Linfedema é uma condição crônica que predispõe a uma substancial morbidade e perda da função do órgão ou tecido afetado. Ele não tem cura e em longo prazo leva a dificuldades físicas e psicológicas ao paciente, tornando-se um grande desafio para os médicos. Infelizmente, é triste constatar que aproximadamente 400 anos após a descoberta dos vasos linfáticos, não há cura para o linfedema, sendo o tratamento baseado em drenagem linfática manual através de massagem e limitadas intervenções de fisioterapia, ambas visando redução do volume de edema, o que fornece alívio parcial para os indivíduos afetados que não garantem o desaparecimento da fibrose, aparentemente irreversível. Por isso, estudos que proporcionem novas intervenções, como a terapia celular com células-tronco, são de grande interesse. Neste trabalho tivemos como objetivo realizar terapia celular de linfedema murino utilizando células-tronco da membrana amniótica. Em um primeiro momento, a obtenção do modelo de insuficiência linfática foi feita com base em Tabibiazar et al., 2006 onde uma microablação de 2 mm em toda a circunferência foi feita na cauda do animal. Entretanto, após 30 dias de indução uma regressão espontânea foi observada inviabilizando a utilização deste modelo. Após vasta pesquisa na literatura outro modelo de indução de linfedema (Shimizu et al., 2012) foi encontrado, onde os autores fazem uma microablação cirúrgica, mantendo um flap de 4 mm na região ventral. Neste trabalho os autores obtiveram um linfedema estável por no mínimo 30 dias. Com base nestes achados, o modelo de linfedema murino induzido baseado em Shimizu foi realizado e após a comprovação desta estabilidade por 60 dias, esse modelo foi utilizado para indução do linfedema. Após esta caracterização, os animais que tiveram o linfedema induzido foram submetidos a terapia celular utilizando 0,5X106 células-tronco da membrana amniótica humana (MAh) ou saco vitelino canino (SVc) no momento da indução. Animais sem lesão, com lesão (SHAM) e tratados apenas com solução fisiológica (placebo) também foram analisados. O monitoramento do linfedema na cauda foi feito através de acompanhamento clínico, registro fotográfico e mensura do diâmetro caudal a cada 2-3 dias. Ao final do estudo, os animais foram eutanasiados, tiveram suas caudas removidas e foram submetidos a avaliação dos efeitos terapêuticos da terapia celular através de análise do exsudato, análises histológicas (HE, picrossírius) e imuno-histoquímicas. A histológica obtida por coloração de HE além de apresentar o melhor resultado quando comparado com as demais técnicas, possibilitou avaliar as alterações patológicas pertinentes de cada amostra, revelando efeitos benéficos da terapia quando comparados com SHAM e placebo. Já, a coloração Picrossírius permitiu visualizar além das alterações estruturais, a inversão da predominância da expressão de colágeno do tipo I, por colágeno do tipo III nos tecidos estruturalmente comprometidos. O resultado do conjunto de análises das amostras apresentou o padrão linfedematoso esperado para os grupos SHAM e placebo, porém também mostrou um processo inflamatório muito menor e mais curto nos grupos MAh, e SVc, permitindo sugerir que a terapia celular causou um impacto favorável e os animais apresentaram resultados muito próximos aos padrões exibidos pelo grupo controle. / Lymphedema is a chronic condition, which predisposes to substantial morbidity and loss of function of the affected organ or tissue. It has no cure and, in the long term, leads patients to physical and psychological problems, which is a major challenge for doctors. Unfortunately, it is sad to realize that, approximately 400 years after the discovery of the lymphatic vessels, there is no cure for lymphedema. The treatment is based on manual lymphatic drainage through massage and limited physiotherapy interventions. Both techniques aim at reducing the volume of the edema, which provides partial relief for affected individuals, but do not guarantee the disappearance of the fibrosis, which is, apparently, irreversible. Therefore, studies that provide new interventions, such as stem cell therapy, are of great interest. In this study, we carried out induced murine lymphedema using human amniotic membrane stem cells. At first, we obtained the model of lymphatic insufficiency based on Tabibiazar et al., 2006, in which a 2 mm microablation throughout the circumference was made in the tail of the animal. However, after 30 days of induction, a spontaneous regression was observed, making this model unusable. After extensive literature research, another model of lymphedema induction (Shimizu et al., 2012) was found. In this model, the authors perform a surgical microablation, maintaining a 4 mm flap in the ventral region. The authors obtained stable lymphedema for at least 30 days. Based on these findings, the model of induced murine lymphedema, based on Shimizu et al., 2012, was performed and, after proving this stability for 60 days, this model was used for the induction of murine lymphedema. After this characterization, the animals that have had induced lymphedema were subjected to cell therapy using 0.5X106 human amniotic membrane stem cells (MAh) or canine yolk sac (SVc) at the time of induction. Animals without lesion, with lesion (SHAM) and treated only with solution were also analyzed. The monitoring of lymphedema in the tail was done through clinical follow-up, photographic record and caudal diameter measurement every 2-3 days. At the end of the study, the animals were euthanized, had their tails removed, and were subjected to evaluation of the therapeutic effects of the cell therapy through exudate analysis, histological analysis (HE, picrosirius) and immunohistochemistry analysis. The histological obtained by HE staining, besides presenting the best result when compared to the other techniques, allowed to evaluate the pertinent pathological alterations of each sample, revealing beneficial effects of the therapy when compared to SHAM and placebo. Picrosirius staining allowed to visualize, in addition to the structural alterations, the reversal of the predominance of type I collagen expression by type III collagen in structurally compromised tissues. The result of the sample analysis showed the expected lymphomatoid pattern for the SHAM and placebo groups, but also showed a much shorter and shorter inflammatory process in the MAh and SVc groups, suggesting that the cell therapy had an impact and the animals presented results very close to the standards presented by the control group.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Acute and Chronic renal diseases have a high morbidity and mortality. There is a good deal of interest in MSC-based approaches for the treatment of Kidney injury, thanks to positive preclinical results and the strong clinical need for novel therapies to treat Acute Kidney Injury. Several routes of administration have been tested and have shown a better response when applied arterially. The main goal of this study was to describe and to compare the use of Fogarty thru-lumen embolectomy catheter with angiographic catheter by using conventional radiology as a guide. We used seven healthy dogs to measure the diameter of the aorta caudal to the renal arteries and right and left femoral and renal arteries. It was assessed the number of attempts for the placement of the introducer, number of radiographic studies to carry out nefrography with both cathethers. In five out of seven animals it was possible to place of the introducer tube 6F. Regarding the number of radiographic films used, the technique with the angiographic catheter needed more than the Fogarty when accessed both arteries, but there is no significant difference when compared to the Fogarty with access to only one renal artery. There was hematoma formation in three animals. The access of the renal artery for drug delivery and cell therapy is possible using both Fogarty thru-lumen embolectomy catheter and angiographic catheter by conventional radiology as a guide, however, we considered the Fogarty catheter easier to be applied, since only one procedure can be performed to access both renal arteries, thus making it less expensive and faster to run. If access to only one renal artery is require, the angiographic catheter would be recommended, since cell therapy would be administered more selectively in the target kidney. / A insuficiência renal aguda e crônica são doenças com altos índices de morbidade e mortalidade. O interesse na utilização de células tronco mesenquimais após um insulto renal tem sido crescente, devido ao indício de efeitos positivos em estudos pré-clínicos e a necessidade de novas terapias para tratar lesão renal aguda. Diversas vias de administração já foram testadas, sendo observado que a aplicação na artéria renal é a via de escolha pela sua melhora mais significativa na função renal. Diante disso o objetivo desse estudo foi descrever e comparar a utilização do cateter Fogarty de embolectomia duplo lúmen com o cateter angiográfico utilizando radiologia convencional. Utilizaram-se sete cães hígidos nos quais foram avaliados os diâmetros da aorta caudal às artérias renais e das artérias femorais e renais direita e esquerda. Quantificou-se o número de tentativas para colocação do introdutor e de estudos radiográficos para a realização de nefrografia com ambos cateteres. Em cinco dos sete animais foi possível a realização do acesso vascular pela artéria renal. Quanto ao número de estudos radiográficos, a técnica com o cateter angiográfico precisou de maior número do que o Fogarty quando se acessou ambas artérias, no entanto não houve diferença significativa quando comparou-se o Fogarty com o acesso de apenas uma artéria renal. Houve a formação de hematoma em três animais. O acesso da artéria renal para administração de fármacos e terapia celular é possível utilizando-se tanto o cateter Fogarty duplo lúmen quanto o Angiográfico por meio de radiologia convencional como guia, no entanto, considerou-se o cateter Fogarty o cateter de escolha, visto que em apenas um procedimento consegue-se realizar o acesso de ambas artérias renais, tornando-se dessa forma menos dispendioso e mais rápido de ser executado. Caso seja necessário o acesso de apenas uma artéria renal, sugere-se a utilização do cateter angiográfico, uma vez que a terapia celular seria administrada mais seletivamente no rim alvo.

O enfisema pulmonar é caracterizado pela destruição das paredes alveolares, sendo a fumaça de cigarro o principal agente etiológico. Pretendeu-se, neste estudo, comparar os efeitos terapêuticos do transplante de células mononucleares da medula óssea (BMMC) e células mesenquimais (CTM) em animais com enfisema pulmonar induzido por exposição à fumaça de cigarro. Camundongos fêmeas da linhagem C57Bl6/J foram expostos à fumaça de cigarro durante 90 dias e, 21 dias após o término do período de exposição, receberam BMMC ou CTM derivadas da medula óssea de camundongos machos da linhagem C57Bl6/J, expressando a proteína GFP. As análises morfométricas mostraram que os tratamentos com BMMC e CTM foram eficientes na recuperação do parênquima pulmonar dos animais expostos à fumaça de cigarro. Testes de fluorescência direta e PCR mostraram a migração de BMMC e CTM para o pulmão. Desta forma, pode-se concluir que, morfologicamente, a terapia celular com BMMC ou CTM é eficaz no tratamento do enfisema pulmonar resultante da exposição à fumaça de cigarro em modelo animal. / Pulmonary emphysema is characterized by destruction of alveolar walls, and the cigarette smoking is the main etiologic agent. It was intended in this study to compare the therapeutic effects of the transplantation of bone marrow mononuclear cells (BMMC) and mesenchymal stem cells (MSC) in animals with pulmonary emphysema induced by exposure to cigarette smoke. C57Bl6/J female mice were exposed to cigarette smoke for 90 days and 21 days after the end of the exposure time, received BMMC or MSC derived from bone marrow of C57Bl6/J male mice expressing the GFP protein. The morphometric analysis showed that treatments with BMMC and MSC were efficient in recovering the lung of animals exposed to cigarette smoke. Fluorescence and PCR tests showed the migration of BMMC and MSC to the lung. Thus, it is concluded the cell therapy with BMMC or CTM is morphologically effective in the treatment of pulmonary emphysema resulting from exposure to cigarette smoke in an animal model.

A terapia celular representa uma abordagem promissora para o tratamento de cardiopatia isquêmica, porém aspectos-chave dessa estratégia permanecem incertos. Neste trabalho avaliamos a eficiência da retenção cardíaca de células da medula óssea marcadas com tecnécio (99m Tc-CMO) transplantadas, de acordo com o tempo após o infarto (1, 2, 3 e 7 dias) e a via de administração dessas células (intravenosa [IV], intraventricular [IC], intracoronariana [ICO] e intramiocárdica [IM]), em ratos submetidos à isquemia-reperfusão cardíaca [I&R]. Após 24 horas, a retenção cardíaca de 99m Tc-CMO foi maior na via IM comparada com a média alcançada pelas demais (6,79% do total injetado vs. 0,53%). O uso de fibrina como veículo para a injeção de células incrementou a retenção em 2.5 vezes (17,12 vs. 6,84%) na via IM. Curiosamente, quando administradas após 7 dias, a retenção de células na via IM alcançou valores próximos dos observados com da matriz de fibrina injetadas 24 h após a I&R (16,55 vs. 17,12%), enquanto que para as demais vias as mudanças foram insignificantes. Nos animais em que as CMO foram administradas por via intramiocárdica 24 horas após a I&R, com ou sem fibrina, observou-se melhora significante do desempenho cardíaco frente ao estresse farmacológico com fenilefrina quando comparados aos controles. Em conjunto, os dados mostram a biodistribuição das células injetadas após a I&R por 4 diferentes vias e 4 intervalos de tempo pós-lesão e indicam que a via IM é a que produz maior retenção cardíaca. O uso do biopolímero de fibrina aumenta a retenção das células e a eficácia deste efeito sobre a função cardíaca e mortalidade dos animais em longo prazo, além de 30 dias pós I&R, merecerá ser investigada no futuro. / Cell therapy represents a promising approach for ischemic cardiac disease, but key aspects of this strategy remain unclear. We examined the effects of timing and route of administration of bone marrow cells (BMCs) after myocardial ischemia/reperfusion injury (I&R). 99mTc-labeled BMCs were injected by 4 different routes: intravenous (IV), left ventricular cavity (LV), left ventricular cavity with temporal aorta occlusion (LV+) and intramyocardial (IM). The injections were performed 1, 2, 3, or 7 days after infarction. Cardiac retention was higher following the IM route compared to the average values obtained by all other routes (6.79% of the total radioactivity injected vs. 0.53%). Use of a fibrin biopolymer as vehicle during IM injection led to a 2.5-fold increase in cardiac cell accumulation (17.12 vs. 6.84%). Interestingly, the retention of cells administered with culture medium at day 7 post-MI by the IM route was similar to that observed when cells were injected 24 h post-IM using fibrin (16.55 vs 17.12%), whereas no significant changes were observed for the other routes. Cell therapy 24 hs post MI by IM injection, with or without fibrin, resulted in comparable improvement in cardiac function under pharmacological stress compared to control animals. Together, we provide evidence for the biodistribution of 99mTc-labeled BMCs injected post MI by 4 different routes and times post-injury, which shows that the IM rout is the most effective for cardiac cell retention. The use of a fibrin biopolymer further increased cardiac cell retention and its potential long term benefits, beyond 30, on reducing mortality and improving cardiac function deserve to be explored in the future.

O diabetes mellitus do tipo 1 (DM-1) é uma doença autoimune caracterizada pela destruição seletiva de células pancreáticas produtoras de insulina. O tratamento convencional é feito com insulina e existe atualmente a necessidade de desenvolver alternativas terapêuticas para o DM-1, como por exemplo o tratamento com células-tronco. As células estromais mesenquimais multipotentes (multipotent mesenchymal stromal cells-MSCs) representam uma fonte de células ideal para terapias celulares em virtude de seu fácil isolamento, expansão e capacidades imunomoduladora e regenerativa. Ainda não está esclarecido se MSCs isoladas de indivíduos com doenças autoimunes possuem alterações funcionais que poderiam limitar seu uso no contexto do transplante autólogo. Já foi descrito que MSCs de pacientes com esclerose múltipla, artrite reumatoide e lúpus eritematoso sistêmico possuem alterações fenotípicas e/ou funcionais. No entanto, pouco se sabe acerca das características das MSCs de pacientes com DM-1. Desse modo, o objetivo principal deste trabalho foi avaliar a eficácia da infusão de MSCs derivadas de pacientes com DM-1 no tratamento do diabetes experimental e comparar os resultados obtidos com o tratamento feito com MSCs isoladas de indivíduos saudáveis. Além disso, investigamos os efeitos da hiperglicemia in vitro sobre as MSCs, estabelecemos a melhor via de administração das MSCs em camundongos diabéticos e caracterizamos fenotipicamente e funcionalmente as MSCs de pacientes com DM-1. O diabetes experimental foi induzido em camundongos C57BL/6 por meio da administração de estreptozotocina. MSCs isoladas de tecido adiposo murino (ADMSCs) foram administradas em camundongos diabéticos pelas vias intravenosa, intraperitoneal, intrapancreática ou intraesplênica. MSCs foram isoladas da medula óssea de pacientes com DM-1 recém-diagnosticado (DM1-MSCs) e de indivíduos saudáveis (C-MSCs). A morfologia, tamanho celular, perfil imunofenotípico, diferenciação em adipócitos, migração e capacidade imunossupressora foram avaliados. 1x106 DM1-MSCs ou C-MSCs foram injetadas pela via intraesplênica em camundongos diabéticos 20 dias após indução do diabetes. A glicemia foi monitorada periodicamente. Após sacrifício dos camundongos, avaliamos a histologia do tecido pancreático, níveis de insulina circulante, a população de células T reguladoras no baço e linfonodos pancreáticos, o perfil de citocinas no soro e homogeneizado pancreático. A migração das ADMSCs Luc+ injetadas foi avaliada por meio de processamento de imagem baseado em bioluminescênia. Sete dias após cultivo com diferentes concentrações de glicose, as MSCs não apresentaram alterações nos parâmetros avaliados. A injeção de MSCs em camundongos diabéticos por meio da via intraesplênica foi a mais eficiente, promovendo reversão da hiperglicemia em cerca de 70-100% dos camundongos tratados. As DM1-MSCs apresentaram morfologia, tamanho celular, perfil imunofenotípico, diferenciação in vitro em adipócitos e capacidade imunossupressora in vitro semelhante às MSCs de indivíduos saudáveis. No entanto, as DM1-MSCs apresentaram maior migração in vitro em relação às C-MSCs. Não houve diferenças significantes do tratamento de camundongos diabéticos feito com DM1-MSCs ou C-MSCs, uma vez que ambas MSCs foram capazes de reverter a hiperglicemia, promover aumento da massa de células pancreáticas, bem como diminuir os níveis de IL-2 e IFN- no pâncreas dos camundongos tratados. Considerando-se que as MSCs de pacientes com DM-1 recém-diagnosticados não apresentaram alterações fenotípicas ou funcionais, elas poderiam ser transplantadas de forma autóloga nesses pacientes, representando uma nova alternativa terapêutica para o DM-1. / Type 1 diabetes mellitus (DM-1) is an autoimmune disease characterized by a selective destruction of insulin-producing pancreatic cells. The conventional treatment for DM-1 patients is the administration of insulin and new therapeutic approaches are needed, such as stem cell therapies. Mesenchymal stromal cells (MSCs) represent an important stem cell source for cell therapies because they are easy to isolate, present good capacity of expansion and they exhibit immunomodulatory and regenerative properties. However, it is not fully understood if MSCs from autoimmune patients are functionally defective or not, limiting their use in the autologous transplantation setting. There are some reports in the literature showing that MSCs from patients with multiple sclerosis, rheumatoid arthritis or systemic lupus erythematosus exhibit phenotypical and/or functional alterations. However, little is known about MSCs isolated from DM-1 patients (DM1-MSCs). Taking this into account, the aim of this work was to evaluate the efficacy of DM1-MSCs transplantation in diabetic mice and to compare this treatment with the treatment using MSCs isolated from healthy individuals. We also evaluated the influence of in vitro hyperglycemia on MSCs and we established the best route of MSCs administration in diabetic mice. The phenotypical and functional characteristics of DM1-MSCs were analyzed. The experimental diabetes model was induced in C57BL/6 male mice by the administration of streptozotocin. MSCs were isolated from mouse adipose tissue (ADMSCs) and injected in diabetic mice by intravenous, intraperitoneal, intrapancreatic or intrasplenic routes. DM1-MSCs were isolated from bone marrow aspirates of newly-diagnosed type 1 diabetes patients and C-MSCs were obtained from healthy individuals. The morphology, immunophenotypic profile, cell size, adipocyte differentiation (in vitro), migration (in vitro) and immunosuppressive capacity (in vitro) were evaluated. 1x106 DM1-MSCs or C-MSCs were injected by intrasplenic route in diabetic mice 20 days after diabetes induction. Glycemia was frequently monitored. The pancreatic tissue (histology and immunohistochemistry), serum insulin levels, the regulatory T cells population in spleen and pancreatic lymph nodes, the serum and pancreatic homogenate cytokine profiles were evaluated after MSCs administration. The homing of ADMSCs Luc+ was analyzed by bioluminescence based image processing. MSCs cultured for seven days with different glucose concentrations did not exhibit alterations in all evaluated parameters. The intravenous, intraperitoneal, intrapancreatic or intrasplenic routes of MSCs administration were tested. The intrasplenic route was the most efficient and promoted diabetes reversion in about 70-100% of MSCs-treated mice. No differences in morphology, cell size, immunophenotypic profile, adipocyte differentiation and immunosuppressive capacity were found for DM1-MSCs when compared with C-MSCs. However, the migration capacity of DM1-MSCs was higher than C-MSCs. The intrasplenic administration of DM1-MSCs or C-MSCs in diabetic mice similarly promoted a decrease in blood glucose levels, improved insulin-producing cell mass and modulated the production of IL-2 e IFN- in pancreatic tissue. Taking into account that MSCs from newly-diagnosed DM-1 patients did not show phenotypical and functional alterations, these cells could be isolated from diabetic patients representing a new therapeutic approach for DM-1 patients (autologous transplantation).

Este trabalho teve como objetivo desenvolver um protocolo para a diferenciação in vitro de células-tronco mesenquimais (CTM) em hepatócitos e a padronização de um modelo animal de fibrose hepática induzida por dimetilnitrosamina (DMN) para ensaios pré-clínicos de transplante de CTM. CTM isoladas de fontes variadas apresentaram morfologia fibroblastóide e aderência ao plástico e o padrão de marcadores de superfície celular esperado na análise por citometria de fluxo. A capacidade de diferenciação osteogênica e adipogênica dessas células foi comprovada pelas colorações de vermelho de alizarina, oil red e azul de toluidina, respectivamente, confirmando, que as células isoladas para este estudo se comportaram como CTM conforme proposto pela Sociedade Internacional de Pesquisa em Células-tronco. A diferenciação hepática foi avaliada quanto à morfologia e capacidade das células diferenciadas de estocar glicogênio confirmada por PAS (ácido periódico-Schiff), de sintetizar albumina confirmada por imunofluorescência, além da capacidade de expressar genes hepato-específicos verificada por ensaios de PCR em tempo real. Com base na literatura para diferenciação hepática, diferentes protocolos de um, dois e três passos foram testados. CTM humanas mostraram capacidade de produzir e estocar glicogênio e de sintetizar albumina, apenas quando diferenciadas com protocolos de três etapas, porém sem uma expressão aumentada dos genes hepato-específicos albumina, α-fetoproteína e c-Met. Uma etapa de diferenciação endodérmica, previamente aplicada à diferenciação hepática, aumentou a capacidade de produzir e estocar glicogênio das CTM diferenciadas. Para a padronização do modelo de fibrose hepática induzida por DMN, foram realizados experimentos de dose-resposta e foi verificado o efeito da hepatectomia em modelos mistos DMN/hepatectomia. A injúria hepática e o efeito do transplante de CTM foram avaliados por análise macroscópica dos fígados, histologia das biópsias de fígados corados com HE e tricromo de Masson e parâmetros bioquímicos séricos. Alterações macroscópicas, histológicas e nos níveis séricos de fosfatase alcalina indicam a indução da fibrose hepática nos ratos Wistar tratados com DMN na dose de 10 µg/g de peso animal por três dias consecutivos durante quatro semanas, mas não observamos nenhum efeito induzido pela hepatectomia. Porém, este modelo com DMN se mostra semelhante a estágios iniciais de uma fibrose hepática. O transplante de 1 x 107 CTM de veia de cordão umbilical humano (VCUH) no modelo de injúria hepática induzida por DMN não resultou em melhora da fibrose, diminuição dos níveis séricos de fosfatase alcalina e nem em ganho de peso dos animais quando comparados aos animais tratados com PBSA após a injúria hepática (grupo placebo). Em conjunto, esses resultados sugerem que CTM humanas se diferenciam após tratamentos mais complexos, onde os indutores hepatogênicos são sequencialmente adicionados ao meio de modo a mimetizar a sinalização durante o desenvolvimento embrionário. O transplante de CTM de VCUH parece não ter efeito positivo em um modelo pré-clínico de injúria hepática similar a estágios iniciais de fibrose. Financiado por CNPq (573578/2008-7) e FAPESP (2007/54260-2). / This study aimed to develop an in vitro differentiation protocol of mesenchymal (MSC) stem cells to hepatocytes and to standardize an animal model for hepatic fibrosis induced by dimethylnitrosamine (DMN) for preclinical transplant assays of MSC. MSC isolated from various sources presented fibroblastoid morphology, plastic adherence, and the expected pattern of cell surface markers by flow cytometry analysis. The capacity of osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation of these cells was confirmed by alizarin red, oil red and toluidine blue staining, respectively, confirming that the cells isolated for this study behave as MSC, as proposed by the International Society for Stem Cell Research. Hepatogenic differentiation was evaluated by analysis of cell morphology, capacity to store glycogen confirmed by PAS (periodic acid-Schiff), albumin synthesis confirmed by immunofluorescence, as well as hepatic-specific gene expression verified by real time PCR assays. Based on the published literature on hepatic differentiation, several protocols of one, two, and three steps were tested. Human MSC differentiated solely when treated in a three step-protocol, showing the ability to produce and store glycogen and synthesize albumin; however the expression of hepatic-specific genes such as albumin, α-fetoprotein and c-Met was not increased. An endoderm differentiation stage, added to the hepatic differentiation protocol, increased the capacity to produce and store glycogen of differentiated MSC. In order to standardize the model of liver fibrosis induced by DMN, dose-response experiments were performed and the effect of hepatectomy in mixed models DMN/hepatectomy was observed. Severity of liver injury and the effect of cell transplantation were evaluated by macroscopic analysis of the livers, histology of liver biopsies stained with HE and Masson\'s trichrome, and evaluation of serum biochemical parameters. The macroscopic and histological observations, and altered alkaline phosphatase serum levels indicated the success in inducing liver fibrosis in DMN-treated rats at a dose of 10 µg/g of animal weight for three consecutive days, during four weeks, without any additional effect upon hepatectomy. Transplanting 1 x 107 umbilical cord MSC in the model of liver injury induced by DMN did not result in improvement of the fibrosis, decrease of alkaline phosphatase serum levels, or in weight gain of the treated animals compared to animals treated with PBSA after liver injury (placebo group). Together, these results suggest that human MSC are capable of differentiating to hepatocyte-like cells after more complex protocols, where hepatogenic inducers are sequentially added to the medium in order to mimic signaling that occurs during fetal development. Transplantation of undifferentiated umbilical cord MSC did not have any positive effect in a preclinical liver injury model characterized by an early stage of fibrosis. Supported by CNPq (573578/2008-7) and FAPESP (2007/54260-2).

INTRODUÇÃO: Apesar dos primeiros relatos sobre o uso clínico de células estromais derivadas do tecido adiposo (ADSC) sugerirem que esta abordagem seja factível e efetiva na reconstrução de partes moles, não existem na literatura ensaios clínicos randomizados e com inclusão de controles. Assim sendo, foi objetivo deste estudo investigar se um novo protocolo para o isolamento de ADSC e seu uso em conjunto com os enxertos de gordura é de fato capaz de aumentar a sobrevivência destes enxertos. MÉTODOS: Pacientes com microssomia craniofacial (n=18) foram selecionados e randomicamente distribuídos para o grupo EC (com suplementação de ADSC) ou o grupo EE (sem suplementação de ADSC). Para o grupo EC, ADSC imediatamente isoladas a partir de metade do volume lipoaspirado foram utilizadas para o enriquecimento de células progenitoras do enxerto. A quantidade de tecido adiposo transplantado foi determinada pela simetria com o lado não afetado, não sendo realizado qualquer tipo de supercorreção. O número total de células viáveis isoladas antes e após a suplementação dos enxertos de gordura foi calculado, e através de citometria de fluxo estas células foram examinadas quanto à presença de marcadores de superfície para células mesenquimais. Tomografia computadorizada foi realizada para avaliar ambas as hemifaces no pré-operatório e no pós-operatório de seis meses. A espessura do revestimento de partes moles em quatro diferentes pontos de referência e o volume das hemifaces foram calculados. Morbidade geral e variáveis transoperatórias foram registradas. RESULTADOS: Para ambos os grupos o volume médio injetado foi de aproximadamente 28 mL. O número médio de células viáveis isoladas antes e após a suplementação dos enxertos foi 5,6 x 105 e 9,9 x 105 células por mL de tecido adiposo (p=0,015). Análise de citometria de fluxo revelou que ADSC foram positivas para marcadores de células mesenquimais (>95% para CD 73 e CD 105). No pós-operatório de seis meses, o índice de espessura média nos pontos de 1 a 4 foi de 0,91 (p=0,002), 1,02 (p=0,01), 1,05 (p=0,001), e 1,00 (p=0,04) no grupo EC, e 0,80 (p=0,58), 0,95 (p=0,18), 0,85 (p=0,009), e 0,84 (p=0,59) no grupo EE. Para o grupo EC o volume de gordura mantido após seis meses foi de 84 % e para o grupo EE foi de 51 % (p=0,003). Nenhuma complicação foi detectada. CONCLUSÕES: Estes resultados sugerem que o isolamento e a suplementação de ADSC é efetivo, seguro e superior à lipoenxertia convencional para o aumento de partes moles da face em pacientes portadores de microssomia craniofacial / INTRODUCTION: Although first reports of the clinical use of adipose-derived stromal cells (ADSC) suggest that this approach may be feasible and effective for soft tissue reconstruction, there is a lack of randomized, controlled clinical trials in the literature. Hence, this study aimed to investigate whether a novel protocol for isolation of ADSC and their use in combination with fat tissue could really improve the long-term retention of the grafts. METHODS: Patients with craniofacial microsomia (n=18) were selected and randomly assigned to group EC (with supplementation of ADSC) or group EE (without supplementation of ADSC). For group EC, ADSC freshly isolated from half of the aspirated fat sample were used to enrich for progenitor cells in the graft. Amount of transplanted adipose tissue was determined by trying to obtain symmetry with the unaffected side without any overcorrection. Number of viable cells isolated before and after the supplementation of the grafts was calculated, and these cells were examined for mesenchymal cell surface markers using flow cytometry. Computed tomography was performed to assess both hemifaces preoperatively and at six months postoperatively. Soft tissue thicknesses at four different reference points and the hemifaces volume were calculated. Overall morbidity and surgical variables were recorded. RESULTS: For both groups mean injected volume was 28 mL. Average number of viable cells isolated before and after supplementation of the grafts was 5,6 x 105 and 9,9 x 105 cells per mL of fat tissue (p=0,015). Flow cytometry analysis revealed that the ADSC were positive for mesenchymal cell markers (>95% for CD 73 and CD 105). At six months postoperatively, average thickness ratio at points 1 to 4 was 0,91 (p=0,002), 1,02 (p=0,01), 1,05 (p=0,001), and 1,00 (p=0,04) in group EC, and 0,80 (p=0,58), 0,95 (p=0,18), 0,85 (p=0,009), and 0,84 (p=0,59) in group EE. For group EC surviving fat volume at six months was 84 % and for group EE it was 51 % (p=0,003). No complications were detected. CONCLUSIONS: These results suggest that this strategy for isolation and supplementation of ADSC is effective, safe and superior to conventional lipoinjection for facial recontouring in patients with craniofacial microsomia

A sepse é uma doença relacionada como a presença de infeção junto a uma resposta inflamatória sistêmica; sua fisiopatologia envolve uma rede complexa de citocinas e mediadores inflamatórios que causam a injúria de diversos tecidos. Na atualidade são muitas as tentativas para diminuir a mortalidade, porém até agora, não existe uma estratégia específica para tratar a doença. As células-tronco mesenquimais da geleia de Wharton do cordão umbilical (CTM-GW) são conhecidas por expressar genes e fatores envolvidos na angiogênese e imunomodulação. Nós usamos o modelo de ligadura e punção do ceco (LPC) para analisar o papel da CTM-GW em disfunção orgânica relacionada à sepse. Foi utilizada a citometria de fluxo para avaliar o fenótipo das células isoladas. Dividimos ratos Wistar em grupos: sham (operação simulada); LPC; e LPC + CTM (106 CTM-GW i.p., 6 horas após LPC). Às 24 h pós-LPC, foram avaliadas a função renal, hepática e outras variáveis do estudo. As CTM-GW foram negativas para CD3, CD34, CD45 e HLA-DR, enquanto eles foram positivos para CD73, CD90 e CD105. O tratamento com CTM na sepse reduziu a mortalidade, melhorou a filtração glomerular (aferido pelo clearance de inulina), função tubular, reduziu a lesão hepática e demostrou uma ação anti-inflamatória. O tratamento também apresentou um efeito anti-apoptótico e protetor do tecido renal e do endotélio, mediante a regulação da expressão de VEGF, AQP2 e eNOS. Em conclusão as CTM-GW diminuem a injúria renal e hepática, portanto, pode desempenhar um papel protetor na sepse / Sepsis is a disease related to the presence of infection with a systemic inflammatory response. The pathophysiology involves complex cytokine and inflammatory mediator networks that cause injury to various tissues. Currently, there are many attempts to reduce mortality, but so far, there is no specific strategy for treating the disease. Human umbilical cord Wharton\'s jelly-derived mesenchymal stem cells (hWJ-MSCs) are known to express genes and factors involved in angiogenesis and immunomodulation. We used a cecal ligation and puncture (CLP) model to analyze the role of hWJ-MSCs in sepsis-related organ dysfunction. We used flow cytometry to evaluate hWJ-MSC phenotypes. We divided Wistar rats into groups: sham (sham-operated); CLP; and CLP+MSC (106 WJ-MSCs, i.p., 6 h after CLP). At 24 h post-CLP, we evaluated renal function, liver and other variables. hWJ-MSCs were negative for CD3, CD34, CD45 and HLA-DR, whereas they were positive for CD73, CD90 and CD105. In sepsis, treatment with MSC reduced mortality, improved glomerular filtration rate (measured by inulin clearance), tubular function, reduced liver damage and decreased the inflammatory markers. The treatment also showed an anti-apoptotic effect and protected the renal tissue and endothelium by up-regulation the expression of VEGF, AQP2 and eNOS. In conclusion, hWJ-MSCs decrease renal and hepatic injury, therefore, may play a protective role in sepsis

A regeneração de defeitos ósseos continua sendo um grande desafio na área de Odontologia e Medicina. É bem estabelecido que células-tronco mesenquimais (CTMs) e osteoblastos (OBs) desempenham um papel crítico na osteogênese, tornando-se candidatos a utilização em procedimentos de terapia celular que visam otimizar o processo de reparação óssea. Porém, pouco se sabe sobre a interação entre CTMs e OBs, e a maioria dos estudos enfatiza o efeito dos OBs sobre CTMs, fazendo com que a influência das CTMs na atividade osteogênica dos OBs continue sendo uma questão desafiadora. Baseados em nossos estudos anteriores, formulamos a hipótese de que a terapia celular que fizesse uso de uma associação de CTMs e OBs poderia ser mais eficaz para o reparo do tecido ósseo do que essas células isoladamente, principalmente como resultado da estimulação de OBs por CTMs. Para tal, foi realizado estudo in vitro para avaliar os efeitos das CTMs sobre os OBs e in vivo para avaliar os efeitos dessas células, isoladamente e combinadas, sobre a reparação óssea. CTMs da medula óssea de rato foram cultivadas em meio de crescimento para manterem-se como CTMs ou em meio osteogênico para diferenciarem-se em OBs. Após alcançar a subconfluência, as células foram cultivadas in vitro em três diferentes condições: (1) co-cultura direta de CTMs e OBs usando três proporções celulares (1:1, 1:2 e 2:1), (2) co-cultura indireta de CTMs e OBs usando insertos e (3) OBs cultivados em meio condicionado por CTMs. Para avaliação das respostas celulares foram realizados ensaios de proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP), formação de matriz mineralizada, expressão gênica de marcadores osteoblásticos, imunolocalização de sialoproteína óssea (BSP) e osteopontina (OPN) e migração celular. Para os experimentos in vivo, as células foram carreadas em esponja de colágeno através de vários ciclos de centrifugação. Após, defeitos ósseos em calvária de rato foram preenchidos com (1) esponja de colágeno sem células, (2) esponja de colágeno com CTMs, (3) esponja de colágeno com OBs e (4) esponja de colágeno com associação de CTMs e OBs. Para avaliação da reparação óssea in vivo após 4 semanas, foram realizadas análises histomorfométricas através de cortes histológicos e microtomografia computadorizada. Os dados foram comparados pelo teste de Kruskal-Wallis e, se necessário pelo teste de Mann-Whitney (p≤0,05). Foi observado que CTMs têm efeito repressivo sobre a proliferação e as expressões fenotípicas e genotípicas de OBs (P≤0,05). Em relação ao reparo dos defeitos ósseos, somente naqueles tratados com células observou-se formação óssea predominantemente como ilhotas isoladas e diferenças, principalmente qualitativas, entre os tipos celulares utilizados, com tendência de maior formação óssea em defeitos tratados com OBs em comparação ao uso de CTMs. Com base nos resultados obtidos, pôde-se concluir que as CTMs apresentam efeito inibitório sobre OBs e que a terapia celular com OBs parece ser mais eficaz no reparo do tecido ósseo. / The regeneration of bone defects remains a major challenge in the field of Dentistry and Medicine. It is well known that mesenchymal stem cells (MSCs) and osteoblasts (OBs) play critical roles in osteogenesis, making them promising alternatives to be employed in cell therapy procedures to enhance the process of bone regeneration. Studies about the crosstalk between MSCs and OBs are mainly focused on the effect of OBs on MSCs, thus how MSCs may affect OBs phenotype expression remains a challenging question. Based on our previous studies, we have hypothesized that cell therapy using a combination of MSCs and OBs could be more effective for the bone repair than these cells separately, mainly due to the stimulation of OBs by MSCs. For this, we carried out in vitro experiments to evaluate the effects of MSCs on the OBs and in vivo experiments to assess the effects of these cells either isolated or combined on bone repair. Rat bone marrow MSCs were cultured either in growth medium to keep MSCs features or in osteogenic medium to differentiate into OBs. After reaching subconfluence, cells were grown in vitro in three different conditions: (1) direct coculture of MSCs and OBs using three cell proportions (1:1, 1:2 and 2:1), (2) indirect coculture of MSCs and OBs using transwell porous filters and (3) OBs cultured in MSCs conditioned medium. Cell responses were evaluated by assaying cell proliferation, alkaline phosphatase activity (ALP), mineralized matrix formation, gene expression of osteoblast markers, immunolocalization of bone sialoprotein (BSP) and osteopontin (OPN), and cell migration. For in vivo experiments, cells were seeded into collagen sponge by a centrifugation method. After, calvarial defects were implanted with (1) collagen sponge without cells, (2) collagen sponge with MSCs, (3) collagen sponge with OBs, and (4) collagen sponge and association of MSCs with OBs. To evaluate bone repair at the end of 4 weeks, histomorphometric analyzes were carried out using histological slides and micro-computed tomography. Data were compared by Kruskal-Wallis test and, if appropriated, by Mann-Whtiney test (p≤0.05). It was observed that MSCs repressed proliferation, phenotypic and genotypic expressions of OBs (P≤0.05). Bone formation was observed only in cell treated defects as isolated islets and qualitative differences were noticed among cell types, with a tendency of more bone formation in OBs treated defects compared with MSCs ones. Based on these results, we can conclude that MSCs exhibited inhibitory effect on OBs and that cell therapy with OBs seemed to be more effective for bone repair.

As coronárias derivam do proepicárdio, uma estrutura formada por precursores dos constituintes de vasos coronários, células endoteliais e musculares lisas (CoSMC). In vivo observa-se um marcante atraso entre a diferenciação endotelial e a integração de CoSMC à parede do vaso. O objetivo deste trabalho foi identificar os mecanismos que inibem a diferenciação a CoSMC in vivo. Baseados na perda progressiva da expressão de raldh2, a principal enzima de síntese de ácido retinóico (AR), nós exploramos a sinalização por AR como um possível inibidor da diferenciação a CoSMC. Através de um vetor adenoviral de expressão de raldh2 e da inibição in vivo da síntese de AR nós demonstramos que a sinalização por AR bloqueia a diferenciação a CoSMC dos precursores coronários. Nós também identificamos o VEGF como um fator chave no controle da diferenciação a CoSMC. Em conjunto, nossos dados suportam o modelo que a síntese de AR e VEGF durante o desenvolvimento cardíaco foi co-optada para o bloqueio da diferenciação a CoSMC até o estabelecimento de uma vasta malha vascular. / Coronary vessels derive from the proepicardium (PE), a structure formed by precursor of coronary vessels cells, endothelial and smooth muscle cells (CoSMC). In vivo there is a clear gap between the endothelial differentiation and the integration of CoSMC into the vascular tubes. The aim of this work was to understand the mechanisms controlling the delayed in vivo CoSMC differentiation. Based on the progressive loss of expression of raldh2, the main retinoic acid (RA) synthesizing enzyme, we explored the RA signaling as a possible candidate inhibitor of CoSMC differentiation. Using a adenoviral raldh2 expression system and in vivo inhibition of RA synthesis we showed that RA signaling act as a brake to slow CoSMC differentiation in PE-derived cells. We also identified VEGF as key factor acting on the control of CoSMC differentiation. Together our results support a model that AR and VEGF synthesis during cardiac development was co-opted to block the CoSMC differentiation of coronary precursors before an extensive endothelial network of tubes is established.