Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005Bitstream added on 2014-06-13T18:58:56Z : No. of bitstreams: 1 rochafilho_an_me_botfmvz.pdf: 542814 bytes, checksum: 0888c83f7ead4d23bbd7aefbda870dd1 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O presente trabalho objetivou avaliar os efeitos de doses baixas de extrato de pituitária (EPE) ou FSH purificado eqüino (eFSH) no crescimento folicular, taxa de ovulação e de recuperação embrionária em éguas. O experimento foi conduzido de outubro a dezembro de 2004 com a utilização de 27 éguas doadoras e 28 receptoras de embriões da raça Mangalarga Marchador. Após uma colheita de embrião no dia 8 pós-ovulação, as éguas receberam uma injeção de luteolítico e foram alocadas em um de dois grupos experimentais: EPE (n=13) ou eFSH (n=14). Para todas as éguas estudaram-se dois intervalos entre uma colheita de embrião e a ovulação subseqüente, sendo o primeiro o ciclo controle (sem tratamento) e o segundo o ciclo tratado. Em ambos os ciclos ultra-sonografia transretal do útero e dos ovários foi realizada diariamente para acompanhar o desenvolvimento dos dois maiores folículos. Durante o estro as éguas foram inseminadas a cada 48 h com sêmen a fresco do mesmo garanhão e receberam hCG (2.500 UI/IV) mediante a detecção de pelo menos um folículo com 35 a 40 mm de diâmetro. Os tratamentos consistiram em administração de EPE (4 mg/IM/s.i.d.; Grupo EPE) ou eFSH (5 mg/IM/s.i.d.; Grupo eFSH) do dia 8 (dia 0 = ovulação) até o dia anterior à indução das ovulações com hCG. As colheitas de embrião foram realizadas no oitavo dia pós-ovulação e sempre seguidas da administração de luteolítico. O percentual de éguas com mais de uma ovulação foi comparado pelo teste de Fischer e o número médio de ovulações e embriões, bem como os diâmetros foliculares, pelo teste t pareado entre ciclos dentro do mesmo grupo ou pelo teste t não pareado entre grupos diferentes. Uma probabilidade de P<0,05 indica que a diferença foi significativa e uma probabilidade de P=0,05 a P<0,1 indica que a diferença se aproximou da significância estatística... / The present study aimed to evaluate the effects of low doses of equine pituitary extract (EPE) or purified equine FSH (eFSH) on follicular growth, ovulation rate and embryo recovery rate in mares. The experiment was conducted from October to December 2004 using 27 donors and 28 recipient mares belonging to the Mangalarga Marchador breed. After an embryo collection attempt on day 8 postovulation, all mares received an injection of luteolytic and were assigned to one of two experimental groups: EPE (n=13) or eFSH (n=14). For all mares two intervals between an embryo collection attempt and the subsequent ovulation were studied. The first served as a control cycle and the second as the treated cycle. In both cycles transrectal ultrasonography of the uterus and ovaries was performed daily to keep track of the two largest follicles. During estrus mares were inseminated every 48 h with fresh semen from a single stallion and received an injection of hCG (2,500 IU/IV) upon detection of at least one follicle of 35 to 40 mm in diameter. The treatments consisted of administration of EPE (4 mg/IM/s.i.d.; Group EPE) or eFSH (5 mg/IM/s.i.d.; Group eFSH) from day 8 (day 0 = ovulation) until the day before the induction of ovulation with hCG. The embryo collections were performed on day 8 post-ovulation and were always followed by administration of luteolytic. The percentage of mares with more than one ovulation was compared by means of Fischer's test and the mean number of ovulations and embryos, as well as follicular diameters, by paired Student's t test between cycles within the same group and by unpaired Student's t test between different groups. A probability of P<0.05 indicates that the difference was significant and a probability...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-08-28Bitstream added on 2014-06-13T20:59:37Z : No. of bitstreams: 1 prado_fra_me_botfmvz.pdf: 162137 bytes, checksum: beea401534797380660b2b808acc6ef3 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Foram avaliadas 57 vacas da raça Gir PO, não lactantes, com escore corporal de 3,5 a 4,0 numa escala de zero a cinco pontos. As doadoras foram distribuídas em três grupos de forma aleatória, onde A (n=19), B (n=19) e C (n=19). As doadoras do grupo A foram superovuladas com 300 UI de FSH, o grupo B com 400 UI de FSH e o grupo C com 500 UI de FSH. Foi utilizado CIDR e administrado, via intramuscular, 2,5 mg de benzoato de estradiol. Cinco dias mais tarde, inicia-se o tratamento superestimulatório com diferentes concentrações de FSH. Com a última aplicação de FSH, administrou-se PGF2a, via intramuscular e doze horas após a aplicação da PGF2a foi retirado o CIDR. As vacas superovulados receberam uma dose de 50 æg de GnRH, via intramuscular, doze horas após a retirada do CIDR. As doadoras foram inseminadas doze horas após a aplicação de GnRH com duas doses de sêmen, em intervalos de doze horas entre as mesmas. As doses de sêmen utilizadas foram do mesmo touro e da mesma partida. Para análise estatística do potencial de desenvolvimento dos protocolos de superovulação, as proporções de embriões viáveis entre os tratamentos foram comparadas pelo teste de Qui-quadrado ( ), adotando os níveis de significância de 5% e 1%. A melhor resposta superovulatória foi utilizando o protocolo com concentração de 400 UI de FSH. / In this study were 57 non-lactating cows, dairy cows (Gir PO), with body condition score 3,5 the 4,0 in a scale of zero the five points. The donors later distributed in three random groups where A (n=19), B (n=19) and C (n=19). The donors of the group had been superovulation it with 300UI of FSH, group B with 400UI of FSH and group C with 500UI of FSH. CIDR had been used and applied to intramuscular, 2,5 mg of benzoate of estradiol. Five days later, in the beginning of a new wave to follicular, the superstimulation treatment with different concentrations of FSH is initiated. Together with the last application of the hormone, dose of PGF2a was managed, it saw to intramuscular and 24 hours after the application of the PGF2a the CIDR was removed. The superovulation animals had received a dose from 50 æg of GnRH, saw to intramuscular, 12 hours after the withdrawal of the CIDR. The donors had been inseminated twelve hours after the application of GnRH with two doses of semen, in intervals of 12 hours between the same ones. The used doses of semen had been of the same bull and the same departure. For analysis statistics of the potential of development of the superovulation protocols, the ratios of viable embryos between the treatments had been compared by the Qui-square test ( ), adopting the levels of significance of 5% and 1%. The best results it was using the protocol with concentration 400 UI of FSH.

Apesar de inúmeros estudos desenvolvidos no Brasil e no mundo, a utilização das biotecnologias de superovulação (SOV) e transferência de embriões (TE) em bubalinos ainda apresenta resultados inconsistentes, associados à principalmente à baixa taxa de recuperação de embriões. Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da utilização de dispositivo de P4 (para promover diminuição da contratilidade do trato genital, Capitulo 1) ou da administração de PGF2&#945; (para promover aumento da atividade da fímbria e da frequência do batimento ciliar, Capítulo 2) durante o período periovulatório na captação dos oócitos pelas fímbrias e no aumento da produção de embriões em búfalas superovuladas. No Experimento 1 (Capítulo 1), doadoras bubalinas foram homogeneamente divididas em dois grupos: controle (G-C; n=8) e tratamento com progesterona (P4) durante o período periovulatório (G-P4; n=8). A emergência da onda de crescimento folicular foi sincronizada com um dispositivo intravaginal de P4 e a administração de 2 mg i.m. de benzoato de em dia aleatório do ciclo estral (Dia 0; D0). A partir do D4, todas as búfalas receberam 200 mg i.m. de FSH duas vezes ao dia, em 8 doses decrescentes. Foram administrados 530&micro;g i.m. de PGF2&#945; no D6 e no D7. A P4 foi removida do G-C no D7 e do G-P4 no D10. No D8, todas as búfalas receberam 25 mg i.m. de pLH. As inseminações foram realizadas 12 e 24 h após o tratamento com pLH. Foram realizadas colheitas de sangue a cada 12h do D7 ao D11 para posterior dosagem de progesterona. As estruturas embrionárias (oócitos/embriões) foram coletadas pelo método não cirúrgico de lavagem uterina seis dias após a segunda IA (D14). Avaliações ultrassonográficas dos ovários foram realizadas no D8 e no D14 para aferir respectivamente as respostas superestimulatória e superovulatória. As variáveis foram analisadas pelo procedimento GLIMMIX do SAS®. As búfalas do G-P4 apresentaram menor taxa de ovulação (13,5±4,9 vs. 71,5±16,1%; P=0,002) e, consequentemente, maior taxa de folículos &ge; 8 mm (87,8±10,6 vs. 34,3±9,8 %; P=0,06) e menor número de CLs no D14 (1,1±0,3 vs. 8,0±2,8; P=0,04) que as búfalas do G-C. O número de estruturas embrionárias (1,9±0,7 vs. 0,0±0,0; P=0,03), de embriões transferíveis (1,6±0,7 vs. 0,0±0,0; P=0,04) e congeláveis (1,6±0,7 vs. 0,0±0,0; P=0,04) foram inferiores para o G-P4. A concentração sérica de progesterona foi maior nos animais do G-P4 (1,87±0,13) que nos do G-C (0,48±0,10; P<0,0001). No Experimento 1 (Capítulo 2), as doadoras foram divididas aleatoriamente em 2 grupos: controle (G-C; n=22) e tratamento com prostaglandina F2&#945; durante o período periovulatório (G-PGF; n=22). Os animais do G-C foram submetidos ao protocolo de superovulação descrito no capítulo 1. No G-PGF todas as búfalas receberam protocolo de superovulação semelhante ao G-C e, adicionalmente, receberam quatro doses de PGF2&#945; (0,53 mg i.m. de cloprostenol sódico) do D8 ao D10 com intervalo de 12h. Foi verificado maior número de estruturas embrionárias recuperadas em búfalas superovuladas tratadas com PGF2&#945; durante o período periovulatório (G-PGF=3,5±0,6) comparado ao grupo controle (G-C=2,3±0,5; P=0,02). Além disso, houve aumento no número de embriões transferíveis (G-PGF=2,7±0,6 vs. G-C=1,8±0,5; P=0,05). No Experimento 2 (Capítulo 2), os animais foram divididos aleatoriamente em três grupos experimentais: Grupo Controle (GC; n=22), Grupo PGF injetável (G-PGF-INJ; n=22) e Grupo PGF Bomba Osmótica (G-PGF-BO; n=22). Os animais pertencentes aos grupos: G-C e G-PGF-INJ foram submetidos aos mesmos protocolos descritos para seus grupos correspondentes no Experimento 1 (Capítulo 2). No GPGF- BO, todas as búfalas receberam protocolo de superovulação semelhante ao G-C e, adicionalmente, receberam a partir do D8 a inserção subcutânea de uma mini-bomba osmótica, contendo PGF2&#945; (2,12 mg de Cloprostenol sódico). A bomba osmótica retirada no D10. Não foram verificadas diferenças no número de estruturas totais recuperadas nas búfalas tratadas com PGF&#945; durante o período periovulatório (G-C=2,1±0,8 vs. G-PGF-INJ=2,1±0,6 vs. GPGF- BO=1,4±0,4; P=0,58). Os tratamentos no período periovulatório com dispositivo intravaginal de P4 (Capítulo 1) e com PGF2&#945; (Capítulo 2) não foram eficientes em aumentar a recuperação de estruturas embrionárias de búfalas superovuladas. / Despite numerous studies conducted in Brazil and world-wide, the use of superovulation (SOV) and embryo transfer (ET) biotechnologies in buffaloes still shows inconsistent results, particularly in terms of low embryos recovery rate. Thus, the aim of this study was to evaluate the use of a P4 device (to decrease contractility of the genital tract, Chapter 1) or PGF2&alpha; administration (to increase activity of the fimbriae and ciliary beat frequency, Chapter 2) during the periovulatory period in the uptake of oocytes by fimbriae and in the increase of embryo production in superovulated buffaloes. In Experiment 1 (Chapter 1), buffalo donors were homogeneously assigned into 2 groups: Control (C-G; n=8) and progesterone (P4) treatment during the periovulatory period (P4-G; n=8). Follicular growth wave emergence was synchronized with an intravaginal P4 device and the injection of 2 mg i.m. of estradiol benzoate at random stage of the estrous cycle (Day 0; D0). From D4 on, all buffaloes received 200 mg i.m. of FSH twice-daily, in 8 decreasing doses. A dose of PGF2&alpha; was given on D6 PM and on D7. The P4 was removed from the C-G on D7 and from the P4-G on D10. On D8, all buffaloes received 25 mg i.m. of pLH. Inseminations were done 12 and 24 h after the pLH treatment. Blood samples were collected every 12h from D7 to D11 for further progesterone assay. The embryonic structures (ova/embryos) were collected by nonsurgical uterine flush 6 days after the second timed AI (D14). Ovarian ultrasound examinations were performed on D8 and on D14 to verify respectively the superestimulation and the superovulatory response. Variables were analyzed by GLIMMIX procedure of SAS®. Buffaloes from P4-G showed lower ovulation rate (13.5±4.9 vs. 71.5±16.1%; P=0.002) and, consequently, higher follicles &ge; 8 mm rate (87.8±10.6 vs. 34.3±9.8 %; P=0.06) and lower number of CLs on D14 (1.1±0.3 vs. 8.0±2.8; P=0.04) than buffaloes from C-G. The total number of embryonic structures (1.9±0.7 vs. 0.0±0.0; P=0.03), transferable (1.6±0.7 vs. 0.0±0.0; P=0.04) and freezable embryos (1.6±0.7 vs. 0.0±0.0; P=0.04) were lower for P4-G. The serum progesterone concentration was greater for animals in P4-G (1.87±0.13) than in the C-G (0.48±0.10; P<0.0001). In Experiment 1 (Chapter 2), donors were randomly assigned into two groups: control (C-G; n=22) and prostaglandin F2&alpha; treatment during the periovulatory period (G-PGF; n=22). Animals from C-G were subjected to the superovulation protocol described on chapter 1. In G-PGF all buffaloes received similar superovulation protocol from the C-G and, additionally, received four doses of PGF2&alpha; (0.53 mg i.m. of sodic cloprostenol) from D8 to D10, 12h apart. A greater number of embryonic structures were recovered from superovulated buffaloes treated with PGF2&alpha; during the periovulatory period (PGF-G=3.5±0.6) compared to control group (C-G=2.3±0.5; P=0.02). Furthermore, increased number of transferable embryos were found in treated animals (PGF-G=2.7±0.6 vs. C-G=1.8±0.5; P=0.05). In Experiment 2 (Chapter 2), animals were randomly assigned into three experimental groups: Control group (CG; n=22), Injectable PGF group (INJ-PGF-G; n=22) and Osmotic pump PGF group (BO-PGF-G; n=22). The animals from C-G and INJ-PGF-G group were subjected to the same protocols described for their correspondent groups in Experiment 1 (Chapter 2). In BO-PGF-G, all buffaloes received the superovulation protocol similar to C-G and, additionally, received from D8, a subcutaneous insertion of a mini osmotic pump, containing PGF2&alpha; (2.12 mg de sodic cloprostenol). The osmotic pump was removed on D10. No differences were found on the total number of recovered structures in buffaloes treated with PGF2&alpha; during the periovulatory period (C-G=2.1±0.8 vs. INJ-PGF-G=2.1±0.6 vs. BO-PGF-G=1.4±0.4; P=0.58). Treatments on the peri- ovulatory period with intravaginal P4 device (Chapter 1) and PGF2&alpha; (Chapter 2) were not efficient in increasing the recovery of embryonic structures in superovulated buffalo.

A nutrição é o principal fator que interfere com o desempenho reprodutivo de mamíferos e vários metabólitos e hormônios, envolvidos no metabolismo energético, funcionam como sinalizadores para o eixo hipotálamo-hipófise-gonadal. O fato de a insulina ser o principal regulador da homeostase de glicose e exercer controle em diversas etapas do metabolismo de gorduras e proteínas, fez desse hormônio, ao longo do processo evolutivo, um modulador da reprodução. Neste estudo, no experimento 1, foi comparado o efeito da hiper e da hipoinsulinemia, no desempenho reprodutivo relacionado ao processo de superovulação em ovelhas. Para tanto foram utilizadas 27 ovelhas, distribuídas em 3 grupos: a) controle; b) grupo diabético (induzido pela aplicação I.V. de 50mg/kg de Alloxano); e c) grupo hiperinsulinêmico (suplementado com 1 UI/kg ao dia, S.C.). Todos os animais receberam um pessário vaginal, contendo 60 mg de medroxiprogesterona no D0 e foram superovulados, com 250UI de FSH em 6 aplicações, iniciadas no D10. No D12 aplicaram-se 250UI de eCG e 125 g de cloprostenol sódico. As ovelhas foram submetidas à monta natural e a colheita dos embriões foi realizada no sétimo dia após o início do estro. Em média, os teores de insulina medidos a partir da remoção dos pessários até a colheita dos embriões foram de 14,52±0,4 vs 10,18 ± 0,5 vs 20,05±0,9 UI/mL (P<0,01), respectivamente para os grupos controle, diabético e hiperinsulinêmico. Os valores para glicemia, medida no mesmo período, para os grupos controle, diabético e hiperinsulinêmico foram de 83,1±2,1 mg/dL vs 241,2±9,2 mg/dL vs 53,9±2,7 mg/dL (P<0,01), respectivamente. O grupo diabético apresentou menor produção de corpos lúteos que os animais controle e hiperinsulinêmicos (5 ±1,1 vs 10.3±1,9 e 11,3±1, P<0,01); pior qualidade do CL (IQCL de 2,3±0,3 vs 1.6±0,1 e 1.3±0,1, P<0,01), menor número de embriões (2.3±1.2 vs 7.9±1.97e 7.4±1.2, P<0,01), que por sua vez também foram de pior qualidade (IQE de 2.9±0.2 vs 2±0.1 e 1.7±0.1, P<0,01). De um modo geral, os animais hiperinsulinêmicos apresentaram desempenho reprodutivo semelhante aos do grupo controle; entretanto, embora o número de embriões colhidos não tenha sido estatísticamente diferente, os dados são sugestivos de que o estado de hiperinsulinemia pode favorecer o crescimento embrionário, acelerando seu desenvolvimento. Histologicamente, os CL do grupo diabético se apresentaram com hipotrofia das LLC, aumento no número de células apoptóticas por campo, quando comparados aos dos tratamentos controle e hiperinsulinêmico. Adicionalmente, no experimento 2, foram testadas formulações de nanopartículas de quitosana, para liberação sustentada de insulina, bem como permeação da mucosa gastrintestinal. A formulação de insulina nanoestruturada, sem proteção lipídica,administrada pela via SC, liberou 92,1 ± 3,01% da quantidade inicial de insulina, in vitro, porém o padrão desejado de liberação sustentada não foi atingido. No teste in vivo, a redução da glicemia foi apenas parcial (em média 60,8±3,2% em relação à linha de base). O sistema composto por nanopartículas incorporadas à matriz lipídica, no teste in vitro, liberou apenas 15,6 ± 4,9% da quantidade inicial. Entretanto, quando administrada pela via oral, no teste in vivo, reduziu, embora parcialmente, a glicemia de ovinos diabéticos alloxano induzidos (em média 79,88±4,3% em relação à linha de base). Concluiu-se, com base no experimento 1 que, na dose empregada, a insulina não foi capaz de produzir benefícios reprodutivos que justifiquem seu uso em protocolos de superovulação de ovelhas. As concentrações subfisiológicas de insulina, observadas nos animais diabéticos podem ser responsáveis por uma série de alterações metabólicas, que, em conjunto, comprometeram os índices de desempenho reprodutivo, relacionados ao processo de superovulação e induziram um quadro inicial de regressão de CL. Com isso, observou-se que o uso de ovelhas, como modelo animal, para estudo dos efeitos reprodutivos da insulina, foi satisfatório. Pela análise do experimento 2, concluiu-se que o sistema de nanopartículas revestidas por lipídios foi capaz de carrear a insulina, ao longo do trato digestivo de um ruminante, no teste in vivo, e compatibilizar sua permeação através da mucosa intestinal, mantendo a atividade biológica do hormônio, o que consiste em um fato inédito. / Nutrition is the main factor that interferes with the reproductive development of all mammals and many of the matobolites and hormones involved in the energetic metabolism work as signaling factors for the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. The fact of insulin being the main regulator of glucose homeostasis and having control in various steps of fat and protein metabolism, has made this hormone, along the evolution process, a reproductive modulator. In the first experiment of this study, the effect of hyper and hypoinsulinemia were compared as to how it affects the reproductive performance related to superovulation in sheep. For this, 27 sheep were used, distributed in 3 groups a) control, b) diabetic group (induced by IV injection of 50mg/kg of Alloxan); and c) hyperinsulinemic group (supplemented with 1 UI/kg per day, SC). All animals received a vaginal pessary, containing 60 mg of medroxiprogesterone on D0 and were superovulated, with 250UI of FSH in 6 applications, starting on D10. On D12 250UI of eCG and 125 g of sodium cloprostenol were administered. The sheep were submitted to natural breeding and embryo collection was performed on the seventh day after the beginning of estrus. In average, the insulin levels recorded starting on the day of pessary removal until the day of embryo collection were 14,52±0,4 vs 10,18 ± 0,5 vs 20,05±0,9 UI/mL (P<0,01), respectively for the control, diabetic and hyperinsulinemic groups. The values for glycemia, measured during the same period, for the control, diabetic and hyperinsulinemic groups were 83,1±2,1 mg/dL vs 241,2±9,2 mg/dL vs 53,9±2,7 mg/dL (P<0,01), respectively. The diabetic group showed less corpus lutea production than the control and hyperinsulinemic groups (5 ±1,1 vs 10.3±1,9 and 11,3±1, P<0,01); worse CL quality (IQCL de 2,3±0,3 vs 1.6±0,1 and 1.3±0,1, P<0,01), less number of embryos (2.3±1.2 vs 7.9±1.97 and 7.4±1.2, P<0,01), which by its turn were also of worse quality (IQE de 2.9±0.2 vs 2±0.1 and 1.7±0.1, P<0,01). Overall, hyperinsulinemic animals presented a reproductive performance similar to the control group; however, although the number of embryos recovered were not statiscally different, the data suggest that the state of hyperinsulinemy can favor embryo growth, acceleratting its development. Histologically, the CLs from the diabetic group showed hypotrophy of LLC and an increase in the number of apoptotic cells per field when compared to the control and hyperinsulinemic treatments. In addiction, the second experiment, chitosan nanoparticles formulations were tested, for sustained release of insulin as well as gastrointestinal mucosal permeability. The nanostructured insulin formulation without lipid protection, administered SC, released 92,1 ± 3,01% of the initial insulin amount, in vitro, however, the desired standard for sustained release was not reached. In the in vivo test, the reduction in glycemia was only partial (on average 60,8±3,2% in relation to base line ). In the in vitro test, the system made up of nanoparticles incorporated to the lipid matrix, released only 15,6 ± 4,9% of the initial amount. However, when administered orally, in the in vivo test, it reduced, although only partially, the glycemia of the alloxan induced diabetic ovines (on average 79,88±4,3% in relation to base line). In conclusion, based on the first experiment, the applied insulin dose was not able to produce any reproductive benefits that may justify its use in sheep superovulation protocols. The sub-physiologic insulin concentrations observed in the diabetic animals may be responsable for various metabolic alterations, that together compromised the reproductive performance levels related to the superovulation process and induced an initial state of CL regression. With that, it was noticed that the use of sheep as an animal model for the study of the effects of insulin on reproduction was satisfatory. By analyzing the second experiment, it was concluded that the nanoparticles system coated with lipids was able to carry insulin along the ruminant digestive during the in vivo test, show permeability through the intestinal mucosa, maintaining the hormone biologic activity, which is a new and unpublished fact.

Apesar de inúmeros estudos desenvolvidos no Brasil e no mundo, a utilização das biotecnologias de superovulação (SOV) e transferência de embriões (TE) em bubalinos ainda apresenta resultados inconsistentes, associados à principalmente à baixa taxa de recuperação de embriões. Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da utilização de dispositivo de P4 (para promover diminuição da contratilidade do trato genital, Capitulo 1) ou da administração de PGF2&#945; (para promover aumento da atividade da fímbria e da frequência do batimento ciliar, Capítulo 2) durante o período periovulatório na captação dos oócitos pelas fímbrias e no aumento da produção de embriões em búfalas superovuladas. No Experimento 1 (Capítulo 1), doadoras bubalinas foram homogeneamente divididas em dois grupos: controle (G-C; n=8) e tratamento com progesterona (P4) durante o período periovulatório (G-P4; n=8). A emergência da onda de crescimento folicular foi sincronizada com um dispositivo intravaginal de P4 e a administração de 2 mg i.m. de benzoato de em dia aleatório do ciclo estral (Dia 0; D0). A partir do D4, todas as búfalas receberam 200 mg i.m. de FSH duas vezes ao dia, em 8 doses decrescentes. Foram administrados 530&micro;g i.m. de PGF2&#945; no D6 e no D7. A P4 foi removida do G-C no D7 e do G-P4 no D10. No D8, todas as búfalas receberam 25 mg i.m. de pLH. As inseminações foram realizadas 12 e 24 h após o tratamento com pLH. Foram realizadas colheitas de sangue a cada 12h do D7 ao D11 para posterior dosagem de progesterona. As estruturas embrionárias (oócitos/embriões) foram coletadas pelo método não cirúrgico de lavagem uterina seis dias após a segunda IA (D14). Avaliações ultrassonográficas dos ovários foram realizadas no D8 e no D14 para aferir respectivamente as respostas superestimulatória e superovulatória. As variáveis foram analisadas pelo procedimento GLIMMIX do SAS®. As búfalas do G-P4 apresentaram menor taxa de ovulação (13,5±4,9 vs. 71,5±16,1%; P=0,002) e, consequentemente, maior taxa de folículos &ge; 8 mm (87,8±10,6 vs. 34,3±9,8 %; P=0,06) e menor número de CLs no D14 (1,1±0,3 vs. 8,0±2,8; P=0,04) que as búfalas do G-C. O número de estruturas embrionárias (1,9±0,7 vs. 0,0±0,0; P=0,03), de embriões transferíveis (1,6±0,7 vs. 0,0±0,0; P=0,04) e congeláveis (1,6±0,7 vs. 0,0±0,0; P=0,04) foram inferiores para o G-P4. A concentração sérica de progesterona foi maior nos animais do G-P4 (1,87±0,13) que nos do G-C (0,48±0,10; P<0,0001). No Experimento 1 (Capítulo 2), as doadoras foram divididas aleatoriamente em 2 grupos: controle (G-C; n=22) e tratamento com prostaglandina F2&#945; durante o período periovulatório (G-PGF; n=22). Os animais do G-C foram submetidos ao protocolo de superovulação descrito no capítulo 1. No G-PGF todas as búfalas receberam protocolo de superovulação semelhante ao G-C e, adicionalmente, receberam quatro doses de PGF2&#945; (0,53 mg i.m. de cloprostenol sódico) do D8 ao D10 com intervalo de 12h. Foi verificado maior número de estruturas embrionárias recuperadas em búfalas superovuladas tratadas com PGF2&#945; durante o período periovulatório (G-PGF=3,5±0,6) comparado ao grupo controle (G-C=2,3±0,5; P=0,02). Além disso, houve aumento no número de embriões transferíveis (G-PGF=2,7±0,6 vs. G-C=1,8±0,5; P=0,05). No Experimento 2 (Capítulo 2), os animais foram divididos aleatoriamente em três grupos experimentais: Grupo Controle (GC; n=22), Grupo PGF injetável (G-PGF-INJ; n=22) e Grupo PGF Bomba Osmótica (G-PGF-BO; n=22). Os animais pertencentes aos grupos: G-C e G-PGF-INJ foram submetidos aos mesmos protocolos descritos para seus grupos correspondentes no Experimento 1 (Capítulo 2). No GPGF- BO, todas as búfalas receberam protocolo de superovulação semelhante ao G-C e, adicionalmente, receberam a partir do D8 a inserção subcutânea de uma mini-bomba osmótica, contendo PGF2&#945; (2,12 mg de Cloprostenol sódico). A bomba osmótica retirada no D10. Não foram verificadas diferenças no número de estruturas totais recuperadas nas búfalas tratadas com PGF&#945; durante o período periovulatório (G-C=2,1±0,8 vs. G-PGF-INJ=2,1±0,6 vs. GPGF- BO=1,4±0,4; P=0,58). Os tratamentos no período periovulatório com dispositivo intravaginal de P4 (Capítulo 1) e com PGF2&#945; (Capítulo 2) não foram eficientes em aumentar a recuperação de estruturas embrionárias de búfalas superovuladas. / Despite numerous studies conducted in Brazil and world-wide, the use of superovulation (SOV) and embryo transfer (ET) biotechnologies in buffaloes still shows inconsistent results, particularly in terms of low embryos recovery rate. Thus, the aim of this study was to evaluate the use of a P4 device (to decrease contractility of the genital tract, Chapter 1) or PGF2&alpha; administration (to increase activity of the fimbriae and ciliary beat frequency, Chapter 2) during the periovulatory period in the uptake of oocytes by fimbriae and in the increase of embryo production in superovulated buffaloes. In Experiment 1 (Chapter 1), buffalo donors were homogeneously assigned into 2 groups: Control (C-G; n=8) and progesterone (P4) treatment during the periovulatory period (P4-G; n=8). Follicular growth wave emergence was synchronized with an intravaginal P4 device and the injection of 2 mg i.m. of estradiol benzoate at random stage of the estrous cycle (Day 0; D0). From D4 on, all buffaloes received 200 mg i.m. of FSH twice-daily, in 8 decreasing doses. A dose of PGF2&alpha; was given on D6 PM and on D7. The P4 was removed from the C-G on D7 and from the P4-G on D10. On D8, all buffaloes received 25 mg i.m. of pLH. Inseminations were done 12 and 24 h after the pLH treatment. Blood samples were collected every 12h from D7 to D11 for further progesterone assay. The embryonic structures (ova/embryos) were collected by nonsurgical uterine flush 6 days after the second timed AI (D14). Ovarian ultrasound examinations were performed on D8 and on D14 to verify respectively the superestimulation and the superovulatory response. Variables were analyzed by GLIMMIX procedure of SAS®. Buffaloes from P4-G showed lower ovulation rate (13.5±4.9 vs. 71.5±16.1%; P=0.002) and, consequently, higher follicles &ge; 8 mm rate (87.8±10.6 vs. 34.3±9.8 %; P=0.06) and lower number of CLs on D14 (1.1±0.3 vs. 8.0±2.8; P=0.04) than buffaloes from C-G. The total number of embryonic structures (1.9±0.7 vs. 0.0±0.0; P=0.03), transferable (1.6±0.7 vs. 0.0±0.0; P=0.04) and freezable embryos (1.6±0.7 vs. 0.0±0.0; P=0.04) were lower for P4-G. The serum progesterone concentration was greater for animals in P4-G (1.87±0.13) than in the C-G (0.48±0.10; P<0.0001). In Experiment 1 (Chapter 2), donors were randomly assigned into two groups: control (C-G; n=22) and prostaglandin F2&alpha; treatment during the periovulatory period (G-PGF; n=22). Animals from C-G were subjected to the superovulation protocol described on chapter 1. In G-PGF all buffaloes received similar superovulation protocol from the C-G and, additionally, received four doses of PGF2&alpha; (0.53 mg i.m. of sodic cloprostenol) from D8 to D10, 12h apart. A greater number of embryonic structures were recovered from superovulated buffaloes treated with PGF2&alpha; during the periovulatory period (PGF-G=3.5±0.6) compared to control group (C-G=2.3±0.5; P=0.02). Furthermore, increased number of transferable embryos were found in treated animals (PGF-G=2.7±0.6 vs. C-G=1.8±0.5; P=0.05). In Experiment 2 (Chapter 2), animals were randomly assigned into three experimental groups: Control group (CG; n=22), Injectable PGF group (INJ-PGF-G; n=22) and Osmotic pump PGF group (BO-PGF-G; n=22). The animals from C-G and INJ-PGF-G group were subjected to the same protocols described for their correspondent groups in Experiment 1 (Chapter 2). In BO-PGF-G, all buffaloes received the superovulation protocol similar to C-G and, additionally, received from D8, a subcutaneous insertion of a mini osmotic pump, containing PGF2&alpha; (2.12 mg de sodic cloprostenol). The osmotic pump was removed on D10. No differences were found on the total number of recovered structures in buffaloes treated with PGF2&alpha; during the periovulatory period (C-G=2.1±0.8 vs. INJ-PGF-G=2.1±0.6 vs. BO-PGF-G=1.4±0.4; P=0.58). Treatments on the peri- ovulatory period with intravaginal P4 device (Chapter 1) and PGF2&alpha; (Chapter 2) were not efficient in increasing the recovery of embryonic structures in superovulated buffalo.

A nutrição é o principal fator que interfere com o desempenho reprodutivo de mamíferos e vários metabólitos e hormônios, envolvidos no metabolismo energético, funcionam como sinalizadores para o eixo hipotálamo-hipófise-gonadal. O fato de a insulina ser o principal regulador da homeostase de glicose e exercer controle em diversas etapas do metabolismo de gorduras e proteínas, fez desse hormônio, ao longo do processo evolutivo, um modulador da reprodução. Neste estudo, no experimento 1, foi comparado o efeito da hiper e da hipoinsulinemia, no desempenho reprodutivo relacionado ao processo de superovulação em ovelhas. Para tanto foram utilizadas 27 ovelhas, distribuídas em 3 grupos: a) controle; b) grupo diabético (induzido pela aplicação I.V. de 50mg/kg de Alloxano); e c) grupo hiperinsulinêmico (suplementado com 1 UI/kg ao dia, S.C.). Todos os animais receberam um pessário vaginal, contendo 60 mg de medroxiprogesterona no D0 e foram superovulados, com 250UI de FSH em 6 aplicações, iniciadas no D10. No D12 aplicaram-se 250UI de eCG e 125 g de cloprostenol sódico. As ovelhas foram submetidas à monta natural e a colheita dos embriões foi realizada no sétimo dia após o início do estro. Em média, os teores de insulina medidos a partir da remoção dos pessários até a colheita dos embriões foram de 14,52±0,4 vs 10,18 ± 0,5 vs 20,05±0,9 UI/mL (P<0,01), respectivamente para os grupos controle, diabético e hiperinsulinêmico. Os valores para glicemia, medida no mesmo período, para os grupos controle, diabético e hiperinsulinêmico foram de 83,1±2,1 mg/dL vs 241,2±9,2 mg/dL vs 53,9±2,7 mg/dL (P<0,01), respectivamente. O grupo diabético apresentou menor produção de corpos lúteos que os animais controle e hiperinsulinêmicos (5 ±1,1 vs 10.3±1,9 e 11,3±1, P<0,01); pior qualidade do CL (IQCL de 2,3±0,3 vs 1.6±0,1 e 1.3±0,1, P<0,01), menor número de embriões (2.3±1.2 vs 7.9±1.97e 7.4±1.2, P<0,01), que por sua vez também foram de pior qualidade (IQE de 2.9±0.2 vs 2±0.1 e 1.7±0.1, P<0,01). De um modo geral, os animais hiperinsulinêmicos apresentaram desempenho reprodutivo semelhante aos do grupo controle; entretanto, embora o número de embriões colhidos não tenha sido estatísticamente diferente, os dados são sugestivos de que o estado de hiperinsulinemia pode favorecer o crescimento embrionário, acelerando seu desenvolvimento. Histologicamente, os CL do grupo diabético se apresentaram com hipotrofia das LLC, aumento no número de células apoptóticas por campo, quando comparados aos dos tratamentos controle e hiperinsulinêmico. Adicionalmente, no experimento 2, foram testadas formulações de nanopartículas de quitosana, para liberação sustentada de insulina, bem como permeação da mucosa gastrintestinal. A formulação de insulina nanoestruturada, sem proteção lipídica,administrada pela via SC, liberou 92,1 ± 3,01% da quantidade inicial de insulina, in vitro, porém o padrão desejado de liberação sustentada não foi atingido. No teste in vivo, a redução da glicemia foi apenas parcial (em média 60,8±3,2% em relação à linha de base). O sistema composto por nanopartículas incorporadas à matriz lipídica, no teste in vitro, liberou apenas 15,6 ± 4,9% da quantidade inicial. Entretanto, quando administrada pela via oral, no teste in vivo, reduziu, embora parcialmente, a glicemia de ovinos diabéticos alloxano induzidos (em média 79,88±4,3% em relação à linha de base). Concluiu-se, com base no experimento 1 que, na dose empregada, a insulina não foi capaz de produzir benefícios reprodutivos que justifiquem seu uso em protocolos de superovulação de ovelhas. As concentrações subfisiológicas de insulina, observadas nos animais diabéticos podem ser responsáveis por uma série de alterações metabólicas, que, em conjunto, comprometeram os índices de desempenho reprodutivo, relacionados ao processo de superovulação e induziram um quadro inicial de regressão de CL. Com isso, observou-se que o uso de ovelhas, como modelo animal, para estudo dos efeitos reprodutivos da insulina, foi satisfatório. Pela análise do experimento 2, concluiu-se que o sistema de nanopartículas revestidas por lipídios foi capaz de carrear a insulina, ao longo do trato digestivo de um ruminante, no teste in vivo, e compatibilizar sua permeação através da mucosa intestinal, mantendo a atividade biológica do hormônio, o que consiste em um fato inédito. / Nutrition is the main factor that interferes with the reproductive development of all mammals and many of the matobolites and hormones involved in the energetic metabolism work as signaling factors for the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. The fact of insulin being the main regulator of glucose homeostasis and having control in various steps of fat and protein metabolism, has made this hormone, along the evolution process, a reproductive modulator. In the first experiment of this study, the effect of hyper and hypoinsulinemia were compared as to how it affects the reproductive performance related to superovulation in sheep. For this, 27 sheep were used, distributed in 3 groups a) control, b) diabetic group (induced by IV injection of 50mg/kg of Alloxan); and c) hyperinsulinemic group (supplemented with 1 UI/kg per day, SC). All animals received a vaginal pessary, containing 60 mg of medroxiprogesterone on D0 and were superovulated, with 250UI of FSH in 6 applications, starting on D10. On D12 250UI of eCG and 125 g of sodium cloprostenol were administered. The sheep were submitted to natural breeding and embryo collection was performed on the seventh day after the beginning of estrus. In average, the insulin levels recorded starting on the day of pessary removal until the day of embryo collection were 14,52±0,4 vs 10,18 ± 0,5 vs 20,05±0,9 UI/mL (P<0,01), respectively for the control, diabetic and hyperinsulinemic groups. The values for glycemia, measured during the same period, for the control, diabetic and hyperinsulinemic groups were 83,1±2,1 mg/dL vs 241,2±9,2 mg/dL vs 53,9±2,7 mg/dL (P<0,01), respectively. The diabetic group showed less corpus lutea production than the control and hyperinsulinemic groups (5 ±1,1 vs 10.3±1,9 and 11,3±1, P<0,01); worse CL quality (IQCL de 2,3±0,3 vs 1.6±0,1 and 1.3±0,1, P<0,01), less number of embryos (2.3±1.2 vs 7.9±1.97 and 7.4±1.2, P<0,01), which by its turn were also of worse quality (IQE de 2.9±0.2 vs 2±0.1 and 1.7±0.1, P<0,01). Overall, hyperinsulinemic animals presented a reproductive performance similar to the control group; however, although the number of embryos recovered were not statiscally different, the data suggest that the state of hyperinsulinemy can favor embryo growth, acceleratting its development. Histologically, the CLs from the diabetic group showed hypotrophy of LLC and an increase in the number of apoptotic cells per field when compared to the control and hyperinsulinemic treatments. In addiction, the second experiment, chitosan nanoparticles formulations were tested, for sustained release of insulin as well as gastrointestinal mucosal permeability. The nanostructured insulin formulation without lipid protection, administered SC, released 92,1 ± 3,01% of the initial insulin amount, in vitro, however, the desired standard for sustained release was not reached. In the in vivo test, the reduction in glycemia was only partial (on average 60,8±3,2% in relation to base line ). In the in vitro test, the system made up of nanoparticles incorporated to the lipid matrix, released only 15,6 ± 4,9% of the initial amount. However, when administered orally, in the in vivo test, it reduced, although only partially, the glycemia of the alloxan induced diabetic ovines (on average 79,88±4,3% in relation to base line). In conclusion, based on the first experiment, the applied insulin dose was not able to produce any reproductive benefits that may justify its use in sheep superovulation protocols. The sub-physiologic insulin concentrations observed in the diabetic animals may be responsable for various metabolic alterations, that together compromised the reproductive performance levels related to the superovulation process and induced an initial state of CL regression. With that, it was noticed that the use of sheep as an animal model for the study of the effects of insulin on reproduction was satisfatory. By analyzing the second experiment, it was concluded that the nanoparticles system coated with lipids was able to carry insulin along the ruminant digestive during the in vivo test, show permeability through the intestinal mucosa, maintaining the hormone biologic activity, which is a new and unpublished fact.

Orientador: Eunice Oba / Resumo: O presente estudo teve por objetivo a utilização do hormônio agonista de GnRH, Deslorelina, para controle da população folicular, com intuito de homogeneizar a onda folicular ao início do tratamento de múltiplas ovulações e transferência de embriões (MOET), reduzindo os efeitos deletérios do folículo dominante no tratamento superovulatório com hormônio folículo estimulante, foltropina de pituitária suína. Foram utilizadas 24 ovelhas deslanadas mestiças da raça santa inês, com idades entre 2 e 4 anos, divididas em dois grupos, Controle (Contr), e Deslorelina (Des). Os experimentos foram conduzidos na propriedade rural denominada ‘’Sítio Panorama’’, no município de Porangaba-SP, situado na latitude -23.15050993 e longitude -48.09904348, estando a uma altitude de 583m. As ovelhas foram monitoradas ultrassonograficamente por um período de sete dias quanto ao dinâmica de crescimento folicular e presença de corpo lúteo. Após determinação da ciclicidade ovariana todas as ovelhas receberam dispositivo intravaginal com 60mg de medroxiprogesterona no dia 0, que foi substituído por um novo dispositivo no dia 7 e que foi mantido até o dia 14, as fêmeas receberam única dose de 125 µg de clopostenol no dia 7. O tratamento superovulatório foi realizado com aplicação de Hormônio Folículo Estimulante Suíno- pFSH, na dose total de 200mg (10 mL), divididas em oito aplicações decrescentes com intervalo de 12h iniciando no decimo segundo dia (40 e 40; 30 e 30; 20 e 20; 10 e 10 mg, respectivamente... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The present study main objective was to use the GnRH agonist hormone deslorelin to control ovarian follicular population, achieving this way a more homogenous follicular wave at the beginning of multiple ovulations and embryo transfer (MOET) program, reducing deleterious effects from dominant follicles over the superovulatory protocol with porcine Follicle Stimulating Hormone (pFSH). Twenty four Santa Inês breed sheep were used, aging from 2 to 4 years, and divided into two groups: control (Contr), and Deslorelin (DES). The experiment was conducted in a private property, located in Brazil, São Paulo, City of Porangaba, latitude -23.15050993 and longitude -48.09904348. All sheep were monitored ultrassonographicaly for seven days, until the presence of a corpus luteum was detected. All sheep received intravaginal sponges containing 60mg of medroxiprogesteron on day 0, and new sponges on day 7 maintained until day 14, among side a single cloprostenol 125 µg dose. Superovulatory treatment was achieved using porcine Follicular Stimulating Hormone -FSH, with the total dose of 200mg (10ml), spread in eight decreasing administrations with 12 hours’ interval between them, starting on the twelve day. On day 14, 300 UI of equine chorionic gonadotrophin – eCG was administrated. On the treated group, in addition to the treatment described above, 3 doses of 100µg of GnRH agonist Deslorelin were administrated with 72 hours’ intervals, starting at day 4 after sponge insertion (day 3, day 6 a... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O uso da gonadotrofina coriônica equina (eCG) tem sido considerado uma potencial ferramenta nos protocolos de estimulação e superovulação para melhorarem o desempenho reprodutivo dos rebanhos. Este fato levou a hipótese de que o tratamento com eCG altera as vias de sinalização intracelular no corpo lúteo (CL) formado. Para testá-la, 18 vacas mestiças de Nelore (Bos indicus) foram divididas em três grupos: controle, estimulado e superovulado. O protocolo de sincronização da ovulação com o uso do dispositivo de P4 foi descrito anteriormente (FÁTIMA et al., 2013). O grupo estimulado recebeu 400 UI de eCG no dia da remoção do dispositivo de P4 e o superovulado recebeu 2000 UI de eCG 4 dias antes. Os animais dos grupos controle e estimulado receberam GnRH no dia 10, enquanto os animais superovulados receberam no dia 8. No sétimo dia após após a administração do GnRH, todos os animais foram abatidos e os CL foram coletados. Foi realizada análise de microarranjo, a partir da qual foram eleitos genes envolvidos na sinalização da esteroidogênese (ADM, MMP9, NOS2), da ativação das metaloproteinases da matriz e do receptor ativado de protease que regula a homeostase e inflamação (PRSS2, PLAU) e da angiogênese (ANG e ANGPT1) e validados por qPCR, western blotting e imuno-histoquímica. A expressão gênica e proteica do PRSS2 e MMP9 foi menor e as células luteínicas grandes e pequenas positivas apresentaram marcação menos intensa nos grupos estimulado e superovulado (P <0,05). A expressão proteica da ANG foi maior no estimulado (P=0,01) e superovulado (P=0,03) e da proteína ANGPT1 foi maior no estimulado (P=0,008). O número de células luteínicas grandes e pequenas positivas para ANG e ANGPT1 foram maiores nos grupos tratados (P <0,05). No estimulado, houve correlação negativa entre os níveis de progesterona e o MMP9 (r = -0,66 e P = 0,03) e com a proteína do PRSS2 (r = -0,63 e P = 0,04). No entanto, houve correlação positiva com a proteína ANG (r = 0,69 e P = 0,03). No superovulado, houve correlação positiva entre a ANG e ANGPT1 (r = 0,96 e P = 0,001). Não houve diferença na expressão de ADM, NOS2 e PLAU nos grupos tratados em relação ao controle. Em resumo, os resultados obtidos são indicativos de que a eCG altera a expressão relativa de genes e proteínas envolvidas nas vias de sinalização de inflamação e a modelação da membrana celular com uma diminuição na expressão do MMP9 e da PRSS2 e na via da angiogênese com maior expressão de ANG em ambos os tratamentos e ANGPT1 em vacas estimuladas. / The use of equine chorionic gonadotropin (eCG) have been considered a potential tool in stimulation and superovulation protocols to improve the reproductive performance of the herd. This fact led to the hypothesis that eCG treatment alters the intracellular signaling pathways in the formed CL. To test that, 18 crossbred Nellore (Bos indicus) cows were divided into three groups: control, stimulated and superovulated. The synchronization protocol with the use of P4 device was previously described (FÁTIMA et al., 2013). The stimulated group received 400 IU eCG at the P4 device removal and superovulated received 2000 IU eCG 4 days before it. Both control and stimulated animals received GnRH on day 10, while superovulated ones received it on day 8. On the seventh day after GnRH administration, CL were collected by slaughter. Microarray analysis was preformed, from which were selected genes involved in the signaling of steroidogenesis (ADM, MMP9, NOS2), activation of matrix metalloproteinases and protease activated receptor that regulates homeostasis and inflammation (PRSS2, PLAU), and angiogenesis (ANG and ANGPT1). They were evaluated by qPCR, western blot and immunohistochemistry. The gene and protein expression of MMP9 and PRSS2 decreased and large and small luteal cells showed weaker staining in stimulated and superovulated groups related to the control group (P <0.05). ANG protein expression was higher on superovulated (P=0.01) and stimulated (P=0.03) and ANGPT1 protein was higher only in stimulated (P=0.008). The number of positive large and small luteal cells for ANG and ANGPT1 were higher in treated groups (P<0.05). In stimulated, there were a negative correlation between progesterone levels and MMP9 (r = 0.03 and P = -0.66) and the PRSS2 protein expression (r = 0.04 and P = -0.63). However, there were a positive correlation with ANG protein expression (r = 0.69 and P = 0.03). In superovulated, there were a positive correlation between ANG and ANGPT1 (r = 0.96 and P = 0.001) and PRSS2 protein expression was negatively correlated with the ANG protein (r = 0.04 and P = -0.96). There was no difference in ADM, NOS2 and PLAU expression in treated groups compared to control. In summary, these findings indicate that eCG alters the relative expression of genes and proteins involved in inflammation and cell modeling signaling pathways by decreasing MMP9 and PRSS2 expression, and on angiogenesis pathway, increasing ANG expression in both stimulated and superovulated animals and ANGPT1 in stimulated cows.

A dinâmica folicular, bem como a preparação do endométrio para a gestação, é dependente do estabelecimento de vascularização adequada. Alguns estudos apontam para a importância do tratamento com eCG após o emprego de protocolos de IATF, de forma a aumentar as taxas de ovulação e prenhez, e para a uma possível propriedade angiogênica, influenciando o fluxo sanguíneo e a vascularização. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência do eCG na espessura e área do endométrio e miométrio, calibre e área da artéria uterina do corno ipsilateral e também na densidade vascular do endométrio e miométrio de vacas submetidas a tratamentos de sincronização (grupo controle), estimulação do folículo dominante e superovulação. Para tal, foram utilizadas 16 vacas mestiças de Nelore ciclando com escore corporal entre 2 e 3 que foram divididas em 3 grupos de acordo com tratamento hormonal: o grupo controle foi submetido apenas ao protocolo de sincronização da ovulação (n=5), o grupo estimulado recebeu 400 UI de eCG no dia 4 após início do protocolo (n=6) e o grupo superovulado recebeu 2000UI de eCG no dia 8 após início do tratamento (n=5). No dia 5 após a ovulação (p.o) foram realizados exames ultrasonográficos para mensuração do miométrio e endométrio dos cornos uterinos, bem como para análise do calibre da artéria uterina. Os animais foram abatidos, os úteros coletados no dia 6 p.o. e imediatamente fixados em paraformaldeido a 4%. Para análise da densidade vascular, foi realizada imunohistoquímica para o KDR com o intuito de marcação das células endoteliais e contagem dos vasos por estereologia. As espessuras e áreas, tanto do miométrio quanto do endométrio, não foram influenciadas pelos tratamentos. A artéria uterina nos animais superovulados apresentou maior calibre do que nos animais do grupo controle (p< 0,05). A densidade vascular do endométrio nos animais estimulados foi menor quando comparada à dos animais do grupo controle (p<0,05), e no grupo superovulado, a densidade vascular apresentou-se diminuída (p<0,05) no miométrio. Os resultados obtidos sugerem que o aumento de vascularização do endométrio após tratamentos com ECG, relatado em outros trabalhos, seja provavelmente influenciado pelo concepto e não exclusivamente pelo tratamento. Além disso, a influência do eCG no útero pode ser dependente tanto da dose quanto do estágio do ciclo estral. / Follicle dynamic, as well as the uterus preparation for gestation, is dependent of an adequate vascularization establishment. Currently, many studies point towards the importance of eCG treatment following fixed-time artificial insemination (FTAI), in a manner to improve ovulation and gestational rates. Moreover, eCG have been implicated in angiogenesis, leading to important changes in uterine blood flow and vascularization. Thus, the present study was designed to investigate the influence of eCG on the endometrial and myometrial thickness and area; on the caliber and area of the uterine artery of the ipsilateral horn; and, on endometrial and myometrial uterine vascular density of cows submitted to sincronization (control group), stimulation (stimulated group), and superovulatory (superovulated group) treatments. For that, we used 16 cows with body score between 2 and 3, randomly distributed into the 3 above described groups: the cows of the control group (n = 5) did not receive eCG, while the cows of the stimulated group (n = 6) and superovulated group 3 (n = 5) received, respectively, 400 UI and 2000 UI of eCG at days 4 and 8 after the protocol beginning. For endometrial and myometrial measurements, as well as for uterine artery caliber and area analysis, ultrasonographic evaluations were done at day 5 after ovulation. At day 6, the animals were slaughtered, the uterus were harvested and fixed in 4% paraformaldehyde. In order to analyze the vascular density, immunohistochemistry for KDR detection and blood vessels counting by stereology were performed. In all studied groups, treatments did not influence either uterine wall thickness or area. In the superovulated animals, the uterine artery presented higher caliber than in the control ones (P<0.05). Endometrial vascular density of stimulated animals in the ipsilateral uterine horn was lower when compared to that of the control (P<0.05),and in the superovulated, vascular density was lower in the myometrium (P<0.05). These results suggest that the endometrial vascularization increase following eCG treatment, described by other groups, is probably influenced by the concept, not only by the treatment. Moreover, the influence of eCG in the uterus could be dependent of both the hormonal dosis and the estrous cycle phase.

Três experimentos foram realizados para testar a hipótese de que a resposta superestimulatória de doadoras Nelore (Bos indicus) com tratamentos iniciados próximo à ovulação durante a primeira onda de crescimento folicular seria maior ou comparável àquela decorrente de tratamentos convencionais. Os animais foram aleatoriamente alocados em três grupos. As doadoras dos Grupos 1 - Onda 1 s/P4 e 2 - Onda 1 c/P4 foram superestimuladas na primeira onda de crescimento folicular, e as do Grupo 3 - SincBE+P4/P4 quatro dias após a sincronização da emergência folicular com estradiol e progesterona. Os animais receberam dispositivo intravaginal de Progesterona (CIDR) associado a 50mg de Progesterona e 2,5mg de Benzoato de Estradiol (IM) no Dia 0. Os animais dos Grupos 1 e 2 receberam PGF2&alpha; no Dia 5 e 12,5mg Armour de LH (Lutropin) 24 horas após a remoção do CIDR (Dia 9), e no Dia 11 iniciou-se o tratamento superovulatório. As doadoras do Grupo 2 receberam um novo CIDR juntamente com a primeira dose de FSH (Dia 11). Todos os animais foram superestimulados com 133mg NIH-FSH-P1 de Folltropin diluídos em 10ml, em duas aplicações diárias de 1ml, por cinco dias. No último dia de tratamento, junto com o FSH foram aplicadas doses luteolíticas de PGF2&alpha; nos Grupos 2 e 3 o CIDR foi removido na ultima aplicação. Todas as doadoras receberam 25mg de LH 24 horas após a ultima dose de FSH e foram inseminadas 12 e 24 horas após o LH. Os embriões foram coletados e avaliados pelo mesmo veterinário sete dias após a inseminação. No primeiro experimento, as quantidades de embriões transferíveis não foi significativamente diferente entre os grupos 2 e 3 (8,0 ± 1,8 x 6,6 ± 2,0), e ambas foram maiores que as do 1 (0,2 ± 0,2; P<0,05). Como não houve diferença entre os Grupos 2 e 3 nos parâmetros analisados, o Grupo 3 foi excluído dos outros dois experimentos. No segundo experimento, as doadoras receberam os mesmos tratamentos dos Grupos 1 e 2, mas foram abatidas 12 horas após receberem 25mg de LH (Dia 16) e tiveram seus ovários removidos e levados para o laboratório, para classificação. Os oócitos foram aspirados e avaliados quanto à maturação pela expansão do COC. Os animais que não receberam dispositivo de P4 durante o tratamento superovulatório apresentaram maior número de oócitos não maturados (6,4 ± 2,7 x 1,2 ± 0,9; P< 0,05). O terceiro experimento foi semelhante ao segundo, com a diferença de que os animais foram inseminados 12 horas após o tratamento com 25mg de LH, e tiveram as estruturas coletadas 7 dias após a IA. Os resultados desse experimento confirmaram os do primeiro, no qual animais sem suplementação exógena de P4 durante o tratamento superovulatório apresentaram menor número de embriões transferíveis que o grupo com P4 (0,0 ± 0,0 x 3,9 ± 1,1; P<0,05). Os resultados obtidos retificam a hipótese, demonstrando que a superovulação durante a primeira onda de crescimento folicular em novilhas Nelore é eficiente somente com suplementação exógena de P4 / Three experiments were design to test the hypothesis that superovulatory (SPO) response of Nelore (Bos indicus) donors to treatments administered during the first follicular wave, initiated at the expected time of ovulation, will elicited a higher or a comparable response to traditional protocols. In the first experiment, cows were randomly allocated into 1 of 3 treatment groups. Cows in Group Wave 1 without P4 e Group Wave 1 with P4 were superstimulated during the first follicular wave and cows in the Control Group were superstimulated after synchronized follicular wave emergence using estradiol and progesterone. All cows received a CIDR device and an injection of 50mg of P4 and 2.5mg EB on Day 0. Cows in Groups Wave 1 with P4 and Wave 1 without P4 were also treated with PGF2&alpha; on Day 5 and 12,5mg Armour of pLH (Lutropin) 24 h after CIDR removal (Day 9), to synchronize ovulation. The SPO treatments were initiated on Day 11; donor cows in Group Wave 1 with P4 also received a new CIDR device at the time of the first FSH injection. All donors in three groups were superstimulated with a total dose of 133mg NIH-FSH-P1 of Folltropin-V, divided into twice daily injections of the same dosage (13,3mg diluted in 1ml) over 5 days. On the last day of FSH treatment, all animals received PGF2&alpha; after each FSH injection and cows in Group Wave 1 with P4 and Control Group had their CIDR removed at the time of the last FSH injection. All cows received 25 mg of pLH 24h after the last FSH treatment and were AI 12 and 24h later. Ova/embryo collection and evaluation was done 7d after, aIl by the same veterinarian. Results indicate that there was no difference in the numbers of transferable embryos in CIDR treated donor cows when SPO treatments were initiated at the time of emergence of either the first follicular wave Group Wave 1 with P4 (8.0 ± 1.8) or following synchronization of follicular wave emergence with BE + P4, control Group (6.6 ± 2.0), but both were greater than when SPO treatments were initiated at the first follicular wave without the use of a CIDR device, Wave 1 without P4 (0.2 ± 0.2; P<0,05). Since there were no differences between Groups Wave 1 with P4 and control on all the end points, this group was dropped from the others experiments. A second experiment was performed in order to evaluate the quality of oocyte recovered after animals were treated under the same protocol of Groups Wave 1. The SPO treatments were the same described previously, however 12h after the injection of 25mg of pLH animals were slaughtered and their ovaries were taken to an IVF lab. Follicles were aspirated and the oocyte was evaluated and those with an expanded COC were considered mature. Animals in Group Wave 1 without P4 showed a greater (P<0,05) number of immature oocyte (6.4 ± 2.7) than Group Wave 1 with P4 (1.2 ± 0.9). The third experiment was performed to confirm the results of the first experiment. The treatments were similar as the second experiment, however, animals were AI 12 and 24h after the 25mg of pLH and had ova/embryos collection and evaluation 7 d after by the same veterinarian. Results of this experiment confirmed the first experiment presenting a greater (P<0,05) number of transferable embryos in Group Wave 1 with P4 (3.9 ± 1,1) when compared to Group Wave 1 without P4 (0.0 ± 0.0). The results did not support the hypothesis, showing that exogenous P4 is necessary in order to superovulate Nelore during the first follicular wave