La technologie des microarrays est une technique d’analyse d’expression génique à grande échelle qui permet d’analyser simultanément l’expression de milliers de gènes dans différentes cellules et différentes conditions physiologiques, pathologiques ou toxicologiques (Shena et al, 2000). Dans notre étude nous avons employé cette technique pour mieux comprendre deux pathologies thyroïdiennes: les carcinomes papillaires (PTC) et les adénomes autonomes hyperfonctionnels.<p>L’étude des profils d’expression génique de 9 carcinomes papillaires thyroïdiens sporadiques et de 13 carcinomes papillaires post-Chernobyl a été effectuée en utilisant les lames commerciales de Perkin-Elmer (comportant 2400 cDNA) et en les comparant à leurs tissus normaux adjacents. Les PTC post-Tchernobyl constituent une population de cancers à cause bien définie puisqu’ils sont directement reliés à l’exposition du même agent mutagène, pendant une même période. L’étude des profils d’expression indique qu’il n’y a pas de signature génique spécifique permettant de distinguer les carcinomes papillaires sporadiques des post-Tchernobyl. La comparaison de ces profils d’expression à celui obtenu avec 13 adénomes autonomes a permis de mettre en évidence une signature de 6 gènes (créatine kinase B, annexine A1, clusterine, métallothionéine 1x, Fc fragment of IgG binding protein et tissue inhibitor of metalloproteinase 1) séparant les carcinomes papillaires malins des adénomes autonomes bénins. <p>Nous avons également analysé l’expression génique sur des mélanges de tumeurs et de leurs contrôles respectifs sur des lames à 17000 cDNA fabriquées au MAF (VIB Microarray Facility, Leuven). Un mélange de 14 cancers papillaires sporadiques, un mélange de 20 cancers papillaires provenant de la région de Tchernobyl et un mélange de 5 adénomes autonomes ont été analysés par microarray et comparés aux études existantes comme celles effectuées sur les lames Perkin-Elmer ou par d’autres groupes (Huang et al, 2001 ;Wasenius et al, 2003 ;Jarzab et al, 2005 ;Eszlinger et al, 2004). <p>De ces données microarray ont résulté des listes de gènes sur- et sous-exprimés dans les tumeurs comparées à leurs tissus normaux adjacents. Plusieurs gènes différentiellement exprimés ont déjà été confirmés dans différentes études réalisées aussi bien dans notre laboratoire que dans d’autres. Nous avons confirmé la modulation de plusieurs gènes intéressants par RT-PCR en temps réel (Taqman) ainsi que certaines modulations au niveau protéique (par Western Blot ou immunohistochimie). L’étude immunohistochimique nous a donné également des informations sur la distribution cellulaire et tissulaire de ces protéines. <p>La modulation d’expression génique dans ces tumeurs reflète des caractéristiques physiopathologiques connues (comme l’hyperactivité fonctionnelle, la faible augmentation de l’AMPc ou encore la diminution de l’apoptose dans les adénomes autonomes et la dédifférenciation ou l’invasivité dans les carcinomes papillaires), mais elle nous a également permis d’identifier des caractéristiques physiopathologiques jusqu’ici encore inconnues de ces tumeurs (comme la surexpression de la N-cadhérine et la diminution de la cavéoline1, deux marqueurs présumés de malignité, dans les tumeurs bénignes et un changement de population cellulaire aussi bien dans les adénomes autonomes que dans les carcinomes papillaires). Ces études nous ont donc permis de définir des gènes potentiellement importants dans la pathologie des différentes tumeurs étudiées, mais également des nouveaux marqueurs diagnostiques potentiels. Ainsi, l’étude immunohistochimique sur des tissu-arrays nous a permis de confirmer la surexpression de l’annexine A1 dans les carcinomes papillaires et de la créatine kinase B dans les adénomes autonomes et pas dans les autres tumeurs thyroïdiennes étudiées. L’immunomarquage de ces protéines nous a également aidé à définir la malignité d’une série d’adénomes atypiques. L’annexine A1 est un marqueur potentiel particulièrement intéressant car cette protéine n’est fortement exprimée que dans les carcinomes papillaires. Une hypothèse, encore à confirmer, sur sa fonction dans cette pathologie est décrite dans ce travail. Finalement, nous avons émis une hypothèse expliquant la raison pour laquelle les réarrangements Ret/PTC mènent à la formation de carcinomes papillaires, tandis qu’une mutation activatrice de Ras, l’effecteur directe du récepteur à activité tyrosine kinase Ret, mène à la formation de tumeurs folliculaires. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’H2O2, produit en grande quantité dans la thyroïde, est depuis longtemps suspecté de jouer un rôle dans la pathogenèse des nodules et des cancers thyroïdiens. En effet, dans une situation pathologique où la production d'H2O2 serait excessive ou lors d’un défaut de protection par les enzymes de détoxification, l’H2O2 pourrait devenir toxique. In vitro, des quantités modérées d’H2O2 sont capables de provoquer des dégâts à l'ADN similaires à ceux induits par une irradiation de 1 Gy et peuvent même provoquer des réarrangements RET/PTC trouvés dans la plupart des carcinomes papillaires de la thyroïde. <p>La première partie de ce travail visait à mieux comprendre les mécanismes de protections qui pourraient être impliqués dans la défense contre les effets néfastes de l’H2O2 ainsi que le rôle de l’H2O2 dans la cancérogenèse thyroïdienne. Nous avons utilisé des cultures primaires de thyrocytes humains et nous les avons comparées à des lignées cellulaires de diverses origines ainsi qu’à des cultures primaires de lymphocytes T. Les résultats obtenus après traitement à l’H2O2 ont été comparés à ceux obtenus après irradiation, agent carcinogène connu. <p>Nous avons montré, grâce à une méthode fluorimétrique, que le thyrocyte était capable de dégrader de façon très efficace l’H2O2.<p>L’utilisation de L-buthionine-sulfoximine (BSO), un agent qui déplète la cellule en glutathion, a conduit à un abaissement du seuil d’observation des cassures de l’ADN (test des comètes) induites par l’H2O2 dans le thyrocyte ;ce qui suggère que la glutathion peroxydase (GPx) est impliquée dans la protection des thyrocytes en réponse à une agression par l’H2O2. Ceci a été confirmé par une augmentation de l'activité enzymatique de la GPx dans le thyrocyte une heure après une exposition à de l’H2O2 et pas après irradiation. <p>Une augmentation de l’expression de l’Hème oxygénase 1 (HMOX1) a été confirmée par RT-qPCR dans le thyrocyte après un traitement à l’H2O2. Ces résultats concordaient avec les résultats précédemment obtenus par microarray. <p>Les cinétiques de réparation de l'ADN ont montré que les dégâts à l'ADN étaient réparés plus lentement quand ils étaient provoqués par l’H2O2 que par l’irradiation. Les lymphocytes T sont incapables de réparer les dommages causés à l'ADN par l’H2O2. <p>Un pré-traitement des thyrocytes avec de l’H2O2 ralentit la réparation des dégâts à l’ADN induits par l’irradiation ce qui suggère une inhibition des enzymes de réparation en cas de stress oxydant. <p>La deuxième partie du travail a consisté à étudier la réaction de Fenton dans la thyroïde. En effet, un excès de fer libre a été suspecté d’être un facteur favorisant dans la génération de divers cancers dont le cancer thyroïdien. En présence d’H2O2, un excès de fer libre entraine la génération de radicaux hydroxyl, hautement réactifs (réaction de Fenton). <p>Nous avons mesuré les dégâts à l’ADN des thyrocytes pré-incubés avec des concentrations de FeSO4 compatibles avec la survie et traités avec l’H2O2. Une augmentation des dégâts à l’ADN et un ralentissement de leur réparation ont été observés dans les cellules. Les dégâts induits par l’irradiation n’étaient pas influencés par la présence de FeSO4. <p>Enfin, la troisième et dernière partie du travail a consisté à étudier les effets d’une irradiation causée par l’iode131 (I131) et de les comparer à ceux produits par une irradiation γ sur des thyrocytes humains en culture primaire ainsi que sur des lignées thyroïdiennes de rats (FRTL5 et PCCl3). L’irradiation par l’I131 produit moins de dégâts à l’ADN sur le thyrocyte, par le test des comètes, qu’une irradiation γ (Cs137) à doses irradiantes absorbées équivalentes. Un effet dose-réponse de l’irradiation par I’131 sur les lignées cellulaires (FRTL5 et PCCl3) est observé avec des activités radioactives faibles et des temps d’incubation courts.<p>En conclusion, le thyrocyte a développé plusieurs mécanismes de protection efficaces contre le stress oxydant, en particulier contre l’H2O2. Une augmentation du stress oxydant suite à un excès d’H2O2, de fer libre ou d’un défaut d’un des mécanismes de protection pourrait favoriser l'apparition de cancers sporadiques de la thyroïde.<p><p><p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les radiations ionisantes sont une cause établie de cancers de la thyroïde mais un nombre croissant de travaux évoque aussi le rôle potentiel du peroxyde d’hydrogène (H2O2) dans la pathogenèse des cancers thyroïdiens spontanés. Si les cassures double-brin de l’ADN (DSBs) sont considérées comme l’une des causes primaires de cancer, leur induction par l’H2O2 était plus controversée.<p><p>Lors de ce travail, nous avons voulu tester in vitro, dans différents modèles thyroïdiens, l’hypothèse selon laquelle l’H2O2 produit en grandes quantités in vivo pour oxyder l’iodure et synthétiser les hormones thyroïdiennes pouvait endommager l’ADN. <p>Les dégâts provoqués à l’ADN ont été évalués par le test des comètes (en milieu alcalin pour les cassures simple-brin (SSBs) et en milieu neutre pour les cassures double-brin de l’ADN) et quantitativement comparés à ceux produits par l’irradiation.<p>Nous avons montré dans une lignée cellulaire thyroïdienne de rat (PCCl3) que des concentrations non létales d’H2O2 (0.1 – 0.5 mM) tout comme l’irradiation (1 - 10 Gy) provoquaient une augmentation dépendante de la dose du nombre de SSBs et de DSBs. <p>L'induction de DSBs a été confirmée par la mesure du taux de phosphorylation de l’histone H2AX sur Sérine 139. L’induction de DSBs par l’H2O2 a également été observée dans des cultures primaires de thyroïdes humaines et dans des tranches de thyroïde de porcs.<p>L’utilisation de L-buthionine-sulfoximine (BSO), un agent qui empêche le renouvellement du glutathion cellulaire, a conduit à un abaissement du seuil d’observation des cassures de l’ADN induites par l’H2O2. <p>Nous avons également observé que les dommages de l’ADN étaient réparés plus lentement lorsqu’ils étaient provoqués par l’H2O2 plutôt que par l’irradiation. <p><p>Dans un second temps, nous avons exploré au niveau moléculaire les conséquences d’une exposition à 1 Gy d’irradiation γ ou à une concentration non létale d’H2O2 (0.05 – 0.2 mM) dans des cultures primaires de thyroïdes humaines et dans des lymphocytes T issus d’un même donneur. Nous avons étudié par micro-arrays les modifications du profil d’expression génétique de ces 2 types cellulaires afin de caractériser la spécificité de la réponse transcriptionnelle en fonction de la nature de l’agression, du type et de l’importance du dommage engendré ainsi que du type cellulaire.<p>Les 2 types cellulaires répondent de manière similaire à l’irradiation en termes de nombre de gènes régulés, avec un large recouvrement de réponses transcriptionnelles caractérisées par une forte sur-représentation de gènes impliqués dans l’apoptose et dans la réparation des dommages de l’ADN.<p>En revanche, la réponse transcriptionnelle à l’H2O2 est différente dans les 2 types cellulaires.<p>D’une part, les lymphocytes T qui montrent un dommage à l’ADN pour de plus faibles concentrations d’H2O2 que les thyrocytes présentent une réponse transcriptionnelle 1000 fois supérieure à celle observée dans les thyrocytes. D’autre part, les quelques gènes régulés dans les thyrocytes ne le sont pas dans les lymphocytes T. Il s’agit de gènes impliqués dans la défense contre les espèces réactives de l’oxygène (ROS). Ces résultats suggèrent l’existence de mécanismes de protection anti-oxydante spécifiquement développés dans les cellules thyroïdiennes.<p><p>En conclusion, ce travail a montré que l’H2O2, à des concentrations non létales, provoque des SSBs mais également des DSBs dans différents modèles thyroïdiens in vitro. La quantité de DSBs produite par l’H2O2 est comparable à celle observée après irradiation mais la vitesse de leur réparation est plus lente. D’autre part, en comparaison avec les lymphocytes T, les thyrocytes semblent particulièrement résistants aux effets de l’H2O2 et dotés de mécanismes de protection particulièrement performants et probablement partiellement inductibles contre les ROS.<p>Ces données soutiennent notre hypothèse de départ selon laquelle la production d’H2O2 dans la thyroïde pourrait jouer un rôle dans l’étiopathogénie des tumeurs thyroïdiennes, en particulier en cas de défenses anti-oxydantes altérées.<p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La progression dans le cycle cellulaire est gouvernée par l’activation séquentielle d’une série de complexes cycline/CDK. La CDK4 initie le passage du point de restriction (point R, à partir duquel l’achèvement du cycle cellulaire devient indépendant des facteurs extracellulaires) en phosphorylant les protéines « antioncogéniques » de la famille pRb. Dans les thyrocytes de chien en culture primaire, l’AMPc (TSH ou forskoline) induit la prolifération et la différenciation alors que la voie mitogénique des facteurs de croissance (l’EGF, par exemple) est associée à une dédifférenciation. Dans ce modèle physiologiquement relevant, la stimulation mitogénique par l’AMPc diffère des cascades des facteurs de croissance puisqu'elle n’induit pas les cyclines D mais au contraire augmente l’accumulation de l’inhibiteur de CDK p27 kip1. Le contrôle positif du cycle cellulaire par l’AMPc requiert néanmoins l’activité de la CDK4. L’AMPc stimule l’assemblage des complexes cycline D3-CDK4 ainsi que leur translocation nucléaire associée à leur liaison à p27. Notre but était d’élucider les différents mécanismes menant au passage du point de restriction dans les cellules épithéliales thyroïdiennes stimulées par l’AMPc ou les facteurs de croissance. Dans ce travail, nous montrons que l’arrêt de la stimulation des thyrocytes de chien par l’AMPc entraîne une diminution rapide de la phosphorylation de pRb et de l’activité de la CDK4 sans affecter la formation des complexes cycline D3-CDK4-p27. Par une approche utilisant le haut pouvoir de résolution de l’électrophorèse bidimensionnelle, nous avons identifié la phosphorylation activatrice de la CDK4 comme cible du contrôle par l’AMPc du passage du point de restriction. Ceci constitue un premier exemple d’une régulation de la phosphorylation et de l’activité de la CDK4 indépendante de son association avec une cycline ou un inhibiteur de CDK. Ces résultats contrastent avec l’absence de modulation d’expression, de localisation subcellulaire et d’assemblage des complexes cycline H-CDK7-Mat1, la CAK considérée comme responsable de la phosphorylation activatrice de la CDK4. Ceci suggère que les CAKs régulées activant la CDK4 n’ont pas encore été identifiées. D’autre part, alors que la TSH induit une accumulation de p27, nous montrons à présent que l’expression de la p21 apparentée est augmentée par l’EGF + sérum et réprimée par la TSH. En réponse à l’EGF + sérum ou à la TSH, respectivement, la p21 ou la p27 supportent la localisation nucléaire, la phosphorylation et l’activité de la CDK4. Les « inhibiteurs » de CDK p21 et p27 pourraient donc être utilisés différentiellement comme régulateurs positifs de la CDK4 lors des stimulations des cellules épithéliales thyroïdiennes de chien par la TSH (p27) ou par l’EGF + sérum (p21). Nous avons également montré que les complexes cycline D1-CDK4 et cycline D3-CDK4 phosphorylent pRb sur des sites partiellement différents. Cette nouvelle observation a été reproduite pour des complexes cycline D-CDK4 surexprimés en cellules CHO ainsi que pour des complexes exprimés de manière endogène dans différents types cellulaires. Cette différence de spécificité de substrat entre la cycline D1 et la cycline D3 conduit à différents profils de phosphorylation de pRb dans les thyrocytes de chien stimulés par la TSH ou les facteurs de croissance, ce qui est dû à l’utilisation préférentielle de la cycline D3 dans les thyrocytes stimulés par la TSH alors que les facteurs de croissance induisent surtout la cycline D1. Comme différentes fonctions de pRb sont régulées par phosphorylation sur différents résidus, ce résultat indique que les complexes cycline D1-CDK et cycline D3-CDK pourraient affecter de manière partiellement différente la fonction de cette protéine. Enfin, nous avons comparé les stimulations mitogéniques par la TSH ou l’EGF + sérum dans les thyrocytes humains normaux en culture primaire. En accord avec leurs modulations différentes, la cycline D3 et la cycline D1 sont utilisées différentiellement dans les voies mitogéniques stimulées par la TSH ou l’EGF + sérum respectivement. De plus, ce système nous a permis de confirmer la régulation de l’activité de la CDK4 au niveau de sa phosphorylation activatrice comme mécanisme déterminant de la réponse mitogénique.

Les tumeurs thyroïdiennes représentent les tumeurs endocrines les plus fréquentes. Parmi ces tumeurs les adénomes autonomes sont des tumeurs bénignes se développant secondairement à l’activation constitutive de la voie de l’AMPc. Cette activation est secondaire à des mutations somatiques survenant à différents niveaux de la cascade de signalisation induite par l’activation du récepteur TSH. La pathologie thyroïdienne maligne est essentiellement représentée par les carcinomes papillaires de la thyroïde pour lesquelles de nombreuses modifications génétiques ont été décrites, les plus fréquentes étant les réarrangements impliquant la tyrosine kinase Ret. Différents modèles de souris transgéniques ont été développés et représentent d’excellents outils pour étudier in vivo l’expression génique secondaire aux mutations initiales. Nous avons choisis d’utiliser la technologie des microarrays pour analyser simultanément l’expression de milliers de gènes dans différents modèles de souris transgéniques développant des pathologies thyroïdiennes bénignes et malignes . Au cours de cette thèse de doctorat, nous avons déterminé à l’aide de microarrays le profil d’expression génique de souris exprimant à la surface des cellules thyroïdiennes de manière spécifique le récepteur A2a de l’adénosine, ce qui mène à l’activation constitutive de la voie de l’AMPc et au développement d’une hyperthyroïdie sévère associée à un énorme goitre. Cette étude nous a permis d’identifier des gènes dont le rôle potentiel dans le développement de tumeur bénigne était jusqu’à lors inconnu. Nous avons également comparé deux modèles murins développant des tumeurs malignes de la thyroïde. D’une part les souris exprimant le réarrangement Ret/PTC3, très commun dans les carcinomes papillaires de la thyroïdes issus de la première vague de cancer survenu après la catastrophe de Chernobyl, d’autre part les souris exprimant l’oncoprotéine E7 dérivée de l’HPV16 responsable du cancer du col de l’utérus. Les différences et les similarités entre ces deux lignées et différentes pathologie humaine ont été décrites. La PCR quantitative en temps réel a été utilisé pour confirmer et quantifier la différence d’expression des gènes d’intérêts entre les thyroïdes de souris contrôles de même souche et les thyroïdes issues de souris transgéniques. La PCR en temps réel permet de monitorer à l’aide d’un signal fluorescent émis lors de l’hydrolyse d’une sonde, la quantité d’amplicons produite dans la réaction. La courbe d’amplification se caractérise par une phase exponentielle, suivie par une phase non exponentielle se terminant par un plateau. Contrairement aux idées reçues, nous avons pu démontrer que le plateau était expliqué par la déplétion de la sonde hydrolysée par la Taq polymérase lors de la réaction d’amplification. Dès lors que l’hydrolyse de la sonde reflète quantitativement la synthèse d’amplicons, la fluorescence produite dans la phase exponentielle de la réaction reflète la concentration des amplicons produits. Nous avons donc, sur base de ces observations pu estimer la quantité d’ADN complémentaire engagé dans la réaction en se basant directement sur les données de fluorescence d’une seule courbe de PCR en temps réel sans passer par une courbe de calibration utilisant une quantité connue d’ADN complémentaire.

Les Connexines (Cx) et les jonctions gap, permettant la communication directe de cellule -àcellule, sont impliquées dans le contrôle de la prolifération cellulaire. Le rôle de la Cx32 sur la croissance normale et tumorale de la thyroïde a été étudié chez des souris surexprimant la Cx32 dans la thyroïde (Cx32-T+) ou n’exprimant pas la Cx32 (Cx32- KO). A l’état basal, les souris Cx32-T+ présentent une hypotrophie de la thyroïde. Après activation par la TSH, les souris Cx32-KO développent un goitre plus important que les souris sauvages. Des souris exprimant les oncogènes RET/PTC3 ou E7 dans la thyroïde ont été croisées avec des souris Cx32-KO. L’hypertrophie induite par RET/PTC3 ou E7 et la formation de tumeurs malignes en réponse à RET/PTC3 sont réduites chez les souris déficientes en Cx32. En conclusion, la Cx32 agirait comme régulateur a) négatif de la croissance de la thyroïde activée via la cascade AMPc, et b) positif du développement tumoral induit par les oncogènes RET/PTC3 ou E7. / Connexins (Cx) and gap junctions, allowing direct cell-to-cell communication, are involved in the control of cell proliferation. The role of Cx32 on normal and tumoral growth of the thyroid has been studied in mice overexpressing Cx32 in the thyroid (Cx32-T+) or deleted for Cx32 (Cx32-KO). In basal conditions, Cx32-T+ mice present a thyroid hypertrophy. After activation by TSH, Cx32-KO mice develop a larger goiter than wild type mice. Mice expressing RET/PTC3 or E7 oncogenes in the thyroid have been crossed with Cx32-KO mice. Hypertrophy induced by RET/PTC or E7 and the formation of malignant tumors in response to RET/PTC3 are reduced in mice deleted for the Cx32. In conclusion, Cx32 would act like as a) a negative regulator on the thyroid growth activated through the cAMP cascade, and b) a positive regulator on the tumoral development induced by RET/PTC3 or E7 oncogenes.

Cette thèse en bioinformatique a été réalisée entre 2010 et 2015 dans le groupe du Pr. Vincent Detours à l’Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire. Nous avons analysé des données génomiques et transcriptomiques provenant de carcinomes papillaires de la thyroïde (CPTs) et leurs tissus non-cancéreux adjacents. La première partie étudiait les différences transcriptomiques entre CPTs post-Tchernobyl et CPTs sporadiques, et leur tissus non-cancéreux adjacents. Dans notre cohorte, les cas sporadiques étaient en moyenne et significativement un an plus jeunes. Après un ajustement des données transcriptionnelles pour l'âge, près de 400 gènes étaient plus exprimés dans les tissus adjacents des patients exposés aux radiations. Cependant, nous n’avons pu détecter aucune surreprésentation de groupe de gènes participant à des fonctions biologiques connues. Il était possible de distinguer les cas sporadiques des cas post-Tchernobyl sur base des transcriptomes de leurs tissus adjacents, avec une précision de ~70%. Cette surexpression de gènes dans les tissus non-cancéreux adjacents pourrait être liée à une radiosensibilité accrue dans le groupe des patients exposés aux radiations de Tchernobyl. Dans la deuxième étude, nous avons intégré des données provenant des patients de la première partie, incluant les nombres de copies d'ADN des CPTs, le génotype de plus de 400.000 SNPs dans le sang et les données transcriptionnelles des CPTs et leurs tissus non-cancéreux adjacents. En reproduisant les résultats d'une étude précédente, nous avons retrouvé la région 7q11.23 dupliquée exclusivement dans un tiers des patients exposés aux radiations. Dans une étude indépendante, un autre groupe a montré que la duplication de cette région était plus fréquente dans une population de lignées cellulaires radiosensibles que dans la population humaine normale. Cependant, en analysant les transcriptomes des patients présentant cette duplication, nous n'avons pas détecté de différence d’expression des gènes codés dans cette région génomique. En outre, aucun génotype de SNP n'était significativement lié à l'exposition aux radiations. En conclusion, les résultats confirment qu'un tiers des CPTs post-Tchernobyl ont des traces d'un dégât radio-sensibilsant dans leur ADN. Dans une troisième étude, nous avons étudié les différences transcriptionnelles entre CPTs et leurs métastases ganglionnaires (MGs) associées, ainsi qu'entre des CPTs développant des MGs (N+) et des CPTs ne développant pas de MGs (N0). Des études précédentes comparant les MGs et leurs tumeurs associées impliquant d’autres organes ont montré une surexpression de gènes dans les MGs, liés aux cellules immunitaires. Ce signal provient du tissu contaminant environnant les MGs. Pour se défaire de ce signal contaminant, d’autres études ont microdisséqué au laser les parties tumorales des MGs. Cependant, la microdissection retire aussi le stroma associé à la tumeur, alors que celui-ci est justement impliqué dans la progression tumorale. Grâce à une méthode originale, nous avons corrigé nos données d’expression des MGs pour leur contenu en contaminant ganglionnaire non-cancéreux. Après cette correction, l’expression de gènes liés au stroma était plus élevée dans les MGs que dans leurs CPTs. Les différences d’expression entre N0 et N+ n’étaient pas reproductibles entre 4 jeux de données indépendants de CPTs. Ceci démontre l’absence d’un signal transcriptionnelle lié au statut nodal dans ces données. Cependant, en utilisant des données publiques comprenant des centaines de tumeurs, il est possible de prédire le statut nodal (N0 ou N+) des CPTs ainsi que des cancers du sein et du colon à partir de leurs transcriptomes. Des études précédentes montraient des taux de prédiction presque parfaits (>90%) du statut nodal à partir des données transcriptomiques. Nous avons décelés dans ces études le même biais technique de sélection des gènes, qui peut expliquer ces taux artificiellement élevés. Dans notre étude, ce biais n’était pas présent et la précision de nos prédictions était limitée (<70%), questionnant l’intérêt clinique de telles prédictions. La présence d’un signal permettant de prédire le statut nodal et l’irreproductibilité de ce signal dans des jeux de données indépendants peuvent s'expliquer par l’association entre le statut nodal et des caractéristiques d'agressivité des tumeurs, qui pourraient, elles, avoir une influence reproductible sur les transcriptomes. Dans notre dernière étude, nous avons analysé les différences entre CPTs, liées à la présence de BRAFV600E, une mutation commune à 60% des CPTs. En utilisant un jeu de données public, nous avons montré que les CPTs présentant la mutation étaient plus dédifférenciés, et plus infiltrés en stroma, probablement en lymphocytes et fibroblastes; et que ces CPTs présentaient plus de fibrose et proliféraient sans doute plus. Tout ceci suggère que les CPTs mutés pour BRAF constituent un groupe de CPTs plus agressif. Des caractéristiques d’agressivité pourraient être détectées au front invasif, c’est-à-dire la périphérie de la tumeur définissant son contact avec le stroma, notamment la présence de regroupement de cellules isolées du reste de la tumeur. Dans les CPTs, ces îlots cellulaires isolés sont observés sur des lames histologiques 2D et pourraient être expliqués soit par un détachement cellulaire, signe d’agressivité lié au processus métastatique, soit une conformation complexe compatible avec une tumeur connexe en 3D. Dans un CPT, nous avons analysé la conformation 3D du front invasif d'un CPT muté. Nous avons reconstruit son volume 3D grâce à une méthode originale. Les groupes de cellules cancéreuses qui semblaient isolées sur les images 2D d’histopathologie, étaient en fait connectés en 3D. L’hypothèse de la présence de détachement cellulaire suite à la transition épithélio-mésenchymateuse n’est donc pas requise pour expliquer la présence de ces îlots cellulaires en 2D. La forme 3D du front invasif impliquait une surface de contact entre tumeur et stroma bien plus importante qu'impliquée par la forme ellipsoïde habituellement décrite. Les fibroblastes participaient autant à la création de la masse tumorale que les cellules cancéreuses, puisque ces deux groupes de cellules proliféraient à la même vitesse. A l'avenir, le séquençage du matériel génétique de cellules individuelles facilitera notre interprétation des signaux génomiques et transcriptomiques, qui jusqu’alors provenaient de tissu complet, i.e. un mélange de populations de cellules tumorales, stromales et de contaminant. Une signature de radiation pourrait être extraite des profils mutationnels de cellules individuelles exposées aux radiations et à l’H2O2 in vitro et comparée à la signature des CTPs post-Tchernobyl. Les cellules tumorales et stromales individuelles des MGs pourraient être comparées aux cellules tumorales et stromales invividuelles des CPTs. De même les cellules individuelles mutées pour BRAFV600E pourraient être comparées aux cellules non mutées. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Afin de mieux comprendre la physiopathologie et de mieux caractériser les différents types de tumeurs thyroïdiennes, notre travail s’inscrit dans un projet de recherche visant à identifier des biomarqueurs (signatures moléculaires) et à développer des outils permettant le diagnostic, le pronostic et le traitement de ces tumeurs. Afin d’arriver à cet objectif, les profils d’expression de différents types de tumeurs thyroïdiennes sont étudiés, ainsi que leurs modèles in vitro. L’un des mécanismes physiopathologiques rencontré dans le développement de tumeurs est la dérégulation ou l’expression aberrante de microARN. Il a, par ailleurs, été rapporté que cette famille d’ARN pourrait fournir de bons classifieurs moléculaires. Nous nous sommes dès lors demandés quelle pouvait être l’implication de ces microARN dans le développement des tumeurs thyroïdiennes, et s’ils pouvaient fournir un bon outil de classification. <p><p>Ainsi, dans la première partie de cette thèse, nous avons caractérisé les profils d’expression miRNA d’une tumeur bénigne différenciée, l’adénome autonome hyperfonctionnel. Afin d’aller au-delà d’une simple description des régulations miRNA observées, nous avons également étudié les profils d’expression ARNm. Au travers d’algorithmes de prédiction de cibles ARNm de miRNA, nous avons pu proposer des hypothèses quant à la signification des régulations observées. De plus, en utilisant un test fonctionnel luciférase, nous avons montré que deux miRNA (hsa-miR-144 et hsa-miR-451) peuvent lier le 3’UTR et réprimer l’expression d’une phosphodiestérase (PDE4D), mettant ainsi en évidence un mécanisme de rétrocontrôle négatif du niveau d’AMPc dans ce type de tumeur. <p><p>Outre les adénomes autonomes, nous avons également étudié les profils d’expression des microARN dans les adénomes et carcinomes folliculaires, afin de mieux comprendre leurs physiopathologies et d’étudier le pouvoir discriminant des miRNA pour la distinction de ces deux types de tumeurs. Nos résultats, encore partiels, remettent en question l’actuelle classification des adénomes et carcinomes folliculaires en deux groupes distincts. Nos données vont plutôt vers un continuum de tumeurs appartenant à une classe unique mais présentant des stades d’évolution différents. <p><p>Afin de pouvoir étudier plus en profondeur les mécanismes tumoraux, il est nécessaire d’avoir à sa disposition de bons modèles in vitro. Nous avons étudié la représentativité des cultures primaires de thyrocytes humains sains et de lignées cellulaires thyroïdiennes humaines cancéreuses pour l’étude des microARN dans les tumeurs thyroïdiennes. Nos résultats indiquent que les longs temps de stimulation des cultures primaires par la TSH ou l’EGF/sérum ne mimiquent respectivement pas les adénomes autonomes ou les carcinomes papillaires, comme c’est le cas au niveau des ARNm. Par contre, il apparaît clairement que les lignées cellulaires, du point de vue des miRNA, ont toutes évolué vers un phénotype commun, dédifférencié. Elles représentent dès lors un bon modèle pour l’étude des cancers thyroïdiens anaplasiques.<p><p>Nos résultats nous ont également amenés à nous poser des questions sur la stabilité des miRNA. Nous avons ainsi entrepris d’en étudier la demi-vie. Nous avons mis au point une stratégie expérimentale permettant d’en étudier la stabilité dans des conditions les plus physiologiques possibles. Ceci nous a permis d’obtenir un atlas de demi-vies des miRNA dans la lignée cellulaire BCPAP. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La thèse s’inscrit dans un projet de recherche global visant à caractériser les tumeurs thyroïdiennes sur le plan moléculaire, afin de mieux comprendre leur physiopathologie et afin d’identifier des biomarqueurs (signatures moléculaires) qui pourront être utilisés pour le diagnostic, le pronostic et leur traitement. Parmi celles-ci, nous distinguons les adénomes autonomes (AA) et folliculaires (FTA) tumeurs bénignes encapsulées, et les carcinomes, tumeurs malignes. Ceux-ci sont eux-mêmes subdivisés en carcinomes différenciés, folliculaires (FTC) ou papillaires (PTC), et peuvent évoluer en carcinomes anaplasiques (ATC), totalement dédifférenciés. Un autre type de tumeurs bénignes différenciées, très rares, existe: l’hyperthyroïdie non auto-immune familiale (FNAH). Ces tumeurs sont causées pour la plupart par des mutations qui activent de manière constitutive des cascades de signalisation, essentiellement la cascade de l’AMPc et la cascade des MAPK. Le but de notre thèse était de valider un système expérimental in vitro des PTC, d’étudier les profils d’expression génique des FNAH et de les comparer avec ceux des AA, et de définir les profils ARNm et miRNA des ATC pour les comparer à ceux des PTC pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Pour réaliser ces objectifs, nous avons utilisé la technologie des microarrays qui permet d’analyser simultanément l’expression de milliers de gènes dans différentes conditions. Nous avons donc utilisé une approche multidisciplinaire alliant une partie expérimentale et une partie bioinformatique.<p><p>La première partie du travail a consisté à réaliser un modèle d’étude in vitro pour caractériser les PTC au niveau moléculaire. A cet effet, des cultures primaires de thyrocytes ont été traitées avec de l’EGF et du sérum pendant différents temps (1,5h, 3h, 16h, 24h et 48h) ce qui stimule la cascade des MAPK, activée constitutivement dans les PTC. Nous avons hybridé sur des lames microarrays maison les différents échantillons et nous avons montré que les cultures primaires stimulées pendant des temps longs (24h et 48h) ont des profils d’expression génique qui ressemblent à ceux des PTC et constituent donc un bon modèle d’étude de cette tumeur. <p><p>La seconde partie a pour objectif de définir les phénotypes moléculaires et fonctionnels des FNAH et de les comparer aux AA. Ces deux pathologies résultent d’une mutation dans le récepteur de la TSH (TSHR) activant de manière constitutive la cascade de l’AMPc. Dans le cas des FNAH, la mutation est héréditaire et toute la glande est affectée contrairement aux AA où la mutation survient plus tard, généralement à l’âge adulte, et où seule une partie de la glande est affectée. Nous avons comparé le profil d’expression génique des FNAH avec celui des AA, par hybridation sur des lames microarrays HEEBO. L’intégration de ces différentes données montre que les AA et les FNAH sont deux sous-types différents de la même maladie: l’hyperthyroïdie génétique. Les caractéristiques de chacun de ces sous-types dépendent de l’intensité de la mutation, du nombre de cellules initialement affectées et du stade de développement au moment duquel la mutation survient.<p><p>Dans la dernière partie de ce travail, nous avons caractérisé les ATC au niveau du profil d’expression des ARNm et des miRNA par hybridation respectivement sur lames Affymetrix ou sur lames miRNA maison et au niveau de leur état mutationnel du gène p53. Le profil d’expression génique des ATC a été comparé avec celui des PTC afin de mettre en évidence des gènes différentiellement exprimés entre les 2 types de cancers, que nous avons ensuite tenté d’invalider par siRNA, dans un modèle in vitro de lignée cellulaire thyroïdienne dérivée d’un ATC (8505C). Les résultats obtenus jusqu’ici ne sont malheureusement pas prometteurs. Le profil d’expression des miRNA nous a permis d’identifier une signature de 34 miRNA caractéristique des ATC.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les tumeurs thyroïdiennes représentent les tumeurs endocrines les plus fréquentes. Parmi ces tumeurs les adénomes autonomes sont des tumeurs bénignes se développant secondairement à l’activation constitutive de la voie de l’AMPc. Cette activation est secondaire à des mutations somatiques survenant à différents niveaux de la cascade de signalisation induite par l’activation du récepteur TSH. La pathologie thyroïdienne maligne est essentiellement représentée par les carcinomes papillaires de la thyroïde pour lesquelles de nombreuses modifications génétiques ont été décrites, les plus fréquentes étant les réarrangements impliquant la tyrosine kinase Ret. Différents modèles de souris transgéniques ont été développés et représentent d’excellents outils pour étudier in vivo l’expression génique secondaire aux mutations initiales. Nous avons choisis d’utiliser la technologie des microarrays pour analyser simultanément l’expression de milliers de gènes dans différents modèles de souris transgéniques développant des pathologies thyroïdiennes bénignes et malignes .Au cours de cette thèse de doctorat, nous avons déterminé à l’aide de microarrays le profil d’expression génique de souris exprimant à la surface des cellules thyroïdiennes de manière spécifique le récepteur A2a de l’adénosine, ce qui mène à l’activation constitutive de la voie de l’AMPc et au développement d’une hyperthyroïdie sévère associée à un énorme goitre. Cette étude nous a permis d’identifier des gènes dont le rôle potentiel dans le développement de tumeur bénigne était jusqu’à lors inconnu. Nous avons également comparé deux modèles murins développant des tumeurs malignes de la thyroïde. D’une part les souris exprimant le réarrangement Ret/PTC3, très commun dans les carcinomes papillaires de la thyroïdes issus de la première vague de cancer survenu après la catastrophe de Chernobyl, d’autre part les souris exprimant l’oncoprotéine E7 dérivée de l’HPV16 responsable du cancer du col de l’utérus. Les différences et les similarités entre ces deux lignées et différentes pathologie humaine ont été décrites.<p>La PCR quantitative en temps réel a été utilisé pour confirmer et quantifier la différence d’expression des gènes d’intérêts entre les thyroïdes de souris contrôles de même souche et les thyroïdes issues de souris transgéniques. La PCR en temps réel permet de monitorer à l’aide d’un signal fluorescent émis lors de l’hydrolyse d’une sonde, la quantité d’amplicons produite dans la réaction. La courbe d’amplification se caractérise par une phase exponentielle, suivie par une phase non exponentielle se terminant par un plateau. Contrairement aux idées reçues, nous avons pu démontrer que le plateau était expliqué par la déplétion de la sonde hydrolysée par la Taq polymérase lors de la réaction d’amplification. Dès lors que l’hydrolyse de la sonde reflète quantitativement la synthèse d’amplicons, la fluorescence produite dans la phase exponentielle de la réaction reflète la concentration des amplicons produits. Nous avons donc, sur base de ces observations pu estimer la quantité d’ADN complémentaire engagé dans la réaction en se basant directement sur les données de fluorescence d’une seule courbe de PCR en temps réel sans passer par une courbe de calibration utilisant une quantité connue d’ADN complémentaire. / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished