O tumor mamário é a segunda neoplasia maligna mais incidente em cães, com uma elevada taxa de mortalidade. Em cães, constituem aproximadamente 52% de todos os tumores que afetam as fêmeas, possuindo uma elevada heterogeneidade biológica e histomorfológica, sendo que 50% são malignos. As neoplasias, independentemente de suas causas primárias, apresentam distúrbios no controle do ciclo celular, o que acaba gerando um aumento na proliferação celular, perda da diferenciação e formação de massas tumorais. Na gênese das neoplasias mamárias estão envolvidos fatores de natureza genética, ambiental e hormonal. O objetivo deste trabalho foi avaliar "in vitro" o efeito da terapia com célula- tronco da medula óssea canina de feto em tumores mamários canino. Após a avaliação histopatológica os tumores foram divididos em grupos de grau I (adenocarcinoma, sem metástase), grau II (carcinoma com metástase regionais) e grau III (carcinomas com metástases sistêmicas). As células dos tumores mamários caninos (TM) e as células - tronco de medula óssea de feto canina (CTMs) foram caracterizadas antes e após o tratamento utilizando marcadores de proliferação, angiogênese e da resposta inflamatória através da citometria de fluxo. A expressão de marcadores de proliferação celular Ki67 foi maior nas linhagens tumorais dos carcinomas grau III, o mesmo observado para os marcadores que regulam a angiogênese e migração celular como VEGFR1, CD44, COX-2 e EGFR. Foi possível observar nas culturas celulares de TM a redução do potencial elétrico mitocondrial alterando permeabilidade da membrana ativando a caspase 3 e reduzindo a Bcl-2, sugerindo que a CTM apresenta efeitos antitumorais pela indução de apoptose e efeitos antiproliferativos da expressão de COX-2 e IL-6 inibindo a proliferação celular levando ao acúmulo das células na fase G0/G1. . A terapia celular com CTMs proporciona novas expectativas para o tratamento de diversas patologias que acometem diferentes espécies.. Desta forma, os resultados os resultados obtidos pela expressão das TM tratadas com CTM pode apresentar como uma nova perspectiva no tratamento de tumores em cadelas. / The breast tumor is the second most frequent malignancy in dogs, with a high mortality rate. In dogs, they constitute approximately 52% of all tumors affecting female, having a high biological and histomorphological heterogeneity, and 50% are malignant. Neoplasms, regardless of their root causes, have disturbances in cell cycle control, which ends up generating an increase in cell proliferation, differentiation loss and formation of tumor masses. In the genesis of mammary tumors are involved genetic, environmental and hormonal factors nature. The objective of this study was to evaluate "in vitro" the effect of therapy with stem cell-canine bone marrow fetus in canine mammary tumors. After histopathological evaluation tumors were divided into grade I groups (adenocarcinoma without metastasis), grade II (carcinoma with regional metastasis) and grade III (carcinomas with metastatic disease) .The cells of canine mammary tumors (TM) and cells - bone marrow stem canine fetuses (MSCs) were characterized before and after treatment using proliferation markers, angiogenesis and inflammatory response by flow cytometry. The expression of cell proliferation markers Ki67 was higher in tumor cell lines of the carcinomas grade III, the same was observed for markers that regulate angiogenesis and cell migration as VEGFR1, CD44, COX-2 and EGFR. It was observed in TM cell cultures to reduce the electric potential changing mitochondrial membrane permeability by activating caspase 3 and reduces Bcl-2, suggesting that MSC has antitumor effects by inducing apoptosis and antiproliferative effects of COX-2 expression and IL-6 inhibiting cell proliferation leading to an accumulation of cells in G0 / G1 phase. Cell therapy MSCs provides new expectations for the treatment of various pathologies affecting different species. Thus, the results the results obtained by the expression of TM-treated MSC can present as a new approach in the treatment of tumors in dogs..

Orientador: Rogério Martins Amorim / Coorientador: Ana Liz Garcia Alves / Banca: Rui Seabra Ferreira Junior / Banca: Fernanda da Cruz Landim / Resumo: Estudos demonstram o grande potencial do uso das células estromais mesenquimais multipotentes (MSCs) como terapia celular. Seu uso em lesões neurológicas, que usualmente apresentam difícil regeneração, tem sido estudado pelo fato das MSCs apresentarem baixa imunogenicidade efeitos imunomoduladores e neuroregenerativos. Nesse contexto, o presente estudo avaliou a viabilidade e a segurança do transplante de MSCs alogênicas provenientes do tecido adiposo, medula óssea e cordão umbilical de equinos, pela via intratecal através do espaço intervertebral C1-C2, por meio de exame neurológico seriado, análises hematológicas e determinação dos níveis séricos de proteínas de fase aguda. Foram utilizados 16 equinos saudáveis, divididos em quatro grupos: grupo SHAM (SHAM) que recebeu o transplante de salina tamponada com fosfato (PBS); grupo tecido adiposo (GTA), recebeu MSCs de origem do tecido adiposo; grupo medula óssea (GMO), recebeu MSCs de origem da medula óssea; e grupo cordão umbilical (GCU), recebeu células de origem da matriz do cordão umbilical. Foram realizadas três aplicações com intervalo de 30 dias em cada grupo, e coletou-se amostras de sangue, nos momentos que antecederam os transplantes, M0, M30 e M60 e 24 horas, após o transplante, M1, M31, M61. E por último foi realizada uma coleta 30 dias após M60, caracterizando M90. Não foram observadas alterações do exame clinico, hematológico e nas proteínas de fase aguda relacionadas aos sucessivos transplantes intratecais de MSC... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Studies demonstrate the great potential of using multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) as cell therapy. Its use in neurological lesions, which usually present difficult regeneration, has been studied because MSCs have low immunogenicity and immunoregulatory and neuroregenerative effects. In this context, the present study evaluated the viability and safety of transplantation of allogeneic MSCs from the adipose tissue, bone marrow and umbilical cord of horses, through the intrathecal route through the C1-C2 intervertebral space, through serial neurological examination, hematological analyzes and determination of serum levels of acute phase proteins. Sixteen healthy horses were used, divided into four groups: SHAM group (SHAM) that received phosphate buffered saline (PBS) transplantation; adipose tissue group (GTA), received adipose tissue MSCs; bone marrow group (GMO), received MSCs from bone marrow origin; and umbilical cord (UGC) group, received cells from the umbilical cord array. M0, M30 and M60 were collected at the time of the transplantation, M1, M31 and M61 and 24 hours after transplantation. And finally a collection was performed 30 days after M60, characterizing M90. There were no changes in the clinical, hematological and acute phase-related proteins related to successive intrathecal transplantations of MSCs, nor were there alterations that contra indicated the use of any of the cellular sources, demonstrating that the protocol used, as well as any of cellula... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Apesar do grande potencial de regeneração do tecido ósseo, em algumas situações a extensão da lesão impede que o tecido se repare completamente. Como uma alternativa em relação aos tratamentos convencionais, a terapia celular tem sido considerada como promissora para o reparo de defeitos ósseos. No entanto, poucos estudos investigaram a terapia celular utilizando osteoblastos, portanto, avaliamos o efeito da injeção direta de osteoblastos na regeneração do tecido ósseo. Como os osteoblastos têm origens embrionárias diferentes, foi comparado in vitro o potencial osteogênico de osteoblastos derivados da crista neural, do mesoderma e de ambas as origens embrionárias. Considerando a necessidade de grande número de células para a terapia, foi comparado o efeito de uma subcultura, como meio de aumentar a quantidade de células, no potencial osteogênico dos osteoblastos. Para avaliação da regeneração dos defeitos, osteoblastos foram injetados diretamente nesses defeitos. Osteoblastos foram obtidos da calvária de ratos recém-nascidos (Wistar), sendo que os derivados da crista neural foram isolados dos ossos frontais (OB-CN); os do mesoderma isolados dos ossos parietais (OB-MS); e de ambas as origens embrionárias isolados de toda a calvária (OB-Cal). O efeito da subcultura no potencial osteogênico foi avaliado em OB-Cal ou na primeira passagem dessa cultura (OB-Cal P1). Após até 14 dias em cultura, foram avaliadas a proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP), formação de matriz extracelular mineralizada e a expressão dos genes marcadores osteoblásticos: fator de transcrição runt-related 2 (RUNX2), ALP, osteocalcina (OC) e sialoproteína óssea (BSP). Para avaliar a regeneração do tecido ósseo, foram criados defeitos de 5 mm de diâmetro na calvária de ratos Wistar, que após 2 semanas foram tratados com 5 x 106 osteoblastos derivados de OB-Cal P1, por meio de injeção local. Ao final de 4 semanas, a formação óssea foi avaliada por microtomografia computadorizada e análise histológica. Os dados foram comparados por ANOVA, seguido do teste de Student-Newman-Keuls, ou teste t, quando apropriado, considerando o nível de significância de 5%. A comparação do potencial osteogênico em relação à origem embrionária mostrou que, os OB-MS apresentaram maior proliferação mas não houve diferença entre as culturas no evento final da diferenciação osteoblástica, que é a formação de matriz mineralizada. No entanto, como as culturas de OB-Cal apresentaram maior expressão gênica de marcadores iniciais, intermediários e finais dessa diferenciação; e considerando que, essas culturas são aquelas nas quais é possível obter o maior número de células, optamos por utilizar essas culturas na avaliação da formação óssea induzida pela terapia celular. Além disso, os resultados mostraram que os OB-Cal P1 tem seu potencial osteogênico reduzido, mas considerando que a subcultura permite a obtenção de maior número de células, são uma boa escolha para a terapia celular. Tanto que, ao avaliar in vivo a capacidade regenerativa das OBCal P1 no reparo dos defeitos ósseos, as análises microtomográficas e histológicas mostraram que que a terapia celular com injeção local de osteoblastos obtidos de fragmentos ósseos da calvária constitui uma estratégia adequada para estimular o reparo ósseo / Despite of the great potential of regeneration of the bone tissue, in some situations the extension of the lesion prevents the tissue from repairing completely. As an alternative to conventional treatments, cell therapy has been considered a promising strategy for the repair of bone defects. However, few studies investigated cell therapy using osteoblasts, therefore, we evaluated the effect of direct injection of osteoblasts on the regeneration of bone tissue. Since osteoblasts have different embryonic origins, the osteogenic potential of osteoblasts derived from neural crest, mesoderm and both embryonic origins was compared in vitro. Considering the need for a large number of cells for the therapy, the effect of a subculture, a common way to increase the amount of cells, on the osteogenic potential was also compared. Then, osteoblasts were injected directly into bone defects to evaluate the regeneration of bone tissue. Osteoblasts were obtained from the calvaria of newborn rats (Wistar), the neural crest derivatives were isolated from the frontal bones (OB-CN); those of the mesoderm isolated from the parietal bones (OB-MS); and from both embryonic origins isolated from the entire calvaria (OB-Cal). The effect of the subculture on the osteogenic potential was evaluated in OB-Cal and in its firstpassage (OB-Cal P1). After up to 14 days, all cultures were assayed for cell proliferation, alkaline phosphatase activity (ALP), mineralized extracellular matrix formation and the expression of the osteoblastic marker genes: runtrelated transcription factor 2 (RUNX2), ALP, osteocalcin (OC) and bone sialoprotein (BSP). To evaluate the effect of cell injection on bone regeneration, defects of 5 mm diameter were created in the calvaria of Wistar rats, that after 2 weeks were injected with 5 x 106 OB-Cal P1-derived osteoblasts. Vehicle injections were used as control. At the end of 4 weeks, the bone formation was evaluated by computerized microtomography and histological analysis. Data were compared by ANOVA, followed by the Student-Newman-Keuls test, or ttest, when appropriate, and the level of significance was set at 5%. The comparison of the osteogenic potential related to the embryonic origin showed that the OB-MS presented a greater proliferation but there was no difference between the cultures in the final event of the osteoblastic differentiation, that is the formation of mineralized matrix. However, as OB-Cal cultures showed greater gene expression of initial, intermediate and final markers of this differentiation; and considering that these cultures are those in which it is possible to obtain the largest number of cells, we selected these cultures for evaluating the bone formation induced by the cell therapy. In addition, the results showed that OB-Cal P1 still holds its osteogenic potential and despite being lower than that of OB-Cal as the subculture allows obtaining more cells, it has been considered as a good choice for cell therapy. In agreement with this, OB-Cal P1-derived osteoblasts injected into the bone defects were capable of inducing more bone formation than control, as revealed by microtomographic and histological analyzes. Therefore, it supports the idea that cell therapy with local injection of osteoblasts obtained from calvarial bone fragments is an adequate strategy to stimulate bone formation

Linfedema é uma condição crônica que predispõe a uma substancial morbidade e perda da função do órgão ou tecido afetado. Ele não tem cura e em longo prazo leva a dificuldades físicas e psicológicas ao paciente, tornando-se um grande desafio para os médicos. Infelizmente, é triste constatar que aproximadamente 400 anos após a descoberta dos vasos linfáticos, não há cura para o linfedema, sendo o tratamento baseado em drenagem linfática manual através de massagem e limitadas intervenções de fisioterapia, ambas visando redução do volume de edema, o que fornece alívio parcial para os indivíduos afetados que não garantem o desaparecimento da fibrose, aparentemente irreversível. Por isso, estudos que proporcionem novas intervenções, como a terapia celular com células-tronco, são de grande interesse. Neste trabalho tivemos como objetivo realizar terapia celular de linfedema murino utilizando células-tronco da membrana amniótica. Em um primeiro momento, a obtenção do modelo de insuficiência linfática foi feita com base em Tabibiazar et al., 2006 onde uma microablação de 2 mm em toda a circunferência foi feita na cauda do animal. Entretanto, após 30 dias de indução uma regressão espontânea foi observada inviabilizando a utilização deste modelo. Após vasta pesquisa na literatura outro modelo de indução de linfedema (Shimizu et al., 2012) foi encontrado, onde os autores fazem uma microablação cirúrgica, mantendo um flap de 4 mm na região ventral. Neste trabalho os autores obtiveram um linfedema estável por no mínimo 30 dias. Com base nestes achados, o modelo de linfedema murino induzido baseado em Shimizu foi realizado e após a comprovação desta estabilidade por 60 dias, esse modelo foi utilizado para indução do linfedema. Após esta caracterização, os animais que tiveram o linfedema induzido foram submetidos a terapia celular utilizando 0,5X106 células-tronco da membrana amniótica humana (MAh) ou saco vitelino canino (SVc) no momento da indução. Animais sem lesão, com lesão (SHAM) e tratados apenas com solução fisiológica (placebo) também foram analisados. O monitoramento do linfedema na cauda foi feito através de acompanhamento clínico, registro fotográfico e mensura do diâmetro caudal a cada 2-3 dias. Ao final do estudo, os animais foram eutanasiados, tiveram suas caudas removidas e foram submetidos a avaliação dos efeitos terapêuticos da terapia celular através de análise do exsudato, análises histológicas (HE, picrossírius) e imuno-histoquímicas. A histológica obtida por coloração de HE além de apresentar o melhor resultado quando comparado com as demais técnicas, possibilitou avaliar as alterações patológicas pertinentes de cada amostra, revelando efeitos benéficos da terapia quando comparados com SHAM e placebo. Já, a coloração Picrossírius permitiu visualizar além das alterações estruturais, a inversão da predominância da expressão de colágeno do tipo I, por colágeno do tipo III nos tecidos estruturalmente comprometidos. O resultado do conjunto de análises das amostras apresentou o padrão linfedematoso esperado para os grupos SHAM e placebo, porém também mostrou um processo inflamatório muito menor e mais curto nos grupos MAh, e SVc, permitindo sugerir que a terapia celular causou um impacto favorável e os animais apresentaram resultados muito próximos aos padrões exibidos pelo grupo controle. / Lymphedema is a chronic condition, which predisposes to substantial morbidity and loss of function of the affected organ or tissue. It has no cure and, in the long term, leads patients to physical and psychological problems, which is a major challenge for doctors. Unfortunately, it is sad to realize that, approximately 400 years after the discovery of the lymphatic vessels, there is no cure for lymphedema. The treatment is based on manual lymphatic drainage through massage and limited physiotherapy interventions. Both techniques aim at reducing the volume of the edema, which provides partial relief for affected individuals, but do not guarantee the disappearance of the fibrosis, which is, apparently, irreversible. Therefore, studies that provide new interventions, such as stem cell therapy, are of great interest. In this study, we carried out induced murine lymphedema using human amniotic membrane stem cells. At first, we obtained the model of lymphatic insufficiency based on Tabibiazar et al., 2006, in which a 2 mm microablation throughout the circumference was made in the tail of the animal. However, after 30 days of induction, a spontaneous regression was observed, making this model unusable. After extensive literature research, another model of lymphedema induction (Shimizu et al., 2012) was found. In this model, the authors perform a surgical microablation, maintaining a 4 mm flap in the ventral region. The authors obtained stable lymphedema for at least 30 days. Based on these findings, the model of induced murine lymphedema, based on Shimizu et al., 2012, was performed and, after proving this stability for 60 days, this model was used for the induction of murine lymphedema. After this characterization, the animals that have had induced lymphedema were subjected to cell therapy using 0.5X106 human amniotic membrane stem cells (MAh) or canine yolk sac (SVc) at the time of induction. Animals without lesion, with lesion (SHAM) and treated only with solution were also analyzed. The monitoring of lymphedema in the tail was done through clinical follow-up, photographic record and caudal diameter measurement every 2-3 days. At the end of the study, the animals were euthanized, had their tails removed, and were subjected to evaluation of the therapeutic effects of the cell therapy through exudate analysis, histological analysis (HE, picrosirius) and immunohistochemistry analysis. The histological obtained by HE staining, besides presenting the best result when compared to the other techniques, allowed to evaluate the pertinent pathological alterations of each sample, revealing beneficial effects of the therapy when compared to SHAM and placebo. Picrosirius staining allowed to visualize, in addition to the structural alterations, the reversal of the predominance of type I collagen expression by type III collagen in structurally compromised tissues. The result of the sample analysis showed the expected lymphomatoid pattern for the SHAM and placebo groups, but also showed a much shorter and shorter inflammatory process in the MAh and SVc groups, suggesting that the cell therapy had an impact and the animals presented results very close to the standards presented by the control group.

Na espécie equina, as enfermidades osteoarticulares causam prejuízo econômico e impacto negativo no desempenho atlético, devido aos danos causados na cartilagem articular. A regeneração da cartilagem hialina e a manutenção da integridade das estruturas que a compõe norteiam a busca do tratamento ideal. Neste contexto, este estudo foi delineado com o objetivo de investigar a presença de células-tronco mesenquimais (CTMs) no líquido sinovial (LS) e na membrana sinovial (MS) de equinos com articulações hígidas, com osteocondrite dissecante (OCD) e com osteoartrite (OA) e compará-las, visando estabelecer qual fonte celular possui melhor característica fenotípica e capacidade de diferenciação celular, mais especificamente, aquela que seja superior em relação à capacidade condrogênica. Foram utilizados equinos machos e fêmeas de diferentes idades, totalizando 97 articulações. O LS e MS foram coletados durante artroscopia e as células foram cultivadas, e avaliadas por citometria de fluxo com os anticorpos CD44, CD90, CD105, CD34; e por imunocitoquímica com os anticorpos nanog, oct4, PGP 9.5, lisozima, vimentina e citoqueratina. Adicionalmente, o potencial de diferenciação das células foi avaliado para as linhagens condrogênica, osteogênica e adipogênica. Foi realizado teste de tumorigenicidade em camundongos Balb-Cnu/nu, para comprovar aplicabilidade clínica, e posteriormente, as CTMs provenientes de LS de articulações hígidas foram aplicadas em articulações de equinos. A identidade das células foi comprovada durante o cultivo demonstrando características de adesão ao plástico e morfologia fibroblastóide. A média percentual das populações positivas para CD90 foi de 64,9% (LS-H), 48,3% (LS-OCD), 48,1% (LS-OA), 66,6% (MS-H), 40,2% (MS-OCD) e 40,3% (MS-OA). A porcentagem de células positivas para CD44 foi de 1,18% (LS-H), 3,98% (LS-OCD), 14,2% (LS-OA), 1,9% (MS-H), 2,17% (MS-OCD) 8,56% (MS-OA). Não foi observada expressão dos anticorpos CD34 e CD105. Na análise imunocitoquímica foi detectada expressão positiva para os anticorpos: lisozima, PGP 9.5, PCNA e vimentina, e negativa para nanog, oct4 e citoqueratina. A multipotência (osteogênica, condrogênica e adipogênica) das células foi confirmada através da coloração Alizarin Red para detecção de matriz de cálcio, Oil Red O para detecção de gotículas de gordura e azul de toluidina, alcian blue e hematoxilina eosina para detecção de matriz de proteoglicanos. Com relação aos resultados do teste tumorigênico, nenhum órgão dos camundongos foi afetado, assegurando a aplicabilidade das células estudadas. Ainda, as articulações de equinos tratadas, não apresentaram quaisquer sinais de reação inflamatória após aplicação de células alogênicas. Por fim, concluímos que, a fenotipagem positiva de CD44 e CD90 somada à capacidade de diferenciação nas linhagens osteogênica e condrogênica confirma a presença de CTMs nas populações celulares obtidas de LS e MS de equinos. Também foi observado que as células de LS provenientes de articulações hígidas, são as de melhor utilização clínica, uma vez que apresentaram maior expressão de CD90 e demonstraram melhor capacidade de diferenciação celular em relação às células derivadas de articulações enfermas. Além disso, possuem método mais fácil de colheita em relação à colheita de MS, visando futura terapia celular na rotina clínica / In the equine species, osteoarticular diseases cause significant economic losses and negative impact on equine athletic performance. The hyaline cartilage regeneration and the maintenance of integrity of its components guide the search for the ideal treatment. In this scenario, this study aimed to investigate the presence of mesenchymal stem cell (MSCs) in the synovial fluid (SF) and in the synovial membrane (SM) of healthy equine joints, osteoarthritic (OA) and osteochondritic joints (OCD), comparing their potential as cellular sources, according to their differentiation ability, in particular with superior chondrogenic potential and the phenotypic characteristics of the MSCs. Ninety-seven equine joints from males and females of different ages were used to harvest cells. SF and SM were obtained during arthroscopy and the cells SF and SM were cultured and assessed for CD90, CD44, CD105 and CD34 markers by flow cytometry, and nanog, oct4, PGP 9.5, lyzozyme, vimentin and cytokeratin were assessed by immunocytochemistry. Additionally, cells were evaluated in vitro for their osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation potential. The tumorigenicity test was carried in Balb-C nu/nu mice, to verify the safety of cell sources and, later, mesenchymal stem cells harvested from healthy equine joints were injected into equine joints. The identity of these cells was confirmed during cell growth, through properties of plastic adhesion and fibroblastoid morphology. The mean percentage of CD90 positive cells was 64.9% (SF-H), 48.3% (SF-OCD), 48.1% (SF-OA), 66.6% (SM-H), 40.2% (SM- OCD) and 40.3% (SM-OA). The percentage of CD44 positive cells was 1.18 % (SF-H), 3.98% (SF-OCD), 14.2% (SF-OA), 1.9% (SM-H), 2.17% (SM-OCD) and 8.56% (SM-OA). The expression of CD34 and CD105 antibodies was not observed. Through immunocytochemical analysis, expression for lysozyme, PGP9.5, PCNA e vimentin antibodies was detected and negative expression for nanog, oct4 e cytokeratin was observed. The multipotent capacity of mesenchymal stromal cells for lineage differentiation (osteogenic, chondrogenoic and adipogenic) was confirmed with different staining techniques: Alizarin Red enabled detection of the calcium matrix, Oil Red O enabled the detection of fat droplets and Toluidin Blue, Alcian Blue and haematoxylin eosin enabled detection of proteoglycan matrix. Results of tumorigenic tests in mice showed no compromise of any internal organ, assuring applicability of the studied cells. Furthermore, equine joints treated with MSC harvested from healthy joints did not show any signs of an inflammatory reaction after injection of the allogeneic cells. The presence of cells with positive CD44 and CD90 phenotypes and with the ability to differentiate into osteogenic and chondrogenic lineages confirms the presence of MSCs in equine SF and SM. Cells obtained from healthy SF were more suitable for clinical application, for they presented higher CD90 expression and demonstrated greater differentiation capabilities, when compared to that of cells retrieved from compromised joints. In addition to that, SF derived cells are easier to obtain when compared to SM cells, aiming their future application clinical

Durante a vida reprodutiva das éguas o endométrio é exposto a eventos como: cópula, parto, puerpério e infecções. Tais circunstâncias podem levar gradativamente a diminuição da capacidade funcional do endométrio com queda da fertilidade. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do tratamento com o meio condicionado de células tronco mesenquimais sobre o endométrio de éguas com fibrose uterina através de avaliação histopatológica. No experimento 1, 21 éguas que não pariram pelo menos em duas temporadas foram avaliadas por meio de exames ultrassonográfico, citológico, bacteriológico e histopatológico. No experimento 2, das 21 éguas avaliadas, quatro éguas classificadas como grau II e duas éguas classificadas como grau III na histopatologia endometrial, foram submetidas a infusão uterina com o meio condicionado de células tronco mesenquimais para promover a regeneração endometrial. No experimento 1, a presença de edema uterino foi observada em 81% (17/21) das fêmeas líquido intrauterino em 23,81% (5/21) e cistos uterinos em 57,14% das éguas (12/21). O crescimento bacteriano identificado em 42,90% (9/21) das éguas pelo exame bacteriológico revelou predominância de Escherichia coli (4/21). O exame citológico revelou processo inflamatório em 44,40% das fêmeas (4/9) com crescimento bacteriano, enquanto 16,70% (2/12) das éguas sem crescimento bacteriano tinham presença de processo inflamatório (P = 0,331). A inflamação uterina foi detectada em 28,60% (6/21) das éguas. A biópsia uterina e avaliação histopatológica revelou 14,30% (3/21) das éguas pertencentes à classe Grau I, 47,60% Grau II (10/21) e 38,10% Grau III (8/21). Verificou-se correlação positiva significativa (r = 0,69; P = 0,0005) entre o grau de endometrose pelo Índice de Caslick e o grau atribuído após exame histopatológico. Maior percentual de éguas com índice Caslick superior a 200 foi observado (P= 0,0242) em éguas classificadas como Grau III (87,5%; 7/8) do que Grau I (0,0%; 0/3). Não houve diferença (P= 0,59) entre as éguas Grau III e as Grau II (70%; 7/10); estas últimas tenderam (P= 0,07) a ter maior percentual com índice Caslick acima 5 de 200 do que as fêmeas com Grau I. O índice Caslick médio comparado entre os graus histológicos revelou maior índice nas éguas Grau III do que nas éguas Grau I (252,0 vs 78,3; P= 0,007). As éguas com Grau II apresentaram índice intermediário (174,6). Não houve associação entre a presença de cistos uterinos e o grau histopatológico das biópsias (P= 0,813). Éguas com cistos uterinos tiveram 16,7%, 41,7% e 41,7% das biópsias classificadas no exame histológico como Graus I, II e III, respectivamente. Esses percentuais nas éguas sem cistos foram de 11,1%, 55,6% e 33,3%, para os Graus I, II e III, respectivamente. A idade média das fêmeas foi similar (P= 0,112) entre as fêmeas com e sem cistos uterinos (20,3 vs 16,3 anos). No experimento 2, a aplicação de 20 mL de meio condicionado de células tronco no lúmen uterino das seis éguas com endometrose grau II e III não resultou em melhoria na condição endometrial. / During the mare reproductive life, the endometrium is exposed to events such as copulation, parturition, puerperium, and infections. Such circumstances may gradually lead to a decrease in the functional capacity of the endometrium, resulting in a drop in fertility. The objective of this study was to evaluate, by using ultrasonographic, cytological, bacteriological, and histopathological exams, the effect of a treatment with mesenchymal stem cell-conditioned medium on the endometrium of 21 mares with uterine fibrosis that did not foal in at least two seasons. In experiment 1, 21 mares were evaluated by using ultrasonographic, cytological, bacteriological and histopathological exams. In experiment 2, from the total 21 females, four mares classified by the endometrial histopathology as grade II and two mares classified as grade III were submitted to uterine infusion with mesenchymal stem cell-conditioned medium to promote the endometrial regeneration. In experiment 1, the evaluation revealed the presence of uterine edema in 81% (17/21), intrauterine liquid in 23.81% (5/21), and uterine cysts in 57.14% of the mares (12/21). Bacteriological examination revealed that 42.86% (9/21) of the mares showed bacterial growth, and the microorganism with the highest incidence was Escherichia coli (4/21). The cytological exam showed inflammatory process in 44.40% (4/9) of the females with bacterial growth, while 16.70% (2/12) of the mares without bacterial growth showed inflammatory process (P = 0.331). Uterine inflammatory process was observed in 28.60% (6/21) of the mares. It was possible to identify by using uterine biopsy and histopathological evaluation that 14.30% (3/21), 47.60% (10/21), and 38.10% (8/21) of mares belong to Grade I, II and III, respectively. There was a significant positive correlation (r = 0.69, P = 0.0005) between the degree of endometrosis evaluated by the Caslick Index and the grade attributed after histopathological examination. The percentage of mares with Caslick index over 200 was higher in females classified as grade III (P= 0.0242) than in grade I females (0.0%; 0/3). There was no difference between mares grade III and grade II 7 (70%; 7/10). Grade II females tended to have a higher percentage with Caslick index above 200 (P = 0.07) when compared to the grade I females. The medium Caslick index compared between the histological grades revealed a higher index in grade III than in grade I mares (252.0 vs 78.3, P = 0.007). Mares grade II showed intermediate index (174.6). There was no association between the presence of uterine cysts and the histopathological grade of biopsies (P = 0.813). Mares with uterine cysts had 16.70%, 41.70%, and 41.70% of the biopsies classified in the histological examination as grades I, II, and III, respectively. The percentages in mares without cysts were 11.10%, 55.60%, and 33.30%, respectively, for Grade I, II and III. The mares mean age was similar (P=0.112) among females with or without uterine cysts (20.3 vs 16.3 years). In experiment 2, the application of 20 mL of mesenchymal stem cell-conditioned medium in the uterine lumen of six mares with endometrosis Grade II and III did not improve the endometrial condition.

O enfisema pulmonar é caracterizado pela destruição das paredes alveolares, sendo a fumaça de cigarro o principal agente etiológico. Pretendeu-se, neste estudo, comparar os efeitos terapêuticos do transplante de células mononucleares da medula óssea (BMMC) e células mesenquimais (CTM) em animais com enfisema pulmonar induzido por exposição à fumaça de cigarro. Camundongos fêmeas da linhagem C57Bl6/J foram expostos à fumaça de cigarro durante 90 dias e, 21 dias após o término do período de exposição, receberam BMMC ou CTM derivadas da medula óssea de camundongos machos da linhagem C57Bl6/J, expressando a proteína GFP. As análises morfométricas mostraram que os tratamentos com BMMC e CTM foram eficientes na recuperação do parênquima pulmonar dos animais expostos à fumaça de cigarro. Testes de fluorescência direta e PCR mostraram a migração de BMMC e CTM para o pulmão. Desta forma, pode-se concluir que, morfologicamente, a terapia celular com BMMC ou CTM é eficaz no tratamento do enfisema pulmonar resultante da exposição à fumaça de cigarro em modelo animal. / Pulmonary emphysema is characterized by destruction of alveolar walls, and the cigarette smoking is the main etiologic agent. It was intended in this study to compare the therapeutic effects of the transplantation of bone marrow mononuclear cells (BMMC) and mesenchymal stem cells (MSC) in animals with pulmonary emphysema induced by exposure to cigarette smoke. C57Bl6/J female mice were exposed to cigarette smoke for 90 days and 21 days after the end of the exposure time, received BMMC or MSC derived from bone marrow of C57Bl6/J male mice expressing the GFP protein. The morphometric analysis showed that treatments with BMMC and MSC were efficient in recovering the lung of animals exposed to cigarette smoke. Fluorescence and PCR tests showed the migration of BMMC and MSC to the lung. Thus, it is concluded the cell therapy with BMMC or CTM is morphologically effective in the treatment of pulmonary emphysema resulting from exposure to cigarette smoke in an animal model.

A terapia celular com células-tronco (CT) surgiu nos últimos anos como uma esperança para o tratamento de doenças, sem tratamento efetivo, como a osteoartrite (OA) em joelho. Nesse trabalho utilizamos células-tronco imaturas de polpa dentária humana (CTPD) cultivadas ou não em associação com biomateriais para o tratamento de lesões osteoarticulares em joelhos de ovinos. As CTPD humanas foram transduzidas com o gene repórter, EGFP, facilitando o monitoramento das mesmas in vitro e in vivo, após o implante na articulação femorotibiopatelar de ovinos. A capacidade de adesão e acomodação das células de polpa dentária no biomaterial foi observada in vitro 24 horas e um mês após sua aplicação no mesmo, sendo a viabilidade celular semelhante em ambos os períodos, porém com uma maior dispersão celular no período mais longo, segundo as análises realizadas por técnicas de microscopia eletrônica de varredura e histologia. Ainda para a realização das análises histológicas, foram realizadas técnicas para padronizar os métodos de descalcificação e inclusão do tecido ósseo-articular, prévio aos cortes. Exames radiográficos, ultrassonográficos e artroscópicos foram feitos para acompanhar a evolução dos tratamentos. Os resultados revelaram que as CTPD humanas aderem bem ao biomaterial e que em associação possuem uma excelente capacidade aparente de reconstituição do tecido lesado. Com a realização deste trabalho, concluímos que o protocolo de terapia utilizado é um bom modelo para o estudo de OA e serve para futuras aplicações clínicas. / Cell therapy with stem cells (CT) has emerged in recent years as a hope for the treatment of diseases without effective treatment, such as osteoarthritis (OA) in knee. In this work we use stem cells from immature human dental pulp (hSCIDP) in association or not with biomaterials for the treatment of osteoarticular lesions in sheep´s kneef. The human hSCIDP were transduced with the reporter gene EGFP, thus making easier monitoring these in vitro and in vivo after implantation in sheep´s femorotibiopatelar joint. The capacity of adhesion and accommodation of dental pulp cells in the biomaterial in vitro was observed 24 h and one month after its application, resulting in similar cell viability in both periods, but with a greater cell dispersion in the longer, period, according to analysis performed by scanning electron microscopy and histology. Moreover, some histological techiniques were performed to standardize the methods for inclusion and decalcification of bone tissue joints. Radiographic, ultrasonographic and arthroscopic analyses were made to monitor the progress of treatment. The results revealed that the human hSCIDP adhere well to the biomaterial and have an excellent apparent reconstitution of damaged tissue. With this work, we conclude that the therapy protocol used is a good model for studying OA and useful for future clinical applications.

A terapia celular representa uma abordagem promissora para o tratamento de cardiopatia isquêmica, porém aspectos-chave dessa estratégia permanecem incertos. Neste trabalho avaliamos a eficiência da retenção cardíaca de células da medula óssea marcadas com tecnécio (99m Tc-CMO) transplantadas, de acordo com o tempo após o infarto (1, 2, 3 e 7 dias) e a via de administração dessas células (intravenosa [IV], intraventricular [IC], intracoronariana [ICO] e intramiocárdica [IM]), em ratos submetidos à isquemia-reperfusão cardíaca [I&R]. Após 24 horas, a retenção cardíaca de 99m Tc-CMO foi maior na via IM comparada com a média alcançada pelas demais (6,79% do total injetado vs. 0,53%). O uso de fibrina como veículo para a injeção de células incrementou a retenção em 2.5 vezes (17,12 vs. 6,84%) na via IM. Curiosamente, quando administradas após 7 dias, a retenção de células na via IM alcançou valores próximos dos observados com da matriz de fibrina injetadas 24 h após a I&R (16,55 vs. 17,12%), enquanto que para as demais vias as mudanças foram insignificantes. Nos animais em que as CMO foram administradas por via intramiocárdica 24 horas após a I&R, com ou sem fibrina, observou-se melhora significante do desempenho cardíaco frente ao estresse farmacológico com fenilefrina quando comparados aos controles. Em conjunto, os dados mostram a biodistribuição das células injetadas após a I&R por 4 diferentes vias e 4 intervalos de tempo pós-lesão e indicam que a via IM é a que produz maior retenção cardíaca. O uso do biopolímero de fibrina aumenta a retenção das células e a eficácia deste efeito sobre a função cardíaca e mortalidade dos animais em longo prazo, além de 30 dias pós I&R, merecerá ser investigada no futuro. / Cell therapy represents a promising approach for ischemic cardiac disease, but key aspects of this strategy remain unclear. We examined the effects of timing and route of administration of bone marrow cells (BMCs) after myocardial ischemia/reperfusion injury (I&R). 99mTc-labeled BMCs were injected by 4 different routes: intravenous (IV), left ventricular cavity (LV), left ventricular cavity with temporal aorta occlusion (LV+) and intramyocardial (IM). The injections were performed 1, 2, 3, or 7 days after infarction. Cardiac retention was higher following the IM route compared to the average values obtained by all other routes (6.79% of the total radioactivity injected vs. 0.53%). Use of a fibrin biopolymer as vehicle during IM injection led to a 2.5-fold increase in cardiac cell accumulation (17.12 vs. 6.84%). Interestingly, the retention of cells administered with culture medium at day 7 post-MI by the IM route was similar to that observed when cells were injected 24 h post-IM using fibrin (16.55 vs 17.12%), whereas no significant changes were observed for the other routes. Cell therapy 24 hs post MI by IM injection, with or without fibrin, resulted in comparable improvement in cardiac function under pharmacological stress compared to control animals. Together, we provide evidence for the biodistribution of 99mTc-labeled BMCs injected post MI by 4 different routes and times post-injury, which shows that the IM rout is the most effective for cardiac cell retention. The use of a fibrin biopolymer further increased cardiac cell retention and its potential long term benefits, beyond 30, on reducing mortality and improving cardiac function deserve to be explored in the future.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:34:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 422850.pdf: 2953890 bytes, checksum: a9a608f4e09d0de94b994f35e62d2827 (MD5) Previous issue date: 2010-03-22 / Introdu??o: Evid?ncias crescentes t?m demonstrado que o transplante de c?lulas-tronco pode tornar-se uma terapia eficaz em hepatopatias. A inje??o sist?mica de c?lulas-tronco tem demonstrado que um percentual significativo dessas c?lulas fica retido no pulm?o e no ba?o. Assim, a pun??o percut?nea da veia porta orientada por ultrassonografia com Doppler colorido, em ratos, para administra??o de c?lulas-tronco apresenta-se como uma alternativa. O objetivo deste estudo foi avaliar a exequibilidade da t?cnica de pun??o percut?nea da veia porta e a efic?cia do transplante intraportal de c?lulas mononucleares de medula ?ssea em ratos com cirrose induzida. Metodologia: Para a execu??o do experimento, foram selecionados 24 ratos f?meas da ra?a Wistar com cirrose induzida atrav?s da ligadura do ducto biliar. Quatorze dias ap?s a ligadura, os animais foram preparados com tricotomia abdominal, seda??o e orienta??o do procedimento por ecografia abdominal com Doppler colorido para facilitar a localiza??o da veia porta. A fra??o mononuclear obtida da medula ?ssea de ratos machos doadores foi infundida utilizando uma agulha de gauge 30, com pun??o direta pela parede abdominal por via transhep?tica at? a veia porta, junto do hilo do f?gado. No 28? dia do experimento, os ratos foram sacrificados e avaliou-se o repovoamento hep?tico de c?lulas-tronco atrav?s da an?lise imunohistoqu?mica das c?lulas portadoras do cromossoma Y e a quantidade de c?lulas atrav?s da citometria de fluxo. Resultados: Os resultados obtidos atrav?s da infus?o de c?lulas-tronco diretamente na veia porta, orientada por ultrassonografia com Doppler colorido, evidenciaram que, dos 24 ratos estudados, sete animais (29,2%) morreram nas primeiras 24 horas. Houve um significativo repovoamento hep?tico com c?lulas da medula ?ssea do doador em 77,8% dos ratos estudados e uma efic?cia de 31,5%. Conclus?o: A t?cnica de pun??o percut?nea da veia porta mostrou-se de f?cil execu??o e com visualiza??o do material no interior do sistema portal durante o procedimento, embora aproximadamente 1/3 dos animais tenham morrido no per?odo relacionado ao procedimento. A infus?o da fra??o mononuclear da medula ?ssea diretamente na veia porta de ratos cirr?ticos permitiu a nida??o, fus?o e/ou fagocitose das c?lulas do animal doador no f?gado do receptor, sugerindo potencial terap?utico no tratamento da cirrose humana.