant différentes approches (biochimique et biophysique), nous avons révélé récemment que les isoformes humain HSulf-1 et -2 agissent de façon processif et orientées pour désulfater les chaines d’HS ce qui régule différemment les facteurs de croissances FGF-1 et -2 (Seffouh et al., FASEB J. 2013). Nous avons également identifié deux motifs impliqués dans l’interaction HSulf-2/HS et qui se sont avérés importants pour l’activité 6-O-endosulfatase [Manuscrit en préparation]. Par ailleurs, HSulf-2, et contrairement à HSulf-1, s’est révélé porteuse d’une O-glycosylation capable de moduler considérablement son activité à la surface cellulaire [Manuscrit en préparation]. Enfin, et en collaboration avec l’'institut Karolinska (Stockholm, Sweden), une éventuelle implication de Sulf-1 dans le mésothéliome malin a été suggéré (Heidari-Hamedani et al., Cellular Signalling J. 2015). / Heparan sulfate (HS) is a polysaccharide able to bind and modulate a wide variety of proteins. HS large interactive properties are essentially governed by precise sulfation patterns of the polysaccharide. Sulf-1 and Sulf-2 are two endosulfatases able to cleave specific 6-O sulfate groups within HS chains. Their action can modulate critical intracellular signaling processes, many of which with key relevance for cancer development. However, little is known on their structure, substrate specificities, and on the way their catalytic activity directs the subtle modifications of HS 6-O-sulfation profile.In this work, we have identified an original enzymatic mechanism by which Sulfs catalyze the processive and orientated desulfation of HS and finely regulate the polysaccharide biological properties. We also identified two basic motifs within the N-terminal domain of HSulf-2. Recombinant enzymes mutated for these sites were then produced and characterized. We found that these epitopes are necessary for its endosulfatase activity. Altogether, these results provide further insights into the enzyme/substrate recognition process and contribute to the understanding of the fundamental role played by these enzymes in the regulation of HS activity. The biochemical study of the purified HSulf-2 allowed to highlight a O-glycosylation able to significantly modulate its activity at the cell surface. Otherwise, and in collaboration with the Karolinska Institute (Stockholm, Sweden), the study of malignant mesothelioma (MM) provided new evidence that enhanced Syndecan-1 expression also finely modulates HS structure by interfering with HS-modifying enzymes HSulf-1. These results suggest important roles for Syndecan-1 and HSulf-1 in MM.