A Mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é causada pela deficiência da α-Liduronidase (IDUA), uma hidrolase lisosomal responsável pela degradação dos glicosaminoglicanos (GAG) heparan e dermatan sulfato. Diversos processos bioquímicos e fisiológicos são afetados pelo acúmulo desses substratos nas células, levando a uma condição patológica multisistêmica. Apesar dos benefícios clínicos obtidos com os tratamentos atualmente disponíveis, várias limitações têm sido relatadas, sendo necessária a busca de novas estratégias terapêuticas. Uma abordagem promissora de terapia gênica/celular para o tratamento da MPS I é a microencapsulação de células geneticamente modificadas. Neste trabalho, produzimos microcápsulas com células recombinantes superexpressando IDUA, as quais foram implantadas em camundongos MPS I a fim de avaliar sua eficiência como uma terapia. No primeiro estudo, as cápsulas foram implantadas no tecido subcutâneo para um tratamento de 120 dias. A atividade de IDUA no soro teve um leve aumento nos primeiros 45 dias. Depois de 120 dias, a atividade de IDUA foi detectada no fígado, rim e coração. A dosagem bioquímica do acúmulo de GAG nos tecidos mostrou níveis reduzidos no rim. A análise histológica confirmou esses resultados e, de modo interessante, mostrou uma reorganização no parênquima hepático com menos células vacuolizadas. Além disso, as microcápsulas foram recuperadas para análise histológica e foi observada a presença de células inflamatórias e uma camada fibrótica em torno das cápsulas. O segundo estudo foi um tratamento de 60 dias com as microcápsulas implantadas no epíplon. Os níveis de IDUA no soro foram transitórios durante o tratamento e 60 dias depois da implantação a atividade enzimática foi detectada apenas no coração. A avaliação do acúmulo de GAG não apresentou diferenças entre os camundongos MPS I tratados e não tratados. Em ambos os estudos, alguns animais foram utilizados para um experimento em curto prazo e um aumento nos níveis de IDUA foi observado nos tecidos 24 horas após a implantação das cápsulas. Concluindo, as células microencapsuladas foram capazes de corrigir alguns aspectos da doença. No entanto, fatores como uma resposta imune contra a enzima e ao biomaterial, ou a dose de células nas cápsulas, podem ter prejudicado a eficiência do tratamento, sugerindo que modificações na técnica são necessárias para obter um melhor desempenho. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is caused by a deficiency of α-Liduronidase (IDUA), a lysosomal hydrolase responsible for the degradation of the glycosaminoglycans (GAG) heparan and dermatan sulfate. The consequent accumulation of these substrates throughout the cells affects several biochemical and physiological processes, leading to multisystemic pathological condition. Although the clinical benefits of the treatments currently available, several limitations have been noted and the search for alternative therapeutic strategies are necessary. A promising gene/cell therapy approach for treating MPS I is the microencapsulation of genetically modified cells. In this work, we produced microcapsules containing recombinant cells overexpressing IDUA, which were implanted in MPS I mice in order to evaluate their efficiency as a treatment. In the first study, capsules were implanted in the subcutaneous tissue for a 120-days treatment. Serum IDUA activity was slightly increased in the first 45 days. After 120 days, IDUA activity was detected in the liver, kidney and heart. The biochemical measurement of GAG accumulation in the tissues revealed decreased levels in the kidney. The histological analysis confirmed these results and, interestingly, showed a reorganization of the hepatic parenchyma with less cell vacuolization. In addition, microcapsules were retrieved for histological analysis and it was observed the presence of inflammatory cells and a fibrotic layer around the capsules. The second study was a 60- day treatment with the microcapsules implanted in the omentum. Serum IDUA levels were transient over treatment and 60 days post-implantation the enzyme activity was detected only in the heart. The evaluation of GAG storage did not reveal differences between treated and untreated MPS I mice. In both studies, some animals were used for a shortterm experiment and increased IDUA levels were observed in the tissues 24 h after capsules implantation. In conclusion, microencapsulated cells were able to correct some aspects of the disease. However, factors such as immune response against the enzyme and the biomaterial or the dose of cells in the capsules could be impairing the efficiency of the treatment, suggesting that modifications on the technique are necessary to achieve a better performance.

Made available in DSpace on 2015-04-20T12:31:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jaime Arnez.pdf: 2202191 bytes, checksum: 2925f1eec50bb2ccb5e644dc0dad1780 (MD5) Previous issue date: 2013-03-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Heart failure (HF) affects approximately 2% of the world population. Ischemic cardiomyopathy accounts for two-thirds of cases of HF, which, when established, leads to physical limitations, multiple hospital admissions, declining quality of life, and increasing morbidity and mortality. Therapeutic alternatives range from pharmacological treatment to heart transplantation. Modern reperfusion strategies and advanced pharmacotherapeutic management have contributed to increase the survival of patients with ischemic cardiomyopathy, but none of these treatment strategies can reverse damage to cardiomyocytes or recover lost vasculature. Within this context, the concept of regenerative medicine, using stem cells (SC) for tissue repair, may become a reality. Mobilization and implantation of autologous, CD34+ hematopoietic SCs may improve myocardial function and perfusion. A total of 15 patients with severe ischemic cardiomyopathy, not eligible for other therapeutic alternatives, received autologous CD34+ cells collected from peripheral blood (PB) after G-CSF mobilization. SCs collected from PB were implanted in the myocardium using two routes (intracoronary and via the coronary sinus). All patients underwent clinical, laboratory, and imaging-based assessment to evaluate left ventricular function, perfusion and voltage. All patients were reevaluated after 4 months of post-implantation follow-up. Of the 15 initial patients, two died during follow-up (late post-implantation mortality). The different variables analyzed at 4-month follow-up showed improvement in functional classification (p=0.014), angina score (CCS) (p=0.006), the six-minute walk test (p=0.005), and quality of life (p=0.003). There was minor improvement in ejection fraction, as analyzed by echocardiography and magnetic resonance imaging, without reaching statistical significance (p=0.062 and p=0.0397 respectively); myocardial perfusion scintigraphy showed a non-significant improvement in viability (20.79% to 27.14%, p=0.390). Electroanatomic mapping of the left ventricle did not show any significant changes in electrical activity (p=0.767). CD34+ SC implantation into the myocardium using two routes simultaneously is a safe procedure. At 4-month follow-up, patients experienced improvement in symptoms and quality of life, but without significant improvement in left ventricular function, perfusion and voltage. Key words: Cell therapy, G-CSF, CD34+, ischemic cardiomyopathy / A insuficiência cardíaca (IC) acomete aproximadamente 2% da população mundial. A cardiopatia isquêmica é responsável por 2/3 da IC, a qual, quando estabelecida, implica limitações físicas, repetidas internações hospitalares, piora da qualidade de vida e aumento da morbimortalidade. As alternativas terapêuticas variam desde o tratamento farmacológico até o transplante cardíaco. Modernas estratégias de reperfusão e avançadas condutas farmacológicas têm propiciado um aumento na sobrevida dos pacientes com cardiopatia isquêmica, porém nenhuma estratégia de tratamento recupera o dano aos cardiomiócitos e à vasculatura perdida; é nesse sentido que o conceito de medicina regenerativa utilizando células-tronco (CT) para o reparo de tecidos pode tornar-se realidade. A mobilização e implante autólogo de CT hematopoéticas CD34+ podem melhorar a função e perfusão. Um total de 15 pacientes com cardiopatia isquêmica grave, inelegíveis para outra alternativa terapêutica, receberam células autólogas CD34+ coletadas de sangue periférico (SP), previamente mobilizadas com fator de estimulação de colônias de granulócitos (G-CSF). As CT coletadas de SP foram implantadas no miocárdio utilizando duas vias (intracoronariana e seio coronariano). Realizou-se em todos os pacientes uma avaliação clínica, laboratorial e exames complementares de imagem para avaliar função, perfusão e voltagem do ventrículo esquerdo. Após 4 meses de seguimento pós-implante, todos os pacientes foram reavaliados. Dos 15 pacientes incluídos, dois foram a óbito durante o seguimento (pós-implante tardio). As diferentes variáveis analisadas no seguimento de 4 meses mostraram uma melhora na classe funcional (p = 0,014), escore de angina (Canadian Cardiovascular Society) (p = 0,006), teste da caminhada de 6 minutos (p = 0,005) e qualidade de vida (p = 0,003). A fração de ejeção analisada por ecocardiograma e ressonância magnética mostrou uma discreta melhora, porém sem significância estatística (p = 0,062 e p = 0,0397); a cintilografia do miocárdio mostrou uma melhora da viabilidade, porém sem significância (20,79 para 27,14%; p = 0,390); a atividade elétrica do ventrículo esquerdo realizada através do mapeamento eletroanatômico não mostrou alterações significativas (p = 0,767). O implante de CT CD34+ no miocárdio utilizando duas vias simultâneas é seguro. No seguimento de 4 meses os pacientes apresentaram uma melhora em relação à sintomatologia e qualidade de vida, porém sem melhora significativa na função, perfusão e voltagem do ventrículo esquerdo

A membrana amniótica é uma membrana translucida sendo a membrana mais interna da cavidade amniótica, formada por uma monocamada de células epiteliais disposta sobre uma membrana basal. Com o crescente interesse na utilização de células-tronco provenientes de anexos fetais, esta se torna uma promissora fonte de células-tronco. Sendo assim em trabalho anterior realizado pelo nosso grupo tivemos como objetivo, o estabelecimento da cultura celular e caracterização das células-tronco fetais de membrana amniótica de cão para verificar se a mesma pudesse ser uma nova fonte celular a ser usada nos protocolos de terapia celular, uma vez que os cães têm sido considerados modelos animais atraentes para avaliar novas drogas ou realizar ensaios pré-clínicos. As células de membrana amniótica obtidas a partir do trabalho anterior foram caracterizadas in vitro, observando-se características semelhantes a outras células-tronco mesenquimais. Porém, quando foi analisado o seu o seu potencial carcinogênico observamos a formação de um tumor de crescimento rápido, aproximadamente um mês, após o inóculo dessas células em 10 camundongos imunossuprimidos nude, sendo o tumor identificado histologicamente como um carcinoma embrionário. Diante deste comportamento acreditamos ser de extrema importância analisar células provenientes de novas coletas verificando se a mesmas podem se comportar como as anteriormente estudadas. Com isso, temos como objetivo deste trabalho estabelecer e caracterizar as células provenientes de duas novas coletas em diferentes períodos gestacionais visando verificar se estas células se comportam da mesma que as anteriores isso é se quando inoculadas nos animais formam tumor e assim poder ter certeza de que essas células são ou não, boas alternativas para terapia celular. As células obtidas nestas novas coletas têm características de células-tronco mesenquimais expressando alguns marcadores, tem curva de crescimento semelhante às células-tronco mesenquimais, se aderem ao plástico e se diferenciaram em adipócitos. Diferentemente das células obtidas no estudo anterior estas células não geraram tumor quando injetadas em camundongos imunossuprimidos, nude em até 60 dias após inoculação. / Amniotic membrane is a membrane translucent with the inner membrane of the amniotic cavity, formed by a monolayer of epithelial cells disposed on a basal membrane. With the growing interest in the use of stem cells from fetal membranes, this becomes a promising source of stem cells. So in a previous study conducted by our group we aim, the establishment of cell culture and characterization of fetal stem cells from amniotic membrane from dog to see if it could be a new source cell to be used in cell therapy protocols, Once the dogs have been considered attractive animal models to evaluate new drugs or performing pre-clinical tests. The cells from amniotic membrane obtained from previous work were characterized in vitro, observing characteristics similar to other mesenchymal stem cells. But when it was analyzed its its carcinogenic potential observed the formation of a fast-growing tumor, approximately one month after inoculation of these cells into immunocompromised nude mice 10, and the tumor identified histologically as embryonal carcinoma. Given this behavior we believe is extremely important to analyze cells from new collections by checking if the same can behave like those previously studied. With this, we aim of this work to establish and characterize the cells from two new collections at different gestational periods to verify whether these cells behave the same as the previous ones is that when inoculated into animals form tumor and thus be able to make sure that these cells are either not good alternatives for cell therapy. The cells obtained in these new collections has characteristics of mesenchymal stem cells expressing some markers, growth curve is similar to mesenchymal stem cells, adhere to plastic and differentiated into adipocytes. Unlike the cells obtained in the previous study these cells did not generate tumors when injected into immunocompromised mice, nude within 60 days after inoculation.

O órgão vômeronasal (OVN), é uma estrutura que detecta feromônios, emitindo sinais que modulam o comportamento social e reprodutivo. Possui células-tronco que se dividem e migram para substituir neurônios ao longo da vida. O objetivo deste estudo foi isolar e caracterizar as células derivadas do órgão vômeronasal de coelhos da raça Nova Zelândia e testar seu potencial terapêutico no tratamento da ablação da via vômeronasal. Utilizou-se 10 coelhos machos com 120 dias, sendo 9 submetidos a ablação do OVN e 1 utilizado para coleta de material para cultivo celular. Foram testados três meios de cultivo DMEM High Glucose, DMEM/F12 e MEM Alfa. No cultivo celular observou-se maior confluência e crescimento quando utilizado o DMEM High Glucose, confirmado pelos ensaios de MTT e Azul de Trypan. Na imunocitoquímica observou-se PCNA+, OCT4+, Nanog+, GFAP+, Vimentina+, Nestin+, Stro-1+, B-Tubulina+, CK-18+, CD73+, CD90+, CD105+, CD34-, CD117- e CD45-. Na citometria de fluxo foi observado PCNA+, OCT-3/4+, Nanog+, GFAP+, Vimentina+, Nestin+, Stro-1+, B-Tubulina+, CK-18+, CD73+, CD90+, CD105+, CD34- e CD45-. Na análise molecular foi possível observar a expressão de CD73, CD105, Oct-4, Nestina, Vimentina e GAPDH. Funcionalmente as células se diferenciaram em adipócitos, osteócitos e condrócitos e não possuem potencial tumorigênico em camundongos Balb-cnu/nu. A análise hormonal demonstrou que nos animais tratados após 7 e 14 dias não houveram diferenças significativas entre os grupos tratados e controles. No grupo após 21 dias notou-se uma diferença de 50% nos níveis hormonais no grupo tratado em relação ao grupo controle. Na análise da expressão para eGFP observou-se que os animais tratados após 7 dias as células injetadas formavam aglomerados celulares na região subjacente ao epitélio sensitivo. Após 14 dias continuavam a circundar o epitélio neurosensorial e após 21 dias observou-se pouca expressão de células localizadas apenas na região subjacente ao epitélio neurosensorial. A linhagem celular derivada do órgão vômeronasal possui uma população de células progenitoras, que foram visualizadas no foco da lesão, demonstrando sua capacidade de migração, o que a torna uma boa fonte para terapia celular em ablação da via vômeronasal. / The vômeronasal organ (VNO) is a structure that detects pheromones, emits signals that modulate social and reproductive behavior. It has stem cells that divide and migrate to replace neurons throughout life. The aim of this study was to isolate and characterize cells derived from the vômeronasal organ from rabbits New Zealand and test their therapeutic potential in the treatment of ablation of the vômeronasal pathway. 10 male rabbits with 120 days were submitted to the ablation of VNO and 2 controls animals used to collect material for cell culture. Three different culture media DMEM High Glucose, Alpha MEM and DMEM/F12 were tested. In cell culture observed greater confluence and growth when used DMEM High Glucose, confirmed by MTT assay and Trypan Blue. In immunocytochemistry observed PCNA + OCT4 +, Nanog +, GFAP + Vimentin +, Nestin +, Stro-1 + B-tubulin +, CK-18 +, CD73 +, CD90 +, CD105 +, CD34-, CD117-and CD45-. In flow cytometry was observed PCNA + OCT-3/4 + Nanog +, GFAP + Vimentin +, Nestin +, Stro-1 + B-tubulin +, CK-18 +, CD73 +, CD90 +, CD105 +, CD34-and CD45-. Molecular analysis was possible to observe the expression of CD73, CD105, Oct-4, Nestin, vimentin and GAPDH. Functionally, the cells differentiate into adipocytes, osteocytes and chondrocytes have not Balb-cnu/nu tumorigenic potential in mice. Hormonal analysis demonstrated that animals treated after 7 days and 14 days there were no significant differences between treated groups and controls. In group after 21 days noticed a 50% difference in hormone levels in the treated group compared to the control group. In expression analysis for eGFP was observed that the treated animals after 7 the injected cells formed cell clusters in the underlying sensory epithelium region. After 14 days continued to surround the neurosensory epithelium and after 21 days there was little expression in the cells located just behind the neurosensory epithelium region. The cell line derived from the vômeronasal organ has a population of progenitor cells that were visualized in the lesion focus, demonstrating their ability to migrate, which makes it a good source for cell therapy in ablation of the vômeronasal pathway.

O tumor mamário é a segunda neoplasia maligna mais incidente em cães, com uma elevada taxa de mortalidade. Em cães, constituem aproximadamente 52% de todos os tumores que afetam as fêmeas, possuindo uma elevada heterogeneidade biológica e histomorfológica, sendo que 50% são malignos. As neoplasias, independentemente de suas causas primárias, apresentam distúrbios no controle do ciclo celular, o que acaba gerando um aumento na proliferação celular, perda da diferenciação e formação de massas tumorais. Na gênese das neoplasias mamárias estão envolvidos fatores de natureza genética, ambiental e hormonal. O objetivo deste trabalho foi avaliar "in vitro" o efeito da terapia com célula- tronco da medula óssea canina de feto em tumores mamários canino. Após a avaliação histopatológica os tumores foram divididos em grupos de grau I (adenocarcinoma, sem metástase), grau II (carcinoma com metástase regionais) e grau III (carcinomas com metástases sistêmicas). As células dos tumores mamários caninos (TM) e as células - tronco de medula óssea de feto canina (CTMs) foram caracterizadas antes e após o tratamento utilizando marcadores de proliferação, angiogênese e da resposta inflamatória através da citometria de fluxo. A expressão de marcadores de proliferação celular Ki67 foi maior nas linhagens tumorais dos carcinomas grau III, o mesmo observado para os marcadores que regulam a angiogênese e migração celular como VEGFR1, CD44, COX-2 e EGFR. Foi possível observar nas culturas celulares de TM a redução do potencial elétrico mitocondrial alterando permeabilidade da membrana ativando a caspase 3 e reduzindo a Bcl-2, sugerindo que a CTM apresenta efeitos antitumorais pela indução de apoptose e efeitos antiproliferativos da expressão de COX-2 e IL-6 inibindo a proliferação celular levando ao acúmulo das células na fase G0/G1. . A terapia celular com CTMs proporciona novas expectativas para o tratamento de diversas patologias que acometem diferentes espécies.. Desta forma, os resultados os resultados obtidos pela expressão das TM tratadas com CTM pode apresentar como uma nova perspectiva no tratamento de tumores em cadelas. / The breast tumor is the second most frequent malignancy in dogs, with a high mortality rate. In dogs, they constitute approximately 52% of all tumors affecting female, having a high biological and histomorphological heterogeneity, and 50% are malignant. Neoplasms, regardless of their root causes, have disturbances in cell cycle control, which ends up generating an increase in cell proliferation, differentiation loss and formation of tumor masses. In the genesis of mammary tumors are involved genetic, environmental and hormonal factors nature. The objective of this study was to evaluate "in vitro" the effect of therapy with stem cell-canine bone marrow fetus in canine mammary tumors. After histopathological evaluation tumors were divided into grade I groups (adenocarcinoma without metastasis), grade II (carcinoma with regional metastasis) and grade III (carcinomas with metastatic disease) .The cells of canine mammary tumors (TM) and cells - bone marrow stem canine fetuses (MSCs) were characterized before and after treatment using proliferation markers, angiogenesis and inflammatory response by flow cytometry. The expression of cell proliferation markers Ki67 was higher in tumor cell lines of the carcinomas grade III, the same was observed for markers that regulate angiogenesis and cell migration as VEGFR1, CD44, COX-2 and EGFR. It was observed in TM cell cultures to reduce the electric potential changing mitochondrial membrane permeability by activating caspase 3 and reduces Bcl-2, suggesting that MSC has antitumor effects by inducing apoptosis and antiproliferative effects of COX-2 expression and IL-6 inhibiting cell proliferation leading to an accumulation of cells in G0 / G1 phase. Cell therapy MSCs provides new expectations for the treatment of various pathologies affecting different species. Thus, the results the results obtained by the expression of TM-treated MSC can present as a new approach in the treatment of tumors in dogs..

A Diabetes mellitus em cães é cada vez mais frequente, decorrente de fatores genéticos e/ou ambientais, como um distúrbio endócrino que, de forma semelhante à que ocorre em humanos, falha no controle adequado de glicose no sangue, desencadeia a hiperglicemia, glicosúria e perda de peso. A terapia celular utilizando as células beta-pancreáticas tem sido alvo de estudos, devido à grande demanda de novos casos de Diabetes mellitus e à falta de órgãos para transplantes em humanos e animais. Acredita-se que a ciência possa responder e inovar em tratamentos, encontrando a possível cura para esta doença complexa. Portanto, o objetivo deste estudo foi obter e caracterizar células derivadas do pâncreas fetal canino de animais com idades compreendidas entre 50 e 60 dias de gestação. As células pancreáticas de fetos caninos apresentam morfologia fibroblastóide e crescimento em monocamada em cultivo, apresentam células pluripotentes e proliferativas, não são tumorigênicas e apresentam expressão de PDX1, um fator de transcrição que tem papel importante na ativação do gene promotor da insulina. O pâncreas possui inervação simpática, observado por fibras nervosas TH+. Histologicamente, o pâncreas fetal canino apresenta ácinos num estágio de organização avançado, com parênquima semelhante ao encontrado no cão adulto. As ilhotas pancreáticas são distribuídas no tecido de maneira irregular, organizando-se em pequenos aglomerados de células por entre os ácinos, especialmente próximas aos vasos sanguíneos. A coloração com Ditizona permitiu inferir a presença de insulina no tecido pancreático, o que foi comprovado mediante técnica de imunofluorescência, além da presença de células que expressam o hormônio somatostatina. Os resultados desta investigação indicam que o pâncreas fetal canino demonstra características favoráveis para ser uma fonte viável de células para estudos aplicados à terapia celular em cães. Outras investigações referentes à comprovação da produção de insulina in vitro por essas células se fazem necessárias / Diabetes mellitus in dogs is increasingly common, due to genetic and/or environmental factors such as an endocrine disorder, similarly to what occurs in humans, failure to adequately control blood glucose triggers hyperglycemia, glycosuria and weight loss. Cell therapy using the pancreatic beta cells has been the subject of studies, due to the great demand of new cases of diabetes mellitus and the lack of organs for transplants in humans and animals. It is believed that science can respond and innovate treatments, finding a possible cure for this disease complex. Therefore, the objective of this study was to obtain and characterize derived cells from canine fetal pancreas, of animals aged between 50 and 60 days of gestation. The pancreatic cells of canine fetuses exhibit fibroblastoid morphology and growth in monolayer culture, exhibit pluripotent and proliferative cells, are not tumorigenic and have PDX1 expression, a transcription factor that plays an important role in the activation of the insulin gene promoter. The pancreas has sympathetic innervation observed by TH+ nerve fibers. Histologically, the fetal pancreatic acini canine presents an advanced stage organization with similar parenchyma that found in adult dog. The pancreatic islets are distributed in the fabric unevenly, organizing themselves into small clusters of cells through the acini, especially close to the blood vessels. Staining with Dithizone allowed inferring the presence of insulin in the tissue, which was confirmed by immunofluorescence, in addition to cells that express somatostatin. The results of this investigation indicate that the canine fetal pancreas shows favorable characteristics to be a feasible source of cells for cell therapy applied to studies in dogs. Further investigation regarding the evidence of in vitro production of insulin by these cells are required

A membrana amniótica humana vem assumindo um papel de extrema importância na medicina regenerativa nos últimos anos, principalmente na área de dermatologia e oftalmologia, sendo seu uso promissor no tratamento de doenças cuja terapêutica atual é pouco eficaz. Além disso, na membrana amniótica humana encontram-se células-tronco mesenquimais, que apresentam plasticidade e vem sendo aplicadas para a regeneração de tecidos. Entretanto, muito pouco se sabe sobre a capacidade plástica e o uso de células-tronco de membrana amniótica de animais, já que a literatura a este respeito, não é tão ampla quanto à de humanos. Neste projeto estabelecemos a cultura de células-tronco de membrana amniótica (MA) de fetos caninos, caracterizando as células in vitro e in vivo. As células de MA foram obtidas a partir de um procedimento cirúrgico de histerectomia em cadelas prenhas, durante campanhas de castração da prefeitura da cidade de São Paulo. As células de MA foram caracterizadas in vitro, observando-se características semelhantes a outras células-tronco mesenquimais. Porém, quando foi analisado o seu comportamento in vivo, observamos a formação de um tumor de crescimento rápido, aproximadamente um mês, após o inóculo dessas células em 10 camundongos imunossuprimidos nude, sendo o tumor identificado histologicamente como um carcinoma embrionário. Diante do comportamento biológico formando um tumor in vivo, inferimos que células-tronco provenientes de membrana amniótica de cães não devem ser usadas para aplicação com objetivos terapêuticos em animais, pelo menos até que novas coletas sejam realizadas para que se possa confirmar ou não este comportamento. / The human amniotic membrane has taken an extremely important role in regenerative medicine in recent years, especially in dermatology and ophthalmology, and its promising use in treating diseases for which current therapy is ineffective. In addition, the amniotic membrane has human mesenchymal stem cells, which exhibit plasticity and have been applied to tissue regeneration. However, very little is known about the plastic capacity and the use of stem cells from amniotic membrane of animals, since the literature in this regard, it is not as broad as those of humans. In this project we established a culture of amniotic stem cells of dog, characterizing these cells in vitro and in vivo. The cells were obtained from a surgical procedure for hysterectomy in pregnant bitches, during castration\'s campaigns of the São Paulo\'s municipality. The cells were characterized in vitro, observing characteristics similar to other mesenchymal stem cells. In spite of their behavior, in vivo we observed the formation of a fast-growing tumor about a month after the inoculation of these cells in 10 immunosuppressed mice, being the tumor identified histologically as an embryonic carcinoma. Considering the biological behavior of forming a tumor in vivo, we infer that stem cells from amniotic membrane of dogs should not be used for application for therapeutic purposes in animals, at least until other collections are carried out so that it can be confirmed or not.

Lesões na cartilagem articular do joelho são patologias frequentes e geralmente causadas por traumas. Apesar de algumas serem assintomáticas, essas alterações osteocondrais podem evoluir para degeneração da cartilagem articular e osteoartrose. Uma da degeneração progressiva da cartilagem articular leva a osteoartrite (OA), comumente sendo a articulação femorotibiopatelar a mais afetada. Como os tratamentos convencionais para OA não são curativos, apenas paliativos, a terapia celular com células-tronco (CT) desponta como alternativa. Neste trabalho utilizamos células-tronco de dente decíduo esfoliado (Stem cells from Human Exfoliated Deciduous teeth - SHED), cultivadas em associação com um biomaterial, para tratar lesões osteocondrais provocadas em joelhos de ovinos. Quatro defeitos osteocondrais foram cirurgicamente produzidos para testar quatro condições: 1) SHED associada ao biomaterial, 2) somente biomaterial, 3) somente SHED e 4) nenhum tratamento (controle). Os ovinos foram acompanhados clinicamente e através de exames radiográfico, US e artroscopia, por 120, 190, 365 e 730 dias até a eutanásia. Os resultados revelaram que o tratamento com biomaterial em associação com SHED, produziu reparo similar à estrutura cartilagínea a partir de 190 dias, apresentando características de cartilagem adjacente. Entretanto, apesar dos resultados positivos em relação ao reparo da lesão osteocondral, não foi possível afirmar se a melhora deveu-se a diferenciação direta das SHED para células presentes na cartilagem ou se foi um efeito parácrino das mesmas. Em tempo, não foi observada rejeição e nenhuma reação adversa ao implante celular xenogênico durante o período experimental. / Articular cartilage injuries on the knee are frequent pathologies and usually caused by trauma. Although some are asymptomatic, these changes may evolve into osteochondral articular cartilage degeneration and osteoarthritis. A progressive degeneration of articular cartilage leads to osteoarthritis (OA), being femorotibiopatelar joint the most affected one. As conventional treatments for OA are not curative, but palliative, cell therapy with stem cells (SC) stands out as an alternative. In this work we used stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED), grown in association with a biomaterial, to treat osteochondral lesions on sheep\'s knees. Four osteochondral defects were surgically produced to test four conditions: 1) SHED associated with the biomaterial, 2) only the biomaterial, 3) only SHED and 4) no treatment (control). The sheep were followed clinically and through radiographic exams, US and arthroscopy, for 120, 190, 365 and 730 days until euthanasia. The results showed that treatment with biomaterial in combination with SHED produced repair similar to the cartilage structure from 190 days, showing cartilage adjacent features. However, despite the positive results in relation to the repair of osteochondral lesion it was not possible to say whether the improvement was due to direct differentiation of SHED for cells present in cartilage or was a paracrine effect. In time, there was no rejection and no adverse reaction to the xenogenic cell implant during the trial period.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-09T15:12:55Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1008959 bytes, checksum: 3d46e11fde8d7a6ac33eb226467cf41f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-09T15:12:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1008959 bytes, checksum: 3d46e11fde8d7a6ac33eb226467cf41f (MD5) Previous issue date: 2014-07-24 / A popularidade das células-tronco mesenquimais (MSCs) vem desde a descoberta de células aderentes, com formato fibroblastoide e capazes de se auto-renovar, formar colônias, além de originar diferentes tecidos como cartilagem, osso, gordura e músculos, sendo então objeto de estudos principalmente na medicina regenerativa. Diante disso, há uma busca constante por fontes de MSCs, sendo a medula óssea a principal fonte dentro da terapia celular, no entanto, rejeição, co-morbidades associadas a coleta e número limitado de doadores estimularam a busca por novas fontes deste tipo celular. O objetivo desse trabalho é descrever a obtenção, o cultivo e a caracterização de células obtidas a partir da digestão enzimática do tecido perivascular do cordão umbilical (UC) de cães, na esperança de estabelecer uma nova fonte deste tipo celular para as espécies canina e humana, através do modelo animal. Para isso, UCs obtidos a partir de cesarianas terapêuticas foram submetidos ao protocolo de digestão enzimática com colagenase e hialuronidase. As células obtidas a partir desse procedimento foram submetidas a três diferentes protocolos de cultivo a fim de estabelecer o melhor meio para esse tipo celular. Estabelecido o melhor meio, através da curva de crescimento e do tempo de duplicação, as células foram submetidas a ensaios de diferenciação para comprovação de sua multipotência. Foram obtidas culturas aderentes e com morfologia fibroblastoide a partir de todos os UCs utilizados, com um número inicial de células de 4,8x105 por UC. A curva de crescimento mostrou uma fase estacionária (lag) de 0 a 24 horas, seguida por uma fase de crescimento de 24 a 168 horas e, então, uma fase de decaimento celular. O tempo de duplicação foi mantido em torno de 15 horas até a sexta passagem, a partir do qual houveram indícios de senescência celular. O ensaio de diferenciação demonstrou a capacidade das células em diferenciar-se em osteoblastos, condrócitos e adipócitos quando submetidos aos meios de indução. Diante dos resultados, acredita-se que as células obtidas a partir do tecido perivascular dos vasos sanguíneos do cordão umbilical de cães após sua digestão enzimática sejam células-tronco, com potencial de uso na terapia celular, necessitando da comprovação de linhagem mesenquimal. / The popularity of mesenchymal stem cells (MSCs) comes from the discovery of adherent cells with fibroblastic shape, ability of self-renewal, form colonies and give rise to different tissues such as cartilage, bone, fat and muscle, therefore is the object of studies mainly in regenerative medicine. There is a constant search for sources of MSCs, with the bone marrow being the major source for cell therapy. However, rejection, co- morbidities associated with collection and limited number of donors stimulated the search for new sources of this cell type. The aim of this paper is to describe the harvesting, culture and characterization of cells obtained from enzymatic digestion of dogs umbilical cord perivascular tissue, hoping to establish a new source of this cell type to canine and human species through the animal model. For this, umbilical cords (UCs) obtained from therapeutic caesarean section were submitted to the protocol of enzymatic digestion with collagenase and hyaluronidase. Cells obtained from this procedure were subjected to three different protocols of culture in order to establish the best medium to that cell type. Established the best media through the growth curve and doubling time, cells were tested for differentiation as evidence of their multipotency. Adherent cells with fibroblastic shape were obtained from all UCs used, with an initial cell number of 4.8 x10 5 by UC. The growth curves showed a lag from 0 to 24 hours, followed by a phase of growth of 24 to 168 hours, and then a mobile phase of decay. The doubling time was kept around 15 hours until the sixth passage, from which there were signs of cellular senescence. The differentiation assay demonstrated the ability of cells to differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondrocytes when subjected to the induction means. Given the results, it is believed that the cells obtained from the perivascular tissue of the blood vessels of the umbilical cord of dogs after enzymatic digestion are stem cells, with potential uses in cell therapy, requiring that their mesenchymal lineage is proven.

As doenças de disco intervertebrais (DDIV) representam a maior parte de atendimentos neurológicos e são responsáveis pela maioria dos casos de paralisia em cães. Os tratamentos utilizados atualmente não demonstram resultados satisfatórios em pacientes com manifestações neurológicas mais graves. A fim de promover recuperação nervosa e motora, além de melhora na qualidade de vida, o presente trabalho objetivou criar um protocolo, através de um ensaio duplo cego, associando cirurgia descompressiva e transplante alogênico de células-tronco (CT) derivadas da membrana amniótica em cães com DDIV crônica. As mesmas células já foram caracterizadas anteriormente como mesenquimais fetais e apresentaram-se seguras para aplicação. Foram selecionados oito cães, onde quatro já passaram por cirurgia e receberam três aplicações epidurais de células-tronco. Os outros quatro animais foram submetidos à cirurgia descompressiva e divididos aleatoriamente (teste duplo cego) em dois grupos: \"cirurgia + placebo\", o qual recebeu apenas solução fisiológica; e \"cirurgia + CT\", que recebeu a terapia celular. Durante o procedimento cirúrgico, foi realizado a aplicação por gotejamento sobre a lesão, e após quinze e quarenta e cinco dias foram realizadas outras duas aplicações, via epidural. Os animais passaram por acompanhamento quinzenal e foram reavaliados três meses após o procedimento cirúrgico, através de exames funcionais e ressonância magnética. Alguns animais apresentaram melhora neurológica significativa, como a recuperação da nocicepção e capacidade de se manter em estação. Apesar da necessidade de mais estudos, até o presente momento, a terapia celular apresentou-se factível e sem efeitos prejudiciais aos animais. / Intervertebral disc (IVD) diseases represent the majority of neurological attendance and are responsible for the most cases of paralysis in dogs. Treatments currently used do not show satisfactory results in patients with more severe neurological manifestations. In order to promote nerve and motor recovery, as well as improve quality of life, the present study aims to create a protocol, using double-blind test method, associating spinal decompression surgery and allogeneic transplantation of amniotic membrane-derived stem cells (AMSCs) in dogs with chronic IVD diseases. Those were previously characterized as fetal mesenchymal cells and were safe for application. Eight dogs were selected, where four have already gone through surgery and received 3 epidural applications of stem cells. The other four animals were submitted to spinal decompression surgery and randomly divided into two groups (double blind test): \"surgery + placebo\", which received only physiological solution; and \"surgery + AMSCs\", which receive cell therapy. During the surgical procedure, a drip application was performed on the lesion and after fifteen and forty five days another two applications were made via epidural. Animals were monitored biweekly and were reassessed three months after surgery, by functional tests and magnetic resonance exams. Some animals presented significant neurological improvement, such as the recovery of nociception and ability to remain on station. Despites the need further studies, until the present moment, cell therapy has been feasible and has no harmful effects on animals.