A terapia celular utilizando células tronco mesenquimais (MSC) derivadas da medula óssea surge como uma alternativa para o tratamento das doenças neurodegenerativas. Apesar dos resultados positivos com o uso dessas células nos ensaios pré-clínicos e clínicos após a isquemia cerebral, seus efeitos colaterais e seu mecanismo de ação permanecem desconhecidos. Os benefícios alcançados após a terapia celular para o tratamento da isquemia não são atribuídos à diferenciação dessas células em novos neurônios, mas sim aos fatores que elas podem secretar. Na tentativa de compreender como os fatores secretados pelas MSC podem influenciar o tecido hipocampal que sofreu ou não privação de oxigênio e glicose (POG) e como os fatores liberados pelo tecido lesionado podem atuar sobre as MSC, nós utilizamos culturas organotípicas de hipocampo expostas ao meio condicionado pelas MSC e MSC expostas ao meio condicionado pelas culturas organotípicas de hipocampo expostas à POG. Os resultados obtidos nesse trabalho mostram que o meio condicionado pelas MSC é tóxico para as culturas organotípicas de hipocampo, induzindo morte celular especificamente nas regiões do Corno de Ammon (CA) e agravando a lesão causada pela POG. Essa toxicidade parece ser específica das MSC, uma vez que o meio condicionado por outros tipos celulares não tem o mesmo efeito. As MSC isoladas tanto de rato como de camundongo e tanto de medula óssea como de pulmão induzem a morte celular de uma maneira semelhante, sugerindo que o efeito não é espécie ou órgão específico. Ainda, nós observamos que os fatores secretados pelas MSC ativam a microglia e os astrócitos, induzindo a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), o aumento da iNOS e um aumento de IL-6 e TNFα nas culturas organotípicas. O efeito tóxico do meio condicionado pelas MSC pode ser atenuado por antioxidantes, anti-inflamatórios, antagonistas NMDA e AMPA, bloqueadores de canal de cálcio dependentes de voltagem e por agonista GABA. Quando as MSC foram analisadas após a sua exposição ao meio condicionado pelo tecido hipocampal lesionado, nós não observamos morte celular ou mudanças morfológicas aparentes nessas células após 24 h de exposição ao meio. Surpreendentemente, as MSC aumentaram a proliferação quando expostas ao meio condicionado pelo hipocampo lesionado, não apresentando nenhum marcador neural após 72 h em contato com esse meio condicionado. Em conjunto, nossos resultados mostram um possível efeito adverso de fatores secretados pelas MSC, introduzindo uma nota de cautela na utilização dessas células. / Cell therapy using bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC) seems to be a new alternative for the treatment of neurodegenerative diseases. In spite of several good and promising results with the use of these cells in preclinical and clinical studies after stroke, their side effects and their mechanism of action are still unknown. The benefits reached after cell therapy to treat stroke are not attributed to the differentiation of the cells in new neurons, but to the factors that these cells can secrete. In an attempt to understand how MSC secreted factors can influence the hippocampal tissue that suffer or not from oxygen and glucose deprivation (OGD) and how the factors secreted from the injured hippocampus can influence MSC behavior, we used organotypic hippocampal slice cultures exposed to MSC conditioned medium and MSC exposed to organotypic hippocampal cultures conditioned medium. The results obtained in this work show that MSC conditioned medium is toxic to organotypic hippocampal slice cultures, inducing cell death specifically in the CA (Cornus Ammonis) region of hippocampus and aggravating the lesion induced by OGD. This toxicity seems to be specific to MSC, once the medium conditioned by other cell types do not induce cell death. Also, MSC isolated from rat or mice and from bone marrow and lungs induce cell death in a similar manner, suggesting that the effect is not organ- or specie- specific. In addition, we have observed that MSC secreted factors activate microglia and astrocytes, inducing reative oxygem species (ROS) generation and iNOS, TNFα and IL-6 increase in organotypic cultures. The MSC conditioned medium-induced toxic effect can be attenuated by antioxidants, antiinflammatory drugs, NMDA and AMPA antagonists, Ca2+ voltage-dependent channel blockers and GABA agonist. When MSC behavior was investigated after these cells were exposed to the conditioned medium from the lesioned hippocampus, we observed that these medium is not able to induce cell death or any apparent change in MSC morphology after a 24 h exposure period. Surprinsingly, MSC increase proliferation in response to the conditioned medium from the injured hippocampal tissue, do not presenting any neural marker after 72 h of contact with this medium. Taken together, our results show a possible side effect of MSC secreted factors, introducing a note of caution in the use of these cells.

Submitted by PMBqBM null (pmbqbm@ufba.br) on 2017-05-24T11:48:23Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Tiago Oliveira Ribeiro_PMBqBM-UFBA.pdf: 3905396 bytes, checksum: 787178064bf80c2b44514b51172abf04 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-07-03T14:40:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Tiago Oliveira Ribeiro_PMBqBM-UFBA.pdf: 3905396 bytes, checksum: 787178064bf80c2b44514b51172abf04 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-03T14:40:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Tiago Oliveira Ribeiro_PMBqBM-UFBA.pdf: 3905396 bytes, checksum: 787178064bf80c2b44514b51172abf04 (MD5) / FAPESB / O diabetes mellitus têm se configurado como uma grave doença que acomete aproximadamente 415 milhões de pessoas no mundo. O transplante de ilhotas pancreáticas surge como uma alternativa terapêutica para esta doença. No entanto, a viabilidade reduzida das ilhotas após o isolamento, e a perda dos capilares sanguíneos que irrigam as ilhotas acarreta uma diminuição na sobrevivência das células e a rejeição imunológica ao enxerto. As células tronco mesenquimais (CTMs) surgem como uma opção interessante devido a sua capacidade de promover a vascularização por meio da liberação de fatores de crescimento e citocinas próangiogênicas. O objetivo desde estudo foi monitorar in vitro o potencial angiogênico do meio condicionado (MC) de CTMs provenientes de medula óssea sobre células endoteliais visando aperfeiçoar a revascularização e a viabilidade de ilhotas pancreáticas humanas. As CTMs de medula óssea foram caracterizadas pela expressão de marcadores moleculares, potencial de multi-linhagem e dobramento populacional. O MC de CTMs promoveu a migração, proliferação, viabilidade e angiogênese de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). O MC ativou a via de sinalização PI3K/Akt em HUVECs. PCR quantitativo em tempo real e array do perfil proteômico do MC demostraram que as células tronco expressam e secretam diversos fatores tróficos e citocinas sob condições de hipóxia. Ensaios in vitro demonstraram que o MC promoveu um aumento na viabilidade das ilhotas, assim como na manutenção da expressão de insulina e de CD31 nas células endoteliais intra-ilhotas. Com estes dados nós concluímos que o MC das CTMs em hipóxia demonstrou potencial angiogênico e contribuíram para a manutenção da viabilidade das ilhotas pancreáticas através da presença de fatores protéicos solúveis. Ainda, estes efeitos foram mediados através da via de AkT nas células endoteliais. Nossos dados corroboram o uso de MC de CTM para otimizar o transplante de ilhotas pancreáticas. / Diabetes mellitus has been characterized as a serious disease that affects approximately 415 million people worldwide. The islet transplantation emerged as an alternative treatment for diabetes. However, the reduced islet cell viability after the isolation and the loss of islet vasculature cause a decrease in the survival of the cells and the immunological graft rejection. Mesenchymal stem cells (MSCs) appear as an interesting option to reduce barriers for this therapy due to its ability to promote vascularization through the release of growth factors and pro-angiogenic cytokines. The goal of this study was investigate in vitro the angiogenic potential of contidioned medium derived from bone marrow on endothelial cells aiming to improve revascularization and viability of human pancreatic islets. MSCs from bone marrow was characterized by the expression of molecular markers, multi-lineage potential and population doubling. MSC derived conditioned medium showed ability to promote migration, proliferation, viability and angiogenesis of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Conditioned Medium activated the PI3K/Akt signaling pathway in HUVECs. q-PCR and proteome profiler array of conditioned medium fractions showed that the stem cells expressed and secrete several trophic factors and cytokines under hypoxic conditions. Insights in vitro proposed that conditioned medium promoted an increase in islet viability as well as increased in insulin secretion and maintenance of intra-islet endothelial cells. With this information we conclude that CM from MSCs in hypoxia showed angiogenic potential and contributed to maintaining the viability of pancreatic islets by the presence of soluble protein factors. Furthermore, these effects were mediated by Akt pathway in endothelial cells. Our data support the use of CM from CTM to optimize islet transplantation.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2017-07-21T14:08:14Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Tiago Oliveira Ribeiro.pdf: 3905396 bytes, checksum: 787178064bf80c2b44514b51172abf04 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-21T14:08:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Tiago Oliveira Ribeiro.pdf: 3905396 bytes, checksum: 787178064bf80c2b44514b51172abf04 (MD5) / FAPESB;CAPES / O diabetes mellitus têm se configurado como uma grave doença que acomete aproximadamente 415 milhões de pessoas no mundo. O transplante de ilhotas pancreáticas surge como uma alternativa terapêutica para esta doença. No entanto, a viabilidade reduzida das ilhotas após o isolamento, e a perda dos capilares sanguíneos que irrigam as ilhotas acarreta uma diminuição na sobrevivência das células e a rejeição imunológica ao enxerto. As células tronco mesenquimais (CTMs) surgem como uma opção interessante devido a sua capacidade de promover a vascularização por meio da liberação de fatores de crescimento e citocinas próangiogênicas. O objetivo desde estudo foi monitorar in vitro o potencial angiogênico do meio condicionado (MC) de CTMs provenientes de medula óssea sobre células endoteliais visando aperfeiçoar a revascularização e a viabilidade de ilhotas pancreáticas humanas. As CTMs de medula óssea foram caracterizadas pela expressão de marcadores moleculares, potencial de multi-linhagem e dobramento populacional. O MC de CTMs promoveu a migração, proliferação, viabilidade e angiogênese de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). O MC ativou a via de sinalização PI3K/Akt em HUVECs. PCR quantitativo em tempo real e array do perfil proteômico do MC demostraram que as células tronco expressam e secretam diversos fatores tróficos e citocinas sob condições de hipóxia. Ensaios in vitro demonstraram que o MC promoveu um aumento na viabilidade das ilhotas, assim como na manutenção da expressão de insulina e de CD31 nas células endoteliais intra-ilhotas. Com estes dados nós concluímos que o MC das CTMs em hipóxia demonstrou potencial angiogênico e contribuíram para a manutenção da viabilidade das ilhotas pancreáticas através da presença de fatores protéicos solúveis. Ainda, estes efeitos foram mediados através da via de AkT nas células endoteliais. Nossos dados corroboram o uso de MC de CTM para otimizar o transplante de ilhotas pancreáticas.

Uma das consequências mais devastadoras do tratamento do câncer na população jovem do sexo feminino é a falência ovariana, que resulta na diminuição do potencial de fertilidade. Nenhum tratamento curativo para a falência ovariana primária é conhecido, no entanto, as células-tronco mesenquimais, através de seu potencial de auto-renovação e de regeneração, vem sendo utilizadas com o intuito de avaliar o seu papel no tratamento da falência ovariana. O objetivo deste estudo foi explorar o impacto das células-tronco adiposo derivadas (ADSC), células de macerado de ovário e células –tronco femininas germinativas mouse vasa homologue positivas (MVH+) na falência ovariana induzida pela cisplatina em camundongos e esclarecer quais tipos celulares promovem melhor recuperação neste modelo. Quarenta e oito camundongas adultas foram injetadas com 7,5 mg/kg de cisplatina para induzir a falência ovariana. Como doadores de células foram utilizadas fêmeas C57BL6 transgênicas para a proteína verde fluorescente (GFP +) . Os animais foram subdivididos em três grupos: grupo controle (que recebeu somente solução salina) grupo ADSC- animais que receberam injeção intra ovariana de células-tronco mesenquimais adiposo derivadas (1x104), grupo ovário - animais que receberam injeção intra ovariana de células obtidas a partir de macerado de ovário (1x104) e grupo FGSC- animais que receberam injeção de células tronco germinativas MVH positivas(1x104). Todos os grupos foram avaliados em dois tempos de eutanásia: 7 e 14 dias após o transplante das células. A partir das análises histológicas, pode-se perceber um aumento significativo (p≤ 0,05) na probabilidade de obtenção de folículos viáveis nos grupos ADSC (43%) e suspensão de células de ovário (48%) quando comparados ao grupo controle (24%) no dia 7 e um amumento significativo na probabilidade de obtenção de folículos viáveis no número no grupo FGSC (71%) quando comparado aos outros grupos. Nos grupos eutanasiados 14 dias pós transplante os animais do grupo MVH apresentaram 72% de probabilidade de folículos viáves em comparação aos grupos: controle (50%), ADSC (58%) e suspensão de ovário (52%) diferença não foi estatisticamente significativa. A dosagem de estradiol não mostrou diferença estatística entre os grupos, nos diferentes tempos de eutanásia. / One of the most devastating consequences of cancer treatment in the young female population is ovarian damage, resulting in diminished fertility potential. No curative treatment is known for primary ovarian failure; however, mesenchymal stem cells, trough self -renewal and regeneration, was tested to evaluate their role in the treatment of ovarian failure. The aim of this study was to explore the impact of adipose derived stem cells (ADSC), ovarian cells macerated and female germline stem cells MVH + (FGSC) in ovarian failure induced by cisplatin in mice and to clarify the mechanism (s) by which the ADSCs exert their action. Methods: Thirty-six adult female mice were injected with 7.5 mg / kg of cisplatin to induce ovarian failure. As donor cells used C57BL6 females GFP +. Animals were divided into three groups: control group (which received only saline), ADSC-group: animals received intra ovarian 1x104 adipose derived stem cells; Ovarian cell group - animals received intra ovarian 1x104 cells obtained from macerated ovarian tissue and FGSC-group: animals received 1x104 female germline stem cells MVH positive. All groups were assessed at two times of euthanasia: 7 and 14 days after cell transplantation. Results: From the histological analysis, one can see a significant increase in the number of viable follicles in groups and MVH ADSC compared to the control group at day 7. On day 14 we also observed a tendency to better recovery in group MVH compared to the control group and the other groups, although this difference was not statistically significant. There was no difference in estradiol serum levels between all groups.

O uso de células da medula óssea no tratamento da insuficiência hepática aguda é uma alternativa promissora, visto que o único tratamento disponível atualmente é o transplante hepático o qual, devido à falta de órgãos para transplante e complicações pós-cirúrgicas, está associado a uma alta mortalidade. O interesse na identificação de populações celulares capazes de se diferenciar em células tipo-hepatócitos tem ganhado grande atenção, não somente como uma promissora fonte de células para terapia celular de doenças hepáticas, mas também como potencial fonte celular para modelos in vitro de testes pré-clínicos de medicamentos, modelos para estudo da hepatogênese, e desenvolvimento de fígados bioartificiais. O presente estudo teve como objetivo identificar a capacidade de diferentes populações de células da fração mononuclear da medula óssea (FMMO) de se diferenciar em células tipo-hepatócitos. Para isso, utilizamos um sistema de co-cultivo, onde as células da fração aderente e nãoaderente da FMMO eram mantidas em contato com o meio de hepatócitos derivados de animais com ou sem lesão por Tetracloreto de Carbono (CCl4). Nossos resultados mostram que células da fração não-aderente são capazes de adquirir características típicas de hepatócitos após 24 horas de exposição às células do tecido lesionado, tais como expressão gênica de Albumina e Citokeratina-18, e produção e secreção de uréia. Foi identificada a presença de microvesículas carregando material genético específico de hepatócitos no sobrenadante das células diferenciadas, indicando um possível mecanismo molecular na indução da diferenciação. Este trabalho permitiu o estudo da diferenciação celular in vitro e análise do papel do microambiente de lesão neste processo. / Cell therapy using bone marrow-derived cells is a promising approach for the treatment of acute liver failure, as liver transplant is associated to high mortality due to lack of organs and post-surgical complications. The identification of cell populations capable of generating hepatocyte-like cells has gained immense interest, not only as a promising cell source for cell-based therapy of liver diseases, but also as a potential cell source for in vitro models of drug safety testing, models for studying hepatogenesis, and development of bioartificial livers. In the present study, we investigated the capability of different populations from the bone marrow mononuclear cells (BMMC) to differentiate into hepatocyte-like cells. For that, adherent and non-adherent cells from the BMMC were co-cultured with hepatocytes obtained from animals with or without Carbon Tetrachloride (CCl4)-induced liver injury. Our results showed that non-adherent BMMC presented signs of differentiation, such as Albumin and Cytokeratin-18 expression and urea production, after 24 hours of co-culture with damaged hepatocytes. Microvesicles carrying hepatocyte-specific genetic material were detected in the supernatant from differentiated cells, thus suggesting a mechanism of differentiation. In summary, this study assessed in vitro differentiation of BMMC and analyzed the role of injury micro-environment in cell plasticity.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2015-03-25T12:18:39Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Marcella Miranda Sales.pdf: 5077309 bytes, checksum: a1310c8c52436e007c5891d63d4b7e5d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-25T12:18:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Marcella Miranda Sales.pdf: 5077309 bytes, checksum: a1310c8c52436e007c5891d63d4b7e5d (MD5) / CAPES;FAPESB / A osteonecrose da cabeça femoral é uma complicação óssea comum em pacientes falciformes sendo decorrente dos eventos vaso-oclusivos frequentes nesta doença. O reparo anormal na região acometida pela necrose pode ser atribuído à neovascularização limitada e possíveis alterações no número e funcionalidade das células-tronco mesenquimais e ósseas neste ambiente isquêmico. Com este trabalho se avaliou a freqüência e funcionalidade das células-tronco mesenquimais (CTMs) isoladas da fração de células mononucleares da medula óssea (CMMO) dos pacientes com doença falciforme (HbSS e HbSC). Esta população compõe a fração de células mononucleares que são injetadas de forma autóloga na cabeça do fêmur para tratamento da osteonecrose nesses indivíduos. O potencial clonogênico foi analisado por ensaio de Unidades Formadoras de Colônias-Fibroblastóides (CFU-F) na fração de células mononucleares. As CTMs isoladas e expandidas em cultivo foram caracterizadas por citometria de fluxo com os principais marcadores: CD105, CD90, CD146 e CD29. O potencial de diferenciação, a taxa de proliferação, a migração celular em câmara de Boyden, a detecção de citocinas no sobrenadante celular através do ELISA e a análise da expressão gênica , através da técnica de PCR quantitativo em tempo real, foram verificados sob condições normais e após o pré-condicionamento em hipóxia temporária por 48 horas. Os resultados demonstraram que a frequência das CFU-F na fração de células mononucleares dos pacientes portadores de anemia falciforme (n=12) está elevada na medula óssea quando comparadas à dos pacientes com osteonecrose do grupo controle (n=8) (p= 0,0409). As CTMs do grupo falciforme expandidas em cultura se apresentaram morfologicamente e imunofenotipicamente semelhantes àquelas do grupo controle. As CTMs dos pacientes falciformes se mostraram multipotentes, viáveis e proliferativas quando cultivadas em condições normais, perdendo a capacidade de diferenciação óssea após o efeito da hipóxia. Os mesmos resultados foram notados na análise da expressão gênica para marcadores ósseos de fase inicial (RUNX2, ALPL e COLLAGEN I). Concluímos que as CTMs presentes na fração de CMMO são viáveis, proliferativas e tem potencial de diferenciação multipotente em condições de normóxia, o que fundamenta o emprego da terapia celular no tratamento da osteonecrose no doente falciforme.

A terapia celular utilizando células tronco mesenquimais (MSC) derivadas da medula óssea surge como uma alternativa para o tratamento das doenças neurodegenerativas. Apesar dos resultados positivos com o uso dessas células nos ensaios pré-clínicos e clínicos após a isquemia cerebral, seus efeitos colaterais e seu mecanismo de ação permanecem desconhecidos. Os benefícios alcançados após a terapia celular para o tratamento da isquemia não são atribuídos à diferenciação dessas células em novos neurônios, mas sim aos fatores que elas podem secretar. Na tentativa de compreender como os fatores secretados pelas MSC podem influenciar o tecido hipocampal que sofreu ou não privação de oxigênio e glicose (POG) e como os fatores liberados pelo tecido lesionado podem atuar sobre as MSC, nós utilizamos culturas organotípicas de hipocampo expostas ao meio condicionado pelas MSC e MSC expostas ao meio condicionado pelas culturas organotípicas de hipocampo expostas à POG. Os resultados obtidos nesse trabalho mostram que o meio condicionado pelas MSC é tóxico para as culturas organotípicas de hipocampo, induzindo morte celular especificamente nas regiões do Corno de Ammon (CA) e agravando a lesão causada pela POG. Essa toxicidade parece ser específica das MSC, uma vez que o meio condicionado por outros tipos celulares não tem o mesmo efeito. As MSC isoladas tanto de rato como de camundongo e tanto de medula óssea como de pulmão induzem a morte celular de uma maneira semelhante, sugerindo que o efeito não é espécie ou órgão específico. Ainda, nós observamos que os fatores secretados pelas MSC ativam a microglia e os astrócitos, induzindo a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), o aumento da iNOS e um aumento de IL-6 e TNFα nas culturas organotípicas. O efeito tóxico do meio condicionado pelas MSC pode ser atenuado por antioxidantes, anti-inflamatórios, antagonistas NMDA e AMPA, bloqueadores de canal de cálcio dependentes de voltagem e por agonista GABA. Quando as MSC foram analisadas após a sua exposição ao meio condicionado pelo tecido hipocampal lesionado, nós não observamos morte celular ou mudanças morfológicas aparentes nessas células após 24 h de exposição ao meio. Surpreendentemente, as MSC aumentaram a proliferação quando expostas ao meio condicionado pelo hipocampo lesionado, não apresentando nenhum marcador neural após 72 h em contato com esse meio condicionado. Em conjunto, nossos resultados mostram um possível efeito adverso de fatores secretados pelas MSC, introduzindo uma nota de cautela na utilização dessas células. / Cell therapy using bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC) seems to be a new alternative for the treatment of neurodegenerative diseases. In spite of several good and promising results with the use of these cells in preclinical and clinical studies after stroke, their side effects and their mechanism of action are still unknown. The benefits reached after cell therapy to treat stroke are not attributed to the differentiation of the cells in new neurons, but to the factors that these cells can secrete. In an attempt to understand how MSC secreted factors can influence the hippocampal tissue that suffer or not from oxygen and glucose deprivation (OGD) and how the factors secreted from the injured hippocampus can influence MSC behavior, we used organotypic hippocampal slice cultures exposed to MSC conditioned medium and MSC exposed to organotypic hippocampal cultures conditioned medium. The results obtained in this work show that MSC conditioned medium is toxic to organotypic hippocampal slice cultures, inducing cell death specifically in the CA (Cornus Ammonis) region of hippocampus and aggravating the lesion induced by OGD. This toxicity seems to be specific to MSC, once the medium conditioned by other cell types do not induce cell death. Also, MSC isolated from rat or mice and from bone marrow and lungs induce cell death in a similar manner, suggesting that the effect is not organ- or specie- specific. In addition, we have observed that MSC secreted factors activate microglia and astrocytes, inducing reative oxygem species (ROS) generation and iNOS, TNFα and IL-6 increase in organotypic cultures. The MSC conditioned medium-induced toxic effect can be attenuated by antioxidants, antiinflammatory drugs, NMDA and AMPA antagonists, Ca2+ voltage-dependent channel blockers and GABA agonist. When MSC behavior was investigated after these cells were exposed to the conditioned medium from the lesioned hippocampus, we observed that these medium is not able to induce cell death or any apparent change in MSC morphology after a 24 h exposure period. Surprinsingly, MSC increase proliferation in response to the conditioned medium from the injured hippocampal tissue, do not presenting any neural marker after 72 h of contact with this medium. Taken together, our results show a possible side effect of MSC secreted factors, introducing a note of caution in the use of these cells.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-12-09T17:10:33Z No. of bitstreams: 1 2016_PaulaQueirozAlvim.pdf: 2137251 bytes, checksum: c937d6955782dde4412bc528cee8f2f4 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-09T21:23:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_PaulaQueirozAlvim.pdf: 2137251 bytes, checksum: c937d6955782dde4412bc528cee8f2f4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-09T21:23:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_PaulaQueirozAlvim.pdf: 2137251 bytes, checksum: c937d6955782dde4412bc528cee8f2f4 (MD5) / INTRODUÇÃO: As células-tronco mesenquimais (CTMs) são células multipotentes presentes em uma grande variedade de tecidos. A administração sistêmica e intrapulmonar dessas células em animais com fibrose pulmonar diminui a mortalidade, o clearence do fluido alveolar e o processo inflamatório local, evitando assim a progressão da fibrose para uma síndrome pulmonar mais grave. Para compreender melhor o processo pelo qual as CTMs atuam na regeneração dos tecidos lesionados, é preciso avaliar sua migração, enxertia e retenção nos tecidos lesionados. As nanopartículas magnéticas vêm sendo usadas como uma estratégia eficiente para mobilizar CTMs para regiões lesionadas na presença de campos magnéticos. Esferas de tungstênio são capazes de alterar a homogeneidade de um campo magnético e consequentemente mudar o gradiente desse campo, intensificando a quantidade de CTMs que chegam no local da inflamação. OBJETIVOS: a) testar se CTMs marcadas com nanopartículas (γ-Fe2O3)-citrato podem ser mobilizadas magneticamente para o órgão alvo com a utilização de ímãs externos; b) investigar o potencial de mobilização magnética para aumentar a enxertia de CTMs humanas provenientes de lipoaspirado marcadas com nanopartículas (γ-Fe2O3)-citrato em um modelo murino de fibrose pulmonar induzido por bleomicina, c) investigar também se, quando submetidas a campo magnético não uniforme, a migração das CTMs marcadas com nanopartículas (γ-Fe2O3)-citrato aumenta na presença de um ímã rodeado por esferas de tungstênio; e d) investigar se uma maior enxertia de CTMs no local da lesão, resultante da mobilização magnética, melhora significativamente a regeneração do tecido pulmonar. METÓDOS: Inicialmente foi estudada a distribuição de fluidos magnéticos quando submetidos a diferentes campos magnéticos a fim de estabelecer qual campo magnético permitiria a distribuição mais adequada para este estudo. Posteriormente, foram feitos estudos in vitro de mobilização magnética com CTMs marcadas com nanopartículas (γ- Fe2O3)-citrato em diferentes campos magnético, e estudos in vivo visando: i) quantificar, sob a influência destes campos, a migração e retenção de CTMs marcadas com nanopartículas (γ- Fe2O3)-citrato nos pulmões com fibrose pulmonar induzida por bleomicina em um modelo murino; e ii) analisar a variação do peso e sobrevida destes animais. RESULTADOS: Observamos em nossos ensaios in vitro que o campo magnético que permitiu a melhor distribuição do fluido magnético de nanopartículas (γ-Fe2O3)-citrato foi o arranjo com um ímã envolto por 5 esferas de tungstênio. Tal arranjo permitiu uma maior migração de CTMs marcadas com nanopartículas (γ-Fe2O3)-citrato in vitro quando comparado a um campo magnético formado apenas por um ímã cilíndrico. Nos ensaios in vivo, os grupos de animais que tiveram mobilização magnética de CTMs marcadas com nanopartículas (γ-Fe2O3)-citrato induzida por campos magnéticos externos apresentaram maior retenção destas células nos pulmões do que o grupo que não foi submetido a mobilização magnética; sendo o grupo que teve o campo magnético formado por um ímã cilíndrico rodeado por cinco esferas de tungstênio o que apresentou maior retenção de CTMs nos pulmões. CONCLUSÕES: É possível aumentar a migração, enxertia, retenção e distribuição de CTMs marcadas com nanopartículas magnéticas para regiões alvo quando submetidas a campos magnéticos externos. Modificar o gradiente de campo com as esferas de tungstênio permite uma maior mobilização magnética de CTMs marcadas com nanopartículas magnéticas in vitro e in vivo. __________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction: Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent cells present in a variety of tissues. The intrapulmonary and systemic administration of these cells in animals with pulmonary fibrosis decreases mortality, clearance of alveolar fluid and local inflammatory process, preventing fibrosis progression to a more severe pulmonary syndrome. To better understand the process of action the MSCs in the regeneration of damaged tissues, it is necessary analyze their migration, grafting and retention in injured tissues. Magnetic nanoparticles have been used as an effective strategy to mobilize MSCs to damaged regions in the presence of magnetic fields. Spheres of tungsten are able to change the homogeneity of a magnetic field and consequently change the gradient of the field. Objective: a) test whether MSCs labeled with nanoparticles (γ-Fe2O3)-citrate can be mobilized magnetically to the target organ by the presence of magnets; b) investigate the potential of magnetic targeting to increase the engraftment of human MSCs derived from liposuction labeled with nanoparticles (γ-Fe2O3)- citrate in a murine model of pulmonary fibrosis induced by bleomycin, c) and also, investigate whether under a non-uniform magnetic field, the migration of MSCs labeled with nanoparticles (γ-Fe2O3)-citrate increases in the presence of a magnet surrounded by spheres of tungsten; and d) investigate if a higher grafting of MSCs to the site of injury, resulting of magnetic targeting, improves significantly the regeneration of lung tissues. Methodology: At first, we studied the distribution of magnetic fluids when submitted to different magnetic fields to determine what magnetic field would allow the most adequate distribution for this study. Subsequently, studies in vitro of magnetic targeting with MSCs labeled with nanoparticles (γ-Fe2O3)-citrate in different magnetic fields have been made studies in vitro; and in vivo studies intending to: i) quantify, under the influence of these fields, the migration and retention of MSCs labeled with nanoparticles (γ-Fe2O3)-citrate in lungs of a murine model of pulmonary fibrosis, induced by bleomycin; and ii) analyze the variation in weight and survival of these animals. Results: It was observed in vitro, that the magnetic field that allowed the best distribution of the magnetic fluid of nanoparticles (γ-Fe2O3)-citrate was the arrangement with a magnetic surrounded by five spheres of tungsten. This arrangement improved the migration of MSCs labeled with nanoparticles (γ-Fe2O3)-citrate in vitro when compared with a magnetic field formed only by a cylindrical magnet. In the teste in vivo, the groups of animals that had magnetic targeting of MSCs labeled with nanoparticles (γ-Fe2O3)-citrate induced by an external magnetics fields showed greater retention of these cells in the lungs than the group that was not submitted to magnetic targeting; being the group that had the magnetic field formed by a cylindrical magnet surrounded by five spheres of tungsten which showed greater engraftment of MSCs in the lungs. Conclusion: It’s possible to increase the homing, engraftment and distribution of MSCs labeled with magnetic nanoparticles to target sites under an external magnetic fields. Modify the gradient field with the spheres of tungsten improves magnetic mobilization of MSCs labeled with magnetic nanoparticles in vitro and in vivo.

Magíster en Gestión para la Globalización / ClusterBio es una empresa dedicada a la investigación, innovación y comercialización de tratamientos personalizados en medicina regenerativa, que nace en Estados Unidos producto de una alianza estratégica. La terapia celular es considerada una herramienta clave para prevenir y tratar diversas enfermedades crónicas y degenerativas, proyectándose como una parte esencial de la medicina del futuro. ClusterBio posee el sub-licenciamiento exclusivo en Chile, Brasil, Colombia y Uruguay de la tecnología para aislar y utilizar las células pluripotenciales adultas derivadas de tejido adiposo, Muse-AT, que presentan características regenerativas superiores a otras células madre adultas. El protocolo para obtener células Muse-AT, patentado por la Universidad de California, Los Angeles (UCLA), es eficiente y de bajo costo, lo que permite su rápida transferencia hacia la clínica. Actualmente se están realizando estudios preclínicos y planificando los primeros estudios clínicos piloto de la aplicación de las células Muse-AT en enfermedad de Parkinson y lesiones musculares. La industria muestra un crecimiento sostenido a una tasa del 23% anual, con ventas sobre los 17 mil millones de dólares (2016). El mercado potencial en Latinoamérica para ClusterBio, considerando solo tratamientos para lesiones musculares y enfermedad de Parkinson, es de 35 mil millones de dólares. La estructura de financiación se compone tanto de fondos públicos como privados, el proyecto contempla una inversión de USD $155.970 para el primer año y USD $274.939 para el segundo año. La evaluación económica de la empresa, proyectada a 10 años, muestra gran potencial con un VAN de USD $1,493,054; una TIR de 97,4% y la recuperación de la inversión en 4,88 años. La empresa ya cuenta con la adjudicación de proyectos de financiamiento para investigación como Ganesha lab y los contratos tecnológicos para la innovación de Corfo, además de una licencia para estudiar el uso de células Muse en el tratamiento de heridas, vendida en Ecuador. / 23/11/2019

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:56:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000413194-Texto+Completo-0.pdf: 3719374 bytes, checksum: 939fa9966f0915aeae6d7fdb447e896d (MD5) Previous issue date: 2009 / Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a major cause of mortality worldwide. In Brazil, every year 280 thousand patients are hospitalized with COPD. Since the adult lung cannot have a spontaneous growth or regenerate itself, the pulmonary emphysema is considered a progressive and irreversible disease. The aim of this study was to evaluate the effect of bone marrow mononuclear cells transplantation in the regeneration of emphysematous lung tissue in mice. The experimental model of pulmonary emphysema was induced in mice by intranasal instillation of 3. 5 mL/kg of papain in 0. 9% NaCl2 solution. The animals were divided into 2 groups: one control (n=8) that received normal saline, and the experimental group (n=8) that received 1x107 EGFP+ bone marrow cells through the tail vein. The animals were killed 45 days after transplant, and lungs were removed and perfused with 10% buffered formalin. The lungs were embedded in paraffin to obtain serial sections of 3 μm. Slides were stained with hematoxylin-eosin to evaluate lung morphology and with 0. 1% Evans Blue and DAPI to confirm the presence of EGFP+ cells in the lung epithelia. The analyses showed the presence of alveolar EGFP+ cells suggesting that the donors bone marrow cells are involved in the repair of lung tissue. / A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é uma importante causa de mortalidade em todo mundo. No Brasil, a cada ano, são hospitalizados 280 mil pacientes com DPOC. Como o pulmão adulto não pode ter um crescimento espontâneo ou regenerar-se, o enfisema pulmonar é considerado uma doença progressiva e irreversível. O objetivo principal deste trabalho foi avaliar o efeito do transplante de células mononucleares de medula óssea na regeneração do tecido pulmonar enfisematoso de animais experimentais. O modelo experimental de enfisema pulmonar foi induzido em camundongos através de instilação intranasal de 3,5 mL/kg de papaína em solução de NaCl2 a 0,9%. Os animais foram divididos em dois grupos, sendo um controle (n=8) que recebeu somente soro, e o grupo experimental (n=8), cujos animais receberam 1x107 células de medula óssea EGFP+ através da veia caudal. Os animais foram sacrificados 45 dias após o transplante e os pulmões foram removidos e perfundidos com formol tamponado a 10%. Os fragmentos pulmonares foram incluídos em parafina para obtenção de cortes seriados de 3 Om. As lâminas foram coradas com Hematoxilina-eosina para avaliar a morfologia pulmonar e com Azul de Evans 0,1% e DAPI para a confirmação da presença de células EGFP+ no epitélio pulmonar. As análises demonstraram a presença de células alveolares EGFP+ sugerindo que as células de medula óssea dos animais doadores estão envolvidas no processo de reparo do tecido pulmonar.