Introdução: a síndrome antifosfolípide (SAF) primária é uma vasculopatia autoimune mediada por autoanticorpos com trombose como sua principal manifestação clínica. A presença de anticorpos antifosfolípides (aPL), embora relevante para confirmar o diagnóstico, não parece ser suficiente para explicar completamente a fisiopatologia da doença e um segundo gatilho é usualmente necessário. Além das hipóteses de infecções virais e insulto inflamatório como possíveis desencadeantes, parece que os receptores toll like (TLR) e o Interferon (IFN) tipo I são possíveis protagonistas nesse processo, contribuindo para o início da trombose. Recentemente, dois pequenos estudos demonstraram que uma porcentagem relevante de pacientes com SAF primária tem uma regulação positiva de genes IFN em células mononucleares do sangue periférico (CMSP). Entretanto, 20% e 28% dos pacientes nessas duas coortes tiveram anticorpos anti-dsDNA positivos, um autoanticorpo altamente específico do lúpus eritematoso sistêmico (LES). Objetivo: avaliar se os pacientes com SAF bem caracterizados apresentam assinatura para interferon nas células mononucleares periféricas. Secundariamente foram avaliadas possíveis associações clínico laboratoriais com a assinatura de IFN. Métodos: foram selecionados 53 pacientes do sexo feminino com diagnóstico de SAF primária de acordo com os critérios de Sidney, com idade igual ou maior a 18 anos, selecionados no Ambulatório de SAF da Disciplina de Reumatologia do HCFMUSP, pareados por sexo e idade com 50 controles saudáveis. Um terceiro grupo com 29 paciente com antecedente de trombofilias não imunomediadas também foi incluido. Após a coleta de sangue as CMSPs foram purificadas por metodologia de Ficoll. A expressão gênica das CMSPs foi realizada através do TaqMan® RNA Assay em placas TLDA. Foram pesquisados 41 genes induzidos por IFN (GIIs). Uma análise de componente principal (ACP) foi realizada para determinar quais genes deveriam compor a assinatura de IFN. O teste de z-score foi utilizado para normalizar e calcular a assinatura de IFN para cada paciente. O cutoff da assinatura de IFN foi definido por uma curva ROC, e foi escolhido o ponto que maximizava a sensibilidade e especificidade. Características demográficas, clínicas e laboratoriais foram analisadas buscando por associações com a assinatura de IFN. Resultados: 11 genes estavam superexpressos nos pacientes com SAF em comparação aos controles. Após a análise de ACP foram escolhidos 6 genes que representavam mais de 95% do comportamento da amostra para compor a assinatura de IFN: DNAJA1, IFI27, IFI6, IFIT5, MX1 e TYK2. O cutoff encontrado pela curva ROC foi de 3,9 folds (AUC = 0,706, S = 0,49, E = 0,86, VPP = 0,79, VPN = 0,61). A assinatura de IFN estava presente em 49% dos pacientes com SAF primário vs. 14% dos controles saudáveis e 17% dos controles positivos (p < 0,001). Foi encontrada associação entre a assinatura de IFN e uma ocorrência mais precoce do primeiro evento clínico (p = 0,023), e com ocorrência de eventos obstétricos (em especial pré-eclâmpsia, p = 0,032). Não foi econtrada nenhuma associação entre a assinatura de IFN e número de eventos trombóticos, exames laboratoriais, comorbidades, antecedentes familiares de doenças autoimunes, e escores de risco de retrombose. De todos os tratamentos em uso a única associação encontrada foi entre uma menor assinatura de IFN e o uso de estatinas (p = 0,026). Conclusão: esse estudo indica que pacientes com SAF primária bem caracterizados apresentam uma assinatura de IFN tipo I, não observada em outras trombofilias não imunidade-mediadas ou em controles saudáveis. Também demonstrou-se que essa superexpressão de genes regulados por IFN tipo I está associada a um início mais precoce dos eventos e pré-eclâmpsia. Mais estudos são necessários para determinar se este subgrupo de pacientes se beneficiará de intervenções terapêuticas direcionadas à via de sinalização IFN tipo I / Introduction: primary antiphospholipid syndrome (PAPS) is an autoimmune vasculopathy mediated by autoantibodies with thrombosis as its main clinical manifestation. The presence of antiphospholipid antibodies, while relevant to confirm the diagnosis, does not seem to be sufficient to fully explain the pathophysiology and a second trigger is usually needed. Besides the hypotheses of viral infections and inflammatory insult as possible triggers, type I Interferon (IFN) has been pointed as a possible protagonist. Recently, two studies have demonstrated that a relevant percentage of PAPS patients have an up-regulation of IFN genes in peripheral blood mononuclear cells (PBMC). However, 20% and 28% of patients in these 2 cohorts, had antidsDNA positive antibodies, a highly specific Systemic Lupus Erythematosus (SLE) autoantibody. Objective: The aim of this study is to determine the prevalence of type I IFN signature in PBMC of patients with PAPS without specific SLE autoantibodies and search for it with clinical and laboratorial associations. Methods: 53 PAPS patients (according to Sydney´s criteria) were consecutively selected and age-matched with 50 healthy controls. A third group, with non-immune-mediated thrombophilia patients, was also included. The expression of 41 IFN induced genes was analysed using real time quantitative PCR (TaqMan Low Density Array). A principal component analysis (PCA) was used to determine which genes should compose the IFN signature and z-score was calculated. The IFN signature score cut-off was defined with a ROC curve, as the point that maximized both the specificity and sensitivity. Clinical and laboratorial features were analysed searching for associations with IFN signature. Results: 11 IFN genes were highly expressed in primary APS patients. After PCA, 6 genes remained in the IFN signature: DNAJA1, IFIT5, IFI27, MX1, IFI6, TYK2. The ROC cutoff was 3,9 folds (AUC = 0.706, S = 0.49, E = 0.86, VPP = 0.79, VPN = 0.61). The type I IFN signature was present in 49% of patients with primary APS compared to 14.0% of healthy controls and 17% of non-immune-mediated thrombophilia patients (p < 0.0001). The mean IFN score was significantly higher in PAPS patients (4.0 fold higher, p < 0.0001) than in controls. A higher IFN signature was associated with a younger age at the first APS event (p = 0.023) and with the presence of obstetric events, especially with preeclampsia (p = 0.032). There was no association between IFN signature and number of thrombotic events, laboratory exams, comorbidities, family history of autoimmune diseases, and thrombosis risk scores. Treatment with statins was associated with lower levels of IFN scores (p = 0.026). Conclusion: our result indicates that PAPS patients, without lupus specific antibodies, have an enhanced type I IFN gene signature, not observed in non-immune mediated thrombophilia. We also provide novel data demonstrating that this overexpression of type I IFN-regulated genes is associated with an earlier onset of APS events and preeclampsia. Further studies are necessary to determine if this subgroup of patients will benefit of interventions targeting the type I IFN signalling pathway

The thesis analyses the female patients' data from Clinical hematology department in České Budějovice hospital from year 2014 to 2015 and tries to statistically confirm connection between D-dimer level and hypercoagulable states described in previous bachelor thesis. D-dimer assay is due to negative predictive value and high sensitivity an initial laboratory test to rule out tromboembolic disease. However, it has low specificity. The elevated level of D-dimer is observed in conditions like infection, trauma, acute cancer, recent surgery or pregnancy and last studies showed increased D-dimer level even in combination with inherited hypercoagulable states. Thus, it is necessary to analyse the level of D-dimer in pregnant women related to specific hypercoagulable states. Moreover, the thesis analyses the influence of other factors like anticoagulation therapy on D-dimer level and tries to find connection between D-dimer level and pregnancy associated complication, birth weight or a type of delivery.

This thesis was about the relationship of the Factor V Leiden mutation and activated protein C resistance. I looked up patients with Leiden mutation and activated protein C resistance. I monitored the frequency of thromboembolism and miscarriages in the personal and family case history of patients. Subsequently, I looked up if other risk factors which affect clinical manifestations in patients with this mutation can be found.

Introduction: Hip fracture surgery is the particular problem of very old patinets (>75 years), with high risk of VTE (up to 80%). It is essential to provide VTE prophylaxis. Patients advanced age and their polymorbidity contribute to the thrombophilic status. Objectives and methods: The aim of the study was to determine the changes of coagulation within the 28 post-operative days in 41 patients over 75 years who underwent hip fracture surgery. Another object was to determine acute phase response and an endothelial activation. The third task was to determine how affected is a key component of hemostasis, FXa activity by its specific inhibitor fondaparinux and enoxaparin, which inhibits FXa and thrombin in a 4:1 ratio and if there is bleeding complication in such a risk group patiens after antithrombotics long-term administration. Patients were randomly divided into two anticoagulant groups: fondaparinux (n = 23) and enoxaparin (n = 18). Results: Thrombophilia is demonstrated by a reactive increase of the most of these parameters preoperatively and reveals the effect of the initial trauma. A surgery further aggravates this reaction. This inflammatory and secondary prothrombogenic condition persisted until postoperative day 28. Both antithrombotics effectively inhibit thrombin generation without...

Introdução: a síndrome antifosfolípide (SAF) primária é uma vasculopatia autoimune mediada por autoanticorpos com trombose como sua principal manifestação clínica. A presença de anticorpos antifosfolípides (aPL), embora relevante para confirmar o diagnóstico, não parece ser suficiente para explicar completamente a fisiopatologia da doença e um segundo gatilho é usualmente necessário. Além das hipóteses de infecções virais e insulto inflamatório como possíveis desencadeantes, parece que os receptores toll like (TLR) e o Interferon (IFN) tipo I são possíveis protagonistas nesse processo, contribuindo para o início da trombose. Recentemente, dois pequenos estudos demonstraram que uma porcentagem relevante de pacientes com SAF primária tem uma regulação positiva de genes IFN em células mononucleares do sangue periférico (CMSP). Entretanto, 20% e 28% dos pacientes nessas duas coortes tiveram anticorpos anti-dsDNA positivos, um autoanticorpo altamente específico do lúpus eritematoso sistêmico (LES). Objetivo: avaliar se os pacientes com SAF bem caracterizados apresentam assinatura para interferon nas células mononucleares periféricas. Secundariamente foram avaliadas possíveis associações clínico laboratoriais com a assinatura de IFN. Métodos: foram selecionados 53 pacientes do sexo feminino com diagnóstico de SAF primária de acordo com os critérios de Sidney, com idade igual ou maior a 18 anos, selecionados no Ambulatório de SAF da Disciplina de Reumatologia do HCFMUSP, pareados por sexo e idade com 50 controles saudáveis. Um terceiro grupo com 29 paciente com antecedente de trombofilias não imunomediadas também foi incluido. Após a coleta de sangue as CMSPs foram purificadas por metodologia de Ficoll. A expressão gênica das CMSPs foi realizada através do TaqMan® RNA Assay em placas TLDA. Foram pesquisados 41 genes induzidos por IFN (GIIs). Uma análise de componente principal (ACP) foi realizada para determinar quais genes deveriam compor a assinatura de IFN. O teste de z-score foi utilizado para normalizar e calcular a assinatura de IFN para cada paciente. O cutoff da assinatura de IFN foi definido por uma curva ROC, e foi escolhido o ponto que maximizava a sensibilidade e especificidade. Características demográficas, clínicas e laboratoriais foram analisadas buscando por associações com a assinatura de IFN. Resultados: 11 genes estavam superexpressos nos pacientes com SAF em comparação aos controles. Após a análise de ACP foram escolhidos 6 genes que representavam mais de 95% do comportamento da amostra para compor a assinatura de IFN: DNAJA1, IFI27, IFI6, IFIT5, MX1 e TYK2. O cutoff encontrado pela curva ROC foi de 3,9 folds (AUC = 0,706, S = 0,49, E = 0,86, VPP = 0,79, VPN = 0,61). A assinatura de IFN estava presente em 49% dos pacientes com SAF primário vs. 14% dos controles saudáveis e 17% dos controles positivos (p < 0,001). Foi encontrada associação entre a assinatura de IFN e uma ocorrência mais precoce do primeiro evento clínico (p = 0,023), e com ocorrência de eventos obstétricos (em especial pré-eclâmpsia, p = 0,032). Não foi econtrada nenhuma associação entre a assinatura de IFN e número de eventos trombóticos, exames laboratoriais, comorbidades, antecedentes familiares de doenças autoimunes, e escores de risco de retrombose. De todos os tratamentos em uso a única associação encontrada foi entre uma menor assinatura de IFN e o uso de estatinas (p = 0,026). Conclusão: esse estudo indica que pacientes com SAF primária bem caracterizados apresentam uma assinatura de IFN tipo I, não observada em outras trombofilias não imunidade-mediadas ou em controles saudáveis. Também demonstrou-se que essa superexpressão de genes regulados por IFN tipo I está associada a um início mais precoce dos eventos e pré-eclâmpsia. Mais estudos são necessários para determinar se este subgrupo de pacientes se beneficiará de intervenções terapêuticas direcionadas à via de sinalização IFN tipo I / Introduction: primary antiphospholipid syndrome (PAPS) is an autoimmune vasculopathy mediated by autoantibodies with thrombosis as its main clinical manifestation. The presence of antiphospholipid antibodies, while relevant to confirm the diagnosis, does not seem to be sufficient to fully explain the pathophysiology and a second trigger is usually needed. Besides the hypotheses of viral infections and inflammatory insult as possible triggers, type I Interferon (IFN) has been pointed as a possible protagonist. Recently, two studies have demonstrated that a relevant percentage of PAPS patients have an up-regulation of IFN genes in peripheral blood mononuclear cells (PBMC). However, 20% and 28% of patients in these 2 cohorts, had antidsDNA positive antibodies, a highly specific Systemic Lupus Erythematosus (SLE) autoantibody. Objective: The aim of this study is to determine the prevalence of type I IFN signature in PBMC of patients with PAPS without specific SLE autoantibodies and search for it with clinical and laboratorial associations. Methods: 53 PAPS patients (according to Sydney´s criteria) were consecutively selected and age-matched with 50 healthy controls. A third group, with non-immune-mediated thrombophilia patients, was also included. The expression of 41 IFN induced genes was analysed using real time quantitative PCR (TaqMan Low Density Array). A principal component analysis (PCA) was used to determine which genes should compose the IFN signature and z-score was calculated. The IFN signature score cut-off was defined with a ROC curve, as the point that maximized both the specificity and sensitivity. Clinical and laboratorial features were analysed searching for associations with IFN signature. Results: 11 IFN genes were highly expressed in primary APS patients. After PCA, 6 genes remained in the IFN signature: DNAJA1, IFIT5, IFI27, MX1, IFI6, TYK2. The ROC cutoff was 3,9 folds (AUC = 0.706, S = 0.49, E = 0.86, VPP = 0.79, VPN = 0.61). The type I IFN signature was present in 49% of patients with primary APS compared to 14.0% of healthy controls and 17% of non-immune-mediated thrombophilia patients (p < 0.0001). The mean IFN score was significantly higher in PAPS patients (4.0 fold higher, p < 0.0001) than in controls. A higher IFN signature was associated with a younger age at the first APS event (p = 0.023) and with the presence of obstetric events, especially with preeclampsia (p = 0.032). There was no association between IFN signature and number of thrombotic events, laboratory exams, comorbidities, family history of autoimmune diseases, and thrombosis risk scores. Treatment with statins was associated with lower levels of IFN scores (p = 0.026). Conclusion: our result indicates that PAPS patients, without lupus specific antibodies, have an enhanced type I IFN gene signature, not observed in non-immune mediated thrombophilia. We also provide novel data demonstrating that this overexpression of type I IFN-regulated genes is associated with an earlier onset of APS events and preeclampsia. Further studies are necessary to determine if this subgroup of patients will benefit of interventions targeting the type I IFN signalling pathway

Orientadores: Ricardo Barini, Egle Cristina Couto de Carvalho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-08T19:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soligo_AdrianadeGoeseSilva_M.pdf: 464907 bytes, checksum: c9378bf0a2d1fe337908abb53f773dbe (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Objetivo: determinar a prevalência dos fatores trombofílicos em mulheres inférteis. Método: estudo de corte transversal, no qual foram admitidas mulheres inférteis (atendidas em clínica privada) e submetidas à investigação de trombofilia, conforme protocolo da referida clínica, no período de março de 2003 a março de 2005. Foram incluídas mulheres em idade fértil com história de infertilidade, definida como um ano de coito sem método contraceptivo e sem concepção. Foram excluídas mulheres com hepatopatia e dados incompletos em prontuário, obtendo-se a amostra de 144 mulheres. Os fatores trombofílicos avaliados foram: o anticorpo anticardiolipina (ACL) e o anticoagulante lúpico (ACGL); a deficiência de proteína C (DPC), a deficiência de proteína S (DPS), a deficiência de antitrombina III (DAT), a presença do fator V de Leiden, uma mutação no gene da protrombina e a mutação da metileno tetrahidrofolato redutase (MTHFR). Resultados: os valores de prevalência obtidos para ACL e ACGL foram de 2%. A prevalência dos fatores trombofílicos hereditários foram: DPC 4%, DPS 6%, DAT 5%, fator V de Leiden 3%, mutação da protrombina 3%, mutação MTHFR 57%. Conclusões: das 144 pacientes selecionadas, 105 mulheres, ou seja, 72,9% apresentavam pelo menos um fator trombofílico presente. Isto reforça a importância e justifica a necessidade da investigação neste grupo / Abstract: Purpose: to establish the prevalence of thrombophilic factors in infertile women. Methods: a cross-sectional study was performed, in which infertile women were included, seen in a private clinic with investigation for thrombophilia, according to the protocol of the clinic, between March 2003 and March 2005, after the approval of the Research Ethics Committee of UNICAMP. One hundred and forty four infertile women without any liver disease were evaluated. Infertility is defined as one year of unprotected sexual intercourse without contraception and with no conception. The acquired and/or inherited thrombophilic factors are: anticardiolipin antibody (aCL) and lupus anticoagulant (LA); protein C deficiency (PCD), protein S deficiency (PSD), antithrombin III deficiency (ATD), presence of the factor V Leiden, mutation in the prothrombin gene, and mutation of Methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR). Results: the prevalence values obtained for aCL and LA were 2%. The prevalence of hereditary thrombophilic factors were: PCD 4%, PSD 6%, ATD 5%, factor V Leiden 3%, prothrombin mutation 3%, MTHFR mutation 57%. Out of the selected 144 patients, 105 women (72, 9%) presented at least one thrombophilic factor. This reinforces the importance and justifies the need of investigation in this grou / Mestrado / Tocoginecologia / Mestre em Tocoginecologia

Orientador: Erich Vinicius de Paula / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T23:01:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_GleiceReginade_M.pdf: 1983428 bytes, checksum: 435b8d4ea1f6b2d6d8254be7fd9c00b2 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Há cerca de 50 anos sabe-se que pacientes com anemia falciforme (AF) apresentam maiores concentrações plasmáticas de heme livre. Recentemente, foi demonstrado que o heme é capaz de ativar a resposta imune inata, desencadeando resposta dependente de receptores "Toll-like", envolvendo a expressão de vários genes pró-inflamatórios. Em consonância com estes achados, o papel pró-inflamatório do heme foi confirmado em diferentes modelos experimentais de AF, colocando este metabólito como potencial desencadeante da oclusão microvascular e síndrome torácica aguda. Tromboses micro e macro vasculares são características da AF, e o papel do heme na patogenia destes eventos foi recentemente sugerido pela demonstração de sua capacidade de induzir a expressão de fator tecidual (FT) em células endoteliais e monócitos. No entanto, a relevância funcional da expressão deste achado ainda não foi demonstrada através de marcadores clinicamente relevantes da coagulação. Métodos: A expressão do FT induzida pelo heme foi avaliada em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) através de dois ensaios globais da hemostasia: tromboelastometria (TEM) e teste de geração de trombina (TGT). Sangue de voluntários saudáveis foram coletados por uma veia antecubital com mínima estase em tubos de citrato de sódio (1:10) ou heparina. A TEM foi realizada em amostras de sangue total (n=10) incubadas com 30 ?M do heme (Sigma¿Aldrich) durante 4 horas a 37°C, em um equipamento ROTEM (Pentapharm). A coagulação foi ativada pela adição de CaCl2. Como controle, amostras dos mesmos indivíduos foram incubadas concomitantemente com o veículo (n=10). O TGT foi realizado em amostras de plasma duplamente centrifugadas, separadas a partir de sangue total estimulado com heme ou veículo sob as mesmas condições (n=16). A TGT foi realizada utilizando flurímetro Fluoroskan Ascent® (Thermolab). A coagulação foi ativada com FT (5pM) e fosfolipídios ( Reagente PPP, Thrombinoscope). A expressão de FT foi avaliada por qRT-PCR. PBMC e neutrófilos foram separados por centrifugação de gradiente de densidade (Ficoll) e então incubados com 30 uM de heme (n=6) ou salina (n=6) por 24hs. Teste estatístico não-paramétrico foi utilizado em todas as análises. Resultados: a incubação do sangue total com 30 uM de heme resultou numa potente indução de expressão de FT quando comparado com o veículo em PBMC (AU) (0,03±0,06 vs 1,18±0,60; P=0,03). Não foi possível detectar a expressão de FT em neutrófilos. A ativação da coagulação induzida pelo heme pode ser demonstrada através da TEM. O Heme diminuiu significativamente o tempo de coagulação (seg) (562,1±88,2 vs 387±84.3; P=0,002) e a MaxV-t (tempo para a velocidade máxima) (651,4±119,2 vs 451,1±87,4; P=0,002), que são dois indicadores de um estado de hipercoagulabilidade. Uma tendência para a diminuição do tempo de formação do coágulo também pode ser observada (P=0.07). Nenhuma diferença pode ser observada na área sob a curva da TEM. Um perfil de hipercoagulabilidade, também foi observado no TGT. Mudanças estatisticamente significativas, compatíveis com a ativação da coagulação foram observadas em parâmetros como: pico de trombina (aumentado), tempo para atingir a trombina (diminuição), índice de velocidade (aumento), período de latência (diminuição) e StarTail (diminuição) (todos<0,05). Nenhuma mudança estatisticamente significativa pode ser observada no parâmetro de pontencial endógeno de trombina. Discussão e Conclusão: A TEM e o TGT são dois testes globais em hemostasia, amplamente utilizados para avaliação de estados de hipo e hipercoagulabilidade. Ambos os métodos tem sido utilizados em pacientes com AF, que apresentam estado de hipercoagulabilidade similar ao encontrado em nosso trabalho, caracterizada por um início mais rápido da ativação da coagulação. Nossos resultados demonstram pela primeira vez que o heme, em concentrações semelhantes às observadas em pacientes com AF, é capaz de estimular não só a expressão do TF em PBMC, mas também de alterar o equilíbrio da coagulação para um estado de hipercoagulabilidade. Estes resultados fornecem um suporte adicional à hipótese de que o heme é um mediador chave na trombose micro e macro vascular na AF e, possivelmente, em outras doenças hemolíticas. Nosso estudo também avaliou de forma preliminar, o efeito do heme sobre a fosforilação do resíduo S879 da proteína p120-catenina, como um marcador indireto da quebra de barreira endotelial. Os resultados, ainda preliminares, sugerem que pode haver um efeito do heme sobre a integridade de barreira endotelial, fato que será investigado em estudos futuros / Abstract: It has been known for more than 50 years that patients with sickle cell disease (SCD) present higher plasma concentrations of heme. More recently, it was shown that heme is capable to activate innate immune response, and to trigger a toll-like receptor-dependent response that involves the expression of several pro-inflammatory genes. Accordingly, the role of heme as critical inflammatory mediator in SCD has been confirmed in different experimental models, suggesting that heme can be a trigger for microvascular occlusion and acute chest syndrome (ACS). The association between innate immune response and coagulation activation dates back to 450 million years in evolution, so that activation of the former is frequently accompanied by activation of the latter. Micro and macrovascular thrombosis are a hallmark of SCD, and the role of heme in the pathogenesis of these events has been recently suggested by demonstrations of heme-induced expression of tissue factor (TF) by endothelial cells and monocytes. However, the functional relevance of heme-induced TF expression on clinically-relevant coagulation markers has not been demonstrated. Methods: herein we evaluated heme-induced TF expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMC), and used two different global assays of hemostasis, namely thromboelastometry (TEM) and Thrombin Generation Test (TGT) to evaluate the effect of heme on coagulation activation. Blood from healthy volunteers was drawn from an antecubital vein with minimal stasis in 0.106 sodium citrate tubes (1:10) or heparin. TEM was performed in whole-blood samples (n=10) incubated with 30 µM heme (Sigma-Aldrich) for four hours at 37oC, in a ROTEM equipment (Pentapharm). Coagulation was activated with the addition of CaCl2. Samples from same individuals incubated with vehicle were assayed concomitantly as controls (n=10). TGT was performed in double centrifuged plasma samples, separated from whole blood stimulated with heme or vehicle under the same conditions (n=16). TGT was performed using a Fluoroskan Ascent Flourimeter (Thermolab). Coagulation was activated with TF (5pM) and phospholipids (PPP reagent, Thrombinoscope). Expression of TF was evaluated by qRT-PCR. Heparin-anticoagulated blood was incubated with 30 µM heme (n=6) or vehicle (n=6) for 24 hours. PBMC and neutrophils were then separated by density gradient centrifugation (Ficoll). Non-parametric statistics were used in all analysis. Results: incubation of whole blood with heme 30 µM resulted in a potent induction of TF expression in PBMC compared to vehicle (AU)(0.03±0.06 vs 1.18±0.60; P=0.03). No TF expression could be detected in neutrophils. Heme-induced coagulation activation could be demonstrated by TEM. Heme significantly decreased the coagulation time (sec) (562.1±88.2 to 387±84.3; P=0.002) and the MaxV-t (time to maximum velocity) (651.4±119.2 to 451.1±87.4 ; P=0.002), which are two indicators of shift towards a hypercoagulable profile. A trend towards a lower clot formation time was also observed (P=0.07). No difference could be observed in the area under the TEM curve. A hypercoagulable profile was also observed in TGT in samples incubated with heme. Statistically significant changes compatible with a shift towards coagulation activation were observed in parameters such as peak thrombin (increased), time to peak thrombin (decreased), velocity index (increased), lagtime (decreased) and StarTail (decreased) (all P<0.05). No statistically significant change could be observed in the endogenous thrombin potential parameter (p=0.10). Discussion and conclusions: TEM and TGT are global hemostasis assays, widely used for evaluation of hypo- and hypercoagulable states. Both methods have been used in patients with SCD, who present hypercoagulable profiles similar to those obtained in our study, and characterized by faster onset and offset of coagulation activation. We demonstrate for the first time that heme, in concentrations similar to those observed in patients with SCD and other hemolytic disorders, is capable to not only stimulate the expression of TF by PBMC, but also to shift the coagulation balance towards a hypercoagulable state, similar to that observed in patients with SCD. These results provide additional support to the hypothesis that heme is a key mediator micro- and macrovascular thrombosis in SCD and possibly, in other hemolytic disorders. Our study also evaluated in a preliminary form the effect of heme on the phosphorylation of the residue S879 from p120-catenin, as a surrogate marker of endothelial barrier breakdown induced by heme. Though preliminary, our results suggest that heme might also affect endothelial barrier integrity. Additional studies are underway to evaluate this hypothesis / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Clínica Médica

Orientador: Egle Cristina Couto de Carvalho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T14:08:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simoni_RenataZaccaria_D.pdf: 2332845 bytes, checksum: fc29ed8709fbdf31408d1968e76a01a0 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Contexto e objetivo: Algumas malformações congênitas têm origem vascular, e a trombose durante a organogênese já foi aventada como possível mecanismo para esta ocorrência. O objetivo deste estudo foi avaliar a associação entre trombofilia fetal e malformações de origem vascular. Tipo de estudo e local: Foi realizado um estudo caso-controle, desenvolvido no ambulatório de Medicina Fetal do CAISM UNICAMP, de 2005 a 2010. Métodos: Foram incluídos no estudo 100 fetos com malformações de sistema nervoso central (SNC), gastrosquise, limb body wall e redução de membros (casos), submetidos a cordocentese como rotina do serviço, cujos resultados de cariótipo foram normais. Como controles, foram incluídos 100 fetos sem malformações cujo sangue de cordão fora previamente doado para o Banco de Sangue de Cordão do HEMOCENTRO UNICAMP. A pesquisa das mutações Fator V de Leiden, G20210A-FII e C677T-MTHFR foi realizada no sangue fetal dos dois grupos, e os resultados foram comparados. A análise descritiva foi feita utilizando Qui-quadrado e Teste Exato de Fisher. Para avaliar a associaçãoo entre as variáveis, foram utilizados o teste de Wilcoxon e a regressão logística. Resultados: Foram incluídos 78 fetos com malformações de SNC, 14 com gastrosquise, 3 com redução de membros e 2 com limb body wall. As mutações fator V de Leiden e G20210A-FII não foram encontradas nos casos e nos controles. A mutação C677T-MTHFR foi encontrada na forma heterozigota (CT) em 24 casos (24,8%) e em 6 controles. A mutação homozigota (TT) foi encontrada em 7 casos (7,2%) e em 1 controle. Estas diferenças foram estatisticamente significativas (p<0,0001). Quando avaliados os fetos com malformações de SNC (Artigo 1), a mutação CT foi encontrada com frequência significativamente maior nos casos do que nos controles (OR 10.309 IC95% 3.344-32.258), e a mutação TT também mostrou diferença significativa (OR 12.346 IC95% 1.388-111.11). A avaliação dos 14 fetos com gastrosquise (Artigo 2) não mostrou diferenças significativas quanto à presença da mutação CT ou TT entre os casos e os controles. Conclusão: A presença da mutação C677T-MTHFR no sangue fetal mostrou associação com malformações de SNC, tanto na forma homozigota quanto heterozigota / Abstract: Context and objective: Some congenital malformations have vascular origin, and a thrombosis during organogenesis is a possible mechanism for them. The aim of this study was to evaluate the association between fetal thrombophilia and malformations of vascular origin. Study type and location: A case-control study was performed at the Fetal Medicine Outpatient Clinic of CAISM UNICAMP, from 2005 to 2010. Methods: Ninety-seven fetuses with central nervous system malformations, gastroschisis, limb body wall and limb reduction were included in the study (cases), after routine cordocentesis showed normal karyotype results. A hundred fetuses without malformations were included as controls. These fetuses' cord blood had been donated to the Cord Blood Bank of HEMOCENTRO UNICAMP. DNA was extracted from fetal cord blood to study the mutations Factor V Leiden, G20210A-FII and MTHFR-C677T in both groups. Descriptive analysis was realized using Chi-square and Fisher's Exact Test. Wilcoxon test and logistic regression were used to analise the associations among variables. Results: We found 78 fetuses with central nervous system malformations, 14 with gastroschisis, 3 with member reduction and 2 with limb body wall. The mutations Factor V Leiden and G20210A-FII were not detected in cases nor in controls. The mutation MTHFR-C677T was encountered in 24 cases (24.8%) and in 6 controls its heterozygous form (CT). The homozygous mutation (TT) was found in 7 cases (7.2%) and in one control. These differences were statistically significant (p <0.0001). When the fetuses with central nervous system malformations were evaluated separately (Article 1), the frequency of the CT mutation was significantly higher in cases than in controls (OR 10.309 95% CI 3.344-32.258), as did the TT mutation (OR 12.346 95% CI 1.388-111.11). The 14 fetuses with gastroschisis were also evaluated separately (Article 2), and the results showed no statistically significant differences between cases and controls when concerning to the presence of the mutation MTHFR-C677T. Conclusion: The presence of the mutation MTHFR-C677T in fetal blood was associated with central nervous system malformations, both in homozygous and heterozygous form / Doutorado / Saúde Materna e Perinatal / Doutora em Ciências da Saúde

Introduction: Hip fracture surgery is the particular problem of very old patinets (>75 years), with high risk of VTE (up to 80%). It is essential to provide VTE prophylaxis. Patients advanced age and their polymorbidity contribute to the thrombophilic status. Objectives and methods: The aim of the study was to determine the changes of coagulation within the 28 post-operative days in 41 patients over 75 years who underwent hip fracture surgery. Another object was to determine acute phase response and an endothelial activation. The third task was to determine how affected is a key component of hemostasis, FXa activity by its specific inhibitor fondaparinux and enoxaparin, which inhibits FXa and thrombin in a 4:1 ratio and if there is bleeding complication in such a risk group patiens after antithrombotics long-term administration. Patients were randomly divided into two anticoagulant groups: fondaparinux (n = 23) and enoxaparin (n = 18). Results: Thrombophilia is demonstrated by a reactive increase of the most of these parameters preoperatively and reveals the effect of the initial trauma. A surgery further aggravates this reaction. This inflammatory and secondary prothrombogenic condition persisted until postoperative day 28. Both antithrombotics effectively inhibit thrombin generation without...

La grossesse est une période de majoration du risque vasculaire, participant à une morbi-mortalité maternelle et fœtale pouvant justifier des mesures de prévention primaire et secondaire. Notre travail évalue l'impact de certains déterminants et l'apport de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans la dysfonction vasculo-placentaire. Le but ultime étant d'optimiser les prises en charge et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nous avons étudié les complications vasculaires placentaires associées à des marqueurs biologiques connus : mutation du facteur V Leiden, mutation du gène de la prothrombine et marqueurs conventionnels du syndrome des anticorps anti-phospholipides (SAPL). Nos résultats montrent que les femmes à antécédents de fausses couches précoces répétitives et porteuses, soit du polymorphisme du facteur V, soit du polymorphisme du facteur II, soit d'un SAPL (traité par héparine et aspirine faible dose), ont un risque élevé de fausse couche tardive lors d'une nouvelle grossesse. Les femmes à antécédent de fausse couche tardive et porteuses des mêmes particularités biologiques, traitées pendant leur grossesse selon les recommandations (héparine pour l'anomalie du facteur V ou II, héparine plus aspirine faible dose pour le SAPL), ont un risque diminué de récidive de perte fœtale tardive mais demeurent, dans le groupe SAPL, fréquemment exposées aux complications tardives de la grossesse malgré la prophylaxie antithrombotique. Nous avons évalué l'apport de nouveaux marqueurs de la dysfonction vasculaire placentaire. Nous montrons que le polymorphisme Ile89Leu du gène de la phosphatase alcaline placentaire (PLAP), enzyme exprimée par les cellules du syncytiotrophoblaste -polymorphisme associé à une augmentation de l'activité PLAP-, exerce un effet protecteur sur l'échec d'implantation et la survenue d'une fausse couche primaire. Un facteur angiogénique (brevet en cours) a également été étudié (génétique, dosage plasmatique, fécondation in vitro) et nous montrons une association de ce marqueur avec les échecs d'implantation et les fausses couches idiopathiques. L'ensemble de ces travaux suggère que ces nouveaux marqueurs moléculaires pourraient contribuer au diagnostic des complications vasculaires de la grossesse et fournir des biomarqueurs d'implantation embryonnaire et/ou de développement placentaire. Ils pourraient suggérer de nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques, répondant aux limites des traitements disponibles. / Vascular risk increases during pregnancy, contributing to maternal and foetal morbidity and mortality, and potentially justifying primary and secondary preventive measures. Our work evaluates the impact of some determinants and the contribution of new molecular actors implicated in placental vascular dysfunction. The ultimate aim is to optimize management and to develop new therapeutic strategies. We studied the placental vascular complications associated with known biological markers: the factor V Leiden or prothrombin polymorphisms, and conventional markers of the antiphospholipid antibody syndrome (APS). Women with previous recurrent abortions carrying polymorphisms of either factor V or factor II, or with APS (treated with heparin and low-dose aspirin), had an increased risk of foetal loss during subsequent pregnancies. Women with a previous foetal loss carrying these biological markers, treated according to recommendations during a new pregnancy (heparin for the polymorphisms, heparin plus low-dose aspirin for APS) had a lower risk of foetal loss, but an excess of late complications was observed in the APS group despite prophylaxis. We evaluated the contribution of new markers of placental vascular dysfunction. The placental alkaline phosphatase enzyme (PLAP) is synthesized and expressed by syncytiotrophoblastic cells. We found that the Ile89Leu polymorphism of the PLAP gene provides protection against implantation failure and primary miscarriage and induces increased PLAP activity. We also studied (genetics, plasma determinations, in vitro fertilisation) an angiogenic factor (patent application underway), which we showed to be associated with idiopathic implantation failure and miscarriage. These findings suggest that these molecular actors are potentially useful for the diagnosis of placenta-mediated pregnancy complications and may be relevant biomarkers of embryo implantation and/or placental development. They may indicate new targets for relevant therapeutic strategies, potentially overcoming the limitations of the currently available treatments.