Orientador: Carlos Eduardo Steiner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T00:08:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cunha_KarinaSoares_M.pdf: 3290868 bytes, checksum: 62ac845d38c989b1515d635bf2bfa79b (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O Mosaico pigmentar tipo Ito é uma alteração cutânea frequente, caracterizada por hipopigmentação da pele que, na maioria dos casos, segue o padrão linhas de Blaschko, geralmente associada a anomalias extracutâneas, sobretudo anomalias do Sistema Nervoso Central (SNC). Sugere-se que esse padrão decorre da presença e migração de duas linhagens celulares no período embrionário, com diferente expressão de genes associados à pigmentação, que darão origem à epiderme e ao SNC no feto. Diversos tipos de mosaicismo foram associados ao quadro e acredita-se que os casos em que não houve tal detecção se devam à limitação das células analisadas. Devido à função, origem embrionária e migração celular, possivelmente o mosaicismo seria melhor identificado em melanócitos e queratinócitos, principalmente na presença de alterações no SNC, as alterações poderiam ter envolvimento com o prognóstico neurológico. Neste estudo foi realizada análise citogenética de linfócitos e fibroblastos de 15 indivíduos com mosaico pigmentar do tipo Ito. Os objetivos incluíram padronizar a cultura de células de melanócitos e queratinócitos, visando analisar o cariótipo desses indivíduos nesses tipos celulares. O estudo citogenético nesses tipos celulares, porém, não pode ser realizado devido à dificuldade de se obter metáfases adequadas para análise. Assim, foi desenvolvido protocolo de cultura e análise citogenética em queratinócitos, o qual funcionou adequadamente em indivíduos testes, porém sem resultado semelhante nos sujeitos de pesquisa. A preparação cromossômica a partir de melanócitos, por outro lado, não se mostrou adequada. Na análise de linfócitos e fibroblastos, foram encontradas alterações cromossômicas diferentes em quatro indivíduos (26% da casuística), presentes em ambos os tipos celulares. Não foram observadas divergências nas amostras a partir de pele hipo e normopigmentadas. Essas alterações incluíram um caso de t(X;21) regular, para o qual foram realizados estudos complementares de forma a aprimorar a investigação laboratorial, sendo análise por array-CGH, FISH e estudo de inativação de X. Um caso se tratou de trissomia 18 em mosaico, nesse indivíduo não foi possível a coleta de biópsia, porém foi realizado FISH interfásico em células da mucosa oral. Houve também um caso de r(22) em mosaico, o único que apresentou diferença na proporção de células alteradas em fibroblastos e linfócitos, possivelmente por maior instabilidade in vitro de cromossomos em anel em culturas de longa duração. O último caso alterado se refere a um cromossomo marcador, também em mosaico. Os resultados obtidos foram comparados com dados da literatura prévia. Assim, apenas um caso apresentou alteração cromossômica não em mosaico, representada por uma translocação X/autossomo regular, para a qual as técnicas de estudo utilizadas não detectaram justificativa para o padrão de mosaicismo observado clinicamente / Abstract: Pigmentary mosaicism of Ito type is a skin abnormality often characterized by hypopigmentation of the skin following, in most cases, the Blaschko lines, usually associated with extracutaneous abnormalities, especially abnormalities of the central nervous system (CNS). It is suggested that this pattern arises from the presence and migration of two cell lineages in the embryonic period, with different expression of genes associated with pigmentation, which will give rise to the epidermis and the CNS in the fetus. Several types of mosaicism have been associated with this disorder. In cases in which no mosaicismo was detected, it is believed that this may be secondary to the limitation of the cells analyzed. Due to the function and embryonic cell migration, in individuals with pigmentary mosaicism, a cytogenetic mosaicism possibly would be better identified in melanocytes and keratinocytes, especially in the presence of changes in the CNS. Besides, these changes could prognose the neurological outcome. This study comprehended cytogenetic analysis of lymphocytes and fibroblasts from 15 individuals with pigmentary mosaicism of Ito type. The targets included standardize the cell culture of melanocytes and keratinocytes in order to analyze the karyotype of these individuals in these cell types. The cytogenetic study in these cell types, however, was not possible due to difficulties in obtaining adequate metaphases for analysis. Given this difficulty, another cell type (fibroblasts) was studied. In the end, chromosomal abnormalities in lymphocytes and fibroblasts were identified in four individuals. These included one case of a balanced traslocation X/21, one case of trisomy 18 mosaicism, one case of a ring 22 mosaic and one marker chromosome, also in mosaic. Considering the results of cytogenetic lymphocytes and fibroblasts, additional studies were undertaken to enhance the laboratory investigation of these cases, including array-CGH, FISH and study of X inactivation. The results were compared with previous literature data. In conclusion, we developed protocol for culture and cytogenetic analysis in keratinocytes, which worked well on test subjects, but without similar results in study subjects. The chromosome preparation from melanocytes, however, was not adequate. There were no differences in samples from different area of skin. Only one case showed different proportion of cells altered in fibroblasts and lymphocytes, possibly due to instability of ring chromosomes in long duration cultures. Finally, only one case showed no chromosomal abnormality in mosaic, represented by a regular translocation X/autosome, for which the techniques used to study detected no explanation for the pattern of mosaicism observed clinically / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Um dos principais problemas em Periodontia refere-se à redução microbiana subgengival e tornar a superfície radicular biocompatível, a qual pode ser realizada por raspagem e alisamento radicular, tratamentos químicos, laser em alta intensidade ou terapia fotodinâmica. O objetivo dessa pesquisa foi de comparar os efeitos de raízes humanas tratadas por diferentes técnicas como terapia fotodinâmica, Er:YAG, Nd:YAG, raspagem e alisamento radicular e ácido cítrico + tetraciclina, na proliferação de fibroblastos gengivais (FGH) e células de granulação óssea (GO) humanos. Para tal, foram preparados 45 fragmentos radiculares de 25 dentes extraídos por razões periodontais e que foram divididos em 6 grupos: controle com células (CC), controle com fragmento raspado (CD), laser de Er:YAG (ER - 60mJ, 10pps, varredura, distância focal 12mm, 10Hz, 10s, 2940nm), laser de Nd:YAG (ND - 0,5W, contato, 15Hz, 10s, 1640nm), terapia fotodinâmica (PDT - laser de InGaAIP - 30mW, distância focal &#x2264;1mm, 45J/cm2, 30s, 660nm + azul de toluidina O), e ácido cítrico com tetraciclina (AC). As células foram cultivadas em meio DMEM com 10% de soro fetal bovino, 1% de solução antibiótica e 0,5% de anfotericina B. Foram plaqueadas 2 x 103 células, na sexta passagem, em placas de 96 poços. Após 24h o meio foi substituído por meio condicionado pelos fragmentos tratados, com exceção do grupo controle de células (CC), que recebeu meio convencional. A viabilidade celular foi medida através do teste do MTT nos períodos de 24, 48, 72 e 96h. Os dados em forma de densidade óptica e porcentagem de crescimento foram analisados estatisticamente pelo teste ANOVA a três critérios complementado pelo teste de Tukey a um nível de significância de 5% (p<0,05). Não houve diferenças entre os grupos controle CC e CD (p>0,05). Para as células FGH em relação ao controle, houve maior estímulo após 48 e 72h no grupo PDT, após 72h no grupo ND, e após72 e 96h no grupo AC (p<0,05). Para as células GO, em relação ao controle, houve maior crescimento apenas no período de 72h para o grupo ND (p<0,05). Ao comparar os grupos experimentais e ambos os tipos celulares, após transformação em porcentagem de crescimento, houve diferença estatisticamente significante para o grupo ER nos períodos de 72 e 96h para as células FGH (p<0,05). Concluiu-se que todos os tratamentos, com exceção da raspagem e alisamento radicular, estimularam a proliferação de fibroblastos gengivais humanos e somente o tratamento com Nd:YAG estimulou a proliferação de células de granulação óssea humana. / One of the main problems in Periodontics is how to eliminate the subgingival bacteria and to convert the root surface in a biocompatible environment. These results can be achieved by scaling and root planning, chemical treatment, high energy lasers or photodynamic therapy. The aim of this study was to compare the effects of human root fragments treated by different techniques as photodynamic therapy, Er:YAG, Nd:YAG, scaling and root planning and citric acid plus tetracycline on proliferation of human gingival fibroblasts (HGF) and human osseous granulation cells (OG). Forty-five root fragments from 25 human teeth extracted by periodontal indication were divided in six groups: control with cells (CC), scaled fragment control (SC), Er:YAG laser (ER - 60mJ, 10pps, scanning, focal distance 12mm, 10Hz, 10s, 2940nm), Nd:YAG laser (ND 0.5W, contact, 15Hz, 10s, 1640nm), fhotodynamic therapy (PDT InGaAIP, 30mW, 45J/cm2,30s, 660nm, toluidine blue O), citric acid plus tetracycline (CA). The cells were grown in DMEM medium with 10% of bovine fetal serum, 1% of antibiotic solution and 0.5% amphotericin B. In 96-weIl plates 2 x 103 cells in the sixth passage were plated. After 24h the medium was replaced by medium conditioned by the treated fragments with exception of cell control group (CC) which received regular medium. Cell viability was measured by MTT test at 24, 48, 72 and 96h. Data was described in optic density and percentage of growth and was analyzed by ANOVA test complemented by Tukeys test at a significance level of 5% (p<0.05). There was no statistical differences between control groups CC and SC (p>0.05). For HGF cells in relation to control, there was a higher growth after 48h and 72h at PDT group, after 72h at ND group, after 72h and 96h at CA group (p<0.05). For OG cells in relation to control, there was a higher growth only at 72h-period at ND group (p<0.05). After transformation in percentage of growth and comparison among experimental groups and both cell types, there was a statistical significant difference at ER group at 72h and 96h-period (p<0.05). It was concluded that all treatments but scaling and root planning stimulated the proliferation of human gingival fibroblasts and only the Nd:YAG treatment stimulated the proliferation of human osseous granulation cells.

Orientadores: Albina Messias De Almeida Milani Altemani, Elizabeth Ferreira Martinez / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T03:06:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Montalli_VictorAngeloMartins_D.pdf: 4723030 bytes, checksum: 1764455ec3666d02c7e74ee7c326caed (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As lesões salivares tumorais compostas por dupla população celular (epitelial e mioepitelial) são consideradas originárias do ducto intercalado e estas lesões são subdivididas em diversas entidades que apresentam sobreposição morfológica, com delimitações entre elas nem sempre nítidas. Entre as neoplasias benignas estão o adenoma pleomórfico (AP) e o adenoma de células basais (ACB). Recentemente foi descrita uma nova entidade tumoral benigna, com composição epitelial e mioepitelial, denominada de lesão do ducto intercalado (LDI). Diante disso, o nosso primeiro objetivo foi analisar os perfis morfológicos e imuno-histoquímicos de LDIs e ACBs classificados em tubulares (ACB-T) e não tubulares (ACB-NT) para verificar se as LDIs e ACB-Ts representam entidades distintas. Ainda, dado o papel crítico da célula mioepitelial na morfogênese das lesões tumorais salivares histogeneticamente relacionadas ao ducto intercalado, nosso segundo objetivo foi avaliar in vitro a influência de fatores do microambiente tumoral (proteínas da matriz extracelular e fatores de crescimento) sobre a morfologia, viabilidade e proliferação de células mioepiteliais advindas de AP. Para a análise morfológica e imuno-histoquímica, foram estudados oito casos de LDIs, nove ACBs-T e 19 ACBs-NT. Todos os ACB-T continham áreas LDI-like, enquanto nos ACB-NT estas eram raras e escassas. As células luminais das LDIs e ACBs-T exibiram positividade para CK7, lisozima, S100 e DOG1. No grupo ACB-NT, poucas células luminais mostraram tal expressão, sendo principalmente positivas para CK14. As células mioepiteliais das LDIs, ACB-T e ACB-NT foram positivas para CK14, calponina, AML e p63, mas essas eram mais numerosas nos ACBs. No estudo in vitro, a morfologia e diferenciação das células mioepiteliais foram avaliadas qualitativamente por imunofluorescência indireta (expressão da vimentina e AML, respectivamente). As células mioepiteliais exibiram morfologia poliédrica em todas as matrizes, independentemente da suplementação do fator de crescimento. AML foi imunoexpressa de forma heterogênea nas células mioepiteliais, porém houve aumento da expressão desta proteína quando acrescentado o TGF- ?1, independentemente do tipo de matriz usada. TGF- ?1 também aumentou significantemente a viabilidade das células mioepiteliais cultivadas na matriz fibronectina. Conclusões: as LDI, ACB-T e ACB-NT formam um continuum de lesões onde as LDIs estão estreitamente relacionadas com o ACB-T, visto que em ambos o imunofenótipo das células luminais e mioepiteliais é semelhante àquele observado nos ductos intercalados. A principal diferença entre LDI e ACB-T é a quantidade de células mioepiteliais, que é maior no último. Além disso, nossos resultados indicam que pelo menos alguns ACBs podem surgir via LDI. Os estudos em cultura de células sugerem que as diferentes matrizes celulares não influenciam a morfologia e diferenciação da célula mioepitelial. Dentre os fatores de crescimento estudados apenas TGF- ?1 associou-se com aumento da expressão de AML (diferenciação celular) e aumentou significantemente a viabilidade celular associado à matriz fibronectina / Abstract: Salivary tumor lesions composed of dual cell population (epithelial and myoepithelial) are considered to originate from the intercalated duct. These lesions are subdivided into several entities that share morphological features. Among the benign tumors are pleomorphic adenomas (PA) and basal cell adenoma (BCA). Recently, a new entity was described that is a benign tumor with epithelial and myoepithelial composition, called intercalated duct lesion (IDL). Our first objective was to analyze the morphological and immunohistochemical profiles of IDLs and BCAs classified into tubular (T-BCA) and non-tubular subtypes (NT-BCA), to determine whether or not IDL and tubular BCA represent distinct entities. Also, given the critical role of myoepithelial cells in the morphogenesis of the salivary tumor lesions histogenetically related to the intercalated duct, our second objective was to evaluate in vitro the influence of tumor microenvironment factors (extracellular matrix proteins and growth factors) on the morphology, viability and proliferation of myoepithelial cells arisen from PA . Eight IDLs, nine tubular BCAs and 19 non-tubular BCAs were studied by immunohistochemical technique. All tubular BCAs contained IDL-like areas, which represented 20-70% of the tumor. In non-tubular BCA, IDL-like areas were occasional and small (<5%). One patient presented IDLs, tubular BCAs and IDL/tubular BCA combined lesions. Luminal ductal cells of IDLs and tubular BCAs exhibited positivity for CK7, lysozyme, S100 and DOG1. In the non-tubular BCA group, few luminal cells exhibited such immunoprofile; they were mainly CK14-positive. Basal/myoepithelial cells of IDLs, tubular BCAs and non-tubular BCAs were positive for CK14, calponin, ?-SMA and p63; they were more numerous in BCA lesions. The in vitro study analyzed morphology and differentiation of myoepithelial cells by vimentin and SMA expressions, respectively, which were qualitatively assessed using indirect immunofluorescence. Myoepithelial cells showed polyhedral morphology in all extra cellular matrixes regardless of the supplementation of growth factors. These cells expressed SMA heterogeneously but when TGF- ?1 was added such expression increased. This modification did not show relationship with the type of extracellular matix. The viability of myoepithelial cells cultured on fibronectin matrix increased significantly with addition of TGF - ?1. Conclusions: IDL, tubular BCA and non-tubular BCA form a continuum of lesions in which IDLs are related closely to tubular BCA. In both, the immunoprofile of luminal and myoepithelial cells recapitulates the normal intercalated duct. The difference between the adenoma-like subset of IDLs and tubular BCA rests mainly on the larger numbers of myoepithelial cells in the latter. Our findings indicate that at least some BCAs can arise via IDLs. The cell culture studies suggest that the different matrixes do not influence the morphology and differentiation of myoepithelial cells. Among the growth factors studied, only TGF - ?1 was associated with an increased expression of SMA (cell differentiation) and a significant increase of the cellular viability associated with the fibronectin matrix / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Orientadores: Ângela Cristina Malheiros Luzo, Sara Teresinha Olalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T14:04:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AndreoliRisso_MarilisaFerruda_M.pdf: 14754073 bytes, checksum: 6e3b6aa9d09a03a1f2873ad414c83bdf (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Lesões cartilaginosas raramente curam-se espontaneamente. As atuais opções terapêuticas cirúrgicas e não são limitadas ao alívio dos sintomas, mando a necessidade de futura substituição total de joelho. Terapia baseada em células tronco adultas representa uma alternativa promissora para os procedimentos existentes. As células-tronco mesenquimais (MSC) apresentam alta plasticidade celular e podem ser obtidas de diversas fontes teciduais, opção que exige grande aporte celular expondo a necessidade de criopreservação, processo vantajoso. Contudo, protocolos convencionais estão diretamente associados a possíveis danos e mortalidade celular, sendo desencadeados por formação de cristais de gelo intracelular, toxicidade do crioprotetor adotado e desidratação celular. Este projeto tem como objetivo investigar a interferência da criopreservação com dimetilsufóxido (Me2SO-) (DMSO) na capacidade de MSCs em diferenciação em linhagens mesodermais e arranjo de fibras de colágeno produzidas na diferenciação condrogência. MSCs foram obtidas de tecido adiposo (ADSC). Em quarta passagem foram caracterizadas por citometria de fluxo e diferenciadas em linhagem mesodermais. Diferenciação comprovada por análise morfológica e expressão gênica por de RT-PCR. Genes escolhidos ADIPOQ, FABP4 e PPARG linhagem adipogênica, AGCAN, SOX9, COL1A1 e COL2A1 linhagem condrogênica e OC, OPN e COL1A1 linhagem osteogênica. Diferenciação condrogênica realizada pela técnica de micromassa. Arquitetura das fibras colágenas observada por microscopia de Geração de Segundo Harmônico (SHG) de MSCs e images analisadas pelos algoritmos Fast Fourier Transform (FFT) e Gray Level Co-occurrence Matrix (GLCM). ADSCs criopreservadas em taxa controlada de congelamente com solução criprotetora de soro fetal bovino e 10% de DMSO, mesmos ensaios realizados após descongelamento. Células descongeladas submetidas aos mesmos protocolos de caracterização. Características morfológicas obtidas por SHG expressão gênica das células frescas e criopreservadas analisadas estatisticamente. Amostras de ADSC, fresca e criopreservadas, foram capazes de se diferenciar em linhagens mesodermais. Perfil de expressão gênica da linhagem adipogênica foi semelhante ao esperado para tal processo de diferenciação, em ambas amostras, criopreservadas e frescas, estas últimas com maior expressão (p=ns). Na diferenciação para linhagem osteogênica também houve o perfil de expressão esperado para os genes estudas, sendo mais expresso no grupo criopreservado (p=ns). Apesar do fato da expressão do gene COL2A1 de linhagem condrogênica ter sido maior no grupo criopreservado, quando o perfil de expressão gênica do grupo fresco foi analisado, este mostrou-se mais consistente com o perfil esperado normal. Análise das imagens de SHG demonstraram que a arquitetura das fibras colágenas foi mais organizada (p=ns) e uniforme (p>0,0001) nas amostras frescas. O grupo criopreservado demonstrou maior entropia (p=ns) e contraste (p=0,0167), demonstrando haver maior tendência direcional das fibras de colágeno nas amostras frescas. Os resultados de expressão gênica sugerem que a criopreservação pode interferir de forma positiva na diferenciação osteogênica e negativamente nas linhagens adipogênica e condrogênica. A arquitetura da rede tridimensional de colágeno foi modulada negativamente pelo processo de criopreservação, dados esses confirmados por análise das imagens obtidas por SHG, o que poderia interferir com as propriedades físico/mecânicas características do tecido colagenoso, importante na manutenção da cartilagem articular baseada em terapia celular. O uso das imagens de SHG tornou-se uma importante ferramenta na melhor avaliação das fibras colágenas / Abstract: Cartilage defects rarely heal spontaneously. Current surgical and non-surgical therapeutic interventions are limited to symptom relief and future total knee replacement continues to be necessary. Adult stem cell based therapy could represent a promising alternative to this procedure. Mesenchymal Stem Cells (MSCs) have great capacity of differentiation and can easily be obtained from various sources. Cryopreservation offers many advantages for practitioners engaged in cell-based therapies. However, conventional slow freezing, despite using cryoprotectant solution, has always been associated with damage and mortality due to intracellular ice formation, cryoprotectant toxicity, and dehydration. The aim of this work is to investigate whether the Dimethyl Sulfoxide (Me2SO-) (DMSO) cryopreservation process interferes with the MSCs capacity of differentiation to mesodermal lineages and/or with collagen fiber network architecture, produced by chondrogenic cells, comparing fresh and thawed MSCs. MSCs were obtained from adipocyte tissue (ADSCs). At the fourth passage cells were characterized as ADSCs by flow cytometry analysis and differentiation to mesodermic lineages was confirmed by morphology (light optical microscopy) and gene expression analysis (RT-PCR). The following genes were chosen ADIPOQ, FABP4 and PPARG for adipogenic lineage, AGCAN, SOX9, COL2A1 and COL1A1 for chondrogenic and OC, OPN and COL1A1 for osteogenic lineage. Chondrogenic differentiation was carried out by micromass technique. Collagen fibers architecture was observed by Second Harmonic Generation (SHG) microscopy. Images were analyzed by Fast Fourier Transform (FFT) and Gray Level Cooccurrence Matrix (GLCM) algorithms. ADSCs were cryopreserved in a controlledrate freezing device with bovine serum fetal and 10% DMSO as cryoprotectant solution. Thawed cells were submitted to the same characterization protocols. SGH morphologic features and gene expression results from thawed and fresh cells were statistically analyzed. Both, thawed and fresh ADSCs were able to differentiate into mesodermal lineages. Gene expression profile of adipogenic lineage was similar to that expected for the differentiation process in both, thawed and fresh cells, with greater expression in fresh ones (p=ns). Osteogenic lineage also demonstrated the expected gene expression profile, being more expressed in the thawed group (p=ns). Despite the fact that COL2A1 gene expression in chondrogenic lineage was greater in the thawed group, when the gene expression profile was analyzed the fresh group was more consistent with the expected normal profile. SHG images results demonstrated that collagen fibers architecture was more organized (p=ns) and uniform (p<0, 0001) in fresh samples. The thawed group showed more entropy (p=ns) and contrast (p=0, 0167) demonstrating that a directional trend in the collagen fibers was only observed in the fresh group. Gene expression results suggested that cryopreservation could interfere in a positive manner with osteogenic differentiation, and negatively on adipogenic and chondrogenic lineages. Collagen network tridimensional architecture was negatively modulated by cryopreservation, confirmed by SHG analysis, which could interfere with the desirable collagen mechanical properties, important for the maintenance of articular cartilage in cell based therapy. SHG analysis has become an important tool for better evaluate collagen fibers / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Gabriel Forato Anhê / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T19:10:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbosa_AnaPauladeLima_D.pdf: 1915868 bytes, checksum: d146b07dfcd99b2676c519233cddf2f2 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O Diabetes Mellitus tipo II (DMT2) é uma doença caracterizada pela diminuição da sensibilidade à insulina e consequente prejuízo na homeostasia glicêmica. Estudos recentes mostraram que a melatonina, um hormônio produzido pela glândula pineal, melhora a tolerância à glicose e a resistência à insulina, diminui a expressão de proteínas ligadas à gliconeogênese hepática (G6Pase e PEPCK) e reduz a apoptose de células beta pancreáticas in vivo. Entretanto, ainda não estava claro se a melatonina conseguia, de fato, reverter in situ as ações lipotóxicas dos ácidos graxos saturados em células beta pancreáticas e na musculatura esquelética, e se podia diminuir a expressão dos genes reguladores da gliconeogênese hepática. Para responder a esse questionamento, utilizamos culturas celulares de insulinoma (MIN6), de músculo esquelético (miotubos de L6) e de hepatoma (HepG2). Os resultados mostraram que a melatonina reverte a resistência à insulina gerada por palmitato em miotubos de L6, mas somente em passagens baixas, não diminui a apoptose em MIN6 e não altera a expressão do G6pc, o gene que codifica a G6Pase, em HepG2 / Abstract: Type II Diabetes Mellitus (T2DM) is characterized by decrease of insulin sensitivity, resulting impairment glucose homeostasis. Recent studies have shown that melatonin, a hormone produced by the pineal gland, improves glucose tolerance and insulin resistance, reduce the expression of hepatic gluconeogenesis proteins (G6Pase and PEPCK) and diminish pancreatic beta cell apoptosis in vivo. However, it was unclear if melatonin could reverse the lipotoxic actions of saturated fatty acid in pancreatic beta cells and skeletal muscle, and if melatonin could decrease the expression of regulatory genes of hepatic gluconeogenesis in situ. To answer this question, we used cell cultures of insulinoma (MIN6), skeletal muscle (L6 myotubes) and hepatoma (HepG2). The results showed that melatonin reverses palmitate insulin resistance in L6 myotubes, but only at low passages, melatonin does not decrease apoptosis in MIN6 and does not alter the expression of G6pc, the encoding gene of G6Pase, in culture cell of HepG2 / Doutorado / Farmacologia / Doutora em Farmacologia

Orientador: Fernanda da Cruz Landim-Alvarenga / Resumo: As células-tronco mesenquimais extraídas da medula óssea ou tecido adiposo são utilizadas em abordagens terapêuticas, em vista das suas propriedades anti-inflamatórias, imunomoduladoras e regenerativas. Estas células são consideradas uma nova alternativa para o tratamento de enfermidades em diversas espécies, incluindo as dos equinos. Dessa forma, com o intuito de investigar a possível utilização das células estromais de mini-horses em tratamentos de cavalos, nesse estudo foi realizada a colheita, isolamento, expansão, caracterização imunofenotípica e diferenciação em duas linhagens mesenquimais: osteogênica e adipogênica de células estromais de mini-horses (Equus ferus caballus), objetivando a formação de um banco celular. Foi ainda realizada a análise transcricional comparativa dessas células, com as células estromais oriundas de cavalos (Equus caballus), produzidas e caracterizadas nas mesmas condições. Os parâmetros analisados foram o perfil de genes relacionados à angiogênese, regulação negativa da proliferação de células T, regulação negativa da ativação de células T, proliferação negativa de linfócitos reguladores, regulação negativa da proliferação de células mononucleares, regulação negativa da adesão célula-célula de leucócitos, regulação negativa da proliferação de leucócitos, regulação negativa da adesão célula-leucócito, regulação negativa da ativação de linfócitos. Também foram pesquisados os principais genes up e down regulados comparando mini-horses aos cavalo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mesenchymal stem cells extracted from bone marrow or adipose tissue are used in therapeutic approaches in view of their anti-inflammatory, immunomodulatory and regenerative properties. These cells are considered a new alternative for the treatment of diseases in several species. In order to investigate the possible use of mini-horses stromal cells in horse treatments, in this study was performed the collection, isolation, expansion, immunophenotypic characterization and differentiation in two mesenchymal lines were performed: osteogenic and adipogenic stromal cell mini-horses (Equus ferus caballus), aiming the formation of a cellular bank. We also performed the comparative transcriptional analysis of these cells, with stromal cells from horses (Equus caballus), produced and characterized under the same conditions. The parameters analyzed were the profile of genes related to angiogenesis, negative regulation of T cell proliferation, negative regulation of T cell activation, negative proliferation of regulatory lymphocytes, negative regulation of mononuclear cell proliferation, negative regulation of cell-cell adhesion leukocytes, negative regulation of leukocyte proliferation, negative regulation of cell-leukocyte adhesion, negative regulation of lymphocyte activation. We also searched the top 10 genes up and down regulated comparing mini-horses to horses. For cell bank formation tests were performed that demonstrated the characteristics of stromal cells in the cells obtained ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Andreia Bufalino / Resumo: O carcinoma espinocelular (CEC) representa mais de 95% de todas as neoplasias malignas que acometem a cavidade oral e muitas vezes estes tumores são precedidos por alterações clínicas que apresentam um evidente potencial de transformação maligna, as quais são chamadas de desordens potencialmente malignas orais (DPMOs). Dentre estas, a leucoplasia oral (LO) possui taxa de transformação maligna que varia de 0,2% até 17,5%; contudo, uma outra DPMO conhecida como leucoplasia verrucosa proliferativa (LVP) apresenta um comportamento persistente e progressivo para malignidade, com taxa de transformação maligna maior que 70%. Diferente da LO, fator de risco como tabaco, álcool e noz de areca não parecem estar associados com o desenvolvimento da LVP. Adicionalmente, a LVP frequentemente apresenta resposta inadequada a todas as modalidades de tratamento, sofre rápida disseminação pelos sítios orais e muitas vezes demonstra recorrência. Estudos recentes sugerem que o infiltrado inflamatório associado às lesões leucoplásicas de paciente com LVP pode estar relacionado a etiologia e/ou comportamento clínico agressivo desta DPMO. Assim, foi realizada uma análise comparativa entre amostras de LO e LVP que consistiu em: (1) avaliar a porcentagem e identificar os subtipos de linfócitos T auxiliares e estado de ativação de linfócitos T citotóxicos, (2) avaliar a densidade e estado de ativação das células dendríticas, e (3) determinar o efeito de produtos solúveis de células displásicas na modul... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-19T11:45:26Z No. of bitstreams: 1 aline-stelling-zanatta.pdf: 2385669 bytes, checksum: 6f759289878ca2d698465044b392ae3f (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-19T11:45:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 aline-stelling-zanatta.pdf: 2385669 bytes, checksum: 6f759289878ca2d698465044b392ae3f (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Desde o trabalho de Köhler e Milstein (1975), hibridomas tem sido cultivados para obtenção de anticorpos monoclonais com finalidade de uso em pesquisa, diagnóstico e terapia. O método tradicional de obtenção de anticorpos monoclonais em altas concentrações é através de indução de ascite em camundongos. Estatécnica vem sendo substituída por cultivos de hibridomas em altas concentrações celulares. Neste trabalho, foram cultivados hibridomas secretores de anticorpos monoclonais anti-dengue tipo 2 em frascos T, garrafas rotatórias (roller) e frascos do tipo spinner, utilizando-se o meio DMEM, suplementado com soro fetal bovino a 10%, e o meio comercial livre de soro animal Ex-Cell® TiterHigh TM (Sigma). Ao longo dos diferentes cultivos, foram avaliadas a concentração celular, viabilidade celular e as concentrações de nutrientes (glicose eglutamina), metabólitos (lactato e amônio) e produto (IgG). A partir dos resultados obtidos, foram calculadas as grandezas representativas do metabolismo celular: concentração máxima de células (X máx), taxa específica de crescimento celular (µexp), tempo de duplicação (td) e coeficientes de rendimento de glicose em células (YX/glc), glutamina em células (Y X/gln), células em produto (YP/X), glutamina em amônio (YNH4/gln), glicose em lactato (Ylac/glc), glicose em produto (YP/glc) e glutamina em produto (YP/gln). O meio livre de soro mostrou ser capaz de fornecer melhores condições para o crescimento celular (alcançando 4 x 106 céls/mL), mantendo a viabilidade por um período maior de tempo, nos três sistemas decultivo testados. Quanto à formação de produto, no meio livre de soro, os hibridomas também secretaram altas concentrações de IgG, alcançando níveis de 3 µg/mL. Os melhores resultados de crescimento e viabilidade celular foram observados em garrafas rollera 40 rpm (após adaptação a rotações inferiores) e a produção de IgG foi maior em garrafas rollera 16 rpm (também após adaptação a rotações inferiores) e em frascos do tipo spinner a 50 rpm (após adaptação a rotações inferiores em garrafas rolleraté 40 rpm). Quando foram comparadas as concentrações de IgG entre os sobrenadantes de cultivo e três amostras de fluido ascítico do mesmo hibridoma, foi observado que o fluido ascítico continha concentrações 10 a 20 vezes maiores que as obtidas nos sobrenadantes de cultivo. Entretanto, como os volumes de sobrenadantes de cultivo são significativamente maiores do que os de fluido ascítico de camundongos, infere-se que é viável a substituição da produção in vivopela obtenção do anticorpo monoclonal estudado neste trabalho em sistemas agitados, utilizando-se meio livre de soro animal. Contudo, sugere-se a condução de experimentos adicionais para confirmação da total viabilidade da obtenção de anticorpos monoclonais anti-dengue tipo2 in vitroutilizando o processo proposto no presente trabalho. / Since Köhler and Milstein’s work (1975), hybridoma cells have been cultured to obtain monoclonal antibodies for research, diagnostic and therapeutic purposes. The traditional method to obtain high concentrations (5 to 10 mg/mL) of the monoclonal antibodies is the induction of ascite in mice. This technique is being replaced by high cell density cultivations. In this work, hybridoma secreting anti-dengue type 2 monoclonal antibodies were cultivated in T flasks, roller bottles and spinner flasks, using DMEM medium supplemented with fetal bovine serum at 10%, and the commercial serum-free medium Ex-Cell® TiterHigh TM (Sigma). Cell concentration, cell viability, as well as concentration of nutrients (glucose and glutamine), metabolites (lactate and amonium) and product (IgG) were evaluated along culture time in the different media and culture systems. Based on these data, variables that reflect the cell metabolism were calculated: maximum cell concentration (Xmáx), specific cell growth rate (µexp), duplication time (td), as well as the yield coefficients of glucose to cells (YX/glc), glutamine to cells (YX/gln), cells to product (YP/X), glutamine to ammonium (Y NH4/gln), glucose to lactate (Ylac/glc), glucose to product (YP/glc) and glutamine to product (YP/gln). Among the culture media, the serum-free medium showed to provide better conditions for cell growth (reaching 4 x 106 cells/mL), keeping high cell viabilities for a longer period, in all three tested culture systems. Concerning product formation, hybridoma also released high IgG concentrations (3 µg/mL) in the serum-free medium. Among the culture systems, the best results for cell growth and viability were found inroller bottles at 40 rpm (after adaptation under lower rotation rates) and IgG production was higher in roller bottles at 16 rpm (after adaptation under lower rotation rates) and in spinner flasks at 50 rpm (after adaptation under lower rotation rates in roller bottles, up to 40 rpm). The IgG concentrations ascitic fluid presented concentrations 10 to 20 times higher thanthose obtained in culture supernatants. However, since the volumes of culture supernatant obtained in relatively simple, small-scale culture systems are significantly higher than thoseof mice ascitic fluids, the replacement of in vivoproduction for in vitroIgG production in stirred systems, using serum-free media, seems to be feasible. Nevertheless, additional experiments should be carried out to confirm the feasibility of switching the production of anti-dengue type 2 monoclonal antibodies for in vitrosystems, using the process proposed in this work.

O efeito de fármacos pode ser potencializado através do desenvolvimento de novos sistemas de liberação como os sistemas mucoadesivos. Estes sistemas permanecem em contato íntimo com o tecido de absorção, às mucosas, liberando o fármaco no local de ação, com o consequente aumento da biodisponibilidade, podendo promover efeitos locais e sistêmicos. Através do desenvolvimento da bandagem bucal antimicrobiana e testadas sua eficiência sobre a cultura de algumas bactérias bucais (S. mutans e C. albicans) se fez necessário continuar os estudos desse material. O objetivo deste trabalho foi analisar as propriedades bioquímicas e funcionais da bandagem bucal antimicrobiana no que tange a: degradação no meio salivar; adequação da composição para a melhoria da aderência à mucosa bucal; desempenho quanto à liberação controlada de fármacos; absorção de água, perda de massa; medida do pH do líquido residual em diferentes períodos de tempo; citotoxicidade da bandagem em cultura de fibroblastos. As bandagens avaliadas tinham diferentes composições quitosana, quitosana com glicerol, quitosana e alginato com/sem glicerol, e todas com/sem fármaco. Através das análises realizadas foi possível observar que as bandagens que absorveram mais água em tampão foi a membrana híbrida (203%) e em saliva foi a híbrida com glicerol (30%). A membrana que perdeu mais massa em tampão e em saliva foi a híbrida com glicerol (40% e 30%), isso quer dizer que elas se decompõe e liberam suas propriedades no meio. A liberação controlada do fármaco pode avaliar que a membrana híbrida liberou de forma crescente o fármaco (0,075%), facilitando sua liberação. No teste de citotoxicidade todas as bandagens com fármaco foram citotóxicas, já as bandagens de quitosana e quitosana com glicerol promoveram o crescimento celular. / The effect of drugs may be enhanced through the development of new delivery systems as mucoadhesive systems. These systems remain in intimate contact with the tissue absorption, in this case the mucosa, releasing the drug at the site of action, with the consequent increase in bioavailability and may promote local and systemic effects. Mucoadhesion is currently explained by six theories: electronics, adsorption, wetting, diffusion, fracture and mechanics (Carvalho et al., 2010). In 2011, Kloster et al. developed an oral bandage and tested antimicrobial efficiency in the culture of some oral bacteria (S. mutans e C. albicans), the results were promising. The aim of this study was to analyze the biochemical and functional properties of oral antimicrobial bandage with respect to: the salivary environment degradation; the composition adjustment for improving the adherence to the buccal mucous membrane; the performance as to the controlled releasing of drugs; water absorption while analyzing the mass loss; pH measurements of the residual liquid in different periods of time; the plaster cytotoxicity in cell and fibroblast culture. Through the analyzes it was observed that the bandages absorb water and lose mass, it means that they decompose and release their property in the middle. The bandages with drug in viability analysis were cytotoxic cell and different concentrations of drug should be study.

Orientador: Janaína Habib Jorge / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do envelhecimento de materiais comumente usados como pilares de próteses implanto-suportadas (abutments) sobre suas características físicas de superfície (rugosidade, energia livre de superfície e molhabilidade) e propriedades biológicas (metabolismo de fibroblastos orais e formação de biofilme fúngico). Para isso, discos (N=62) com rugosidade inferior a 0,2 µm foram confeccionados em zircônia (ZrO2) do tipo Y-TZP (yttriumstabilized tetragonal zirconia polycrystalline) e em titânio (Ti) comercialmente puro, e foram submetidos a um processo de envelhecimento simulado em autoclave a 134ᵒC (pressão de 2 bar) por 20 horas. ZrO2 e Ti envelhecidos foram comparados aos seus homólogos não envelhecidos. Os materiais também foram comparados entre si, nas condições envelhecida e não envelhecida. Para os testes biológicos, os grupos também foram comparados a um controle positivo de poliestireno. Todos os testes, exceto o de rugosidade, foram realizados após a formação de película salivar sobre os discos. Os testes biológicos utilizados foram de Alamar Blue (n=9) para avaliar o metabolismo de fibroblastos da gengiva humana (FGH) e de contagem de colônias viáveis (n=9) para verificar a formação de biofilme de uma cepa padrão de Candida albicans (ATCC90028) sobre os materiais. Além disso, microscopia eletrônica de varredura (MEV) (n=2) foi realizada para avaliação da morfologia dos fibroblastos e dos microrganismos. Para a análise estatística, fo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to evaluate the effect of aging of commonly used abutments on their surface physical characteristics (roughness, surface free energy and wettability) and biological properties (oral fibroblasts metabolism and formation of fungal biofilm). For this purpose, discs (N=62) with roughness less than 0.2 μm were made in yttrium-stabilized tetragonal zirconia polycrystalline (Y-TZP) zirconia (ZrO2) and in commercially pure titanium (Ti), and underwent a simulated aging process in autoclave at 134 °C (pressure of 2 bar) for 20 hours. ZrO2 and Ti were compared to their unaged counterparts. The materials were also compared to each other in the aged and unaged conditions. For the biological tests, the groups were also compared to a positive control of polystyrene. All tests, except roughness, were performed after the formation of salivary film on the discs. The biological tests used were Alamar Blue (n=9) to evaluate the metabolism of human gingival fibroblasts (HGF) and colony counting test (n=9) to verify the biofilm formation of a reference strain of Candida albicans (ATCC90028) on the materials. In addition, scanning electron microscopy (SEM) (n=2) was performed to evaluate the morphology of fibroblasts and microorganisms. For statistical analysis, the t-test for paired samples was used for roughness, t-test for independent samples was used for surface free energy, wettability and fibroblasts metabolism, and one-way ANOVA with Welch correction and Games-Howe... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre