Das Cyanobakterium Synechococcus elongatus PCC 7942 besitzt eine circadiane Uhr, die aus nur drei Proteinen besteht: KaiA, KaiB und KaiC. Durch 24stündige Phosphorylierungs- und ATPase-Zyklen des KaiC wird u. a. die globale Genaktivität gesteuert. Der Anteil circadian regulierter Gene sowie die Zahl und Organisation der kai-Gene scheinen in Cyanobakterien stark zu variieren. Um die Komponenten eines potenziell komplexeren Kai-Systems zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit Synechocystis sp. PCC 6803 als Modell ausgewählt. In dessen Genom werden ein KaiA- sowie jeweils drei divergierte KaiB- und KaiC-Proteine kodiert. Durch in vitro Studien konnte die Aktivität von KaiC1 und KaiC3 erstmals charakterisiert werden: KaiC1 zeigte eine KaiA-abhängige Kinase-Aktivität und bildet mit KaiA und KaiB1 vermutlich einen „Standard-Oszillator“. KaiC3 wies die typischen Kinase-, ATP-Synthase- und ATPase-Aktivitäten des KaiC aus Synechococcus auf. Deren Ausprägung erschien jedoch modifiziert. Ferner wurde die zeitliche und räumliche intrazelluläre Verteilung des KaiA sowie der KaiC-Proteine aufgeklärt. Die Kai-Proteine verhielten sich insgesamt abweichend von den Homologen aus Synechococcus, was das Fehlen einer circadianen Rhythmik unter den gewählten Wachstumsbedingungen erklärt. Angesichts kontroverser Diskussionen über die molekularen Details der Assemblierung von KaiC und KaiB aus Synechococcus wurde in einem ergänzenden Projekt demonstriert, dass die gesteigerte Phosphorylierung des KaiC bei 4°C zur Bildung stabiler KaiC-KaiB-Komplexe führt. Die dabei etablierte Methode erlaubt Untersuchungen der KaiC-KaiB-Interaktion unter Verwendung der Wildtyp-Proteine. / The cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 harbors a circadian clock consisting of only three proteins: KaiA, KaiB and KaiC. 24hour phosphorylation and ATPase cycles of KaiC control global gene activity. The number of circadian regulated genes as well as the number and organization of kai-genes seem to vary strongly among cyanobacteria. To analyze the components of a probably more complex Kai-system, Synechocystis sp. PCC 6803 was chosen as a model in the present study. Its genome encodes one KaiA- and each three KaiB and KaiC proteins. The activity of KaiC1 and KaiC3 was – for the first time - characterized by in vitro studies: KaiC1 displayed a KaiA-dependent kinase activity and builds a ,standard oscillator‘ together with KaiA and KaiB1. KaiC3 displayed the typical kinase, ATP synthase and ATPase activities of KaiC from Synechococcus. However, the characteristics of the activities appeared to be modified. Moreover, the temporal and spatial intracellular distribution of KaiA and the KaiC proteins was elucidated. Altogether, the Kai proteins performed different from their Synechococcus homologs, explaining the lack of circadian rhythms under the chosen growth conditions. In view of the controversial discussions about the assembly of KaiC and KaiB from Synechococcus, an additional project was set up to demonstrate that increased auto-phosphorylation of KaiC at 4 °C leads to the formation of stable KaiC-KaiB-complexes. In this context, a protocol was established that allows to analyse KaiC-KaiB interactions using wild-type proteins.

Cyanobakterien sind einzellige, phototrophe Mikroorganismen, die aufgrund ihrer Fähigkeit, Sonnenenergie und Kohlenstoffdioxid für das Zellwachstum zu nutzen, ideale Modellorganismen für ein besseres Verständnis des phototrophen Stoffwechsels darstellen. Sie werden auch zunehmend als potenzieller Wirtsorganismus für die Synthese von wertvollen Chemikalien und verschiedenen Biokraftstoffen wahrgenommen. Um diese Vorteile in vollem Umfang zu nutzen, bietet die genomskalige Rekonstruktion von Mikroorganismen ein weitgehendes Verständnis über die metabolischen Umwandlungen, die während des phototrophen Wachstums stattfinden. In dieser Arbeit wurden detaillierte Rekonstruktionen des metabolischen Netzwerkes der Cyanobakterien Synechocystis sp. PCC 6803 (Synechocystis) und Synechococcus elongatus PCC 7942 erstellt und analysiert. Darüber hinaus wurden beim Netzwerk von Synechocystis unklare Reaktionsschritte experimentell validiert und die funktionellen Konsequenzen von abweichenden Stoffwechseltopologien untersucht. Dabei umfasst das Modell neuartige Ergebnisse in Bezug auf den cyanobakteriellen TCA-Zyklus, einen angeblich vorhandenen Glyoxylatzyklus und die Rolle der Photorespiration beim Zellwachstum, die mithilfe der Flussbilanzanalyse (FBA) systematisch auch in Bezug auf den täglichen Hell-Dunkel-Zyklus des cyanobakteriellen Stoffwechsels gewonnen wurden. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit liegt im Zugewinn des allgemeinen Verständnisses über die genomische Diversität innerhalb unterschiedlicher Cyanobakterienstämme und speziell innerhalb des cyanobakteriellen Stoffwechsels. Dazu wurden die Genome mehrerer phototropher Cyanobaktierenstämme untereinander verglichen und besonders Unterschiede und Gemeinsamkeiten auf Ebene des Stoffwechsels hervorgehoben. Zum Abschluss dieser Arbeit wurde unter Zuhilfenahme der FBA die Synthese von neun unterschiedlichen Biokraftstoffen im metabolischen Netzwerk von Synechocystis, analysiert. / Cyanobacteria are unicellular, phototrophic microorganisms. Owing to their capability to utilize solar energy and atmospheric carbon dioxide for growth, they represent ideal model organisms to better understand phototrophic metabolism. Moreover they are gaining increasing attention as a potential host organism for the synthesis of valuable chemicals and various biofuels. To fully harness this potential of cyanobacteria necessitates an in-depth understanding of the metabolic interconversions that take place during phototrophic growth, such as that provided by genome-scale reconstructions of microbial organisms. In this work, detailed metabolic network of two cyanobacteria, Synechocystis sp. PCC 6803 (Synechocystis) and Synechococcus elongatus PCC 7942, were reconstructed and analyzed. In addition uncertain reaction steps in the network of Synechocystis were experimentally validated and the functional consequences of aberrant metabolic topologies were examined. The model integrates novel results regarding the cyanobacterial TCA cycle, an alleged glyoxylate shunt, and the role of photorespiration in cellular growth, which were systematically obtained studying the diurnal light/dark cycles of cyanobacterial metabolism using flux balance analysis (FBA). Another aspect of this work focuses on gaining general understanding of the genomic diversity within different cyanobacterial species and specifically within cyanobacterial metabolism. For this purpose, the genomes of several phototrophic cyanobacterial strains were compared and in particular differences and similarities at the level of metabolism were highlighted. In conclusion I reflected on the biotechnological relevance of metabolic network reconstruction by analyzing the synthesis of nine different biofuels in the metabolic network of Synechocystis using FBA.

Apparues il y a environ trois milliards d'années, les cyanobactéries ont façonné notre planète, en produisant l’atmosphère oxygénique. De nos jours, les cyanobactéries sont les organismes photosynthétiques les plus abondants dans notre environnement, elles assurent environ 30 à 40% de la production d'O2, et de la consommation du CO2 par les océans et constituent le premier maillon de la chaîne alimentaire. A part la photosynthèse, leur métabolisme est encore très mal connu. Ainsi, pour mieux comprendre le métabolisme cyanobactérien et proposer des stratégies de reprogrammation, il est primordial de développer des méthodes analytiques permettant l’étude globale de leur métabolisme en réponse à des variations de conditions environnementales et de stress. La cyanobactérie modèle Synechocystis PCC6803 convient parfaitement à ce type d’analyse. En effet, Synechocystis est un unicellulaire, hétérotrophe facultative capable de se développer en eau douce ou saumâtre et à un pH alcalin. Synechocystis possède un petit génome d’environ 4.0 Mb entièrement séquencé et facilement manipulable grâce aux outils développés au laboratoire. Son génome prédit l'existence d'un métabolisme carboné complexe mais encore peu étudié. Mon travail de thèse est centré sur cette analyse par la combinaison de deux approches, la génomique fonctionnelle et la métabolomique. Durant ma thèse en collaboration avec le LEMM dirigé par Christophe Junot iBiTec-S/SPI, j’ai développé un protocole d’extraction des métabolites de Synechocystis, ainsi qu’une méthode d’analyse métabolomique par couplage de la chromatographie liquide à la spectrométrie de masse LTQ-Orbitrap à haute résolution. L’application de cette nouvelle méthode analytique m’a permis d’étudier l’influence de la lumière et du glucose sur le métabolisme de Synechocystis. Ainsi, j’ai montré que Synechocystis cultivée en présence du glucose reprogramme fortement son métabolisme. Parmi les résultats très intéressants, j’ai montré que le glucose engendre un stress oxydant. Chez tous les organismes, une forte activité du métabolisme carboné entraîne la production de métabolites toxiques tels que le méthyglyoxal (MG). Le MG modifie irréversiblement de nombreuses bio-molécules. Dans le cadre de ma thèse, j’ai commencé à m’intéresser à l'effet du MG sur la physiologie et le métabolisme de Synechocystis. J'ai construit 25 mutants KO pour les gènes de la glycolyse et du métabolisme du glycérol permettant de moduler la concentration intracellulaire de MG et également les gènes impliqués dans les voies de détoxication du MG dont celle dépendante de la synthèse du GSH (la voie des glyoxalases). J’ai pu montrer que les gènes responsables de la synthèse du GSH sont essentiels à la viabilité cellulaire. Je suis parvenu toutefois à obtenir un mutant déplété de gshB et ne produisant plus de GSH à un niveau détectable. En faisant une analyse métabolomique approfondie, j’ai mis en évidence pour la première fois que Synechocystis était capable produire deux tripeptides non-thiolés analogues structuraux du GSH; l’acide ophthalmique et l’acide norophthalmique identifiés jusqu’à présent uniquement chez les mammifères. La comparaison des métabolomes de culture de souches sauvage, ou dépletées en gshA, gshB ou ggt, a permis de montré que ces analogues sont synthétisés par les mêmes enzymes que le GSH à savoir GshA et GshB. Par ailleurs, une autre molécule anti-oxydante dont la synthèse est connue chez quelques champignons et qui s’accumule chez l’Homme par l’apport alimentaire a également été observée. / Cyanobacteria are fascinating microorganisms. They are among the oldest life forms, regarded as the progenitors of the oxygenic photosynthesis and plant chloroplast. Furthermore, cyanobacteria have evolved as the largest and most diverse groups of bacteria in colonizing most marine and fresh waters, as well as soils. An important reason for the hardness of cyanobacteria is their successful combination of effective metabolic pathways driven by their efficient photosynthesis that uses nature's most abundant resources, solar energy, water and CO2, to produce a large part of the Planet's oxygenic atmosphere and organic assimilates for the food chain. Hence, cyanobacteria are receiving a growing attention because of their potential for the carbon-neutral production of biofuels and bioplastics. To better understand cyanobacteria and turn their biotechnological potentials into an industrial reality, we need to develop robust protocols for global analysis of their metabolism and its responses to environmental stresses. The model cyanobacterium Synechocystis PCC6803 is well suited for this purpose. Synechocystis is a basic organism, i.e. unicellular, which grows well (i) in fresh- and marine-waters; (ii) in the presence of glucose that can compensate for the absence of light; and (iii) at high pH that prevents microbial contaminations. Furthermore, Synechocystis harbors a small sequenced genome (about 4.0 Mb), which can be easily manipulated. In the present work, we developed a robust protocol for metabolome analyses of Synechocystis, using liquid chromatography (LC) for metabolite separation, coupled to a LTQ-Orbitrap mass spectrometer that provides high sensitivity and resolution, accurate mass measurements, and structural informations with MS/MS or sequential MSn experiments that facilitate metabolite identification. Consequently, we applied the PFPP-LC/MS method to analyze the metabolome of Synechocystis growing under various conditions of light and glucose, which strongly influence cell growth. We found that glucose increases glucose storage and catabolism, while it decreases the Calvin-Benson cycle that consumes photosynthetic electrons for CO2 assimilation. Depending on light and glucose availabilities, this global metabolic reprogramming can generate an oxidative stress, likely through the recombination of the glucose-spared electrons with the photosynthetic oxygen thereby producing toxic reactive oxygen species. Furthermore, we studied the metabolism of an endogenous toxic the méthylglyoxal and its main catabolic pathway going through the glyoxalases system glutathione dependent.

Le développement d'organismes photosynthétiques (piégeant le C02 en préservant l'eau douce et les terres cultivables sans ajout d'engrais) capables d'utiliser l'énergie solaire pour produire du dihydrogène (H2) passe par une meilleure compréhension du rôle de l'hydrogénase dans le métabolisme cyanobactérien. Le Laboratoire de Biologie et Biotechnologie des Cyanobatéries où j'ai travaillé durant ma thèse utilise une approche de "Biologie Intégrative" pour analyser le métabolisme qui conduit à la photo-production d’H2 chez la cyanobactérie modèle Synechocystis sp. PCC6803. Mon travail s'est focalisé sur l’analyse des réseaux de régulation amenant à la production d'H2 par l’hydrogénase bidirectionnelle à centre Ni-Fe (composée de 5 sous-unités) codée par l’opéron hox. Lorsque j’ai débuté ce travail, 2 activateurs de l’opéron hox avaient été identifiés: AbrB1 et LexA. Un article dont je suis co-premier auteur est paru (Dutheil et al. 2012 J Bact.), il décrit l'identification par l'utilisation de diverses approches d'un nouveau facteur de transcription de l'opéron hox: AbrB2 (homologue d'AbrB1). J'ai ainsi montré que l'expression de l’opéron hox était régulée négativement par AbrB2 en utilisant des fusions transcriptionnelles au gène rapporteur cat (introduites dans la souche sauvage ou dépourvues d'AbrB2) ainsi que des expériences de qRT-PCR. Par la technique de retard sur gel, nous avons confirmé une interaction directe entre AbrB2 et la région promotrice de l’opéron hox. En collaboration avec deux laboratoires du CEA, nous avons montré qu'un mutant dépourvu d’AbrB2 possède une activité hydrogénase augmentée, confirmant ainsi qu'AbrB2 est un régulateur négatif de la production d'H2.Dans un deuxième temps et en collaboration avec deux post-doc du laboratoire, nous avons mis en évidence le rôle de la cystéine unique d'AbrB2 dans le contrôle redox de son activité de régulation transcriptionnelle.Par la technique du retard sur gel,j’ai montré que cette cystéine n’est pas cruciale pour la fixation d'AbrB2 sur le promoteur hox, mais que par contre, la modification redox de celle-ci l’affecte de manière drastique. Dans le cadre de collaborations, nous avons identifié la modification post-traductionnelle qui peut avoir lieu sur la cysteine d'AbrB2 et il s’agit de la première fois, qu’un tel mécanisme de régulation est identifié pour cette famille de régulateur et chez les cyanobactéries. J’ai construit une souche portant l'allèle muté abrB2 Cys>Ser sur le chromosome et exprimé par le promoteur sauvage d’abrB2. J’ai montré grâce à cette construction et en utilisant diverses techniques (activité hydrogénase, qRT-PCR, Western blot et transcriptome) que la cystéine d'AbrB2 joue un rôle dans son activité de régulation qui est 60% moins bonne sur les 529 gènes cibles (directes ou indirectes) du régulateur muté. L’effet est également visible sur l’activité hydrogénase. Ce résultat a été complété par des tests de surexpression thermoinduite d’AbrB2 qui montrent que la mutation C34S affecte la stabilité de la protéine qui ne s’accumule pas autant que la sauvage dans les même conditions et dont la surexpression est létale. Un manuscrit dont je suis copremier auteur et décrivant ces résultats est en cours de finalisation et sera prochainement soumis à l’Intern. Journ. of Hydrogen Energy.L’ensemble de ces travaux permet de mieux comprendre les mécanismes biologiques liés à l’expression de l’hydrogénase bidirectionnelle et vont dans le sens d’un rôle important de celle-ci dans la détoxification des stress redox. La détermination des relations entre les différents régulateurs de l’hydrogénase et les possibles modifications post-traductionnelles de chacun de ces facteurs que j’ai mises en évidence traduisent une enzyme à la régulation complexe. Ces nouvelles connaissances permettent d’éclairer sous un angle nouveau la photoproduction d’H2 par les cyanobactéries et permettront peut-être d’élaborer des stratégies de production d’H2 efficace. / Developing photosynthetic organism (trapping CO2 while preserving fresh water and arable soils without adding fertilizers) able to use Sun light to produce dihydrogen (H2) is depending on a better understanding of the role of hydrogenase in the cyanobacterial metabolism. The Laboratoire de Biologie et Biotechnologie des Cyanobactéries (LBBC) where I worked during my thesis uses « Integrative Biology » approach to analyze the metabolism leading to H2 photoproduction by the model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803. My work focused on analyzing the regulation network leading to H2 production by the bidirectionnal hydrogenase with Ni-Fe cluster (composed of 5 subunits) encoded by hox operon. When I started this work, two transcriptionnal activators were identified : AbrB1 and LexA. An article, of which I’m sharing first author position, is published (Dutheil et al. 2012 J Bact.), it describes the identification by different approachs of a new transcriptionnal factor of hox operon : AbrB2 (homologous to AbrB1). I showed that hox expression is negatively regulated by AbrB2 by using transcriptionnal fusion to cat reporter gene (introduced in the wild type background or the AbrB2-deleted one) and qRT-PCR experiments. By the electrophoretic mobility shift assay (EMSA) method, we confirmed a direct interaction between AbrB2 and the promoter region of hox operon. Collaborating with two CEA laboratories, we showed that a mutant lacking AbrB2 harbours an increased hydrogenase activity, validating that AbrB2 is a negative regulator of H2 production.In a second time of my thesis and colaborating with two post-doc of the laboratory, we evidenced the role of the unique cysteine of AbrB2 in redox-controlling the transcriptionnal regulator activity of the protein.Using the EMSA method, I showed that the cysteine is not crucial for AbrB2 fixing on hox promoter, but also that the redox modification occuring on this residue inhibits this same binding activity. Collaborating with other labs, we identified the post-translational modifications that may occur on AbrB2 cysteine and it is the first time that such a regulating mechanism is identified for this family of regulators and in cyanobacteria. I constructed a strand harbouring the abrB2C34S mutant allele on the chromosome and expressed by the abrB2 natural promoter. I showed with this construction and using diverse methods (hydrogenase activity, qRT-PCR, Western blot and transcriptome) that AbrB2 cysteine plays a role in its regulating activity : regulating activity is 60% less efficient towards the 529 target genes (either direct and indirect) of the mutated regulator. The effect is also seen on hydrogenase activity and hox genes. This result was completed by thermoinduced overexpression assays that show that C34S mutation of AbrB2 alters protein stability : the mutated protein accumulates less than wild type allele in the same conditions, which is lethal. A manuscript, of which I’m sharing first author position, and describing those results is being finalised and will be submitted soon to the IJHE (International Journal of Hydrogen Energy).Altogether, my results allow a better understanding of the biological mechanisms linked to bidirectionnal hydrogenase expression and agree with a possible role for hydrogenase in detoxifying redox stresses. The determination of the relationships between the different regulators of hydrogenase, and their possible post-translational modifications that I revealed, highlight an enzyme with complex regulation. This new knowledge brings an original outlook on hydrogen photoproduction by cyanobacteria and shall allow elaboration of efficient H2 production strategies.

The aim of this diploma thesis was to subject selected cyanobacterial strains to adaptive evolution and subsequently investigate the properties of the resulting adapted strains, especially their changes related to polyhydroxyalkanoates (PHA) accumulation. The theoretical part of the work describes in more detail the issue of cyanobacteria, PHA and their interconnection in the field of evolutionary engineering. Cyanobacterial strains Synechocystis sp 6803 and. Synechocystis salina CCALA 192 were used for evolutionary experiments. Selection pressures of hydrogen peroxide and copper. were applied to selected representatives. The resulting cultures and their ability to accumulate PHA were subsequently assessed by gas chromatography. Both of these selection pressures proved to be unsuitable, as strong growth inhibition was observed after their application to cultures, which did not allow the application of evolutionary engineering methods. In the second half of the experimental part, the provided adapted strains to 6% NaCl were monitored. Adaptation has been shown to have a positive effect on microorganisms, as they have a higher biomass content, better stress resistance and a slight increase in PHA accumulation.

The diploma thesis is confused to verify the applicability of selected physicochemical and spectroscopic methods for characterization of cyanobacteria, with special emphasis on possibilities of qualitative and quantitative analysis of polyhydroxyalkanoates (specifically polyhydroxybutyrate (PHB)) accumulated in cyanobacterial cells. The sample basis of the work was formed by cultures of cyanobacterial strains of Synechocystis sp. PCC 6803 and Synechocystis salina CCALA 192. The cultures were were cultivated in several ways to cover the widest possible range of physiological conditions and PHB contents, in particular using an autotrophic way of cultivation on shakers and multicultural culture method in a basic culture medium,and in media enriched with 2% salt (NaCl ) as well as mixotrophic culture media with different types of the carbon substrate. After few weeks of cultivation, cyanobacterial cultures were obtained and complexly analyzed by following techniques- cell suspensions were analyzed by flow cytometry and UV-VIS spectrometry (transmission and diffusion transmission mode), dry cell biomass was characterised by gas chromatography to obtain a exact amount of PHB, and then FT-IR spectrometry and thermogravimetric analysis. The work aimed to assess whether any of these methods can be a quick and affordable alternative to the determination of PHB content to the most commonly used method of gas chromatography, but also to assess what additional information about the physiological state of cyanobacterial cells can provide test methods. The highest correlation on PHB content was determined for the parameters determined by infrared spectroscopy, in which specific peaks from the characteristic wavelengths for polyhydroxybutyrate were important. Weak correlations on PHB content were achieved in thermogravimetric analysis and cytometry, using the hydrophobic fluorescent probe BODIPY 439/503, which bound to lipophilic parts of cells. In addition to the determination of PHB, it was possible to determine pigments present in cyanobacteria (such as chlorophyll, phycocyanin and carotenoids) by flow cytometry and UV-VIS diffusion transmission spectrometry. In the end, results from all used techniques were compared by PCA analysis to determine the similarity of all analyzed samples.

La lumière est essentielle pour les organismes photosynthétiques qui convertissent l'énergie solaire en énergie chimique. Cependant, la lumière devient dangereuse lorsque l'énergie qui arrive aux centres réactionnels de l'appareil photosynthétique, est en excès par rapport à l’énergie consommée. Dans ce cas, la chaîne de transport d'électrons photosynthétiques se réduit et les espèces réactives de l'oxygène (ROS) sont accumulées, notamment au niveau des deux photosystèmes, PSI et PSII. Les cyanobactéries ont développé des mécanismes photoprotecteurs qui diminuent l'énergie transférée au PSII atténuant ainsi l'accumulation de ROS et les dommages cellulaires, comme l’extinction non-photochimique (NPQcya) induite par la lumière bleue-verte. La soluble Orange Caroténoïde Protéine (OCPo) est essentielle pour ce mécanisme de photoprotection. L'OCP agit comme un senseur de l’intensité lumineuse et un inducteur de la dissipation d'énergie des phycobilisomes (PBS), l'antenne extra-membranaire des cyanobactéries. L'OCP est la première protéine photo-active à caroténoïde connue comme senseur. Une forte lumière bleue-verte déclenche des changements structurels dans l'OCPo qui induisent une forme active, rouge (OCPr). Le domaine N-terminal de l’OCPr, en s’intercalant entre les trimères externes d’un des cylindres basaux du cœur du PBS, augmente la dissipation thermique de l'énergie au niveau de l'antenne. L'OCP possède aussi une autre fonction : l’extinction de l’oxygène singulet, qui protège les cellules du stress oxydatif. Pour récupérer pleinement la capacité de l’antenne en faible lumière, une deuxième protéine est nécessaire, la "Fluorescence Recovery Protein" (FRP), dont le rôle est de détacher l’OCPr des PBS et d’accélérer sa reconversion en OCPo inactive. Ce manuscrit est un état des lieux des connaissances et des dernières avancées sur le mécanisme de NPQ associé à l'OCP dans les cyanobactéries. / Photosynthetic organisms use light energy from the sun in order to perform photosynthesis and to convert solar energy into chemical energy. Absorbance of excess light energy beyond what can be consumed in photosynthesis is dangerous for these organisms. Reactive oxygen species (ROS) are formed at the reaction centers and collecting light antennas inducing photooxidative damage which can lead to cell death. In cyanobacteria, one of these photoprotective mechanisms consists to reduce the amount of energy arriving to the reaction centers by thermal dissipation of the excess absorbed energy. Energy dissipation is accompanied by a decrease of Photosystem II-related fluorescence emission called non-photochemical quenching (NPQ). The soluble Orange Carotenoid Protein (OCPo) is essential for this photoprotective mechanism. The OCP is the first photo-active protein with a carotenoid known as light intensity sensor and acts as energy quencher of the phycobilisome (PB), the extra-membrane antenna of cyanobacteria. Structural changes occur when the OCPo absorbs a strong blue-green light leading to a red active form (OCPr). The N-terminal domain of OCPr burrows into the two external trimers of the core basal APC cylinders of the PB and increases thermal energy dissipation at the level of antenna. The OCP has an additional function in photoprotection as oxygen singlet quencher protecting cells from oxidative stress. Under low light conditions, to recover the full antenna capacity, a second protein is needed, the "Fluorescence Recovery Protein" (FRP), whose role is to detach the OCPr from the PB and accelerate its conversion into an inactive OCPo. In this manuscript, I will review the knowledge about the OCP, since the discovery of the mechanism and its characterization to the latest advances on the OCP-related-NPQ mechanism in cyanobacteria.

In oxygenic phototrophs, the photosynthetic machinery is located in thylakoid membrane (TM), a specialized endogenous membrane system. How TM are synthesized remains however mostly unknown. The aim of this thesis was to clarify a link between the synthesis of chlorophyll (Chl)-binding proteins, the main protein component of TM, and the formation of TM system in the model cyanobacterium Synechocystis PCC 6803. During the project, the analysis of TM under various growth conditions and in Chl-deficient mutants has demonstrated that a sufficient amount of de novo produced Chl molecules is crucial for the TM biogenesis. Particularly, the synthesis of the photosystem II subunit CP47 and trimeric photosystem I appeared to be sensitive to a shortage in de novo made Chl molecules. Interestingly, a specialized ribosome-binding protein (Pam68) has been identified to facilitate the insertion of Chl molecules into CP47. The synthesis of Chl-proteins and the biogenesis of TM have been further explored in cells recovering from long-term nitrogen depletion. Using this approach, it was possible to identify a large structure in the cell cytosol, which is very likely the site of TM biogenesis, and to correlate the appearance of this structure with the restored biogenesis of Chl-binding proteins.

Today, mankind faces a new challenge in energetic terms: a new Industrial Revolution is imperative, already called by some as an Energetic Revolution. This corresponds to a conversion to clean, environmentally friendly and renewable energy sources. In this context, hydrogen arises as a valid alternative, since its combustion produces a considerable amount of energy and releases solely water as a by-product. In the present thesis, two model cyanobacteria, namely Synechocystis sp. strain PCC 6803 and Anabaena/Nostoc sp. strain PCC 7120, were used to examine the hydrogen metabolism. The efforts were focused on to understand the transcription regulation of the hox genes, encoding the structural elements of the bidirectional hydrogenase enzyme. Here, it is shown that such regulation is operated in a very distinct and intricate way, with different factors contributing to its delicate tuning. While in Synechocystis sp. strain PCC 6803 the hox genes were shown to be transcribed as a single operon, in Anabaena/Nostoc sp. strain PCC 7120 they were shown to be transcribed as two independent operons (possibly three). Two transcription factors, LexA and AbrB-like protein, were identified and further characterized in relation to the hydrogen metabolism. Furthermore, different environmental conditions were demonstrated to operate changes on the transcription of the bidirectional hydrogenase genes. In addition, functional studies of three open reading frames found within the hox operon of Synechocystis sp. strain PCC 6803 suggest that this may be a stress responsive operon. However, based on the gained knowledge, it is still not possible to connect the signal transduction pathways, from the environmental signal, through the response regulator, to the final regulation of the hox genes. Nevertheless, the crucial importance of studying the transcription regulation of the different players involved in the hydrogen metabolism is now established and a new era seems to be rising.

Oxidative stress is a natural consequence of photosynthetic oxygen evolution and redox enzyme processes. Trp oxidation to N-formylkynurenine (NFK) is a specific, reactive oxygen species (ROS)-mediated reaction. This thesis work describes the identification and functional characterization of NFK in oxygen evolving Photosystem II (PSII). Although proteomics studies have confirmed NFK modifications in many types of proteins, limited knowledge on the biochemical significance exists. In vitro studies in thylakoids and PSII membranes were used to establish a correlation between oxidative stress, NFK formation, and photoinhibition. The in vivo effect of preventing Trp oxidation to NFK was assessed by site-directed mutation in the cyanobacteria Synechocystis sp. PCC 6803. This work provides insight into the role of NFK in photosynthetic oxygen evolution and photoinhibition. Based on the current knowledge of NFK, ROS, and repair, a new model is described. In this modified model for photoinhibition and repair, NFK plays a role in signaling for turnover of damaged proteins. NFK may play a similar role in replacement of damaged proteins in other systems.