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Estudo in vivo da capacidade das células-tronco mesenquimais e células progenitoras endoteliais provenientes do cordão e do sangue umbilical humano na melhora funcional e pró-angiogênica no tratamento da miocardiopatia isquêmica / Paula Hansen Suss ; orientador, Paulo R. S. Brafman ; co-orientador, Alejandro Correa DominguezSuss, Paula Hansen January 2012 (has links)
Tese (doutarado) - Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, 2012 / Bibliografia: f. 136-162 / Introdução: Tendo em vista que as doenças cardiovasculares constituem uma importante causa de morbi-mortalidade, se faz necessário o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas na tentativa de diminuir o imenso impacto social e econômico. Neste sent / Introduction: Given that cardiovascular disease constitutes an important cause of morbidity and mortality, it is necessary to develop new therapeutic strategies in an attempt to reduce the immense social and economic impact. Cell therapy has shown promisi
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Caracterização de células mesenquimais estromais da medula óssea coelhos associadas à hidroxiapatita e fibroína de seda na reparação óssea coelhos / Characterization of mesenchymal stromal cells from rabbits’ bone marrow combined to hydroxyapatite and silk fibroin in rabbits’ bone repairEleotério, Renato Barros 07 March 2016 (has links)
Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-07-14T12:02:06Z
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Previous issue date: 2016-03-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Terapias com células indiferenciadas são uma promissora ferramenta para aprimorar a reparação de diversos tecidos e órgãos. Muitos benefícios já foram demonstrados in vitro, entretanto, esforços têm sido dedicados para manter as células aplicadas in vivo no sítio em que se deseja a reparação, e, nesse contexto, biomateriais têm sido desenvolvidos. Assim, o objetivo do presente trabalho foi dispobilizar um método completo para obtenção, expansão e caracterização de células mesenquimais estromais (CME) oriundas da medula óssea de coelhos e avaliar o potencial de reparação óssea destas células quando utilizadas em associação com um novo biomaterial composto de hidroxiapatita e fibroína de seda (HAP/FS). Células mononucleares da medula óssea (CMMO) do úmero e fêmur de coelhos foram obtidas e, para avaliar sua taxa de proliferação, três meios de cultura diferentes foram testados. As CMMO também foram cultivadas em meios de indução osteogênico, condrogênico e adipogênico para comprovar a sua multipotencialidade. Em seguida, o biomaterial proposto foi caracterizado por difração de raios-x e microscopia eletronica de varredura, e seus efeitos na viabilidade celular e na ativação de leucócitos foram investigados. Finalmente, foi avaliada a habilidade deste biomaterial em atuar como um carreador de CME e o efeito da associação das CME ao biomaterial na reparação de defeitos ósseos na calvaria de coelhos também foi investigado. Os resultados mostraram que as técnicas aqui apresentadas fornecem um método completo para obtenção, expansão e caracterização de CME da medula óssea de coelhos de forma adequada e que a utilização destas células em associação com o compósito de HAP/SF teve um efeito benéfico na reparação dos defeitos em calvaria de coelhos. / Therapies based on undifferentiated cells has been shown to be a promising tool to improve the repair of various tissues and organs. Many benefits have been demonstrated in vitro already, however, efforts have been addressed to maintain the cells applied in vivo at the site where the reparation is desired, and, in this context, biomaterials have been developed. Therefore, the aim of this study was to provide a full method to harvest, expand and characterize mesenchymal stromal cells (MSCs) from rabbits’ bone marrow and to assess the bone repair potential of these cells when applied in combination to a new biomaterial composed of hydroxyapatite and silk fibroin (HAP/SF). Bone marrow mononuclear cells (BMMCs) were harvested from rabbits’ humerus and femur and their proliferation rate were tested using three different culture media. BMMCs were also cultured in osteogenic, chondrogenic and adipogenic media to prove their multipotentiality. Next, the biomaterial proposed was characterized by x-ray diffraction and scanning electron microscopy, and its effects on cell viability and leukocytes activation were assessed. Finally, the biomaterial ability to act as MSCs carrier was evaluated, and its effect, in combination with the proposed biomaterial, on the repair of bone defects in rabbits’ calvaria was also investigated. The results showed that the techniques presented here provide a full method for successful isolation, expansion and characterization of MSCs from rabbits’ bone marrow and the utilization of these cells combined to the HAP/SF composite have had a benefic effect on the defects repair in calvaria of rabbits.
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Microencapsulação de células recombinantes superexpressando α-L-iduronidase para o tratamento da mucopolissacaridose tipo 1Martinelli, Bárbara Zambiasi January 2014 (has links)
A Mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é causada pela deficiência da α-Liduronidase (IDUA), uma hidrolase lisosomal responsável pela degradação dos glicosaminoglicanos (GAG) heparan e dermatan sulfato. Diversos processos bioquímicos e fisiológicos são afetados pelo acúmulo desses substratos nas células, levando a uma condição patológica multisistêmica. Apesar dos benefícios clínicos obtidos com os tratamentos atualmente disponíveis, várias limitações têm sido relatadas, sendo necessária a busca de novas estratégias terapêuticas. Uma abordagem promissora de terapia gênica/celular para o tratamento da MPS I é a microencapsulação de células geneticamente modificadas. Neste trabalho, produzimos microcápsulas com células recombinantes superexpressando IDUA, as quais foram implantadas em camundongos MPS I a fim de avaliar sua eficiência como uma terapia. No primeiro estudo, as cápsulas foram implantadas no tecido subcutâneo para um tratamento de 120 dias. A atividade de IDUA no soro teve um leve aumento nos primeiros 45 dias. Depois de 120 dias, a atividade de IDUA foi detectada no fígado, rim e coração. A dosagem bioquímica do acúmulo de GAG nos tecidos mostrou níveis reduzidos no rim. A análise histológica confirmou esses resultados e, de modo interessante, mostrou uma reorganização no parênquima hepático com menos células vacuolizadas. Além disso, as microcápsulas foram recuperadas para análise histológica e foi observada a presença de células inflamatórias e uma camada fibrótica em torno das cápsulas. O segundo estudo foi um tratamento de 60 dias com as microcápsulas implantadas no epíplon. Os níveis de IDUA no soro foram transitórios durante o tratamento e 60 dias depois da implantação a atividade enzimática foi detectada apenas no coração. A avaliação do acúmulo de GAG não apresentou diferenças entre os camundongos MPS I tratados e não tratados. Em ambos os estudos, alguns animais foram utilizados para um experimento em curto prazo e um aumento nos níveis de IDUA foi observado nos tecidos 24 horas após a implantação das cápsulas. Concluindo, as células microencapsuladas foram capazes de corrigir alguns aspectos da doença. No entanto, fatores como uma resposta imune contra a enzima e ao biomaterial, ou a dose de células nas cápsulas, podem ter prejudicado a eficiência do tratamento, sugerindo que modificações na técnica são necessárias para obter um melhor desempenho. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is caused by a deficiency of α-Liduronidase (IDUA), a lysosomal hydrolase responsible for the degradation of the glycosaminoglycans (GAG) heparan and dermatan sulfate. The consequent accumulation of these substrates throughout the cells affects several biochemical and physiological processes, leading to multisystemic pathological condition. Although the clinical benefits of the treatments currently available, several limitations have been noted and the search for alternative therapeutic strategies are necessary. A promising gene/cell therapy approach for treating MPS I is the microencapsulation of genetically modified cells. In this work, we produced microcapsules containing recombinant cells overexpressing IDUA, which were implanted in MPS I mice in order to evaluate their efficiency as a treatment. In the first study, capsules were implanted in the subcutaneous tissue for a 120-days treatment. Serum IDUA activity was slightly increased in the first 45 days. After 120 days, IDUA activity was detected in the liver, kidney and heart. The biochemical measurement of GAG accumulation in the tissues revealed decreased levels in the kidney. The histological analysis confirmed these results and, interestingly, showed a reorganization of the hepatic parenchyma with less cell vacuolization. In addition, microcapsules were retrieved for histological analysis and it was observed the presence of inflammatory cells and a fibrotic layer around the capsules. The second study was a 60- day treatment with the microcapsules implanted in the omentum. Serum IDUA levels were transient over treatment and 60 days post-implantation the enzyme activity was detected only in the heart. The evaluation of GAG storage did not reveal differences between treated and untreated MPS I mice. In both studies, some animals were used for a shortterm experiment and increased IDUA levels were observed in the tissues 24 h after capsules implantation. In conclusion, microencapsulated cells were able to correct some aspects of the disease. However, factors such as immune response against the enzyme and the biomaterial or the dose of cells in the capsules could be impairing the efficiency of the treatment, suggesting that modifications on the technique are necessary to achieve a better performance.
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Toxicidade e estresse oxidativo das células mesenquimais estromais de tecido adiposo de cão em diferentes passagens de cultura / Toxicity and oxidative stress of canine mesenchymal stromal cells from adipose tissue in different culture passagesSprada, Arícia Gomes 04 September 2014 (has links)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Stem cells are undifferentiated cells capable of autorenovation and differentiation in several cell lines. These cells can be found in various tissues such as bone marrow, skin, nervous tissue, adipose tissue and dental pulp. Adipose tissue is an alternative source of mesenchymal stem cells because it consists in a less invasive collection and provides higher number of cells when compared to bone marrow. In humans, adipose tissue metabolism differs according to the anatomical location. In mice, differences in the cellular composition and differentiation capacity of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (ADSCs) were observed according to the anatomical regions. In order to assist researchers in choosing the site of collection and the best cell passage, this study aimed to compare the viability and quality of multipotent mesenchymal stromal (CMEM) derived from subcutaneous and omentum of a dog through indicator of cytotoxicity and oxidative stress in six different passages of culture. The samples of adipose tissue from the both sites were collected from a dog corpse. Cells were processed and cultured in a humidified atmosphere with 5% CO2 and subsequently stained with Trypan Blue and counted in a Neubauer chamber. To assess cytotoxicity the technique of fragmentation and fluorimetry with picogreen dye was used. Also, oxidative stress assays were performed by using fluorimetric assay 2-70-dichlorofluorescein diacetate technique (DCFH-DA) and measuring the levels of thiobarbituric acid reactive species (TBARS). The results showed greater levels of oxidative stress in the first and last passages of both groups, favoring cytotoxicity and cell death. / As células-tronco são células indiferenciadas com capacidade de autorrenovação e diferenciação em diversas linhagens celulares. Estas células podem ser encontradas nos mais variados tecidos, como medula óssea, pele, tecido nervoso, tecido adiposo e polpa dentária. O tecido adiposo é fonte alternativa de células-tronco mesenquimais, apresentando-se como método menos invasivo e permitindo coleta de maior quantidade celular em comparação a medula óssea. Nos humanos, o tecido adiposo apresenta diferenças de metabolismo, conforme a localização anatômica. Em camundongos, foram observadas diferenças em relação à composição celular e à capacidade de diferenciação das células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (ADSCs), de acordo com as regiões anatômicas. Com o intuito de auxiliar pesquisadores na escolha do sítio de coleta e as melhores linhagens celulares, este trabalho teve como objetivo comparar a viabilidade e a qualidade de células mesenquimais estromais multipotentes (CMEM) derivadas do tecido adiposo subcutâneo e do omento maior de cão através de indicadores de citotoxicidade e estresse oxidativo em seis diferentes passagens de cultura. Para isso foram coletados tecido adiposo do omento e subcutâneo de um cadáver fresco de cão oriundo da rotina do Hospital Veterinário da Universidade Federal de Santa Maria. As células foram processadas e cultivadas em atmosfera umidificada a CO2 5%, sendo posteriormente coradas com Azul de Tripan e contadas em câmara de Neubauer. Para avaliar a citotoxicidade foi utilizada a técnica de fragmentação e fluorimetria com corante Picogreen. O nível de estresse oxidativo foi medido através do ensaio fluorimétrico do 2-70-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) e níveis de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Os resultados mostraram que a primeira e última passagem em ambos os grupos são as passagens mais submetidas ao estresse oxidativo ficando mais sujeitas à citotoxicidade.
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Função cardíaca de cães submetidos ao transplante autólogo de células-tronco hematopoiéticas em dois modelos experimentais de cardiomiopatiaSousa, Marlos Gonçalves [UNESP] 17 July 2007 (has links) (PDF)
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Previous issue date: 2007-07-17Bitstream added on 2014-06-13T20:41:32Z : No. of bitstreams: 1
sousa_mg_dr_jabo.pdf: 788549 bytes, checksum: 1d83d7d53925e7aa7edb678ee0f699f0 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / No trabalho em tela, avaliou-se o potencial terapêutico do transplante de células-tronco autológas em dois modelos experimentais de cardiomiopatia. Na primeira parte avaliou-se a função cardíaca de cães chagásicos crônicos submetidos ao transplante de células-tronco hematopoiéticas autólogas. Na segunda etapa, a terapia foi realizada em cães com cardiomiopatia dilatada induzida pela doxorrubicina. Nas duas situações, as células-tronco foram obtidas da medula óssea, que foi coletada e, subsequentemente, fracionada em gradiente de ficol. A seguir, as células mononucleares foram recuperadas, lavadas e diluídas para transplantação intracoronariana. A cateterização das coronárias foi realizada pela técnica de Seldinger e foram infundidas cerca de 60 milhões de células em cada animal. Ao longo de seis meses os cães foram avaliados mensalmente quanto aos parâmetros eletrocárdiográficos, ecocardiográficos e de pressão arterial. Nos cães chagásicos pouco parâmetros se modificaram ao longo do período de avaliação, embora tenham observadas variações nos parâmetros ecocardiográficos PVAO, PPE, TRIV e ITEI. Com relação aos cães com cardiomiopatia induzida pela doxorrubicina, o período pós-transplante foi caracterizado por variação importante nos parâmetros ecocardiográficos PE, IEPs, PPE, TRIV, ITEI, SIV, PLVE, FEJ, FEC, VMEF e IE, embora não ocorrido alterações nas variáveis eletrocardiográficas e de pressão arterial. Os resultados mostraram evolução favorável da função sistólica e diastólica do ventrículo esquerdo em ambos os modelos utilizados. / This study was conceived to evaluate the therapeutic potential of stem cells transplantation in two experimental models os cardiomyopathy. In the first of the study, the cardiac function of dogs with chronic Chagas disease sbumeitted hematopoietic stem cell therapy was assessed. In the second part, cell teraphy was carried out in dogs with doxorubicin-induced cardiomyopathy. In either situation, the animals included in the study underwent autologous bone marrow-derived stem cell transplantation into the coronary arteries. Bone marrow was aspirated and centrifuged in ficoll gradient. Mononuclear cells were collected, washed and diluted to permit intracoronary delivery. Coronary catheterization was accomplished with the Seldinger's technique, and approximately 60 million cells were transfunded in each animal. Dogs were assessed for electrocardiographic, echocardiographic and blood pressure parameters for six months at monthly intervals. Dogs with Chagas disease showed improvement in only a few parameters during the period of study, although a significant variation was seen in the echo parameters PVAO, PPE, TRIV and ITEI. Regarding the dogs with doxorubcin-induced cardiomyopathy, the post-transplantation riod was characterized by an important change in the echocardiographic parameters IVEs, SSPE, IEPs, PPE, TRIV, ITEI, SIV, PLVE, FEJ, FEC, VMEF and IE, although no change was documented in the electrocardiographic and blood pressure measurements. Results showed enhancement of left ventricular systolic and diastolic functions in both experimental models.
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Desenvolvimento de protocolos pré-clínicos de terapia celular em modelos animais de lesão hepática aguda e crônicaBaldo, Guilherme January 2008 (has links)
Neste trabalho verificamos o efeito da administração de células mononucleares de medula óssea murinas em ratos submetidos a modelos de lesão hepática aguda (por CCl4) e crônica (por ligadura de ducto biliar comum). No modelo de lesão hepática aguda as células foram injetadas através da veia porta 24 horas após a administração de 1,25 mL/kg de CCl4. Nos ratos submetidos à LDB a injeção foi realizada 14 dias após a lesão, através da veia mesentérica. Em ambos casos, foram injetadas 1 x 106 células mononucleraes de medula óssea diluídas em 0,2 mL de PBS. A sobrevida, níveis de ALT e avaliação histológica foram analisados no modelo agudo, 72 horas após lesão. A quantificação da fibrose hepática, ALT, AST, FA, peroxidação lipídica e avaliação histológica foram realizadas no modelo crônico 14 e 28 dias após a lesão. Pode-se observar um aumento na sobrevida de ratos tratados pós IHA, com aumento do número de mitoses no tecido hepático e diminuição nos níveis de ALT 72 horas após a lesão. No modelo de LDB houve uma redução na deposição de colágeno após o tratamento e uma diminuição nos níveis de fosfatase alcalina. Os outros parâmetros não apresentaram alterações. Em ambos estudos pode-se observar a presença das células transplantadas no fígado dos animais. Nossos dados sugerem um efeito benéfico do transplante celular para as duas situações, no entanto, os resultados encontrados indicam mecanismos de ação diferentes destas células em resposta aos danos induzidos. Os resultados deste trabalho juntamente com estudo destes mecanismos podem ajudar no desenvolvimento de futuros protocolos clínicos envolvendo esta abordagem terapêutica. / In this work we verified the effects of bone marrow mononuclear cell transplantation in animal models of acute and chronic liver disease induced by carbon tetrachloride and common bile duct ligation, respectively. In the acute liver damage model, cells were injected through the portal vein of rats 24 hours after damage, induced by 1.25 mL/kg of CCl4. Rats with common bile duct ligation were transplanted with bone marrow cells 14 days after surgery through the mesenteric vein. In both protocols 1 x 106 cells were injected in 0.2 mL of PBS. Survival, ALT levels and histological evaluation were the main endpoints of the CCl4 protocol, while liver fibrosis, ALT, AST, ALP, lipid peroxidation and histologic evaluation were studied in the chronic disease model. In the CCl4 model, we were able to verify an increase in the survival rate of treated animals with a two fold raise in liver mitotic activity and reduced ALT levels 72 hours after damage. In the common bile duct ligation model there was a significant reduction in fibrotic area in cell treated animals. Besides, a significant reduction in alkaline phophatase levels was also observed. Other parameters did not show any differences among the groups. In both protocols it was possible to detect the presence of donor-derived cells in livers from treated rats. Our data suggest a benefit from cell therapy in both situations. Moreover, our findings indicate that these cells may act through different mechanisms in response to different liver insults. The results obtained in this work, combined to further studies may help in developing adequate and safe clinical protocols using cell therapies in liver disease.
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Terapia celular na regeneração e recuperação funcional do defeito agudo do nervo femoral em coelhos Nova Zelândia (Oryctolagus cuniculus)Trindade, Anelise Bonilla January 2009 (has links)
A aceleração da regeneração nervosa aliada à sua qualidade através da inoculação de células no sítio da lesão tem sido objeto de diversos estudos experimentais. Assim, o presente trabalho objetiva avaliar a regeneração nervosa associando a técnica de tubulização com a fração mononuclear autóloga de medula óssea em coelhos. Foram utilizados 28 coelhos da raça Nova Zelândia, hígidos, distribuídos em dois grupos: terapia (GT) e controle (GC), de igual número, subdivididos de acordo com o tempo de avaliação em 50 e 75 dias. Todos os animais foram anestesiados e submetidos a secção do nervo femoral direito com imediata neurorrafia utilizando tubo de silicone, deixando um intervalo de 5 mm entre os cotos nervosos, porém apenas o GT recebeu a terapia celular. A avaliação da regeneração foi realizada funcionalmente e histologicamente, sendo os dados de função obtidos por exame clínico neurológico realizado a cada dez dias de pós-operatório e eletrofisiologia nervosa realizada previamente a eutanásia aos 50 e 75 de pós-operatório. Na análise histológica constataram-se presença de ponte nervosa e boa regeneração das fibras em todos os animais. A eletrofisiologia nervosa demonstrou queda nos valores de amplitude e aumento da latência, independentemente dos grupos. Entretanto, na avaliação funcional da marcha, o GT apresentou melhor desempenho significativo nas três primeiras semanas de avaliação. Estes dados sugerem que a terapia celular associada à técnica de tubulização influencia beneficamente no início da regeneração nervosa, proporcionando retorno funcional do nervo mais precoce quando comparado a animais controle. / The acceleration of nerve regeneration combined with its quality by the inoculation of cells is the site of the injury has been the object of several experimental studies. This paper aims to evaluate the nerve regeneration using the tubulization technique associated with the transplantation of autologous mononuclear cell from bone marrow in rabbits. The study has used twenty-eight animals New Zealand, healthy, allocated in two groups with equal number: therapy group (TG) and control group (CG), divided according to the evaluation duration time at 50 and 75 days. All animals were anaesthetized and then had their right femoral nerve sectioned, followed by immediate neurorrhaphy with a silicon tube, leaving a 5mm gap between the nervous stumps, but only the GT received cell therapy. The evaluation of the regeneration was made histologically and functionally through clinical examination carried out each ten days postsurgery and through electrophysiology prior to euthanasia at 50 and 75 postsurgery in both groups. The histological analysis, showed the presence of nerve repair and good regeneration of fibers in both groups. The electrophysiology showed a reduction of the amplitude values and increased latency, irrespective of the group. However, the lameness analysis showed that the GT had significantly better performance on the first three weeks postoperatively. The results suggest that cell therapy associated with the silicon channels can be a good influence on the beginning of nerve regeneration, providing functional return of the nerve earlier when compared to control animals.
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Uso de transplante de astrócitos na redução da epilepsia experimentalFarias, Kelly Soares 28 February 2018 (has links)
Submitted by Automação e Estatística (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-07-26T17:35:31Z
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Previous issue date: 2018-02-28 / Os astrócitos, células especializadas da glia, estão envolvidos na homeostase extracelular
por tamponar íons de potássio (K+), metabolizar neurotransmissores, controlar o disparo
e a sincronização neuronal e contribuir para a formação da barreira hematoencefálica. Em
condições patológicas, os astrócitos podem alterar a sua morfologia (hipertrofia dos seus
processos celulares) e bioquímica (aumento da expressão da proteína ácida fibrilar glial,
GFAP), sendo conhecidos por astrócitos reativos (a.k.a., gliose reativa). Apesar de serem
frequentemente observados em regiões cerebrais associadas à geração e propagação de
crises epilépticas, a participação dos astrócitos reativos na sincronização anormal é pouco
conhecida. Enquanto os astrócitos modificam o metabolismo do potássio e do glutamato, a
sua reativação, por períodos prolongados, pode levar à disfunção da atividade neuronal. A
epilepsia do lobo temporal (ELT), uma das formas mais comuns de epilepsia e
frequentemente associada à refratariedade ao tratamento farmacológico, é caracterizada
por morte neuronal em regiões temporais (esclerose do hipocampo), reorganização
sináptica (brotamento aberrante de fibras musgosas) e gliose reativa. Nessa tese testamos
a hipótese de que o transplante de astrócitos imaturos no hipocampo de animais
cronicamente epiléticos reduzirá a atividade epileptiforme, incluindo a ocorrência de
crises espontâneas eletrográficas e comportamentais. Para isso, os animais foram feitos
epilépticos pela injeção sistêmica da pilocarpina (que induziu o estado epiléptico, SE) e
foram transplantados unilateralmente no hilo do giro denteado (GD) com astrócitos que
expressavam a proteína fluorescente verde (GFP+) 30 dias após o SE. A alocação dos
animais epilépticos nos grupos controle (SE-controle) e experimental (SE-astro GD) foi
feita de acordo com a severidade comportamental do SE. Atividades epileptiformes
espontâneas (espículas interictais, oscilações de alta frequência e crises recorrentes)
foram registradas em ambos os hipocampos (tratado e não tratado) usando eletrodos
cronicamente implantados. A sobrevivência dos astrócitos foi de 1 %. Astrócitos GFP+
foram encontrados em diversas sub-regiões hipocampais por até sete meses após o
transplante, sendo que algumas células migraram aproximadamente até 1500 µm no polo
anteroposterior. Essas células foram localizadas principalmente no hilo, na camada
granular do giro dentado e na camada molecular do hipocampo, e em alguns animais, no
córtex, tálamo e fímbria. Células ou grupos de tecidos indicativos de tumor não foram
identificados. A atividade epileptiforme eletrográfica foi registrada em 80% dos animais
controle (SE-controle, N = 8/10), em 80% dos animais experimentais com astrócitos GFP+
localizados no córtex (SE-Astro Córtex, N = 4/5) e em 60% dos animais com astrócitos
GFP+ no hipocampo (SE-Astro GD, N=2/5). A frequência de crises espontâneas foi variável
entre os animais (21 vs 12 vs 1 crises espontâneas registradas nos grupos SE-control, SEAstro
Córtex e SE- Astro GD, respectivamente) e não houve diferença na frequência de
crises entre os grupos (crises/hora: 0,05 ± 0,01 vs 0,03 ± 0,003 vs 0,02, para SE-controle e
SE-Astro Córtex e SE-Astro GD, respectivamente). O transplante dos astrócitos não alterou
a duração das crises (67,5 ± 3,6 s vs 74,2 ± 3,9 s vs 65,3, para SE-controle e SE-Astro
Córtex e SE-Astro GD, respectivamente). Além disso, não observamos diferenças quanto à
morfologia, periodicidade ou frequência das espículas interictais do hipocampo entre os
grupos experimentais e/ou entre os hemisférios tratados. Interessantemente, o
transplante de astrócitos reduziu significativamente a severidade das crises
comportamentais nos animais que receberam astrócitos no córtex (Escala livre: 5,0 ± 0,6
vs 4,0 ± 0,4, SE-controle e SE-Astro Córtex, respectivamente, p=0,02, teste de MannWhitney).
O grupo SE-Astro GD apresentou apenas uma crise epiléptica e, portanto, não
candidato a estatística. Nossos resultados enfatizam o uso da terapia celular para o
tratamento das epilepsias e reforçam a importância do sítio do transplante para a redução
da atividade epileptiforme. / Astrocytes are specialized glial cells involved in the extracellular homeostasis by buffering
potassium cation (K+) concentration, metabolizing neurotransmitters, controlling
neuronal firing and synchronization and contributing to the blood-brain barrier. Under
pathological conditions, astrocytes may change their morphology in order to compensate
abnormal function, being referred to as activated astrocytes (reactive gliosis). This
phenomenon is commonly observed in brain regions associated with seizure generation
and spread, although its role in abnormal synchronization is unknown. While astrocytes
can enhance potassium and glutamate-related metabolism, sustained long-term
reactivation can lead to neuronal dysfunction. Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most
common form of epilepsy and is usually associated to refractoriness. TLE is characterized
by extensive cell death (hippocampal sclerosis), synaptic reorganization (mossy fiber
sprouting) and reactive gliosis. Here, we hypothesize that transplantation of immature
astrocytes in chronically epileptic hippocampus would reduce epileptiform activity,
including the occurrence of electrographic and behavioral seizures. To test this
hypothesis, animals made epileptic by the systemic injection of pilocarpine (which
induced status epilepticus, SE) were unilaterally transplanted with green fluorescent
protein-positive (GFP) astrocytes into the hippocampus 30 days after the SE. Group
assignment (SE-Saline e SE-Astro GD) was made according to SE behavioral severity and
spontaneous epileptiform activities (interictal spikes, high-frequency oscillations,
seizures) were recorded in both (treated and untreated) hippocampi using chronically
implanted multi-electrodes. Astrocytes had migrated approximately 1500µm injection
site, and survival rate was 1%. Astrocytes were found in the host hippocampus seven
months after transplantation and were mainly localized at the hilus, at the granular layer
of the dentate gyrus, at molecular layer of hippocampus. Cells or tissue clusters indicative
of tumor were not identified. In a second group, astrocytes were found in the cortex and
constituted the SE-Astro Cortex group. No difference was found in epileptiform activity
recorded between groups. Epileptiform electrographic activity was recorded in 80% of
control animals (SE-Saline, N= 8/10, in 80% of SE-Astro Cortex group (SE-Astro Córtex,
N=4/5) and in 60% of animals that received astrocytes into the hippocampus (SE-Astro
GD, N=2/5). Spontaneous seizure occurrence was variable between animals (21 vs 12 vs 1
recorded seizures in SE-Saline and SE-Astro Cortex and SE-Astro GD groups, respectively),
however, no difference was observed in seizure frequency between groups
(seizures/hour: 0.05±0.01 vs 0.03±0.003 vs 0.02, SE-Saline, SE-Astro Cortex and SE-Astro
GD, respectively). Astrocytes grafting did not change seizure duration (67.5 ± 3.6 s vs 74.2
± 3.9 s vs 65.3 s for SE-Saline, SE-Astro Cortex and SE-Astro GD groups, respectively). Also,
we did not observe any difference in the morphology, periodicity or frequency of
hippocampal interictal spikes between experimental groups and/or treated hemisphere.
Additionally, however, the animals of SE-Astro Cortex group showed reduced behavioral
seizure severity (scores: 5 ± 0.1 vs 4 ± 0.4; for SE-Saline and SE-Astro Cortex, respectively;
p =0.02, Mann-Whitney test). SE-Astro GD group animals showed only one spontaneous
seizure, and therefore not a candidate for statistics. Even thought the small sample size,
our results present the cell therapy relevance for the treatment of epilepsies and reinforce
importance of transplantation site for epileptiform activity reduction.
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Análise da integridade genômica por meio do ensaio cometa e teste do micronúcleo em células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo / Analysis of genomic integrity through the comet and micronucleus test test in mesenchymal stem cells derives from adipose tissueMalagutti-Ferreira, Maria José [UNESP] 17 March 2016 (has links)
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Previous issue date: 2016-03-17 / O tecido adiposo (TA) representa, atualmente, uma importante fonte de células-tronco mesenquimais (CTM), uma vez que pode ser obtido de forma relativamente fácil, por meio de procedimentos pouco invasivos, com baixa incidência de morbi-mortalidade e com grande disponibilidade de material para pesquisa aplicada. Para utilização das CTM derivadas do TA, em protocolos de terapia celular em pacientes humanos, emprega-se, em média, uma quantidade significativa de células, da ordem 107 a 108 células/kg do paciente. A partir de uma pequena fração de tecido adiposo autólogo ou heterólogo pode-se expandir o número de células, por meio de procedimentos de cultivo celular “in vitro”, a fim de se obter um número adequado de células que resulte em eficácia terapêutica. Os procedimentos de cultivo prolongado “in vitro”, podem, no entanto, provocar efeitos genotóxicos e mutagênicos. Neste sentido, é de extrema importância o monitoramento da análise da estabilidade genética durante as culturas de CT destinadas aos procedimentos de terapia celular em pacientes humanos. Em função destes aspectos, este trabalho teve por objetivo analisar, por meio do Ensaio Cometa (EC) e Teste de micronúcleo (MCN), a integridade genômica de células-tronco mesenquimais oriundas do tecido adiposo (CT-TA), mantidas em cultura até a décima primeira passagem, avaliando os possíveis efeitos genotóxicos e mutagênicos do cultivo celular prolongado. Os resultados mostraram que no teste EC, não houve diferença estatística entre os controles e células mantidas em cultivo por diferentes passagens. Os testes de MCN, no entanto, mostraram aumento de micronúcleos, a partir da terceira passagem de cultivo celular, com aumento significativo a partir da sétima passagem, em relação à primeira passagem. Os resultados mostram efeitos genotóxicos sobre células-tronco mantidas em cultura para expansão celular e indicam a necessidade de novas análises, a fim de se avaliar com maior segurança o emprego com células-tronco em terapia celular resultantes de culturas celulares expandidas “in vitro” durante diferentes passagens. / The adipose tissue (AT) currently represents a major source of mesenchymal stem cells (MSC), since it can be obtained relatively easily by means of minimally invasive procedures, with low incidence of morbidity and mortality and a large availability of material for applied research. For use of MSC derived from AT in cell therapy protocols in human patients, is employed, on average, a significant amount of cells of the order 107 -108 cells / kg patient. From a fraction of autologous adipose tissue or heterologous one can expand the number of cells through cell culture procedures "in vitro" in order to obtain an adequate number of cells resulting in therapeutic efficacy. Prolonged culture procedures "in vitro" may, however, cause genotoxic and mutagenic effects. Therefore, it is extremely important to monitor the analysis of the genetic stability during CT crops to cell therapy procedures in human patients. Based on these aspects, this study aimed to analyze, through the comet assay (AC) and micronucleus test (MCN), the genomic integrity of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (CT-AT), maintained in culture until the eleventh passage, evaluating the possible genotoxic and mutagenic effects of prolonged cell culture. The results showed that the AC test, there was no statistical difference between the control and cells maintained in culture for different passages. The MCN tests, however, showed an increase in micronuclei after the third passage of cell culture, significant increase from the seventh passage to the first passage. The results show genotoxic effects on stem cells maintained in culture for cell expansion and indicate the need for further analysis in order to assess with greater certainty employment stem cells in cell therapy resulting from expanded cell cultures "in vitro" during different passages.
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Análise da integridade genômica por meio do ensaio cometa e teste do micronúcleo em células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo /Ferreira, Maria José Malagutti. January 2016 (has links)
Orientador: João Tadeu Ribeiro Paes / Banca: Dario Abel Palmieri / Banca: Alexeia Barufatti Grisolia / Resumo: O tecido adiposo (TA) representa, atualmente, uma importante fonte de células-tronco mesenquimais (CTM), uma vez que pode ser obtido de forma relativamente fácil, por meio de procedimentos pouco invasivos, com baixa incidência de morbi-mortalidade e com grande disponibilidade de material para pesquisa aplicada. Para utilização das CTM derivadas do TA, em protocolos de terapia celular em pacientes humanos, emprega-se, em média, uma quantidade significativa de células, da ordem 107 a 108 células/kg do paciente. A partir de uma pequena fração de tecido adiposo autólogo ou heterólogo pode-se expandir o número de células, por meio de procedimentos de cultivo celular "in vitro", a fim de se obter um número adequado de células que resulte em eficácia terapêutica. Os procedimentos de cultivo prolongado "in vitro", podem, no entanto, provocar efeitos genotóxicos e mutagênicos. Neste sentido, é de extrema importância o monitoramento da análise da estabilidade genética durante as culturas de CT destinadas aos procedimentos de terapia celular em pacientes humanos. Em função destes aspectos, este trabalho teve por objetivo analisar, por meio do Ensaio Cometa (EC) e Teste de micronúcleo (MCN), a integridade genômica de células-tronco mesenquimais oriundas do tecido adiposo (CT-TA), mantidas em cultura até a décima primeira passagem, avaliando os possíveis efeitos genotóxicos e mutagênicos do cultivo celular prolongado. Os resultados mostraram que no teste EC, não houve diferença estat... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The adipose tissue (AT) currently represents a major source of mesenchymal stem cells (MSC), since it can be obtained relatively easily by means of minimally invasive procedures, with low incidence of morbidity and mortality and a large availability of material for applied research. For use of MSC derived from AT in cell therapy protocols in human patients, is employed, on average, a significant amount of cells of the order 107 -108 cells / kg patient. From a fraction of autologous adipose tissue or heterologous one can expand the number of cells through cell culture procedures "in vitro" in order to obtain an adequate number of cells resulting in therapeutic efficacy. Prolonged culture procedures "in vitro" may, however, cause genotoxic and mutagenic effects. Therefore, it is extremely important to monitor the analysis of the genetic stability during CT crops to cell therapy procedures in human patients. Based on these aspects, this study aimed to analyze, through the comet assay (AC) and micronucleus test (MCN), the genomic integrity of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (CT-AT), maintained in culture until the eleventh passage, evaluating the possible genotoxic and mutagenic effects of prolonged cell culture. The results showed that the AC test, there was no statistical difference between the control and cells maintained in culture for different passages. The MCN tests, however, showed an increase in micronuclei after the third passage of cell culture, sign... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre
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