Objectifs : Les cancers de la thyroïde représentent environ 2% de l'ensemble des cancers dans les pays développés mais sont les cancers les plus fréquents des glandes endocrines. L'incidence des cancers de la thyroïde se caractérise par de fortes variations géographiques dans le monde, les taux les plus élevés étant observés en Nouvelle-Calédonie, et par une augmentation régulière au cours des dernières décennies dans les pays occidentaux. Cette augmentation d'incidence est en grande partie attribuée à l'évolution des pratiques médicales mais pourrait aussi être en partie liée à une évolution des modes de vie et/ou à des expositions environnementales. En dehors de l'exposition aux radiations ionisantes dans l'enfance, les facteurs de risque de cancer de la thyroïde restent très mal connus. L'objectif de ce travail était d'étudier le rôle des antécédents familiaux de pathologie de la thyroïde, des caractéristiques de la vie hormonale et reproductive, des caractéristiques anthropométriques et des expositions environnementales et professionnelles dans l'étiologie des cancers de la thyroïde. Méthode : Les analyses reposent principalement sur une étude cas-témoins en population menée en France métropolitaine (étude CATHY). Nous avons également utilisé les données d'une étude cas-témoins menée en Nouvelle-Calédonie pour étudier le rôle des antécédents familiaux dans cette zone géographique de forte incidence. L'étude CATHY repose sur 621 cas diagnostiqués dans trois départements français (Calvados, Marne, Ardennes) entre 2002 et 2007 et sur 706 témoins, appariés par fréquence aux cas sur l'âge, le sexe et le département de résidence. L'étude cas-témoins en Nouvelle-Calédonie repose sur 332 cas diagnostiqués entre 1985 et 1999, et sur 412 témoins appariés par fréquence aux cas sur l'âge et le sexe. Résultats : Les résultats montrent une augmentation du risque de cancer de la thyroïde chez les individus ayant des apparentés de premier degré atteints de cancer de la thyroïde ou de goitre multinodulaire, en France métropolitaine comme en Nouvelle-Calédonie. Parmi les facteurs hormonaux et reproductifs, un âge tardif aux premières règles, une ménopause précoce et une parité élevée étaient associés à une augmentation du risque de cancer de la thyroïde. Une relation dose-effet inverse était observée entre la durée cumulée des cycles menstruels au cours de la vie et le risque de cancer de la thyroïde. La prise d'une contraception orale était associée à une diminution du risque de cancer de la thyroïde, avec une relation dose-effet inverse entre la durée de la contraception orale et le risque de cancer de la thyroïde. La taille, l'indice de masse corporelle et la surface corporelle étaient positivement associés au risque de cancer de la thyroïde. Une augmentation du risque de cancer de la thyroïde était observée dans certains secteurs d'activité professionnelle comme l'industrie du papier, l'industrie du caoutchouc et des plastiques, le travail du bois, la réparation automobile et la métallurgie.

Le transporteur de Na+/ acide monocarboxylique sensible à l’ibuprofène (SMCT1) est exprimé dans la membrane apicale de plusieurs épithélia. Son rôle physiologique dans la glande thyroïde reste cependant obscur mais on présume qu’il pourrait agir comme un transporteur apical d’iode nécessaire pour la synthèse des hormones thyroïdiennes. Récemment, on a montré que SMCT1 possède un courant de fuite anionique sensible à [Na+]e qui permettrait de transporter l’iode de façon électrogénique. Cependant, un efflux d’iode sensible à l’ibuprofène, mais indépendant de la [Na+]e a été aussi observé sur des cultures primaires des thyrocytes porcins, suggérant un autre mécanisme de transport d’iode par SMCT1. Ce travail vise à comprendre les caractéristiques de ce genre de transport en utilisant comme modèle d’expression les ovocytes de Xenopus laevis. Les résultats obtenus des essais de captation d’iode radioactif montrent que SMCT1 présente un transport d’iode sensible à l’ibuprofène de l’ordre de 30nmol/ovocyte/h. Si ce transport est non saturable en iode (0-100 mM), il nécessite du Na+ dans la solution externe. En effet, le remplacement du Na+ extracellulaire par le NMDG inhibe complètement le transport. En outre, on s’est intéressé à exclure la possibilité de différents artefacts. En ayant trouvé que la grande majorité de l’iode radioactif se trouve dans la partie soluble de l’ovocyte, on exclut une liaison non spécifique de l’iode à la membrane cellulaire. Cependant, une bonne proportion de l’iode transporté pourrait être liée à des protéines à l’intérieur de l`ovocyte. En effet, on observe une réduction du transport d’iode dans les ovocytes exprimant SMCT1 de 81,6 ± 2 % en présence de 2 % BSA dans la solution extracellulaire. Également, on écarte la possibilité que le transport d’iode soit le résultat de la surexpression de protéines de transport endogènes dont les canaux chlore. Le transport d’iode semble spécifique à l’expression de SMCT1 et de manière intéressante à l’expression d’un autre transporteur de monocarboxylates, MCT1. L’analyse de l’ensemble des essais, y compris le fait que l’amplitude du transport observé est 20 fois plus grande que celle du courant de fuite nous mène à proposer que SMCT1 puisse transporter l’iode de façon électroneutre. Cependant, le mécanisme par lequel ceci est accompli n’est pas évident à identifier. L’utilisation d’un autre modèle cellulaire serait surement utile pour répondre à cette question. / Ibuprofen sensitive, Sodium Monocarboxylate Transporter (SMCT1) is expressed in the apical membrane of diverse epithelia. Its physiological role in the thyroid remains however unknown, but it has been proposed that SMCT1 could act as an apical iodide transporter required for the main function of the gland: the thyroid hormone synthesis. We previously reported that SMCT1 exhibit a [Na+]e sensible anionic leak current that could account for the electrogenic transport of iodide. However, an iodine efflux sensitive to ibuprofen but independent of [Na+]e, was also observed in primary cultures of porcine thyrocytes, suggesting another mechanism of iodine transport mediated by SMCT1. This work aims to understand the characteristics of this type of transport using Xenopus laevis oocytes as an SMCT1 expression system. By realising 125I uptakes, we found that SMCT1 transports iodide in an ibuprofen sensitive manner (30nmol/oocyte/h). While nonsaturable uptake iodide kinetics were observed, SMCT1 iodide transport was Na+ dependent as shown by the transport reduction when the [Na+]e is replaced by NMDG. The possibility of artifacts, such as non specific binding and the overexpression of endogenous proteins, was analysed. By observing that the vast majority of the radioactive iodide is found in the soluble portion of the oocyte, we excluded non-specific binding of iodide to the cell membrane. However, it is believed that most of the iodide entering the cell is not free and must be bound to some intracellular proteins. Indeed, there is a significant reduction of SMCT1-mediated iodide transport when 2% BSA is present at the extracellular solution. Furthermore, the lack of iodide transport when overexpressing other proteins than SMCT1, precludes the possibility of an overexpression of endogenous transport proteins like chloride channels for example. In fact, the transport of iodide appears to be specific to the expression of SMCT1 and interestingly of another monocarboxylate transporter MCT1. The analysis of all trials, including the fact that the amplitude of the observed transport is 20 times larger than the leak current lead us to propose that SMCT1 can carry iodide in an electroneutral manner. However, the mechanism by which this is accomplished is not easy to identify and future experiments will be necessary to determine whether this transport is observed in other SMCT1 expression systems.

Ce travail s’inscrit dans un projet de recherche global qui consiste en une caractérisation moléculaire des tumeurs thyroïdiennes papillaires (PTC) afin de déterminer des signatures diagnostiques et pronostiques potentielles, et d’identifier des cibles thérapeutiques. Le PTC est le cancer thyroïdien le plus fréquent des cancers endocriniens, et son incidence ne cesse d’augmenter avec les années. Il présente un bon pronostic de survie malgré un pourcentage non négligeable de patients qui récidivent et qui développent des métastases distantes. A l’heure actuelle, le diagnostic et le pronostic d’un PTC sont réalisés sur base de ponctions à l’aiguille fine visant des nodules thyroïdiens dont 30% des diagnostics restent toutefois incertains. Il est donc incontestable que des patients sont opérés inutilement pour éviter les risques d’un diagnostic douteux. La thérapie actuelle pour un PTC est basée sur une thyroïdectomie totale, suivie d’un traitement au radioiode I131 afin d’éliminer toute cellule cancéreuse résiduelle. Les cas de récidives sont en réalité associés à une résistance à ce traitement par radioiode, de par l’état dédifférencié des cellules cancéreuses. La plupart des autres cancers ont leur métabolisme énergétique qui est caractérisé, ce qui permet de les diagnostiquer et les pronostiquer par des techniques d’imagerie avec des métabolites marqués tels que le glucose. Enfin, tout un pan de la recherche scientifique essaie de caractériser davantage les dérégulations moléculaires impliquées dans le métabolisme pour proposer des alternatives thérapeutiques. Aujourd’hui il existe en effet une série d’inhibiteurs qui sont utilisés pour enrayer la machinerie énergétique des cellules cancéreuses. Très peu de données métaboliques existent actuellement sur les cancers thyroïdiens, alors qu’il semble évident que ces recherches pourraient contribuer à améliorer leur diagnostic et leur traitement. Par analyse protéomique, nous avons montré que les PTC ont un métabolisme mitochondrial oxydatif augmenté par rapport aux cellules thyroïdiennes normales. Nous avons identifié la pyruvate carboxylase comme étant une enzyme clé dans l’anaplérose, de par sa surexpression dans tous les PTC analysés, et de par son rôle dans la prolifération, la migration et l’invasion de lignées cellulaires thyroïdiennes cancéreuses. Une mesure de consommation d’oxygène a montré que les lignées avaient un profil métabolique oxydatif. D’autre part, nous avons caractérisé l’augmentation d’autres voies métaboliques telles que la glutaminolyse, la dégradation des acides gras, ou la gluconéogenèse. L’hétérogénéité des PTC, due notamment à la présence de fibroblastes associés au cancer (CAFs), nous a aussi permis de proposer le modèle de l’effet Warburg inverse. Celui-ci se caractérise par la libération de lactate dans le microenvironnement tumoral par les CAFs, disponible pour les cellules tumorales qui le métabolisent via le cycle de Krebs. Toutes ces signatures métaboliques, déjà proposées dans d’autres cancers comme marqueurs d’agressivité, ou comme cibles thérapeutiques, pourraient être davantage investiguées dans les cancers thyroïdiens.Un second projet, à visée purement thérapeutique, a été mené pour tenter de solutionner la problématique de résistance d’une fraction des cancers thyroïdiens au traitement par radioiode. Nous avons étudié le rôle de la colforsine dans l’activation de la voie AMPc, et sur la réexpression de l’ARNm du transporteur d’iode (NIS), dont la protéine correspondante n’est plus exprimée à la membrane des PTC dédifférenciés. Nous avons démontré dans des expériences in vitro et in vivo que la colforsine était capable de réinduire l’expression de NIS, et d’augmenter les niveaux de captation de radioiode dans les cellules thyroïdiennes. Une combinaison du traitement à la colforsine pour redifférencier les cellules, avec un traitement déjà développé sur l’inhibition de BRAF pour bloquer la dédifférenciation cellulaire, pourrait être une nouvelle perspective thérapeutique. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Abnormal thyroid cell proliferation causes human diseases, such as goiter, thyroid adenoma or carcinoma and primary hypothyroidism resulting from hypoplasia. Thyrotropin (TSH), mainly acting through cAMP and cAMP-dependent protein kinases (PKA), is considered the main regulator of thyrocyte proliferation and differentiation. The general aim of this thesis was to get new mechanistic insights in the regulatory action of the cAMP pathway on various functions of thyrocytes, including proliferation.<p><p>During the first part of this thesis work, we have collaborated to a study of the effects of the TSH/cAMP pathway on small G proteins of the Rho family and their impact on the actin cytoskeleton and thyroid cell function. This study, performed in canine thyrocytes, showed for the first time, that the TSH/cAMP/PKA pathway inactivates the three small G proteins RhoA, Rac1 and Cdc42 and the RhoA/ROCK/LIMK/cofilin pathway. Inactivation of the latter appeared both necessary and sufficient to mediate the action of TSH and PKA on the reorganization of actin microfilaments and its morphological impact. Moreover, this inactivation by PKA of Rho-mediated actin polymerization also played an important role in the cAMP-dependent expression of thyroid differentiation genes. On the other hand, a residual RhoA activity appeared to be required for mitogenesis. This dependence of DNA synthesis on RhoA activity was not mediated by ROCK-dependent events nor by the integrity of the actin cytoskeleton. Indeed, DNA synthesis induction was unexpectedly resistant to actin depolymerisation in canine thyrocytes, which explains how it could be compatible with the cAMP-dependent microfilament disruption. <p><p>This first study did not provide new insights on how the cAMP/PKA-dependent mitogenic stimulus can trigger cell cycle progression, which, in thyrocytes, depends on the phosphorylation of pRb by the cyclin D3-CDK4 complex. In the various in vitro thyroid models, the only convergent early signaling event found in response to TSH/cAMP, insulin and growth factors was the phosphorylation and activation of p70 S6K1 which largely depends on mTOR (mammalian Target Of Rapamycin). The main part of the work in this thesis has been devoted to investigation of the action of TSH/cAMP on the mTOR pathway. mTOR is a therapeutic target for a wide variety proliferative disorders and rapamycin derivates are now considered in anti-cancer treatments.<p><p>We have shown for the first time in PC Cl3 rat thyroid cells that TSH, through cAMP, activates mTORC1, leading to phosphorylation of S6K1 and 4E-BP1. mTORC1-dependent S6K1 phosphorylation in response to both insulin and cAMP required amino acids, whereas inhibition of AMPK and GSK3 enhanced insulin but not cAMP effects. Unlike insulin, TSH/cAMP did not activate PKB, nor induce TSC2 phosphorylation at Thr1462 and Tyr1571. However, like insulin, TSH/cAMP produced a stable increase in mTORC1 kinase activity associated with augmented 4E-BP1 binding to raptor. This could be caused in part by Thr246-phosphorylation of PRAS40, which was found as an in vitro substrate of PKA, but other regulatory events likely remain to be uncovered. Both in PC Cl3 cells and primary dog thyrocytes, rapamycin inhibited DNA synthesis and pRb phosphorylation induced by TSH and insulin. Rapamycin reduced cyclin D3 accumulation but not the abundance of cyclin D3-CDK4 complexes. However, rapamycin inhibited the activity of these complexes and the activating Thr172-phosphorylation of CDK4 stimulated by both TSH and insulin. We propose that mTORC1 activation by TSH, at least in part through PKA-dependent phosphorylation of PRAS40, crucially contributes to mediate cAMP-dependent mitogenesis by regulating CDK4 Thr172-phosphorylation. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Thyroid carcinomas are the most common endocrine tumors in humans. There are three major types of carcinomas of thyrocyte origin, including papillary, follicular, and anaplastic carcinomas. Papillary thyroid carcinoma (PTC) is the most common type of thyroid malignancy accounting 80% of thyroid cancer cases, and present several histologic variants, namely classical (45%), follicular (18%), solid, diffuse-sclerosing, cribriform, … .Specific genetic events represent early initiating and late triggering events. Several genetic lesions have been identified in various thyroid carcinomas and some of them are specifically associated to one type thyroid cancer. For instance, RET/PTC is the most common molecular event in the radiation-associated PTC in childhood. <p>In the first part of the work, we studied two transgenic mouse models: the Tg-RET/PTC3 (Tg-RP3) mouse and the Tg-E7 mouse. Both strains express the human origin transgene (RET/PTC3 rearrangement or E7) exclusively in the thyroid under the control of the bovine thyroglobulin promoter. <p>Our study of these two models showed:<p>In both E7 and RET/PTC3 mouse models, the thyroids exhibited hyperplasia with own 'oncogene-dependent' follicular cell characteristics. Small follicular cells with hyperchromatic nuclei with an increased nucleus/cytoplasm ratio were numerous in the E7 mice, and large cells with convex apical border, a decreased nucleus/cytoplasm ratio, a pale nucleus and dispersed chromatin were found in the RET/PTC3 mice. <p>At 6, 10 months and later on, E7 mice developed huge heterogeneous, normal functional thyroid goiter, with no tumor formation. <p>As in previous studies on transgenic RET/PTC3 mouse models, the generally encountered features such as solid tumours were present. We also observed conventional variant of human PTC at late age (since 11 month-old) with quite low incidence (4%). In addition to solid and conventional variant PTCs, 28% of mice developed a peculiar big size thyroid tumor pattern with “proliferative papillary cystic changes with spindle cells and remodelling” and macrophage infiltration in the cysts at as early as 2 month of age; this kind of tumor histologically resembles the rare human young age 'diffused sclerosing' variant PTC (DSVP), but disappeared after 6 month. The other peculiar tumor exhibits morphological similarity with another rare human FAP-associated (Familial Adenomatous colonic polyposis) cribriform PTC, which showed a mixed architecture of several histological patterns (solid, follicular, cribriform). At 6 months, 26% of mice presented the cribriform tumor pattern.<p>From the analyse of the proliferation index in the two models, we conclude that RET/PTC3 fusion protein over stimulates MAPK and Akt/PKB-signalling pathways, through Ras-Raf-Mek-Erk, Ras-PI3-K/Akt/PKB, particularly in the large cells which were strongly positive for three proliferation markers. E7 bypasses these two pathways, by directly binding to Rb1 protein and releasing the E2F transcription factor which induces cell proliferation. <p>So RET/PTC3 and E7 mice present several morphologic features which mimic human PTC tumors; RET/PTC3 could therefore be used as a partial model for human PTCs. <p>Further investigation of gene expression will allow the characterization of the molecular phenotype of the observed variants.<p>In the second part of the work, we attempted to generate by xenobiotic administration an in vivo model of thyroid carcinoma. Chronic exposure of CD1 mice to acrylamide in the drinking water during 6 and 8 months at doses of 3mg/kg per day similar to those causing thyroid tumorigenesis after 2 years in rats, did not induce any thyroid tumors whatever the level of thyroid stimulation. <p><p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La thyroïde est une glande endocrine importante pour le contrôle du métabolisme, le développement et la croissance des mammifères. Sa fonction est stimulée par la « Thyroid Stimulating Hormone » (TSH) mais inhibée par une forte élévation de l’iode plasmatique. Cette inhibition par l’iode a été décrite il y a plus de 70 ans, mais la compréhension des mécanismes sous-jacents reste partielle et controversée. La mise en place de l’effet inhibiteur de l’iode nécessite la génération de composants intermédiaires iodés dont la nature est inconnue. La première partie de cette thèse a eu pour objectif d’étudier si des protéines iodées pourraient avoir un rôle dans la régulation de la thyroïde par l’iode. En combinant le marquage radioactif, l’électrophorèse bidimensionnelle et la spectrométrie de masse, nous avons mis en évidence dans des cellules en culture une iodation spontanée de la Peroxyrédoxine 6 (PRDX6). Nous avons ensuite identifié les positions d’iodation sur la protéine PRDX6 et évalué leurs effets sur son activité enzymatique. De plus, nous avons montré qu’une diminution de l’expression de la PRDX6 par « Short hairpin RNA » amplifie la diminution de la capacité de captation d’iode induite par un excès d’iode. Sur la base de ces résultats, nous proposons que la PRDX6 exerce un rôle protecteur vis-à-vis d’une exposition aiguë à l’iode. Les résultats obtenus apportent des connaissances originales dans le mécanisme de la régulation thyroïdienne par l’iode et dévoilent un nouveau rôle potentiel de cette peroxydase dans la thyroïde. La deuxième partie de cette thèse a consisté à développer des approches en métabolomique pour les appliquer dans les études sur des dysfonctionnements ou des lésions de la thyroïde. Pour ce faire, nous avons utilisé la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse pour mesurer la variation des métabolites dans les cellules ou les tissus. Grâce à l’exposition à des perturbateurs thyroïdiens d’une lignée de cellules thyroïdiennes de rat, nous avons identifié une liste de métabolites iodés comme étant de potentiels marqueurs d’exposition aux perturbateurs thyroïdiens. Par la suite, grâce aux prélèvements congelés de lésions thyroïdiennes dont le diagnostic de nature avait été réalisé en histologie, nous avons construit un modèle de classification supervisée (de type OPLS-DA) basé sur les données métabolomiques pour discriminer les lésions bénignes des malignes. Les variations des métabolites déterminants pour cette classification indiquent une altération au niveau du cycle de Krebs, du métabolisme du glutathion et du métabolisme des bases puriques. En outre, nous avons montré qu’une liste restreinte de métabolites suffit pour établir un modèle de discrimination statistiquement significatif. Ces résultats ouvrent la possibilité d’affiner le diagnostic sur les prélèvements de cytoponction en ciblant uniquement ces métabolites. Ces approches en métabolomique ont également été appliquées à l’étude d’autres types de tumeurs, notamment la classification des sous-types histologiques de carcinomes du rein. / Thyroid function is stimulated by the thyroid-stimulating hormone TSH while inhibited by iodide. The inhibition of thyroid function by an excess of circulating iodide was first reported more than 70 years ago but our understanding of the underlying molecular mechanisms remains unclear. The inhibitory effect of iodide is due to the presence of oxidized iodide in the thyrocytes and the subsequent generation of iodinated intracellular signaling molecules. The first part of this thesis aimed to study the potential role of iodinated proteins in thyroid regulation by iodide. By combining radioactive labeling, two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry, we showed that the cytosolic enzyme, peroxiredoxin 6 (PRDX6), is spontaneously iodinated in cultured cells in the presence of iodide. We identified the iodinated amino acids in the PRDX6 sequence and studied the effect of the iodination on the protein’s activity. In addition, decreased expression of PRDX6 by short hairpin RNA led to increased cell iodide uptake loss induced by excess iodide. Based on our findings, we propose that PRDX6 is involved in the cellular responses to excess iodide. This novel function for PRDX6 provides new insights into the molecular mechanisms underlying acute regulation by iodide.The second part of this thesis aimed to develop metabolomics approach in the studies of thyroid disruptors and thyroid cancers. To this end, we analyzed metabolite variations in various samples using LC-MS (Liquid chromatography-Mass spectrometry). Firstly, in rat thyroid cell line exposed to different thyroid disruptors, we identified a list of iodinated metabolites, which could serve as potential biomarkers for thyroid disruptor screening. Secondly, we analyzed frozen specimens from thyroid nodules previously diagnosed by histology. Our data allowed us to build a multivariate classification for the discrimination of benign and malignant thyroid nodules. We also detected various metabolic dysregulations in malignant thyroid nodules, including the TCA cycle, the glutathione metabolism and the purine metabolism. Accurate classification was possible by using only a short list of metabolites, allowing for future LC-MS-based thyroid nodule diagnosis on fine-needle aspiration biopsies. Finally, we showed that metabolomics approach could also be helpful for the characterization of other tumors.

Le symporteur Na+/I- (NIS) médie le captage de l'iode dans la glande thyroïde et cette propriété est exploitée depuis de nombreuses années en thérapeutique pour traiter les cancers différenciés de la thyroïde à l’iode radioactif 131 (Radiothérapie métabolique ou RAI). Cependant, 5 à 10% des patients deviennent réfractaires à la RAI, ce qui indique un mauvais pronostic. La réduction de l'expression NIS et son internalisation sont caractéristiques de ce processus. La mutation activatrice BRAFV600E est la plus fréquemment identifiée au sein des cancers différenciés de la thyroïde de type papillaires (CPT), qui est le type le plus répandu. Dans les thyrocytes de souris, BRAF muté induit la sécrétion de TGF qui active ensuite la voie Smad ce qui entraîne la répression du NIS. La NADPH oxydase 4 (NOX4), enzyme génératrice d’espèces réactives de l'oxygène (ROS), est un médiateur clé de la signalisation du TGFß dans de nombreux types cellulaires et sa surexpression a été détectée dans le cancer de la thyroïde. L'objectif de ce travail est d'évaluer si NOX4 est un médiateur de la répression NIS induite par BRAFV600E dans des lignées cellulaires thyroïdiennes. En utilisant une lignée cellulaire de thyroïde normal de rat (PC-BRAF), nous avons démontré que le TGF-β ou l'expression BRAFV600E promeut la diminution de l'ARNm NIS ainsi que celle du captage de l'iodure en revanche ils augmentent l’expression de l'ARNm NOX4. Le silençage de Nox4 par siRNA ou un traitement des cellules par SIS3, un inhibiteur de pSmad3, inhibe la répression du NIS médiée par BRAFV600E, indiquant l'implication de la voie Smad3 et de Nox4 dans cette répression. Dans la lignée tumorale BCPAP derivée d’un CPT humain et porteuse de la mutation BRAFV600E, nous avons également observé une augmentation de l'expression de l'ARNm NIS lorsque BRAFV600E ou NOX4 sont inhibés. Dans les cellules BCPAP, un traitement par H2O2 augmente l'expression de la protéine ADN méthyltransférase 1 (DNMT1) dans la fraction cellulaire enrichie en protéines liées à la chromatine. Un traitement par des antioxydants ou le silençage de NOX4 réduise ce recrutement. Le TGF augmente le niveaux de protéines DNMT1 dans la fraction cellulaire enrichie en chromatine, lequel qui est renversé par un traitement par un inhibiteur de NADPH oxydase : le Diphenyleneiodonium (DPI). La méthylation de l'ADN induite par le TGF et l'hypoacétylation de l'histone H3K9/K14, qui sont des marques de répression de la transcription, sont détectées au niveau du promoteur NIS. L’ensemble de ces données suggère que Nox4 est un acteur clé de la signalisation TGF-BRAFV600 et joue un rôle répressif sur l'expression du NIS, probablement par des mécanismes épigénétiques. Cette étude apporte des données fonctionnelles pour le développement de nouveaux outils thérapeutiques. / The co-transporter Na+/ I- (NIS) mediates iodide uptake in thyroid gland which is a key step in hormonal biosynthesis. Iodide accumulation by thyrocytes is the basis of radioiodine therapy (RAI) which is the standard post-surgery therapeutic approach to efficiently eliminate remaining cancer lesions and metastasis of differentiated thyroid cancer (DTC). However, 5-10% of DTC patients become RAI-refractory which is indicative of poor prognosis. Reduced NIS expression and NIS internalization are in this process. BRAFV600E mutation is the most common genetic event in papillary thyroid cancers (PTCs), the most prevalent type of DTC. In rat thyrocytes, BRAFV600E induces secretion of TGFβ that activates Smad pathway resulting in NIS downregulation and overexpression of TGFβ is associated with NIS repression in patients. NADPH oxidase NOX4, a professional reactive oxygen species (ROS) generating enzyme, is a key mediator of TGFβ signaling in many cell types and has been previously demonstrated to be overexpressed thyroid cancers. To better understand the molecular mechanisms involved in PTC loss of iodine avidity, the aim of this work is to evaluate whether NOX4 is a key player of BRAFV600E-mediated NIS repression in thyroid cell lines. Using a normal rat thyroid cell line (PC-BRAF) we demonstrated that TGF-β administration or expression of BRAFV600E resulted in reduced NIS mRNA, reduced iodine uptake and increased NOX4 mRNA expression. NOX4 silencing or treatment with SIS3 an inhibitor of Smad pathway partially inhibited NIS repression indicating the implication of both Smad pathway and NOX4. To confirm this results we used a human thyroid cancer cell lines that harbors BRAFV600E mutation (BCPAP and 8505c) and observed an increase in NIS expression followed by BRAFV600E or NOX4 downregulation. Exogenous H2O2 induced DNA methyl-transferase 1 (DNMT1) enrichment in tight-chromatin protein fraction which was decreased by antioxidants or NOX4 silencing in BCPAP cells. TGF increased DNMT1 protein levels in chromatin-enriched cell fraction which was reversed by NADPH oxidase inhibitor, Diphenyleneiodonium (DPI). TGF-mediated DNA methylation and histone H3K9/K14 hypoacetylation were detected in NIS promoter, which is a repressive transcriptional mark. The data obtained suggest that NOX4 is a mediator of BRAFV600-TGF signaling and has a repressive role over NIS expression probably through epigenetic mechanisms. These results should lead to a better understanding of NIS expression regulation in thyroid cancer, bringing functional data for the development of new therapeutic tools.

Congenital Hypothyroidism (CH) is the most common endocrine disorder, affecting one out of 2000-4000 newborns. Most CH are due to a defect in thyroid embryonic development and they can lead to severe phenotypes if not treated correctly. Multiple observations argue in favor of a genetic cause in a minority of thyroid dysgenesis, but to date, only few cases could be explained by a mutation in one of the genes coding for the factors known to be important in thyroid development and/or function (NKX2-1, PAX8, FOXE1, TSHR). This is the reason why it was important to develop new models allowing the discovery of new genes/mechanisms potentially implicated in the gland organogenesis. To that purpose, we set up in the laboratory a structure enabling the use of zebrafish as an animal model. The latter is indeed more and more used by developmental biologists, including by scientists interested in thyroid development.<p><p>The first step of our project consisted in a deeper characterization of the model, notably by the study of the expression patterns of the thyroid functional differentiation markers. Furthermore, the exact role of the Tsh/Tshr signaling – main regulator of thyroid growth and function in mammals – was dissected. In a second part of the project, we generated a stable transgenic line (tg(tg:mCherry)) allowing the visualization of thyroid development in living embryos and in a dynamic manner, thanks to real-time imaging techniques. On the one hand, this tool enabled us to better understand the morphological aspect of the different stages of thyroid development, such as the budding, evagination, relocalization or folliculogenesis. On the other hand, the use of double transgenic fishes obtained by crossing tg(tg:mCherry) with other lines expressing GFP in surrounding structures of interest, allowed us to highlight the contacts between the cardiovascular system and thyroid, and this along the whole gland development. The introduction of this model within the laboratory paves the way for the discovery and the study of thyroid intrinsic and extrinsic genes/mechanisms which might play a role on its development.<p><p>L’hypothyroïdie congénitale (HC) est une maladie relativement fréquente, touchant un nouveau-né sur 2000-4000. La majorité des HC sont dues à un défaut dans le développement embryonnaire de la glande, et peuvent mener à des phénotypes sévères si elles ne sont pas correctement traitées. Il existe plusieurs arguments en faveur d’une cause génétique dans une minorité de ces dysgénésies thyroïdiennes mais, à ce jour, seuls quelques cas ont pu être reliés à une mutation dans un des gènes codant pour des facteurs connus pour être importants dans le développement/la fonction de la glande (NKX2-1, PAX8, FOXE1, TSHR). C’est pour cette raison qu’il est important de développer de nouveaux modèles pouvant permettre la découverte de nouveaux gènes/mécanismes potentiellement impliqués dans l’organogénèse de la glande. A cette fin, nous avons mis en place au sein du laboratoire une structure permettant l’utilisation du poisson-zèbre comme modèle animal. Ce dernier est en effet de plus en plus utilisé par les biologistes du développement, y compris par les scientifiques qui s’intéressent au développement thyroïdien.<p><p>La première étape de notre travail a consisté en une caractérisation approfondie du modèle, notamment par l’étude du réseau d’expression des marqueurs de différenciation fonctionnelle de la glande. En outre, le rôle exact de la signalisation par la TSH – principal régulateur de la croissance et de la fonction de la thyroïde des mammifères – a été étudié. Dans la deuxième partie du projet, nous avons généré une ligne transgénique stable (tg(tg:mCherry)) permettant la visualisation du développement thyroïdien dans des embryons vivants et ce, de manière dynamique, grâce au principe d’imagerie en temps réel. D’une part, cet outil nous a permis de mieux comprendre l’aspect morphologique des différentes étapes du développement thyroïdien, telles que la formation du bourgeon, l’invagination, la relocalisation ou la folliculogénèse. D’autre part, l’utilisation de poissons doublement transgéniques obtenus par le croisement de tg(tg:mCherry) avec d’autres lignées où les structures environnantes d’intérêt expriment la GFP nous a permis de mettre en avant les contacts entre le système cardiovasculaire et la thyroïde, et ce, tout au long de son développement. La mise en place de ce modèle au sein de notre laboratoire ouvre la voie à la découverte et à l’étude de mécanismes/gènes extrinsèques à la thyroïde mais pouvant jouer un rôle sur son développement. / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

New technologies to probe the global output of the normal and cancer genomes have recently reached widespread use. The resulting genomewide gene expression profiles, e.g, a gene expression measurement per gene and per tissue sample, remain challenging to analyze and interpret, but have already provided new insights into the pathophysiology of cancer and towards personalized care.<p><p><p>In vitro cell culture-based experimental models are used to elucidate cancer onset and progression because experimentation in humans is difficult practically and ethically unacceptable, and because they provide simplified, reproducible and controlled systems to test hypotheses. The thyroid tumors and their in vitro experimental models are particularly suited to compare the molecular phenotypes of experimental models and tumors. From one type of cell, the thyrocyte, at least five distinct benign and malignant tumors can arise. In addition, many immortalized tumor-derived cell lines and primary cultures models of these cells exist.<p><p><p>This thesis has focused on the bioinformatic comparison of these in vitro models to the in vivo tumors, from the point of view of their gene expression profiles, to gain insight into the pathogenesis of thyroid tumors, and of tumors in general.<p><p><p>In a first study, we showed that primary cultures of freshly isolated normal thyroid cells where proliferation and differentiation through the TSHR/cAMP pathway was chronically activated experimentally resemble specifically the autonomous thyroid adenomas, a type of benign thyroid tumor, and provide insight into a general mechanism of tumor progression: the suppression of negative feedbacks that normally restrain excessive cell division.<p><p><p>Subsequently, we found that immortalized thyroid tumor-derived cell lines have converged to a common phenotype regardless of their tumor subtype of origin. A TSHR/cAMP thyroid cell differentiation signature, derived from data obtained for the first study, was used to show that the cell lines were dedifferentiated. Accordingly, we showed that the cell lines resemble most the phenotype of the more dedifferentiated, clinically aggressive anaplastic thyroid cancers.<p><p><p>Finally, using large databases of gene expression profiles publicly available, we extended the comparison of cell lines and tumors to cancers of five other organs: breast, colon, kidney, ovary and lung. We discuss the correct use of these models and advance an hypothesis regarding the nature of the state to which these cells have converged: they could represent a surviving subpopulation of tumors cells, cancer stem cells, capable of initiating and maintaining tumor growth.<p><p><p>As other technologies designed to perturb the genome in experimental models are emerging, careful characterization and validation of the experimental models are needed to extrapolate the results in vivo.<p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les tumeurs thyroïdiennes constituent les tumeurs endocrines les plus fréquentes. Parmi celles-ci, on distingue les adénomes, tumeurs bénignes et encapsulées, et les carcinomes, tumeurs malignes. Ceux-ci sont eux-mêmes subdivisés, principalement sur base histologique, en carcinomes papillaires ou folliculaires, qui conservent certaines caractéristiques de différenciation des cellules thyroïdiennes initiales dont ils dérivent, et qui peuvent évoluer en carcinomes anaplasiques, totalement dédifférenciés. Les carcinomes différenciés de la thyroïde sont généralement de bon pronostic, contrairement aux cancers anaplasiques qui sont nettement plus agressifs, avec un taux de survie à 5 ans inférieur à 5%. <p>La technologie des microarrays permet d’analyser simultanément l’expression de milliers de gènes dans différentes cellules et différentes conditions physiologiques, pathologiques ou toxicologiques. Au cours de cette thèse de doctorat, nous avons déterminé le profil d’expression génique des carcinomes papillaires de la thyroïde à l’aide de la technique des microarrays en utilisant une plateforme contenant plus de 8000 gènes. Douze des 26 cancers papillaires étudiés étaient issus de patients habitant la région de Tchernobyl lors de l’explosion de la centrale nucléaire de 1986 et sont considérés comme des cancers radio-induits. Les 14 tumeurs restantes proviennent de patients habitant la France. Leur étiologie n’étant pas connue, ils sont considérés comme des cancers sporadiques. <p>La réalisation de ces expériences nous a permis d’identifier des signatures moléculaires entre des sous-types de cancers papillaires. Premièrement, nous avons montré que malgré un profil d’expression génique global similaire entre les cancers papillaires sporadiques et radio-induits, une signature multigénique permet de les séparer, indiquant que des subtiles différences existent entre les deux types de tumeurs. Deux autres signatures indépendantes, l’une liée aux agents étiologiques présumés de ces tumeurs (radiation vs. H2O2), l’autre liée aux mécanismes de recombinaison homologue de l’ADN, permettent également de séparer les cancers post-Tchernobyl des cancers sporadiques. Nous avons interprété ces résultats comme une différence de susceptibilité à l’irradiation entre ces deux types de tumeurs. D’autre part, nous avons pu identifier une liste de gènes permettant de séparer les cancers papillaires à variante classique des autres sous-types de cancers papillaires. L’analyse de cette liste de gènes a permis de mettre en relation cette signature avec l’important remodelage de cette variante histologique par rapport aux autres. <p>Ces expériences ont aussi abouti à l’obtention d’une liste de gènes différentiellement exprimés entre les cancers papillaires et leur tissu normal adjacent. Une analyse minutieuse de cette liste à l’aide d’outils statistiques a permis de mieux comprendre la physiopathologie de ces tumeurs et d’aboutir à différentes conclusions :(1) un changement de population cellulaire est observé, avec une surexpression de gènes liés à la réponse immune, reflétant l’infiltration lymphocytaire de ces tumeurs par rapport au tissu normal adjacent (2) la voie de signalisation JNK est activée par surexpression de ses composants (3) la voie de signalisation de l’EGF, également par une surexpression de ses composants, complémente les altérations génétiques des cancers papillaires pour l’activation constitutive de la voie ERK1/2 (4) une sousexpression des gènes de réponse précoce est observée (5) une surexpression de nombreuses protéases, d’inhibiteurs de protéases et de protéines de la matrice extracellulaire permet d’expliquer l’important remodelage des cancers papillaires (6) le profil d’expression génique des cancers papillaires peut être corrélé avec un mode de migration collectif de ces tumeurs. <p>Finalement, dans la dernière partie de la thèse, nous avons déterminé le profil d’expression génique des cancers anaplasiques de la thyroïde et l’avons comparé à celui des cancers papillaires. Nous avons montré que les deux types de tumeurs présentent des profils moléculaires globaux distincts, reflétant leur comportement tumoral très différent. <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished