Polycystic ovary syndrome is an endocrine disorder with symptoms of hyperandrogenism, insulin-resistance and anovulation in women which creates a disposition for other disorders, like Type 2 Diabetes. Drosophila Melanogaster flies have short generation, low cost-management and share several signaling pathways with humans and are therefore an excellent tools to study disease aetiology – yet no such model exists for PCOS. This thesis aimed to create such PCOS-like disease model through treatment of Drosophila Melanogaster adults and larvae with 5-α Dihydrotestosterone and/or high sugar diet. The samples were studied by measuring weight, fecundity, total glycerol concentration and Real-Time quantitative Polymerase Chain Reaction (RT qPCR) using PCOS-related orthologue genes. While previous studies have frequently studied the effects of high sugar diets on Drosophila Melanogaster – there are no previous studies that have studied the effects of 5-α Dihydrotestosterone, with or without high sugar diet, on the weight, fecundity and gene expression of Drosophila Melanogaster. Results showed that larva raised on high sugar diet had traits resembling an insulin-resistant phenotype while the fecundity of flies treated with high sugar diet was significantly lower than those treated with standard sugar diet and DHT. RT qPCR showed overexpression of the standard sugar diet and DHT groups in the investigated genes EcR, Med, TOLL, THADA and FOXO. The conclusion, based on the results, is that insulin-resistance was produced but that more studies are required before a complete PCOS-like disease model is possible in Drosophila Melanogaster.

As the prevalence of type 2 diabetes has increased globally, so has the need to further investigate the disorder’s underlying features and a potential target for treatment. Drosophila melanogaster has proven to be an excellent model organism to study type 2 diabetes (T2D). To see whether it can serve as a model organism to identify the treatment of T2D, a type 2 diabetes like model were created in Drosophila through high sugar diet (HSD). The aim of the study was to investigate the therapeutic effects of six different probiotic bacteria strains on T2D characteristics markers. Longevity, size, and weight measurement were performed. Followed by verification of HSD effects on these phenotypes. It was demonstrated that probiotics could improve weight and lifespan. Treatment using probiotics showed statistically increased body weight in both 3rd instar larvae and adult flies (p-value <0.05). There was no statistically significant difference in length between any of the groups including controls (p-value 0.25). However, the triglyceride assay showed a slightly significant difference between control low sugar diet and few of the treatment groups (L. paracasei with p-value 0.037, and L. acidophilus with p-value 0.025) fed larvae/adult flies, and there was no statistically significant difference between controls (high and low sugar diets), and probiotics treatment groups (L. plantarum, B. animalis and B. breve) fed larvae/adult flies with a p-value >0.05. To investigate the effect on gene expression of four genes (FASNCG3523, FASNCG3524, FASNCG17374 & dsREBP) important in lipid metabolism, qPCR was performed using the Taqman method. All probiotic treatment groups had significantly decreased gene expression of FASN compared to the control groups. Findings of this study suggest that Drosophila melanogaster can be utilized as a model organism to study T2D and that further studies concerning the effects of probiotic treatment in Drosophila are required to fully understand the interactions and mechanism of action.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The fruit fly, Drosophila melanogaster, has been considered a suitable model organism for investigation of developmental/metabolic dysfunctions and therapeutic strategies. In this work Drosophila melanogaster larvae were used to evaluate the role of the plants Syzygium cumini and Bauhinia forficata on the effects triggered by consumption of high-sucrose diets (HSD) as oxidative stress markers and phenotypic responses associated to insulin signaling. The experiments were performed with first instar larvae (L1), collected 24 hr after egg deposition. The larvae were fed on high-sucrose diets (15 and 30%) supplied or not with 5mg/mL of S. cumini and B. forficata aqueous extracts. Newly-eclosed flies from larvae (1-3 day-old) were used to assess biochemical parameters. During the larval stage, 15% HSD and 30% HSD intake delayed the time to pupation and reduced the number of white pupa. The flies hatched from larvae treated with 30% sucrose also had a significant decrease in body weight compared with the flies from control group. The consumption of both diets increased the hemolymph glucose+treahalose levels and hemolymph/whole body homogenate triglycerides in adult flies. H202 levels were also increased in the homogenate of flies hatched from larvae grown on both diets when compared to control; however only 30% sucrose diet induced loss of mitochondrial viability. The intake of this diet also caused a decrease in the activity of superoxide dismutase, glutathione S-transferase, acetylcholinesterase and δ-D-aminolevulinate dehydratase enzymes as well as an increase in catalase activity in adult flies. Supplementation with S. cumini and B. forficata extracts reversed most of metabolic and developmental disorders caused by high sucrose diets. However, S. cumini extract was more efficient than B forficata in reducing hyperglycemia promoted by ingestion of both high sucrose diets and antioxidant status changes caused by 30% HSD. Overall, the obtained results highlight D. melanogaster as an effective model organism to investigate conditions that alter metabolic homeostasis and mainly point out the plant S. cumini as promising agent for studies related with metabolic disorders linked to excessive sugar. / A mosca da fruta, Drosophila melanogaster, tem sido considerada um organismo modelo adequado para a investigação de disfunções metabólicas/desenvolvimentais e estratégias terapêuticas. Neste trabalho foram utilizadas larvas de Drosophila melanogaster para avaliar o papel das plantas Syzygium cumini e Bauhinia forficata sobre os efeitos provocados pelo consumo de dietas ricas em sacarose como marcadores de estresse oxidativo e respostas fenotípicas associadas à sinalização da insulina. Os experimentos foram realizados com larvas do primeiro estágio (L1), coletadas 24 horas após a deposição dos ovos. As larvas foram tratadas com dietas ricas em sacarose (15 e 30%) suplementadas ou não com 5mg/mL dos extratos aquosos de S. cumini e B. forficata. As moscas recém-eclodidas das larvas (1-3 dias de idade) foram utilizadas para avaliar os parâmetros bioquímicos. Durante o estágio larval, o consumo das dietas ricas em sacarose 15 e 30% atrasou o tempo para pupação e reduziu o número de pupas brancas. As moscas nascidas de larvas tratadas com sacarose 30% também tiveram uma diminuição significativa do peso corporal quando comparado com as moscas do grupo controle. O consumo de ambas as dietas elevou os níveis de glicose+trealose na hemolinfa e de triglicerídeos na hemolinfa e em homogenato do corpo total nas moscas adultas. Os níveis de H202 foram aumentados no homogenato das moscas nascidas de larvas que cresceram em ambas as dietas quando comparados ao controle; no entanto somente a dieta com sacarose 30% induziu perda da viabilidade mitocondrial. A ingestão desta dieta também causou uma diminuição na atividade das enzimas superóxido dismutase, glutationa S-transferase, acetilcolinesterase e δ-aminolevulinato desidratase, bem como um aumento na atividade da catalase em moscas adultas. A suplementação com os extratos de S. cumini e B. forficata reverteu a maioria das disfunções metabólicas e desenvolvimentais provocadas pelas dietas ricas em sacarose. No entanto, o extrato de S. cumini foi mais eficiente que a B forficata em reduzir a hiperglicemia promovida pela ingestão de ambas as dietas e as alterações no status antioxidante causadas pela dieta rica em sacarose 30%. No geral, os resultados obtidos destacam a D. melanogaster como um organismo modelo efetivo para investigar condições que alteram a homeostase metabólica e apontam principalmente a planta S. cumini como agente promissor para estudos relacionados com desordens metabólicas ligadas ao excesso de açúcar.

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No. of bitstreams: 1 santiagotavarespaes.pdf: 1214222 bytes, checksum: 624191b9f520fa9270585bbfc50073f4 (MD5) Previous issue date: 2013-12-11 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O presente estudo objetivou: 1) Verificar se o procedimento da adrenodemedulação contribui para potencializar o efeito da dieta rica em carboidratos simples no desenvolvimento da obesidade; 2) Comparar os efeitos do exercício físico crônico, iniciado aos 35 dias de vida, sobre a glicemia e colesterol total de ratos obesos e controles adrenodemedulados ou falso operados; 3) Avaliar se a diminuição do conteúdo das catecolaminas exerce influência no desempenho físico. Os animais foram distribuídos em 2 grupos controles e obesos, e divididos em 4 subgrupos falso operados e adrenodemedulados, exercitados ou sedentários. A indução da obesidade pelo consumo de ração rica em carboidrato iniciou-se aos 21 dias de vida e a adrenodemedulação ocorreu aos 22 dias de vida. O protocolo de exercício físico realizado foi o de corrida em esteira com intensidade e volume incrementais, durante 8 semanas, 5 vezes por semana. Os animais foram eutanasiados aos 92 dias de vida. Avaliou-se o consumo alimentar, peso corporal, índice de Lee, gorduras perigonadal e retroperitoneal, catecolaminas, teste de esforço, glicemia e colesterol. Na análise inferencial, foi realizada uma análise de variância (ANOVA) de três fatores com o intuito de testar os efeitos da dieta, adrenodemedulação e treinamento físico sobre as variáveis dependentes, seguido da ANOVA de um fator para comparar a diferença entre essas variáveis. Os animais com obesidade induzida por dieta rica em carboidratos apresentaram valores de consumo alimentar mais elevados que os animais controles, o que culminou num aumento 25% maior de peso corporal cujo reflexo foi observado pelo índice de Lee mais elevados que os animais com dieta padrão; essas diferenças foram independentes da adrenodemedulação. Ademais, tanto os valores de gordura perigonadal e retroperitoneal quanto glicemia e colesterol total se mostraram aumentados nos animais obesos, sendo que, para essas variáveis a adrenodemedulação mostrou-se capaz de influenciar significativamente no potencial aumento dos valores apresentados. Por outro lado o treinamento físico mostrou-se capaz de atenuar tais valores. As catecolaminas dos animais adrenodemedulados mostraram-se aproximadamente 100 vezes mais baixas que os grupos falso operados, dado que demonstra a efetividade da cirurgia; entretanto, o desempenho no teste de esforço dos animais adrenodemedulados não se mostrou diferente de seus pares falso operados, exercitados ou não. Portanto, concluímos que a variável desempenho físico não parece ter sido influenciada pela presença das catecolaminas adrenais. Além disso, sugerimos que a dieta rica em carboidratos quando associada à ausência das catecolaminas adrenais promove maior adiposidade em ratos. O treinamento físico atenua a composição corporal, glicemia e colesterol total independentemente da dieta. Contudo, a adrenodemedulação parece impedir uma redução mais pronunciada dos níveis de glicemia e colesterol. / The present study aimed to: 1) Verify if the adrenaldemedullation procedure contributes to potentiate the effect of high-sugar diet during the development of obesity; 2) Compare the effects of chronic exercise, initiated at 35 days of life on blood glucose and total cholesterol of obese and controls sham or adrenaldemedullated rats; 3) Evaluate if the lack of adrenal catecholamine influences physical performance. Animals were distributed into 2 groups of obese and lean rats, and then divided into 4 subgroups sham and adrenaldemedullated, exercised or sedentary. At 21 days old, obesity was induced by high-sugar diet and, adrenaldemedullation was performed at 22 days of life. Exercise protocol performed was treadmill running with incremental intensity and volume, 5 times a week during 8 weeks. Animals were euthanized at 92 days and it were evaluated food intake, body weight, Lee index, retroperitoneal and perigonadal fat pads, total adrenal catecholamine content, performance test, blood glucose and total cholesterol. It was used three-way ANOVA to test the effects of diet, exercise training and adrenaldemedullation on dependent variables followed by one-way ANOVA to compare the difference among variables. High-sugar diet obese groups presented higher values of food intake than control animals, resulting in an increase of 25 % on body weight and higher Lee Index independent of adrenaldemedullation. Moreover, retroperitoneal and perigonadal fat pad, blood glucose and total cholesterol values were enhanced in high-sugar obese animals and potentiated by adrenaldemedullation. On the other hand, physical training was able to attenuate those parameters. Adrenaldemedullated rats, control and obese ones, showed 100 times lower adrenal catecholamine than sham groups, which demonstrates the effectiveness of the surgery. Therefore, the variable physical performance does not appear to be influenced by the presence of adrenal catecholamine. Moreover, we suggest that the high-carbohydrate diet when associated to the absence of adrenal catecholamines promotes greater adiposity in rats. Physical training reduces body composition, blood glucose and total cholesterol levels regardless of diet. However, adrenaldemedullation seems to prevent a more pronounced reduction of blood glucose and cholesterol on trained rats.

A infância e a adolescência são períodos sensíveis de maturação neuronal, caracterizados por alta plasticidade de circuitos encefálicos em desenvolvimento, como é o caso do sistema mesolímbico dopaminérgico. Experiências estressantes neste período, como o isolamento social (IS), podem produzir neuroadaptações nesses circuitos e aumentar a vulnerabilidade ao consumo de drogas e de alimentos palatáveis ao longo da vida. Tendo em vista que extensa literatura analisa longos períodos de isolamento social, que não são modelos adequados para o estresse por isolamento que ocorre em sociedades humanas, o objetivo do presente estudo foi investigar os efeitos de uma exposição curta ao isolamento social durante o período pré-púbere sobre o sistema mesolímbico dopaminérgico e a susceptibilidade para o abuso de drogas e para o consumo compulsivo de alimento palatável em ratas Wistar fêmeas, na idade adulta. Também foi objetivo avaliar o papel da exposição crônica a uma dieta rica em sacarose (DRS) sobre estas variáveis. Como resultados, foi observado que o IS aumentou a resposta locomotora a um desafio com anfetamina, bem como aumentou, no estriado dorsal, o imunoconteúdo do transportador de dopamina, da enzima tirosina hidroxilase e diminuiu os níveis do receptor D2 de dopamina (D2R); além disso, os animais submetidos ao IS na pré-puberdade apresentaram aumento nos parâmetros relacionados ao estresse oxidativo após o desafio. De modo interessante, a exposição a DRS preveniu os efeitos do IS sobre a resposta locomotora, mas não afetou os parâmetros dopaminérgicos. O IS também diminuiu o imunoconteúdo basal de D2R no núcleo accumbens (NAc) e estimulou o consumo do tipo-compulsivo de alimento doce (Froot Loops®). A DRS não interferiu nestes parâmetros. Observamos também que o IS não alterou os níveis basais de corticosterona plasmática, enquanto que a DRS diminuiu tais níveis. Os registros das correntes excitatórias pós-sinápticas (CEPS) espontâneas indicaram, como resultado preliminar, que a DRS reduziu o tempo de subida das CEPS, indicando uma resposta glutamatérgica fugaz. Os achados deste estudo demonstram pela primeira vez que um período curto de IS em uma fase crítica do desenvolvimento é capaz de programar o sistema mesolímbico dopaminérgico de forma a aumentar a susceptibilidade tanto ao uso de drogas quanto ao consumo do tipo-aditivo de alimento doce. Esses efeitos podem ser em parte explicados pela redução dos níveis de D2R basal no NAc e pela maior estimulação do sistema dopaminérgico no estriado frente a um desafio com anfetamina. Os achados desta tese sugerem que experiências estressantes, como o isolamento social, durante um período crítico do desenvolvimento é capaz de programar o sistema de recompensa encefálico de forma permanente e aumentar a susceptibilidade a comportamentos aditivos na vida adulta. Identificar fatores preditores de propensão a esse tipo de comportamento é importante para prevenir o desenvolvimento de dependência de drogas e/ou de distúrbios alimentares, além de possibilitar a identificação de alvos terapêuticos e o desenvolvimento de estratégias de tratamento para estes distúrbios. / Childhood and adolescence are sensitive periods of neuronal maturation, characterized by high plasticity of developing brain circuits, such as the mesolimbic dopaminergic system. Stressful experiences in these periods, such as social isolation (SI), can produce changes in these circuits and increase vulnerability to drug addiction and eating disorders throughout life. Considering that most of literature analyze long periods of social isolation, that are not good models for social stress in human societies, the objective of this study was to investigate the effects of a short post-weaning social isolation on mesolimbic dopaminergic system and the susceptibility to drug and food addiction in female Wistar rats in adulthood. Moreover, we also aimed to evaluate the role of a chronic high sugar diet (HSD) on these variables. It was observed that IS increased the locomotor response to a challenge with amphetamine (AMPH), as well as increased the immunocontent of dopamine transporter, the enzyme tyrosine hydroxylase, decreased the D2 dopamine receptor (D2R) and increased the parameters related to oxidative stress in dorsal striatum after the challenge. Interestingly, exposure to DRS prevented the effects of SI on locomotor response, but did not affect dopaminergic parameters. IS also decreased the basal immunocontent of D2R in the nucleus accumbens (NAc), and stimulated binge eating of high sweet food (Froot Loops®). HSD did not interfere with these parameters. We also observed that SI did not alter plasma corticosterone baseline levels after IS, whereas HSD induced a decrease in these levels. Excitatory postsynaptic currents (EPSC) indicated, as a preliminary result, that the exposure to a HSD reduced the rise time, indicating a more fleeting glutamatergic response. The findings of this study demonstrate for the first time that a short period of SI at a critical period of development is able to programme the mesolimbic dopaminergic system in order to increase susceptibility to both drug and food addiction. These results are possibly due, at least in part, to low basal levels of D2R in NAc and the higher stimulation of the dopaminergic system in striatum after a challenge with AMPH. The findings of this thesis suggest that stressful experiences such as social isolation during a critical period of development are able to permanently program the brain reward system and increase the susceptibility to additive behaviors in adult life. Identifying predisposing factors to this type of behavior is extremely important to prevent the development of drug addiction and/or eating disorders, to identify therapeutic targets and to enable the development of treatment strategies for these disorders.

Orientador: Antonio Carlos Cicogna / Resumo: A obesidade é uma doença metabólica complexa considerada uma pandemia global e associada à alta incidência de doença cardiovascular. O excesso de tecido adiposo pode promover mal adaptação que resulta em alterações na estrutura e função do coração; no entanto, os mecanismos não estão totalmente elucidados. A proteômica pode fornecer uma compreensão mais profunda do processo fisiopatológico e contribuir para a identificação de novos potenciais alvos terapêuticos. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a expressão proteica miocárdica em ratos saudáveis e obesos por dieta Ocidental, empregando duas abordagens proteômicas, para melhor compreender a rede de mecanismos inerentes à disfunção cardíaca na obesidade. Ratos Wistar foram distribuídos em dois grupos: controle (C, n = 13; dieta controle) e obeso (Ob, n = 13; dieta Ocidental) alimentados por 41 semanas. A obesidade foi determinada pelo índice de adiposidade. A função cardíaca foi avaliada pelo ecocardiograma e análise do músculo papilar isolado. A proteômica foi baseada em eletroforese em gel bidimensional (2-DE) juntamente com espectrometria de massa (LC-MS/MS) e cromatografia-líquida em nanofluxo com espectrometria de massa em tandem (nanoLC-MS/MS) seguida de quantificação label-free. Ratos obesos apresentaram aumento do índice de adiposidade e disfunção cardíaca sistólica e diastólica comparados aos controles. Um total de 82 proteínas miocárdicas foram identificadas como diferencialmente expressas entre os grupos ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Obesity is a complex metabolic disease considered a global pandemic and associated with high incidence of cardiovascular disease. The excess of adipose tissue may promotes maladaptation that result in alterations in structure and function of the heart; however, the mechanisms are not fully elucidated. Proteomics may provide a deeper understanding into the pathophysiological process and contribute to the identification of new potential therapeutic targets. Thus, the aim of this was evaluate the myocardial protein expression in healthy and obese rats, employing two proteomic approaches to better comprehend the network of mechanisms inherent to cardiac dysfunction in obesity. Male Wistar rats were distributed into two groups: control (C, n=13; standard diet) and obese (Ob, n=13; Western diet) fed for 41 weeks. The obesity was determined by adipose index. Cardiac function was evaluated by echocardiogram and isolated papillary muscle analysis. The proteomics was based on two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) along with mass spectrometry identification (LC-MS/MS) and nano-liquid chromatography with tandem mass spectrometry (nanoLC-MS/MS) followed by label-free quantification. Obese rats showed increased adiposity index and systolic and diastolic cardiac dysfunction. A total of 82 myocardial proteins was identified as differentially expressed between C and Ob groups using two proteomic strategies, being 43 up- and 39 down-regulated by obesity. These proteins are involved in imp... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A infância e a adolescência são períodos sensíveis de maturação neuronal, caracterizados por alta plasticidade de circuitos encefálicos em desenvolvimento, como é o caso do sistema mesolímbico dopaminérgico. Experiências estressantes neste período, como o isolamento social (IS), podem produzir neuroadaptações nesses circuitos e aumentar a vulnerabilidade ao consumo de drogas e de alimentos palatáveis ao longo da vida. Tendo em vista que extensa literatura analisa longos períodos de isolamento social, que não são modelos adequados para o estresse por isolamento que ocorre em sociedades humanas, o objetivo do presente estudo foi investigar os efeitos de uma exposição curta ao isolamento social durante o período pré-púbere sobre o sistema mesolímbico dopaminérgico e a susceptibilidade para o abuso de drogas e para o consumo compulsivo de alimento palatável em ratas Wistar fêmeas, na idade adulta. Também foi objetivo avaliar o papel da exposição crônica a uma dieta rica em sacarose (DRS) sobre estas variáveis. Como resultados, foi observado que o IS aumentou a resposta locomotora a um desafio com anfetamina, bem como aumentou, no estriado dorsal, o imunoconteúdo do transportador de dopamina, da enzima tirosina hidroxilase e diminuiu os níveis do receptor D2 de dopamina (D2R); além disso, os animais submetidos ao IS na pré-puberdade apresentaram aumento nos parâmetros relacionados ao estresse oxidativo após o desafio. De modo interessante, a exposição a DRS preveniu os efeitos do IS sobre a resposta locomotora, mas não afetou os parâmetros dopaminérgicos. O IS também diminuiu o imunoconteúdo basal de D2R no núcleo accumbens (NAc) e estimulou o consumo do tipo-compulsivo de alimento doce (Froot Loops®). A DRS não interferiu nestes parâmetros. Observamos também que o IS não alterou os níveis basais de corticosterona plasmática, enquanto que a DRS diminuiu tais níveis. Os registros das correntes excitatórias pós-sinápticas (CEPS) espontâneas indicaram, como resultado preliminar, que a DRS reduziu o tempo de subida das CEPS, indicando uma resposta glutamatérgica fugaz. Os achados deste estudo demonstram pela primeira vez que um período curto de IS em uma fase crítica do desenvolvimento é capaz de programar o sistema mesolímbico dopaminérgico de forma a aumentar a susceptibilidade tanto ao uso de drogas quanto ao consumo do tipo-aditivo de alimento doce. Esses efeitos podem ser em parte explicados pela redução dos níveis de D2R basal no NAc e pela maior estimulação do sistema dopaminérgico no estriado frente a um desafio com anfetamina. Os achados desta tese sugerem que experiências estressantes, como o isolamento social, durante um período crítico do desenvolvimento é capaz de programar o sistema de recompensa encefálico de forma permanente e aumentar a susceptibilidade a comportamentos aditivos na vida adulta. Identificar fatores preditores de propensão a esse tipo de comportamento é importante para prevenir o desenvolvimento de dependência de drogas e/ou de distúrbios alimentares, além de possibilitar a identificação de alvos terapêuticos e o desenvolvimento de estratégias de tratamento para estes distúrbios. / Childhood and adolescence are sensitive periods of neuronal maturation, characterized by high plasticity of developing brain circuits, such as the mesolimbic dopaminergic system. Stressful experiences in these periods, such as social isolation (SI), can produce changes in these circuits and increase vulnerability to drug addiction and eating disorders throughout life. Considering that most of literature analyze long periods of social isolation, that are not good models for social stress in human societies, the objective of this study was to investigate the effects of a short post-weaning social isolation on mesolimbic dopaminergic system and the susceptibility to drug and food addiction in female Wistar rats in adulthood. Moreover, we also aimed to evaluate the role of a chronic high sugar diet (HSD) on these variables. It was observed that IS increased the locomotor response to a challenge with amphetamine (AMPH), as well as increased the immunocontent of dopamine transporter, the enzyme tyrosine hydroxylase, decreased the D2 dopamine receptor (D2R) and increased the parameters related to oxidative stress in dorsal striatum after the challenge. Interestingly, exposure to DRS prevented the effects of SI on locomotor response, but did not affect dopaminergic parameters. IS also decreased the basal immunocontent of D2R in the nucleus accumbens (NAc), and stimulated binge eating of high sweet food (Froot Loops®). HSD did not interfere with these parameters. We also observed that SI did not alter plasma corticosterone baseline levels after IS, whereas HSD induced a decrease in these levels. Excitatory postsynaptic currents (EPSC) indicated, as a preliminary result, that the exposure to a HSD reduced the rise time, indicating a more fleeting glutamatergic response. The findings of this study demonstrate for the first time that a short period of SI at a critical period of development is able to programme the mesolimbic dopaminergic system in order to increase susceptibility to both drug and food addiction. These results are possibly due, at least in part, to low basal levels of D2R in NAc and the higher stimulation of the dopaminergic system in striatum after a challenge with AMPH. The findings of this thesis suggest that stressful experiences such as social isolation during a critical period of development are able to permanently program the brain reward system and increase the susceptibility to additive behaviors in adult life. Identifying predisposing factors to this type of behavior is extremely important to prevent the development of drug addiction and/or eating disorders, to identify therapeutic targets and to enable the development of treatment strategies for these disorders.

A infância e a adolescência são períodos sensíveis de maturação neuronal, caracterizados por alta plasticidade de circuitos encefálicos em desenvolvimento, como é o caso do sistema mesolímbico dopaminérgico. Experiências estressantes neste período, como o isolamento social (IS), podem produzir neuroadaptações nesses circuitos e aumentar a vulnerabilidade ao consumo de drogas e de alimentos palatáveis ao longo da vida. Tendo em vista que extensa literatura analisa longos períodos de isolamento social, que não são modelos adequados para o estresse por isolamento que ocorre em sociedades humanas, o objetivo do presente estudo foi investigar os efeitos de uma exposição curta ao isolamento social durante o período pré-púbere sobre o sistema mesolímbico dopaminérgico e a susceptibilidade para o abuso de drogas e para o consumo compulsivo de alimento palatável em ratas Wistar fêmeas, na idade adulta. Também foi objetivo avaliar o papel da exposição crônica a uma dieta rica em sacarose (DRS) sobre estas variáveis. Como resultados, foi observado que o IS aumentou a resposta locomotora a um desafio com anfetamina, bem como aumentou, no estriado dorsal, o imunoconteúdo do transportador de dopamina, da enzima tirosina hidroxilase e diminuiu os níveis do receptor D2 de dopamina (D2R); além disso, os animais submetidos ao IS na pré-puberdade apresentaram aumento nos parâmetros relacionados ao estresse oxidativo após o desafio. De modo interessante, a exposição a DRS preveniu os efeitos do IS sobre a resposta locomotora, mas não afetou os parâmetros dopaminérgicos. O IS também diminuiu o imunoconteúdo basal de D2R no núcleo accumbens (NAc) e estimulou o consumo do tipo-compulsivo de alimento doce (Froot Loops®). A DRS não interferiu nestes parâmetros. Observamos também que o IS não alterou os níveis basais de corticosterona plasmática, enquanto que a DRS diminuiu tais níveis. Os registros das correntes excitatórias pós-sinápticas (CEPS) espontâneas indicaram, como resultado preliminar, que a DRS reduziu o tempo de subida das CEPS, indicando uma resposta glutamatérgica fugaz. Os achados deste estudo demonstram pela primeira vez que um período curto de IS em uma fase crítica do desenvolvimento é capaz de programar o sistema mesolímbico dopaminérgico de forma a aumentar a susceptibilidade tanto ao uso de drogas quanto ao consumo do tipo-aditivo de alimento doce. Esses efeitos podem ser em parte explicados pela redução dos níveis de D2R basal no NAc e pela maior estimulação do sistema dopaminérgico no estriado frente a um desafio com anfetamina. Os achados desta tese sugerem que experiências estressantes, como o isolamento social, durante um período crítico do desenvolvimento é capaz de programar o sistema de recompensa encefálico de forma permanente e aumentar a susceptibilidade a comportamentos aditivos na vida adulta. Identificar fatores preditores de propensão a esse tipo de comportamento é importante para prevenir o desenvolvimento de dependência de drogas e/ou de distúrbios alimentares, além de possibilitar a identificação de alvos terapêuticos e o desenvolvimento de estratégias de tratamento para estes distúrbios. / Childhood and adolescence are sensitive periods of neuronal maturation, characterized by high plasticity of developing brain circuits, such as the mesolimbic dopaminergic system. Stressful experiences in these periods, such as social isolation (SI), can produce changes in these circuits and increase vulnerability to drug addiction and eating disorders throughout life. Considering that most of literature analyze long periods of social isolation, that are not good models for social stress in human societies, the objective of this study was to investigate the effects of a short post-weaning social isolation on mesolimbic dopaminergic system and the susceptibility to drug and food addiction in female Wistar rats in adulthood. Moreover, we also aimed to evaluate the role of a chronic high sugar diet (HSD) on these variables. It was observed that IS increased the locomotor response to a challenge with amphetamine (AMPH), as well as increased the immunocontent of dopamine transporter, the enzyme tyrosine hydroxylase, decreased the D2 dopamine receptor (D2R) and increased the parameters related to oxidative stress in dorsal striatum after the challenge. Interestingly, exposure to DRS prevented the effects of SI on locomotor response, but did not affect dopaminergic parameters. IS also decreased the basal immunocontent of D2R in the nucleus accumbens (NAc), and stimulated binge eating of high sweet food (Froot Loops®). HSD did not interfere with these parameters. We also observed that SI did not alter plasma corticosterone baseline levels after IS, whereas HSD induced a decrease in these levels. Excitatory postsynaptic currents (EPSC) indicated, as a preliminary result, that the exposure to a HSD reduced the rise time, indicating a more fleeting glutamatergic response. The findings of this study demonstrate for the first time that a short period of SI at a critical period of development is able to programme the mesolimbic dopaminergic system in order to increase susceptibility to both drug and food addiction. These results are possibly due, at least in part, to low basal levels of D2R in NAc and the higher stimulation of the dopaminergic system in striatum after a challenge with AMPH. The findings of this thesis suggest that stressful experiences such as social isolation during a critical period of development are able to permanently program the brain reward system and increase the susceptibility to additive behaviors in adult life. Identifying predisposing factors to this type of behavior is extremely important to prevent the development of drug addiction and/or eating disorders, to identify therapeutic targets and to enable the development of treatment strategies for these disorders.

Eine Vielzahl an Studien konnte Veränderungen dopaminerger Signale in verschiedenen Stadien von Übergewicht zeigen. Diese Veränderungen wurden mit fehlangepassten Verhaltensweisen wie zum Beispiel maladaptiven Veränderungen im Kontext von Dopamin-abhängigem Verstärkungslernen in Verbindung gebracht. Solche Verhaltensänderungen wiederum können die Entstehung und Aufrechterhaltung von Übergewicht fördern. Tierstudien lieferten erste Hinweise, dass nicht nur Übergewicht an sich, sondern auch eine Ernährung reich an gesättigten Fetten und freien Zuckern – eine der wichtigsten Triebkräfte der aktuellen Adipositas-Pandemie – unabhängig von Übergewicht zu solchen maladaptiven Veränderungen in Dopamin-abhängigem Verhalten beitragen könnte. Belastbare Erkenntnisse aus Studien am Menschen stehen hierzu noch aus. Hier setzt diese Promotionsarbeit an, die den Einfluss einer diätetischen Dopamin-Vorläufer Manipulation – der akuten diätetischen Phenylalanin/ Tyrosin Depletion (APTD) – auf das Verstärkungslernen von zwei Gruppen gesunder Frauen untersucht, die sich in der habituellen Aufnahme von gesättigten Fettsäuren und freien Zuckern unterscheiden. Ausgehend von der Annahme, dass eine Ernährung reich an gesättigten Fetten und freien Zuckern zu veränderten dopaminergen Signalen führen könnte, erwartete ich, dass Dopamin-abhängiges Verstärkungslernen in den beiden Ernährungsgruppen unterschiedlich von der APTD beeinflusst werden würde. Dazu habe ich zunächst mithilfe des Dietary Fat and Free Sugar Kurzfragebogens (DFS) die habituelle Aufnahme von gesättigten Fettsäuren und freien Zuckern von gesunden Probandinnen erhoben. Auf Basis der erreichten Punktzahl im DFS wurden die Probandinnen entweder der Gruppe mit hoher oder der Gruppe mit niedriger Fett- und Zuckeraufnahme zugeteilt. Um einen möglichen Einfluss veränderter dopaminerger Signale zu bestimmen, habe ich dann eine diätetische Phenylalanin und Tyrosin Depletion durchgeführt. Diese Methode hat eine diätetische Manipulation der Dopamin-Synthese mittels Depletion von Dopamin-Vorläufern zum Ziel. Konkret wurde in früheren Studien bereits gezeigt, dass die APTD die peripheren Konzentrationen der Aminosäuren Phenylalanin und Tyrosin senkt, Dopaminvorstufen welche enzymatisch in Dopamin umgewandelt werden. Demzufolge senkt die APTD potenziell zentrales Dopamin in beiden Ernährungsgruppen. Verstärkungslernen habe ich schließlich mithilfe der Probabilistischen Auswahlaufgabe (PST), gemessen. Im Ergebnis konnte ich keine direkten Anhaltspunkte für einen Einfluss der Dopamin-Manipulation in Interaktion mit Ernährungsgruppen finden. Dennoch liefert diese Promotionsarbeit wichtige Ansatzpunkte für zukünftige Studien: In einer explorativen Analyse konnte ich vorläufige Hinweise für einen Zusammenhang zwischen Variationen in Dopamin-Vorstufen und einer habituellen fett- und zuckerreichen Ernährung aufzeigen. / Many studies have found alterations in dopaminergic signaling in different stages of obesity. Such alterations have been linked to maladaptive behaviors such as maladaptive alterations in the context of dopamine-dependent reinforcement learning. These behavioral changes are likely to foster the further emergence and maintenance of obesity. Animal studies have delivered first indications, that not only obesity itself, but also a diet high in saturated fat and free sugars – one of the main drivers of the current obesity epidemic – could independently contribute to such maladaptive alterations in dopamine-dependent behaviors. However, profound evidence in human studies is pending. Addressing this issue, this thesis investigates the influence of a dietary dopamine precursor manipulation – the acute phenylalanine/tyrosine depletion (APTD) – on reinforcement learning in two groups of healthy females that differ in their habitual intake of saturated fat and free sugars. Assuming, that a diet high in saturated fat and free sugars might lead to changes in dopaminergic signaling, I expected a differential influence of APTD on dopamine-dependent reinforcement learning in the diet groups. To test this hypothesis, I firstly assessed the habitual intake of saturated fat and free sugars in healthy female participants using the Dietary Fat and Free Sugar – Short Questionnaire (DFS). According to their score, participants were assigned either to the group with a high or the group with a low habitual intake of fat and sugar. To determine the impact of possible dopaminergic alterations, I secondly administered an acute phenylalanine/tyrosine depletion. This method aims at a dietary manipulation of dopamine synthesis via manipulation of its precursors. Concretely, the APTD has been shown to significantly reduce the peripheral concentration of the amino acids phenylalanine and tyrosine, dopamine precursors that are converted to dopamine enzymatically. Thus, the APTD is likely to lower central dopamine signaling in both diet groups. Thirdly, I measured reinforcement learning with the Probabilistic Selection Task (PST). As a result, I could not find direct evidence for an influence of APTD on reinforcement learning in interaction with diet groups. Nevertheless, this thesis supplies important starting points for further investigation: In an exploratory analysis, I could reveal preliminary evidence for a positive association between variations in dopamine precursors and habitual high-fat high-sugar diet.

Tesis por compendio / [ES] La obesidad es un gran reto de salud pública que ha alcanzado proporciones epidémicas. El entorno "occidentalizado" en el que vivimos, caracterizado por la accesibilidad a alimentos hipercalóricos, contribuye al desequilibrio crónico entre energía ingerida y gasto energético que causan la obesidad. Las intervenciones conductuales diseñadas para la pérdida de peso tienen limitada efectividad a largo plazo, por lo que existe una urgente necesidad de desarrollar estrategias más eficaces y seguras para prevenir y tratar la obesidad y sus comorbilidades. El desarrollo de estrategias terapéuticas dirigidas al intestino para mejorar la salud metabólica requiere un conocimiento en profundidad de las vías de señalización neuroendocrina intestinal que regulan el la ingesta y el equilibrio energético. El objetivo de esta tesis ha sido profundizar en las interacciones intestino-cerebro implicadas en el control de la homeostasis energética, incluyendo los componentes endocrinos, neurales y la microbiota intestinal, en el contexto del desarrollo de la obesidad inducida por una dieta hipercalórica. En los Capítulos 1 y 2 hemos explorado nuevas funciones de las neuronas sensoriales aferentes que expresan el canal de sodio Nav1.8 en el control de la homeostasis energética, considerando las diferencias entre sexos. Hemos generado un modelo de ratón carente de las neuronas Nav1.8+ mediante ablación con toxina diftérica. En el Capítulo 1 hemos demostrado que las neuronas Nav1.8+ son indispensables para regular específicamente según el sexo las vías neurales y endocrinas implicadas en la homeostasis energética. En hembras, la ablación de estas neuronas mejora la regulación de la glucosa postprandial potenciando la señalización enteroendocrina de GLP-1 y acelera el tránsito intestinal, mientras que en machos induce resistencia al aumento de peso inducido por una dieta obesogénica. En el Capítulo 2 hemos demostrado que, en machos, la ablación de las neuronas Nav1.8+ altera el control coordinado de la ingesta i las variaciones de peso diarias, además de alterar la señalización enteroendocrina y las oscilaciones diarias de la microbiota intestinal en respuesta al estado nutricional (ayuno/ingesta), y perturbar la homeostasis del sistema inmune intestinal. En el capítulo 3, hemos usado un modelo de ratón con obesidad inducida por dieta para explorar los mecanismos por los cuales Phascolarctobacterium faecium DSM 32890, una cepa bacteriana intestinal aislada de humanos metabólicamente sanos, previene la obesidad modulando la ingesta. La administración de P. faecium reduce la ingesta calórica gracias a la hipersecreción de la hormona gastrointestinal saciante el PYY. Independientemente de sus efectos anorexigénicos, la bacteria ejerce sus beneficios metabólicos estimulando el tránsito intestinal y reduciendo la absorción intestinal de lípidos, evitando la acumulación de grasa corporal. En conclusión, esta tesis doctoral proporciona evidencia preclínica que contribuye a una comprensión más precisa de las vías neuroendocrinas que comunican el intestino y el cerebro, y del papel que tiene la microbiota intestinal en la regulación de la ingesta y el gasto energético. Destacamos la importancia de las neuronas sensoriales aferentes Nav1.8+ en la detección de estímulos intestinales por quimiorreceptores para regular el balance energético en ambos sexos, lo cual abre una nueva línea de investigación para diseñar herramientas de neuromodulación de las neuronas Nav1.8+ con el fin de prevenir y tratar los trastornos metabólicos inducidos por la dieta, de forma específica para cada sexo. También destacamos que P. faecium es una bacteria candidata como probiótico de nueva generación, ya que modula el sistema enteroendocrino del hospedador y previene la obesidad en un modelo preclínico. En conjunto, estos hallazgos proporcionan una base para el desarrollo de estrategias terapéuticas basadas en el intestino dirigidas a combatir la obesidad y comorbilidades asociadas. / [CA] L'obesitat és un gran repte de salut pública que ha assolit proporcions epidèmiques. L'entorn "occidentalitzat" en el que vivim, caracteritzat per l'accessibilitat a aliments hipercalòrics, contribueix al desequilibri crònic entre energia ingerida i despesa energètica que causen l'obesitat. Les intervencions conductuals dissenyades per a la pèrdua de pes tenen una eficàcia limitada a llarg termini, per la qual cosa hi ha una necessitat urgent de desenvolupar estratègies més eficaces i segures per a prevenir i tractar l'obesitat i les seues comorbiditats. El desenvolupament d'estratègies terapèutiques dirigides a l'intestí per a millorar la salut metabòlica requereix un coneixement en profunditat de les vies de senyalització neuroendocrina intestinal que regulen la ingesta i l'equilibri energètic. L'objectiu d'aquesta tesi ha sigut aprofundir en les interaccions intestí-cervell implicades en el control de l'homeòstasi energètica, incloent els components endocrins, neurals i la microbiota intestinal, en el context del desenvolupament de l'obesitat induïda per una dieta hipercalòrica. En els Capítols 1 i 2 hem explorat noves funcions de les neurones sensorials aferents que expressen el canal de sodi Nav1.8 en el control de l'homeòstasi energètica, considerant les diferències entre sexes. Hem generat un model de ratolí mancat de les neurones Nav1.8+ mitjançant ablació amb toxina diftèrica. En el Capítol 1 hem demostrat que les neurones Nav1.8+ són indispensables per a regular, específicament segons el sexe, les vies neurals i endocrines implicades en l'homeòstasi energètica. En femelles, l'ablació d'aquestes neurones millora la regulació de la glucosa postprandial potenciant la senyalització enteroendocrina de GLP-1 i accelera el trànsit intestinal, mentre que en mascles indueix resistència a l'augment de pes induït per una dieta obesogènica. En el Capítol 2 hem demostrat que, en mascles, l'ablació de les neurones Nav1.8+ altera el control coordinat de la ingesta i les variacions de pes diàries, a més d'alterar la senyalització enteroendocrina i les oscil·lacions diàries de la microbiota intestinal en resposta a l'estat nutricional (dejuni/ingesta), i pertorbar l'homeòstasi del sistema immunitari intestinal. En el capítol 3, hem utilitzat un model de ratolí amb obesitat induïda per dieta per explorar els mecanismes pels quals Phascolarctobacterium faecium DSM 32890, una soca bacteriana intestinal aïllada d'humans metabòlicament sans, prevé l'obesitat modulant la ingesta. L'administració de P. faecium redueix la ingesta calòrica gràcies a la hipersecreció de l'hormona gastrointestinal saciant PYY. Independentment dels seus efectes anorexigènics, el bacteri exerceix els seus beneficis metabòlics estimulant el trànsit intestinal i reduint l'absorció intestinal de lípids, evitant l'acumulació de greix corporal. En conclusió, aquesta tesi doctoral proporciona evidència preclínica que contribueix a una comprensió més precisa de les vies neuroendocrines que comuniquen l'intestí i el cervell, i del paper que té la microbiota intestinal en la regulació de la ingesta i la despesa energètica. Destaquem la importància de les neurones sensorials aferents Nav1.8+ en la detecció d'estímuls intestinals per quimioreceptors per a regular l'equilibri energètic en ambdós sexes, que obri una nova línia d'investigació per a dissenyar ferramentes de neuromodulació de les neurones Nav1.8+ amb la finalitat de prevenir i tractar els trastorns metabòlics induïts per la dieta, de forma específica per a cada sexe. També destaquem que P. faecium és un bacteri candidat com a probiòtic de nova generació, ja que modula el sistema enteroendocrí de l'hoste i prevé l'obesitat en un model preclínic. En conjunt, aquests troballes proporcionen una base per al desenvolupament d'estratègies terapèutiques basades en l'intestí dirigides a combatre l'obesitat i comorbiditats associades. / [EN] Obesity is a major global public health challenge that has reached epidemic proportions. Besides its profound impact on health and well-being, this metabolic disorder represents a significant economic burden to society. Our westernized environment where high-calorie foods are readily available, represents a major driver of the chronic imbalance between energy intake and energy expenditure that cause obesity. The limited effectiveness of behavioral interventions to manage long-term weight loss highlights the urgent need to develop more effective and minimally invasive approaches to prevent and treat obesity and its comorbidities. The development of gut-targeted therapeutic strategies to improve metabolic health requires a comprehensive understanding of the gut neuroendocrine signaling pathways that, in interaction with the gut microbiota, control feeding behavior to ultimately maintain energy balance. The aim of this thesis has been to gain insight into gut-brain interactions, including those mediated by endocrine, neural and gut microbial components, involved in the control of energy homeostasis, with a focus on obesogenic diet-related dysfunctions that increase susceptibility to develop obesity. In Chapters 1 and 2, we have investigated novel functions of sensory afferent neurons expressing the sodium channel Nav1.8 in the control of energy homeostasis, considering sex-specificities, by generating a mouse model lacking Nav1.8+ neurons through a diphtheria toxin ablation strategy. In Chapter 1, we show that Nav1.8+ neurons are required to control neural and endocrine pathways involved in energy homeostasis in a sex-specific manner. Specifically, ablation of Nav1.8+ neurons in females improves postprandial glucose regulation by enhancing glucagon-like peptide-1 enteroendocrine signaling and accelerating intestinal transit, whereas in males it induces resistance to weight gain in response to an obesogenic diet. To further explore the role of Nav1.8+ neurons in controlling food intake and pre- and post-prandial daily rhythms that influence metabolic phenotype, in Chapter 2 we show in males that ablation of Nav1.8+ sensory neurons impairs the coordinated control of food intake and body weight fluctuations throughout the day. The loss of these neurons also alters the physiological enteroendocrine signaling and daily gut microbiota oscillations in response to the nutritional status (fasting/refeeding cycles) and disrupts intestinal immune homeostasis. In Chapter 3, we used a diet-induced obese mouse model to investigate the mechanisms by which Phascolarctobacterium faecium DSM 32890, a gut bacterial strain isolated from metabolically healthy humans, prevents obesity by modulating food intake. We show that administration of P. faecium reduces caloric intake by promoting hypersecretion of a satiating gastrointestinal hormone, the peptide YY (PYY). Independently of its anorexigenic effects, the bacterium exerts its metabolic benefits via complementary mechanisms, specifically by stimulating intestinal transit and reducing intestinal lipid absorption, thereby preventing body fat accumulation. In conclusion, this doctoral thesis provides preclinical evidence for a better understanding of gut-to-brain neuroendocrine pathways and the role of gut microbiota in the regulation of food intake and energy expenditure. We highlight the importance of Nav1.8+ sensory afferent neurons in gut chemosensing for maintaining energy balance in both sexes, which prompts novel research lines and opportunities to design of sex-specific neuromodulation tools targeting Nav1.8+ neurons for prevention and treatment of diet-induced metabolic disorders. We also highlight that P. faecium is a promising next-generation probiotic candidate, as it modulates the host enteroendocrine system and prevents obesity in a preclinical model. Overall, our findings contribute to the development of gut-based therapeutic strategies to combat obesity and associated comorbidities. / This study has been funded by the European Union 7th Framework Program through the MyNewGut project (Grant agreement No. 613979) and Horizon 2020 research and innovation program under the Marie Sklodowska-Curie grant agreement No. 797297 (MRP), the Spanish Ministry of Science and Innovation (Grant PID2020-119536RB-I00), the European Commission – NextGenerationEU, through the CSIC Interdisciplinary Thematic Platform (PTI+) NEURO- AGING+ (PTI-NEURO-AGING+)”. The grant of the Spanish Ministry of Science and Innovation (MCIN/AEI) to IATA-CSIC as Accredited Center of Excellence (CEX2021-001189-S/ MCIN/AEI / 10.13039/501100011033) is acknowledged. / Bullich Vilarrubias, C. (2024). Influence of gut-to-brain neuroendocrine pathways and intestinal microbiota on energy homeostasis [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/207342 / Compendio