Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-23Bitstream added on 2014-06-13T20:05:16Z : No. of bitstreams: 1 freitasneto_oc_dr_jabo.pdf: 1961940 bytes, checksum: 7291da4800867b31fbd9a7d43c4a44cd (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / S. Gallinarum (SG) provoca o tifo aviário, doença sistêmica com alta mortalidade em aves. Esse biovar é imóvel devido à falta de flagelos. Foi sugerido que a ausência de flagelo resultaria na indução de resposta pró-inflamatória de menor intensidade na mucosa intestinal, favorecendo o desenvolvimento da infecção sistêmica. Para investigar essa hipótese, um mutante de SG capaz de produzir flagelos (SG Fla+) foi construído. Analisou-se a capacidade deste mutante de invadir células epiteliais renais (CRGs), sobreviver em macrófagos da linhagem HD 11 e induzir a expressão de genes responsáveis por mediadores da resposta imune nestas células, em conjunto com outras estirpes de Salmonella spp. Aliado a isso, comparou-se a patogenicidade de SG Fla+ e SG para aves de uma linhagem para postura comercial, avaliando-se a mortalidade e as alterações macroscópicas. Os resultados demonstraram que o flagelo aumentou a capacidade de invasão das estirpes para CRGs, mas não alterou a sobrevivência de SG Fla+ no interior dos macrófagos HD 11. SG Fla+ induziu a maior aumento da expressão de CXCLi2, IL-6 e de iNOS em CRGs que as estirpes sem flagelos (p<0,05). A expressão de genes responsáveis por mediadores da resposta imune em macrófagos HD11 não esteve ligada a presença de flagelo. SG Fla+ provocou menores taxas de mortalidade que SG (p<0,05). Após 28 dias do desafio, SG Fla+ foi isolada no conteúdo de alguns cecos com alterações sugestivas de inflamação / S. Gallinarum (SG) is the causative agent of fowl typhoid, a systemic disease responsible for high mortality rates in birds. This biovar is non-motile due to the lack of flagella. It has been proposed that the absence of flagellum would provoke less pro-inflammatory immune response in the gut, favoring the development of systemic infection. In order to investigate this, a SG mutant strain capable of producing flagella (SG Fla+) was constructed. The capability of this mutant and other Salmonella spp. strains in invading chicken kidney cells (CKCs), surviving in HD 11 macrophages and inducing inflammatory responses in these cells were assessed. In adittion, the pathogenicity of SG Fla+ and SG was comparatively assessed in commercial laying hens. Mortality rates and gross lesions were evaluated. The results shown that flagellum increased the invasiveness of strains to CKCs while its presence did not change the survival of SG Fla+ in HD11 macrophages. SG Fla+ induced higher levels of CXCLi2, IL- 6 and iNOS gene expression than non-flagellated strains did (p<0.05). The expression of genes responsible for mediators of immune responses in infected HD11 macrophages were not related to the presence of flagella. SG Fla+ caused lower mortality rates than SG (p<0.05). SG Fla+ was recovered from the contents of caeca which presented inflammation-like macroscopic alterations not observed in birds infected with SG

Orientador: Angelo Berchieri Júnior / Coorientador: Paul Barrow / Banca: Guilherme Correa de Oliveira / Banca: Fabiana Horn / Banca: Raphael Lucio Andreatti Filho / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Resumo: S. Gallinarum (SG) provoca o tifo aviário, doença sistêmica com alta mortalidade em aves. Esse biovar é imóvel devido à falta de flagelos. Foi sugerido que a ausência de flagelo resultaria na indução de resposta pró-inflamatória de menor intensidade na mucosa intestinal, favorecendo o desenvolvimento da infecção sistêmica. Para investigar essa hipótese, um mutante de SG capaz de produzir flagelos (SG Fla+) foi construído. Analisou-se a capacidade deste mutante de invadir células epiteliais renais (CRGs), sobreviver em macrófagos da linhagem HD 11 e induzir a expressão de genes responsáveis por mediadores da resposta imune nestas células, em conjunto com outras estirpes de Salmonella spp. Aliado a isso, comparou-se a patogenicidade de SG Fla+ e SG para aves de uma linhagem para postura comercial, avaliando-se a mortalidade e as alterações macroscópicas. Os resultados demonstraram que o flagelo aumentou a capacidade de invasão das estirpes para CRGs, mas não alterou a sobrevivência de SG Fla+ no interior dos macrófagos HD 11. SG Fla+ induziu a maior aumento da expressão de CXCLi2, IL-6 e de iNOS em CRGs que as estirpes sem flagelos (p<0,05). A expressão de genes responsáveis por mediadores da resposta imune em macrófagos HD11 não esteve ligada a presença de flagelo. SG Fla+ provocou menores taxas de mortalidade que SG (p<0,05). Após 28 dias do desafio, SG Fla+ foi isolada no conteúdo de alguns cecos com alterações sugestivas de inflamação / Abstract: S. Gallinarum (SG) is the causative agent of fowl typhoid, a systemic disease responsible for high mortality rates in birds. This biovar is non-motile due to the lack of flagella. It has been proposed that the absence of flagellum would provoke less pro-inflammatory immune response in the gut, favoring the development of systemic infection. In order to investigate this, a SG mutant strain capable of producing flagella (SG Fla+) was constructed. The capability of this mutant and other Salmonella spp. strains in invading chicken kidney cells (CKCs), surviving in HD 11 macrophages and inducing inflammatory responses in these cells were assessed. In adittion, the pathogenicity of SG Fla+ and SG was comparatively assessed in commercial laying hens. Mortality rates and gross lesions were evaluated. The results shown that flagellum increased the invasiveness of strains to CKCs while its presence did not change the survival of SG Fla+ in HD11 macrophages. SG Fla+ induced higher levels of CXCLi2, IL- 6 and iNOS gene expression than non-flagellated strains did (p<0.05). The expression of genes responsible for mediators of immune responses in infected HD11 macrophages were not related to the presence of flagella. SG Fla+ caused lower mortality rates than SG (p<0.05). SG Fla+ was recovered from the contents of caeca which presented inflammation-like macroscopic alterations not observed in birds infected with SG / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-23Bitstream added on 2014-06-13T20:57:22Z : No. of bitstreams: 1 garcia_ko_me_jabo.pdf: 1338222 bytes, checksum: 3ae3f6dbbedafe616111a3bd7c911731 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este trabalho objetivou avaliar a anatomopatologia, o hemograma e o perfil bioquímico sérico de aves de postura inoculadas por Salmonella Gallinarum (SG) contendo os genes cobS e cbiA inoperantes (SGcobScbiA) que mostrou ser avirulenta em trabalhos anteriores, comparando-a com cepas virulentas SGNalr e SGcobS, para mostrar se SGcobScbiA pode ser componente de vacina contra cepas selvagens de SG e S.Enteritidis. 280 pintainhas foram distribuídas em 4 grupos (G); G1 (SGcobS), G2 (SGNalr), G3 (SGcobScbiA) e G4 (controle). Com exceção do G4, os grupos receberam 0,2 mL de suas respectivas cepas contendo aproximadamente 108 UFC/mL de inóculo, aos 5 dias de idade. A eutanásia foi realizada 24h antes (1DAI) e após a inoculação (1DPI), e 3 (3DPI), 5 (5DPI), 7 (7DPI), 10 (10DPI) e 15 (15DPI) dias após a administração do inóculo, sacrificando-se, em cada momento, dez aves de cada grupo. As aves foram sacrificadas, obtendo-se amostras de sangue utilizadas para os exames hematológicos e bioquímicos. Fragmentos de fígado, baço, timo, bursa de Fabricius, rins e coração foram destinados aos exames histológicos. As aves inoculadas com a cepa SGcobS tiveram comportamento semelhante às aves inoculadas por SGNalr, porém com algumas respostas diferentes nos exames hematológicos e bioquímicos. As aves inoculadas com a cepa SGcobScbiA tiveram comportamento semelhante ao grupo controle, entretanto foi verificado alterações brandas em alguns parâmetros, mostrando que estudos futuros devem ser feitos, verificando se as alterações constatadas não irão interferir no desempenho de aves vacinadas com a cepa SGcobScbiA. / The aim of the present study was to evaluate anatomopathology, hemogram and blood serum components of commercial layers experimentally inoculated with SGcobScbiA, which is a Salmonella Gallinarum (SG) strain it shows attenuation of the virulence in previous research and it was compared with high virulence SGNalr and SGcobS strains in order to show if SGcobScbiA has potential to be use as a vaccine against SG and S. Enteritidis wild strains. 280 commercial layers were divided into 4 groups (G); G1 (SGcobS), G2 (SGNalr), G3 (SGcobScbiA) and G4 (control group). With exception of G4, all the other groups received 0,2 mL of their respective strain containing about 108 CFU/mL of the inoculum with five days of age. Birds were sacrificed 24 hours before (1DBI) and 24 hours after the inoculation (1DAI), and three (3DAI), five (5DAI), seven (7DAI) ten (10DAI), and fifteen (15DAI) days after the administration of the inoculum, slaughtering ten birds at a time in each group. Birds were submitted to euthanasia and blood samples were collected in order to make the hematological and blood serum components test. Samples of liver, spleen, thymus, bursa of Fabricius, kidneys and heart were collected for the histological test. The birds inoculated with SGcobS strain had similar behavior when compared with that ones who received SGNalr strain, however some different responses in the hematological and blood serum components were found. On the other hand, the birds inoculated with SGcobScbiA strain had similar behavior when compared with the control group, however, lower alterations in some parameters were found. Further studies must be done to verify if these alterations will not interfere in the performance of the vaccinate birds with SGcobScbiA strain.

Submitted by Lucas Bocchini Rodrigues Alves null (lucasbocchini@gmail.com) on 2017-12-05T19:45:59Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Lucas_Bocchini_Rodrigues_Alves.pdf: 48834271 bytes, checksum: 5031c0180284664e9a7c99d9701586b4 (MD5) / Submitted by Lucas Bocchini Rodrigues Alves null (lucasbocchini@gmail.com) on 2017-12-11T18:47:10Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Lucas_Bocchini_Rodrigues_Alves.pdf: 48834271 bytes, checksum: 5031c0180284664e9a7c99d9701586b4 (MD5) / Approved for entry into archive by Karina Gimenes Fernandes null (karinagi@fcav.unesp.br) on 2017-12-13T11:36:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 rodriguesalves_lb_jabo.pdf: 48291587 bytes, checksum: dba569cb90d71bd85abca6cc394cb228 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-13T11:36:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rodriguesalves_lb_jabo.pdf: 48291587 bytes, checksum: dba569cb90d71bd85abca6cc394cb228 (MD5) Previous issue date: 2017-07-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / RESUMO – Salmonella Gallinarum (SG) é um patógeno hospedeiro-específico que causa o tifo aviário, doença sistêmica severa que é considerada uma das principais preocupações da indústria avícola mundial. Quando infecta a ave, SG utiliza mecanismos de evasão para sobreviver e replicar no interior de macrófagos. Nesse contexto, os genes phoPQ codificam o sistema regulatório de dois componentes (PhoPQ) que regula genes de virulência responsáveis pela adaptação de Salmonella spp. a fatores antimicrobianos como baixo pH, peptídeos antimicrobianos e baixas concentrações de cátions bivalentes. No presente estudo, objetivou-se investigar a função desses genes para SG. Assim, uma estirpe de SG com genes phoPQ defectivos (SG ∆phoPQ) foi construída e sua patogenicidade avaliada em aves poedeiras de 20 dias de vida susceptíveis ao tifo aviário. SG ∆phoPQ não causou sinais clínicos nem mortalidade em aves desafiadas oralmente, sendo não-patogênica. Ademais, essa estirpe não foi recuperada de fígados e baços. Por outro lado, aves desafiadas subcutaneamente com a estirpe mutante tiveram alterações patológicas discretas a moderadas e baixas contagens bacterianas em tecidos de fígado e baço. A partir dos dados, observa-se que SG ∆phoPQ é atenuado para aves o que sugere que ambos os genes são importantes durante a infecção sistêmica em aves por SG. / ABSTRACT – Salmonella Gallinarum (SG) is a host-restrict pathogen that causes fowl typhoid, a severe systemic disease that is one of the major concerns to the poultry industry worldwide. When infecting the bird, SG makes use of evasion mechanisms to survive and to replicate within macrophages. In this context, phoPQ genes encode a two-component regulatory system (PhoPQ) that regulates virulence genes responsible for adaptation of Salmonella spp. to antimicrobial factors such as low pH, antimicrobial peptides and deprivation of bivalent cations. Herein, we aimed to investigate the role of the mentioned genes to SG. Thus, a phoPQ-depleted SG strain (SG ∆phoPQ) was constructed and its virulence assessed in twenty-day-old laying hens susceptible to fowl typhoid. SG ∆phoPQ did cause neither clinical signs nor mortality in birds orally challenged, being non-pathogenic. Furthermore, this strain was not recovered from livers or spleens. On the other hand, chickens challenged subcutaneously with the mutant strain had discreet to moderate pathological changes and also low bacterial counts in liver and spleen tissues. These findings show that SG ∆phoPQ is attenuated to susceptible chickens and suggest that both genes are important during chicken systemic infection by SG.

Submitted by DIEGO FELIPE ALVES BATISTA null (diegofelipe_vet@hotmail.com) on 2017-07-23T15:53:00Z No. of bitstreams: 1 Tese final.pdf: 4005234 bytes, checksum: 457b822652d4193c9c8e25953f4d3dc1 (MD5) / Rejected by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: Incluir o número do processo de financiamento FAPESP nos agradecimentos da dissertação/tese. Corrija esta informação e realize uma nova submissão com o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2017-07-26T13:34:20Z (GMT) / Submitted by DIEGO FELIPE ALVES BATISTA null (diegofelipe_vet@hotmail.com) on 2017-07-26T14:07:28Z No. of bitstreams: 1 Tese_Diego_Felipe_Alves_Batista.pdf: 4004591 bytes, checksum: 1de74c2da3ba5ba3e56c6bcf6f9ba6f2 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-07-26T19:26:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 batista_dfa_dr_jabo.pdf: 4004591 bytes, checksum: 1de74c2da3ba5ba3e56c6bcf6f9ba6f2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-26T19:26:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 batista_dfa_dr_jabo.pdf: 4004591 bytes, checksum: 1de74c2da3ba5ba3e56c6bcf6f9ba6f2 (MD5) Previous issue date: 2017-07-04 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O tifo aviário, causado por Salmonella Gallinarum biotipo Gallinarum, é uma infecção caracterizada pela alta mortalidade nos lotes de aves suscetíveis acometidos, enquanto S. Gallinarum biotipo Pullorum, o agente da pulorose, infecta as aves de produção industrial com as quais desenvolve relação mais branda. Ainda é escasso o conhecimento sobre os mecanismos moleculares que sustentam essas diferentes interações patógeno-hospedeiro. Nesse estudo, objetivou-se investigar o efeito de deleção parcial das sequências codificantes dos genes idnT (transportador de L-idonato ou D-gluconato), idnO (5-cetogluconato redutase) e ccmH (heme liase necessária na montagem de citocromos do tipo C) sobre a patogenicidade de S. Gallinarum 287/91 (SG287/91), uma vez que seus ortólogos são pseudogenes conservados em S. Pullorum. Os clones mutantes SG∆idnTO, SG∆ccmH e SG∆ccmHidnTO foram obtidos por meio da técnica de mutação sítio-dirigida, denominada de recombinação Lambda-Red e testados em dois experimentos independentes com aves comerciais semipesadas de postura suscetíveis ao tifo aviário. No 1º experimento não se observou alteração da patogenicidade dos clones mutantes após inoculação oral, pois todos os animais infectados desenvolveram sinais clínicos típicos do tifo aviário e vieram a óbito ao longo de 12 dias pós-infecção (dpi). Apesar dos 100% de mortalidade, as infecções desenvolvidas pelos clones SG∆idnTO e SG∆ccmHidnTO levaram os animais a óbito dentro de 48 horas desde o aparecimento dos sinais clínicos, enquanto SG287/91 o fez em 6 dias, sugerindo aumento da virulência dos clones mutantes. No 2º experimento observou-se que as mutantes invadiram o hospedeiro a partir do intestino, embora as quantidades recuperadas de SG∆idnTO e SG∆ccmHidnTO nos fígados e de SG∆idnTO nos baços, no 5º dpi, foram superiores a de SG287/91, reforçando a hipótese de aumento da virulência dos clones contendo a alteração idnTO. Apesar disso, os níveis de transcrição das citocinas CXCLi2 e IL6 produzidos à infecção por SG∆idnTO e SG∆ccmHidnTO não diferiram nas tonsilas cecais nos 1º e 3º dpi e nos baços no 3º dpi em relação à infecção por SG287/91. Somente SG∆ccmH inclinou-se a estimular a transcrição de CXCLi2 e IL6 nas tonsilas cecais no 1° dpi em relação ao grupo controle, enquanto SG287/91 tendeu a suprimi-la. Porém, não houve suporte estatístico para essa observação. Os níveis de mRNA do IFNγ estavam aumentados para todas as estirpes de S. Gallinarum, mutantes ou não, porém sem diferença estatística entre eles. Os resultados do presente estudo indicam que a ruptura nos genes idnTO, e em menor grau do gene ccmH, poderiam levar a perda de “fitness” em S. Gallinarum, lhes justificando a permanência no genoma desse micro-organismo, ao contrário do que ocorre com S. Pullorum. O estudo da patogenicidade de estirpe de S. Pullorum tendo reconstituídos os genes idnTO e ccmH no seu genoma poderia esclarecer os motivos pelos quais esses foram negativamente selecionados por esse micro-organismo. / Fowl typhoid, caused by Salmonella Gallinarum biovar Gallinarum, is an infectious disease which elicits high mortality into a flock of susceptible birds whereas S. Gallinarum biovar Pullorum, the aetiological agent of pullorum disease, infects poultry of commercial importance with which such a bacterium sets off a more permissive host-pathogen interaction. Little is known about the molecular mechanisms driving these distinct interplays with the host. Herein, we aimed at investigating the effect of partial deletions in the idnT (L-idonate / D-gluconate transporter), idnO (5-ketogluconase reductase) and ccmH (heme liase involved in the c-type cytochrome maturation) coding sequences on S. Gallinarum 287/91 (SG287/91) pathogenicity since they are conserved pseudogenes in S. Pullorum genomes. SG∆idnTO, SG∆ccmH and SG∆ccmHidnTO mutant strains were constructed through a one-step inactivation technique, known as Lambda-Red-mediated recombination, and tested on two independent experiments by using a commercial brown egg-producing layer line susceptible to fowl typhoid. On the experiment 1, no changing was observed in the pathogenicity of the mutant strains upon oral inoculation as the infected animals developed typical fowl typhoid clinical signs and died along 12 days post-infection (dpi). In spite of causing 100% mortality, SG∆idnTO and SG∆ccmHidnTO killed all the animals within 48 hours since the clinical signs appearance while SG287/91 did so in 6 days, indicating an increased virulence by these mutant strains. On the experiment 2 every mutant strain were able to invade the host system from the intestine albeit SG∆idnTO and SG∆ccmHidnTO were recovered from livers and SG∆idnTO alone from spleens at higher numbers than was SG287/91, supporting the hypothesis of increased virulence for those clones harbouring the idnTO mutation. Despite the results above, CXCLi2 and IL6 transcription levels during infection by SG∆idnTO and SG∆ccmHidnTO were similar to that induced by SG287/91 in caecal tonsils at 1 and 3 dpi and in spleens at 3 dpi. In contrast, SG∆ccmH trended to stimulate CXCLi2 and IL6 transcription in caecal tonsils at 1 dpi when compared to the negative, control group whereas SG287/91 tended to suppress it, but no statistical significance was found for such an observation. IFNγ mRNA were augmented for all S. Gallinarum strains, mutant or not, but without statistical difference amongst them. These findings indicate that gene decay into idnTO, and at a lesser extent, into ccmH sequences might lead to the loss of fitness by S. Gallinarum, raising an explanation for their maintenance on this bacterium chromosome when the opposite happens to S. Pullorum. Studying the pathogenicity of a S. Pullorum strain possessing both the idnTO and ccmH genes in its genome could bring to light the reasons whereby such genes were negatively selected by this microorganism. / FAPESP: 2013/22920-4 / FAPESP: 2013/26127-7