Dans cette thèse, nous avons concentré notre étude sur les mécanismes qui génèrent la polarité cellulaire, en particulier dans le cas de la migration cellulaire. Malgré les derniers développements concernant l’observation de l’activité des RhoGTPases, les principes qui dictent la capacité des cellules à coordonner plusieurs modules de signalisation en parallèle ne sont toujours pas compris. L’optogénétique est un outil d’intérêt pour disséquer ces réseaux de signalisation à partir de la création d’une perturbation dont les caractéristiques spatiotemporelles sont contrôlées. Tout d’abord, à partir de la caractérisation des différents processus biophysiques en jeu, nous avons établi les relations quantitatives entre l’illumination et les gradients moléculaires que l’on induit. Nous avons déterminé qu’il est possible de créer des gradients subcellulaires avec une résolution spatiale de l’ordre de 5 μm et temporelle d’environ 3 minutes Ensuite, nous avons utilisé cette approche optogénétique pour contrôler l’activité de Cdc42, Rac1 et RhoA. Nous avons caractérisé les effets subcellulaires de l’activation de ces RhoGTPases en utilisant l’activité de membrane, les changements de forme cellulaire et leurs déplacements comme rapporteurs de la polarisation et de la migration. Nous avons ainsi montré qu’une activation locale de RhoGTPase permet la réorganisation interne des cellules jusqu’à générer un phénotype de migration.Enfin, nous avons caractérisé les effets d’une activation locale de RhoA sur différents acteurs moléculaires comme les points focaux d’adhésion, l’actine et les moteurs moléculaires myosines. Nous avons mesuré alors la dynamique de l’intégration des points focaux dans le cytosquelette et analysé la réponse du réseau d’acto-myosine au cours d’évènements de rétraction.Notre approche optogénétique couple le contrôle d’une perturbation à la mesure de la réponse cellulaire simultanément de manière directe et reproductible. Elle apporte une méthode pour contrôler la polarité cellulaire et une manière de disséquer des réseaux de signalisation à l’échelle subcellulaire. / In this thesis we focus on the mechanisms that establish cell polarization, particularly during cell migration. Despite latest developments that enable visualization of RhoGTPases activity, the underlying principles dictating the cell’s ability to coordinates multiple signaling modules is still unclear. Optogenetic methods have been recognized as promising tools to dissect these intracellular signaling networks by allowing perturbations to be spatially and temporally controlled. We established the quantitative relationship between illumination patterns and the corresponding gradients of induced signaling activity through the characterization of the biophysical properties of CRY2/CIBN. We determined that it is possible to create subcellular gradients of recruited proteins of different shapes of choice up to spatial resolutions of 5μm and temporal ones of ca. 3 minutes.We applied the aforementioned optogenetic approach as a means to perturb the activity of cdc42, Rac1 and RhoA. We characterized the effects of subcellular activation of those RhoGTPases using membrane activity, cell shape changes and cell displacement as reporters of cell polarization and migration. We show that localized activation of RhoGTPases can trigger cellular organization and drive the cell into a migrating state.We also characterized the effects of local activation of RhoA on different cellular effectors as focal adhesion complexes, actin filaments and myosin molecular motors. We measured the dynamics of the newly formed focal adhesion complexes and the acto-myosin complex during retraction events.Altogether, our optogenetic methodology enables simultaneous measurement of the imposed perturbation and the cell response in a straightforward and reproducible way. It provides a quantitative way to control cell polarity and a step forward in the dissection of subcellular signaling networks.

Le maintien de l’homéostasie passe notamment par la sécrétion d’hormones provenant des cellules neuro-endocrines ou endocrines telles que les cellules chromaffines ou les cellules b pancréatiques. Par exemple, la régulation de la glycémie nécessite l’exocytose de l’insuline depuis les cellules b pancréatiques des îlots de Langerhans. Une famille de protéines membranaires est au cœur de la machinerie de fusion d’une vésicule avec la membrane plasmique. Ce groupe appelé, la famille des protéines SNARE est composé de trois protéines. VAMP2 est localisée à la membrane vésiculaire alors que syntaxine 1A et SNAP25 sont localisées à la membrane plasmique. Syntaxine 1A et VAMP2 ont un domaine transmembranaire alors que SNAP25 est reliée à la membrane par prénylation de résidus cystéine. Cette famille forme le complexe cytosolique SNARE décrit comme essentiel à l’exocytose. La structure et la fonction du complexe cytosolique ont été étudiées en profondeur et ont mené au modèle du « zipper ». Celui-ci décrit un enroulement progressif des domaines cytosoliques SNARE permettant l’apposition des membranes puis la fusion. Le rôle des domaines transmembranaires reste encore peu décrit. Pourtant, leur étude est nécessaire afin d’établir un modèle complet de la fusion membranaire par les protéines SNARE. Nous avons donc mené une étude alliant une analyse structurale dynamique à une analyse biologique pour déterminer l’importance du domaine transmembranaire de VAMP2 dans la sécrétion. L’analyse biologique représente donc le centre de ma thèse. Le système biologique utilisé est basé sur l’extinction de l’expression de la protéine VAMP2 endogène et l’expression concomitante d’une protéine VAMP2 mutée dans son domaine transmembranaire. Deux lignées cellulaires considérées comme des modèles dans l’étude de la sécrétion hormonale et du trafic vésiculaire ont servi de support à notre étude. Par des approches de microscopies (confocal, TIRF) et d’analyses biochimiques, nous avons observé les conséquences fonctionnelles des mutations ponctuelles, établis par mutagénèse dirigée, sur le trafic vésiculaire et sur la capacité des cellules à sécréter.Les mutations induites présentent différents effets cellulaires. Certaines bloquent la sortie de VAMP2 du réseau golgien alors que d’autres ont un effet important sur la sécrétion hormonale et plus précisément sur l’exocytose. Les études structurales ont permis de corréler ces effets avec une diminution de la flexibilité structurale dans le cas de la diminution de l’exocytose, ou avec une restriction à la conformation hélice alpha dans le cas du sorting. Ce projet pluridisciplinaire a pu mettre en avant le rôle biologique du domaine transmembranaire de VAMP2 au cours de l’exocytose probablement soutenue par la dynamique conformationelle unique observée par le versant structural du projet. / The hormonal secretion plays a key role in the maintenance of homeostasis. For example, the maintenance of normoglycaemia requires insulin exocytosis from the pancreatic beta cells. The SNARE membrane family protein has been described as the core machinery of fusion between the vesicle containing hormones and the plasma membrane. This family consists of 3 different membrane proteins that are essential during exocytosis. VAMP2 is localized on the vesicle and Syntaxin 1A - on the plasma membrane. They both are transmembrane protein whereas SNAP25 is linked to the plasma membrane by palmitoylation. The SNAREs appear to be essential as they form the cytosolic SNARE complex to dock the vesicle to the plasma membrane. Even though the role of this cytosolic domain has been studied in depth, much less is known on the role of their transmembrane domain during the fusion. Their study remains necessary to establish a complete model of membrane fusion mediated by the SNARE proteins.Here, we have studied the behavior and the role of the SNARE transmembrane domain during exocytosis. In a multidisciplinary project, we have combined a structural approach with a biological study to evaluate the role of this domain. Using mutagenesis in the transmembrane domain of VAMP2 and a cellular system with a clean background, we have assessed the effect of mutations on the secretion and exocytosis in two different cell lines (INS1E and PC12). The biological system is based on the silencing of endogenous VAMP2 and reconstitution of the expression of VAMP2 wt or mutated in the transmembrane domain. Using biochemistry assay and TIRF microscopy we have shown that mutations in this domain can lead to a missorting of the Golgi apparatus or a reduction of the stimulated secretion and exocytosis. This effect can be correlated to a modification of the structural dynamics of this domain.The obtained results clearly demonstrate the role of the transmembrane domain of VAMP2 during exocytosis probably sustained by its unique structural dynamics observed by physico-chemistry.

The microtubular cytoskeleton is a ubiquitous and highly diverse biopolymer network present in all eukaryotic cells. Microtubules stochastically alternate between phases of growth and shrinkage. Cells take advantage of this dynamicity to generate forces for essential processes, such as cell division, motility or morphogenesis. Regulating the microtubule dynamics enables cells to adaptively respond to a wide range of tasks and conditions. Molecular mechanisms underpinning the regulation are not fully understood. Using a bottom-up approach and the combination of single molecule total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and interference reflection microscopy (IRM), we here reconstituted and explored two dynamic cytoskeletal systems. (i) Microtubule doublets, comprising incomplete B-microtubule on the surface of a complete A- microtubule, provide an essential structural scaffold for flagella. Despite the fundamental role of microtubule doublets, the molecular mechanism governing their formation is unknown. We here demonstrate an inhibitory role of tubulin C-terminus in microtubule doublet assembly. By partial enzymatic digestion of polymerized microtubules followed by the addition of free tubulin in the presence of a stabilizing agent, we assembled microtubule doublets and revealed the B-...

Many genetic processes require enzymes or enzyme complexes that interact simultaneously with distant sites along the genome. Such long-range DNA-enzyme interactions are important for example in gene regulation, DNA replication, repair and recombination. In addition many restriction enzymes depend on interactions between two recognition sites and form therefore a model system for studying long-range communications on DNA. Topic of the present work are Type III restriction enzymes. For these enzymes the communication mechanism between their distant target sites has not been resolved and conflicting models including 3D diffusion, 1D translocation and 1D diffusion have been proposed. Also the role of ATP hydrolysis by their superfamily 2 helicase domains which catalyse functions of many enzyme systems is still poorly understood. To cleave DNA, Type III restriction enzymes sense the relative orientation of their distant target sites and cleave DNA only if at least two of them are situated in an inverted repeat. This process strictly depends on ATP hydrolysis. The aim of this PhD thesis was to elucidate this long-range communication. For this a new single molecule assay was developed using a setup combining magnetic tweezers and objective-type total internal reflection fluorescence microscopy. In addition of being able to mechanically manipulate individual DNA molecules, this assay allows to directly visualize the binding and movement of fluorescently labelled enzymes along DNA. Applying this assay to quantum dot labelled Type III restriction enzymes, a 1D diffusion of the enzymes after binding at their target sites could be demonstrated. Furthermore, it was found that the diffusion depends on the nucleotide that is bound to the ATPase domains of these enzymes. This suggested that ATP hydrolysis acts as a switch to license diffusion from the target site which leads to cleavage. In addition to the direct visualization of the enzyme-DNA interaction, the cleavage site selection, the DNA end influence (open or blocked) and the DNA binding kinetics were measured in bulk solution assays (not part of this thesis). The experimental results were compared to Monte Carlo simulations of a diffusion-collision-model which is proposed as long-range communication in this thesis.

Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) is a powerful tool to measure important physical quantities such as concentrations, diffusion coefficients, diffusion modes or binding parameters, both in solution and in membranes. However, it can suffer from severe artifacts, especially in non-ideal systems. Here we develop several novel implementations of FCS which overcome these limitations and facilitate accurate and quantitative determination of dynamic parameters in membranes. Two-focus FCS with camera-detection allows for accurate and calibration-free determination of diffusion coefficients. Confocal FCS using a laser scanning microscope provides an unprecedented positioning accuracy which enabled us to study, for the first time with FCS, dynamics in bacterial membranes. Scanning FCS with a scan path perpendicular to the membrane plane allows to correct for instabilities permitting long measurement times necessary to study slow diffusion. It can easily be extended to measure calibration-free diffusion coefficients with two-focus scanning FCS and to quantify binding with dual color scanning FCS. Spectral crosstalk can be avoided effectively by using alternating excitation. Using this method we were able to perform measurements in systems previously not accessible with FCS, such as yeast cell membranes or membranes of living zebrafish embryos. Line-scan FCS with a scan path in the membrane plane uses the parallel acquisition along the line to increase the statistical accuracy and decrease the measurement times. Knowledge of the scan speed serves as an internal calibration, enabling accurate diffusion and concentration measurements within seconds, hardly affected by photobleaching. Both realizations of scanning FCS can be easily implemented with commercial laser scanning microscopes. Often, a fluorescence background around the membrane cannot be avoided. The high surface selectivity needed in this case can be achieved efficiently by using a novel objective for FCS, the supercritical angle objective, which produces a very flat and laterally confined detection volume. Another technique with similar surface selectivity is FCS with total internal reflection excitation (TIRFCS). Due to the lack of a correct model, the accurate analysis of TIR-FCS data was previously not possible. In this work we develop such a model, enabling quantitative measurements of membrane dynamics with TIR-FCS. The novel FCS techniques developed here will have a high impact on the use of FCS to address key questions in biological systems, previously inaccessible by other methods. / Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) ist eine mächtige Methode, um wichtige physikalische Parameter wie Konzentrationen, Diffusionskoeffizienten, Diffusionsarten oder Bindungsparameter in Lösung und in Modell- oder Zellmembranen zu bestimmen. In nichtidealen Systemen ist FCS fehleranfällig. In dieser Arbeit entwickeln wir mehrere neuartige Realisierungen von FCS, welche diese Fehlerquellen umgehen und die genaue und quantitative Messung dynamischer Parameter in Membranen ermöglichen. Zwei-Fokus FCS mit Kamera-Detektion erlaubt eine genaue und kalibrationsfreie Messung von Diffusionskoeffizienten. Konfokale FCS mit einem Laserscanningmikroskop besitzt eine bislang unerreichte Positionsgenauigkeit, welche uns erstmals dynamische Messungen in Bakterienmembranen mit FCS ermöglichte. Scanning FCS mit einem Scanweg senkrecht zur Membran ermöglicht eine Korrektur von Instabilitäten und damit lange Messzeiten, die zur Bestimmung langsamer Diffusionskoeffizienten notwendig sind. Eine Erweiterung zur kalibrationsfreien Messung von Diffusionskoeffizienten mit Zwei-Fokus Scanning FCS und von Bindungsparametern mit Zwei-Farben Scanning FCS ist einfach. Mit diesen Methoden konnten wir in Systemen messen, die bislang FCS nicht zugänglich waren, so in Hefezellmembranen oder in Membranen lebender Zebrafischembryonen. Line-scan FCS besitzt einen Scanweg parallel zur Membran. Die parallele Messung entlang der ganzen Linie führt zu einer deutlichen Verbesserung der Statistik und damit zu kurzen Messzeiten. Die Kenntnis der Scangeschwindigkeit dient einer internen Kalibration und erlaubt eine akkurate Bestimmung von Diffusionskoeffizienten und Konzentrationen innerhalb weniger Sekunden, kaum beeinflusst vom Bleichen von Fluorophoren. Beide Arten von Scanning FCS können mit einem kommerziellen Laserscanningmikroskop realisiert werden. Häufig kann bei FCS Messungen ein fluoreszierender Hintergrund nicht vermieden werden. Hier ist eine hohe Oberflächenselektivitiät nötig, welche effizient mit einem neuartigen Objektiv erreicht werden kann. Dieses Supercritical Angle-Objektiv erzeugt ein sehr flaches und lateral begrenztes Detektionsvolumen. Eine weitere Methode mit einer ähnlich guten Oberflächenselektivität ist FCS mit Anregung über totale interne Reflektion (TIR-FCS). Bislang war eine quantitative Analyse der TIR-FCS Daten kaum möglich, da keine ausreichend genaue theoretische Beschreibung existierte. In dieser Arbeit entwickeln wir ein akkurates Modell, welches quantitative Messungen mit TIR-FCS erlaubt. Die hier entwickelten neuartgien FCS-Techniken ermöglichen die Untersuchung biologischer Fragestellungen, welche bislang keiner anderen Methode zugänglich sind.

Eukaryontische Zellen besitzen ein Zytoskelett, ein zelluläres Netzwerk aus Biopolymeren. Unter diesen Biopolymeren sind die Mikrotubuli weitgehend konserviert. Diese aus Tubulin aufgebauten Filamente sind dynamisch und wechseln zwischen Phasen des Wachstums und der Schrumpfung. Die genauen Mechanismen, die die dynamische Instabilität der Mikrotubuli bestimmen, werden noch erforscht. Die Allgegenwart von Mikrotubuli wirft die Frage auf, wie sie in verschiedenen thermischen Umgebungen konservierte Funktionen ausführen können. Um dieser Fragestellung nachzugehen, habe ich verwandte Froscharten mit unterschiedlich temperierten Lebensräumen untersucht: Xenopus laevis (16-22 °C), Xenopus borealis (19-23 °C) und Xenopus tropicalis (22-30 °C). Um zu untersuchen, ob sich die biochemischen Eigenschaften von Tubulin und die Dynamik der Mikrotubuli bei den drei Arten an die Temperatur angepasst hat, habe ich die Methoden der Tubulin-Affinitätsreinigung und die temperaturgesteuerte TIRF-Mikroskopie zur Rekonstitution der Mikrotubuli-Dynamik kombiniert. Dabei habe ich festgestellt, dass bei einer Temperatur von 25°C die Wachstumsgeschwindigkeit der Mikrotubuli im Bezug zur thermischen Nische der einzelnen Arten negativ korreliert. Die Verwendung der Arrhenius-Gleichung zum Vergleich der Aktivierungsenergie der Mikrotubuli-Polymerisation für jede Spezies ergab, dass die freie Energie des Tubulins umso höher ist, je kälter die thermische Nische der Spezies ist. Die Mikrotubuli von X. laevis und X. borealis zeigten eine längere Lebensdauer und wurden häufiger zerstört als die von X. tropicalis. Die Tubuline von X. laevis und X. borealis sind phosphoryliert, im Gegensatz zu X. tropicalis. Die Ergebnisse zeigen, dass sich Xenopus Tubulin und die Dynamik der Mikrotubuli an die Temperatur angepasst haben. Kalt lebende Arten kommen mit der niedrigeren Energie des Milieus zurecht, durch verbessertes Wachstum und Stabilität. / Eukaryotic cells hold a cytoskeleton, a cellular network of biopolymers. Among the filaments of the cytoskeleton, microtubules are widely conserved. Built from tubulin, those filaments are dynamic, alternating between phases of growth and shrinkage. The biochemical properties of tubulin shape the dynamic behavior of microtubules, which is crucial for many cellular processes. The precise mechanisms determining microtubule dynamic instability are still under investigation. The ubiquity of microtubules raises the question of how they can perform conserved functions within various thermal environments. To address this, I turned to closely related frog species living at different temperatures, Xenopus laevis (niche: 16-22°C), Xenopus borealis (19-23°C) and Xenopus tropicalis (22-30°C). To probe whether the biochemical properties of tubulin and microtubule dynamics adapted to temperature across those three species, I combined tubulin affinity purification and temperature-controlled TIRF microscopy of in vitro reconstitution of microtubule dynamics. I found that at 25°C, the microtubule growth velocity inversely correlates with the thermal niche of each species. Adjusting temperature to each species’ endogenous condition modulates the growth rate differences across species. Using the Arrhenius equation to compare the activation energy of microtubule polymerization for each species suggested that the colder the thermal niche of the species, the higher the free energy of its tubulin. Microtubules from the cold-adapted species X. laevis and X. borealis have longer lifetimes and rescue more often than those of X. tropicalis, both at 25°C and at each species’ endogenous condition. X. laevis and X. borealis tubulins are phosphorylated, contrary to X. tropicalis. My results show that Xenopus tubulin and microtubule dynamics have adapted to temperature. Cold-living species cope with the lower energy of the milieu by facilitating growth and stability.

Clustered Regularly Interspersed Palindromic Repeats (CRISPR) und ihre zugehörigen (Cas) Proteine sind eine Reihe neuer Werkzeuge, die eine beispiellose Kontrolle über genetisches Material ermöglichen. Die meisten CRISPR-Cas-Systeme verwenden ein kurzes RNA-Molekül, das in ihre Struktur eingebunden ist, um sie zu einer spezifischen, komplementären DNA-Sequenz zu führen. Nach Erkennung der Komplementarität wird die DNA dann gespalten. Aufgrund der einfachen Reprogrammierbarkeit der Guide-RNA und ihrer hohen Spezifität für die Ziel-DNA-Sequenz haben diese Systeme ein enormes Potenzial in Bereichen wie Medizin, Landwirtschaft, Biotechnologie und Krankheitsforschung sowie in anderen Bereichen gezeigt und die Aufmerksamkeit von Wissenschaft und Industrie auf sich gezogen. Das gründliche Verständnis dieser Systeme ist entscheidend für ihre sichere Anwendung, insbesondere wenn man die ethischen Implikationen in Betracht zieht. In dieser Arbeit wurden komplexe Einzelmolekülexperimente unter Verwendung mehrerer hochmoderner Methoden eingesetzt, um einige bisher ungelöste Fragen bezüglich der Target-Suche und -spaltung dieser CRISPR-Cas-Systeme zu beantworten. • Direkte Beobachtung und Quantifizierung der Target-Suche durch den CRISPR-Cas-Überwachungskomplex Cascade Der Typ I-E CRISPR-Cas-Komplex Cascade ist ein Multiprotein-Komplex ohne inhärente Nukleaseaktivität, der doppelsträngige DNA bindet, indem er zuerst eine kurze Sequenz von zwei Nukleotiden namens Protospacer Adjacent Motif (PAM) erkennt und dann eine sogenannte R-Loop-Struktur mit dem benachbarten komplementären DNA-Strang bildet. Während der Prozess der R-Loop-Bildung vielfach untersucht wurde, bleibt der Mechanismus, wie Cascade bei potenziell sehr langen DNA-Sequenzen überhaupt zur richtigen Stelle gelangt unklar. Um Licht in diesen Prozess zu bringen, wurde ein kombiniertes Magnetpinzetten- und Fluoreszenzmikroskopie-Experiment etabliert, das die gleichzeitige Erfassung von DNA-Bindung und R-Loop-Bildung ermöglicht. Diese Experimente zeigten, dass Cascade für die Target-Suche einen Mechanismus namens Facilitated Diffusion verwendet. Dies bedeutet, dass Cascade nach einem dreidimensional Diffusionsprozess an einer zufälligen Stelle an DNA bindet und dann mit einem eindimensionalen Scannen um die Bindungsstelle beginnt. Wenn kein Target gefunden wird, wird der Prozess wiederholt. Bei einer nichterfolgreichen Suche dauert das eindimensionale Scannen etwa 150 ms und erstreckt sich über mehrere hundert potenzielle Targets. Das Verdrehen der DNA und damit das Anlegen von Supercoiling erleichtert oder behindert die R-Schleifen-Bildung, je nach Dreh-Richtung, und beeinflusst damit indirekt die Dauer der Suche. Die Experimente zeigten weiterhin, dass auch die Effizienz der Target-Suche, d.h. die Wahrscheinlichkeit, das richtige Ziel zu finden, sobald das eindimensionale Scannen begonnen hat, stark vom Supercoiling abhängt. Während Wahrscheinlichkeiten von über 40 % für negatives Supercoiling gefunden wurden, d.h. mit erleichterter R-Loop-Bildung, betrug sie in Abwesenheit von Supercoiling nur 5 %. • Entwicklung eines kinetischen Modells für den Such- und Erkennungsprozess für den CRISPR-Cas-Überwachungskomplex Cascade Als nächstes wurde ein kinetisches Modell entwickelt, das die Target-Suche als Random Walk auf DNA beschreibt, während dem sich der Cascade-Komplex von PAM zu PAM bewegt und die benachbarten Stellen auf Komplementarität prüft. Dieses Modell ermöglichte nicht nur Vorhersagen von Suchparametern wie Sucheffizienz und -dauer, sondern ermöglichte auch eine genaue Beschreibung der Erkennungswahrscheinlichkeiten, sobald das richtige PAM gefunden wurde. Es konnte herausgefunden werden, dass die Wahrscheinlichkeit, bei der Begegnung mit dem richtigen Ziel erfolgreich einen R-Loop zu bilden, gering ist, höchstwahrscheinlich um einen zu langen Aufenthalt an nur teilweise komplementären und damit falschen Targets zu verhindern. Das Modell sagt jedoch voraus, dass eine Stelle während eines eindimensionalen Scans bis zu 15 Mal besucht wird, um die geringe Erkennungswahrscheinlichkeit auszugleichen. Es wurde somit gezeigt, dass Target-Suche und -Erkennung in einem ausgefeilten Prozess eng miteinander verbunden sind, der die Zeit an falschen Targets minimiert aber dennoch eine schnelle Erkennung des richtigen Targets ermöglicht. • Untersuchung der Stabilität von CRISPR-Cas9 nach der Spaltung CRISPR-Cas9 ist ein einzelnes Protein, das doppelsträngige DNA in einem durch RNA gesteuerten Prozess ähnlich dem von Cascade anvisiert und bindet. Cas9 hat jedoch eine inhärente Nukleaseaktivität und spaltet die DNA nach der R-Loop-Bildung selbst. Dafür hat es zwei Nuklease-Domänen, die jeweils einen Strang der DNA spalten. Cas9 ist das derzeit am weitesten verbreitete Tool für Anwendungen in der Genomeditierung. Eine Erkenntnis, an dessen Erklärung weiterhin geforscht wird, ist, dass Cas9 auch nach der Spaltung für Stunden an sein DNA-Target gebunden bleibt, was es zu einem de-facto Single-Turnover-Enzym macht. Biologisch gesehen ist dies erstaunlich, da CRISPR-Cas-Systeme in einem engen Wettbewerb gegen ihre viralen Gegner stehen. Aus Anwendungssicht verbirgt und behindert Cas9 durch das lange Binden die zu bearbeitende DNA-Stelle vor den Reparatursystemen der Zellen. Für ein effizientes Gensystem ist es entscheidend, Möglichkeiten zu entwickeln, Cas9 kontrolliert von seinem Ziel zu entfernen. Dafür ist ein detailliertes Verständnis des Verhaltens von Cas9 nach der Reaktion erforderlich. Bisher wurde angenommen, dass Cas9 in eine einzelne, stabile post-Spaltungskonformation eintritt, deren Stabilität, insbesondere unter Einfluss von Torsion und Kraft, wie sie in der Zelle oft auftreten nicht gut untersucht ist. Unter Verwendung eines hochparallelen Magnetpinzetten-Experiments, das die gleichzeitige Beobachtung von bis zu Hunderten von DNA-Molekülen ermöglicht, wurde gezeigt, dass die post-Spaltungsstabilität von Cas9 und seinen mutierten Nickase-Varianten viel komplexer ist: Wenn der Non-Target- Strang (der Strang, der nicht an der R-Loop-Bildung beteiligt ist) gespalten wird, wie es bei Wildtyp-Cas9 und seiner Non-Target-Strang spaltenden Nickase-Variante der Fall ist, wird der gespaltene Non-Target-Strang über eine Drehbewegung um den anderen Strang herum unter Reibung freigesetzt. Auf diese Weise können diese Varianten hohe Torsionsspannungen aushalten und bleiben für Stunden an ihrem Ziel gebunden, was nachfolgende Zellreparaturmechanismen behindert. Für die Nickase-Variante, die nur den Target-Strang spaltet, kann der Non-Target-Strang bei ausreichend hohem Supercoiling-Niveau, wie es zum Beispiel während der Transkription in Zellen häufig vorkommt, nicht freigesetzt werden. Stattdessen kollabiert bei ausreichend hohen Supercoiling-Niveaus der R-Loop und die Cas9-Nickase dissoziiert von der DNA. Für diese Cas9-Variante deckten die Experimente mehrere verschiedene Stabilitätszustände mit Kollapszeiten von einigen Minuten bis hin zu Stunden auf. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es nach der Spaltung hohe konformationelle Flexibilität mit komplexen Dynamiken zwischen verschiedenen Stabilitätszuständen gibt.:Table of Contents 1 Introduction 1 1.1 How to fight off viruses: CRISPR and the adaptive immune system of prokaryotes 1 1.2 How to edit the genome: Strategies, applications and obstacles 6 1.3 The needle in the haystack: Search, recognition, and cleavage of specific DNA sequences 11 1.4 The influence of torque on the interaction of CRISPR-Cas systems with DNA 21 1.5 How to model target search and recognition 25 2 Methods 33 2.1 Magnetic Tweezers 33 2.2 Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy 41 2.3 Combined Magnetic Tweezers and TIRF Measurements 44 3 Objectives and Outline 47 4 Dynamic interplay between target search and recognition for a Type I CRISPR-Cas system 49 4.1 Summary 49 4.2 Associated publication 51 4.3 Supplementary Information 66 5 Probing the stability of the SpCas9-DNA complex after cleavage 93 5.1 Summary 93 5.2 Associated publication 95 5.3 Supplementary Information 107 6 Correlated Single-Molecule Magnetic Tweezers and Fluorescence Measurements of DNA-Enzyme Interactions 115 6.1 Summary 115 6.2 Associated publication 116 7 Conclusion and Outlook 147 Bibliography 151 List of Figures 171 Selbstständigkeitserklärung 175 Author Contributions 177 Acknowledgements 179 / Clustered Regularly Interspersed Palindromic Repeats (CRISPR) and their associated (Cas) proteins are new tools that allow unprecedented control over genetic material. Most CRISPR-Cas systems use a short RNA molecule incorporated into their structure to guide them to a specific, complementary sequence of DNA. Upon recognition of the complementarity, the DNA is then cleaved. Given the simple re-programmability of the guide RNA and high specificity for the targeted DNA sequence, these systems have shown immense potential in fields such as medicine, agriculture, biotechnology, and disease research, among others, and have attracted the attention of academia and industry. A thorough understanding of these systems on different scales is paramount to their safe usage, especially considering the ethical implications. In this work, complex single-molecule experiments combining several state-of-the-art methods were employed to shed light on some unresolved questions regarding target search and cleavage of these CRISPR-Cas systems. • Direct observation and quantification of the target search by the CRISPR-Cas surveillance complex Cascade The Type I-E CRISPR-Cas complex Cascade is a multi-protein complex without inherent nuclease activity that targets and binds double-stranded DNA by first detecting a short two-nucleotide long sequence called Protospacer Adjacent Motif (PAM) and then forming a so-called R-loop structure with the adjacent complementary DNA strand. While the process of R-loop formation has been studied extensively, the mechanism of how Cascade gets to the correct site in the first place - on potentially vast DNA sequences - remains unclear. To shed light on this process, a combined magnetic tweezers and fluorescence microscopy assay was established that allowed the simultaneous detection of DNA binding and R-loop formation. These experiments showed that Cascade employs a facilitated diffusion mechanism for target search. After a three-dimensional diffusion process, it randomly binds DNA and proceeds to one-dimensional scanning around the binding site. If no target is found, the process is repeated. If no target can be found, the one-dimensional scanning lasts approximately 150ms and spans several hundred potential targets. Twisting the DNA facilitates or hinders R-loop formation depending on the direction and thereby indirectly affects the duration. The experiments further showed that the efficiency of the target search, i.e., the probability of finding the correct target once a one-dimensional scanning event has started, also depends greatly on the level of supercoiling. While probabilities higher than 40% were found for negative supercoiling levels, i.e., with facilitated R-loop formation, it was as low as 5% in the absence of supercoiling. • Establishment of a kinetic model for the target search and recognition process employed by the CRISPR-Cas surveillance complex Cascade Next, a kinetic model was developed, which described the target search as a random walk on DNA, during which the Cascade complex scans individual PAMs for adjacent targets. This model enabled predictions of target search parameters, such as search efficiency and duration, and also allowed the accurate description of target recognition probabilities once the correct PAM had been found under varying supercoiling levels. We found that upon encountering the correct target, the probability of successfully forming an R-loop is low, preventing stalling at only partially complementary sequences. However, our model predicts that the target site is revisited up to 15 times during one scanning process to compensate for the low recognition probability. It was thus shown that target search and recognition are tightly linked in a delicate process, minimizing time at off-targets while nonetheless enabling fast recognition. • Probing the stability of CRISPR-Cas9 after cleavage CRISPR-Cas9 is a single protein that targets and binds double-stranded DNA in an RNA-guided process similar to Cascade. In contrast to Cascade, Cas9 has inherent nuclease activity and cleaves the DNA upon R-loop formation. More specifically, Cas9 has two nuclease domains that each cleave one strand of the DNA. It is the currently most widely used tool for applications in genome editing. One finding that continues to puzzle researchers is that Cas9 stays bound to its DNA target for durations in the order of hours even after cleavage, making it a de facto single-turnover enzyme. From a biological standpoint, this is puzzling because CRISPR-Cas systems are in a tight arms race against their viral adversaries. From an application viewpoint, Cas9 conceals and obstructs the to-be-edited DNA site from the cells’ repair systems. For an efficient gene editing system, it is crucial to develop ways of removing Cas9 from its target in a controlled manner. For this, a detailed understanding of the post-reaction behavior of Cas9 is required. So far, Cas9 was believed to enter a single, stable post-cleavage conformation, the stability of which was not well understood, especially under the influence of force and twist. Employing a highly parallel magnetic tweezers experiment, allowing the simultaneous observation of up to hundreds of DNA molecules, the post-cleavage stability of Cas9 and its mutated nickase variants was shown to be much more complex: If the non-target strand (the strand not involved in the R-loop) is cleaved, as is the case for wild-type Cas9 and its non-target strand cleaving nickase variant, the cleaved non-target strand is released via a swiveling motion under friction. This way, these variants can release high torsional stress and stay bound to their target for hours, hindering subsequent cell repair machinery. The non-target strand cannot be released upon torsional stress for the nickase variant that only cleaves the target strand. Instead, if the supercoiling levels are high enough, as often applied in cells, for example during transcription, the R-loop collapses, and the Cas9 nickase dissociates from the DNA. We found several different stability states with collapse times of a few minutes up to hours. These results suggest high conformational flexibility after cleavage with complex dynamics between different stability states.:Table of Contents 1 Introduction 1 1.1 How to fight off viruses: CRISPR and the adaptive immune system of prokaryotes 1 1.2 How to edit the genome: Strategies, applications and obstacles 6 1.3 The needle in the haystack: Search, recognition, and cleavage of specific DNA sequences 11 1.4 The influence of torque on the interaction of CRISPR-Cas systems with DNA 21 1.5 How to model target search and recognition 25 2 Methods 33 2.1 Magnetic Tweezers 33 2.2 Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy 41 2.3 Combined Magnetic Tweezers and TIRF Measurements 44 3 Objectives and Outline 47 4 Dynamic interplay between target search and recognition for a Type I CRISPR-Cas system 49 4.1 Summary 49 4.2 Associated publication 51 4.3 Supplementary Information 66 5 Probing the stability of the SpCas9-DNA complex after cleavage 93 5.1 Summary 93 5.2 Associated publication 95 5.3 Supplementary Information 107 6 Correlated Single-Molecule Magnetic Tweezers and Fluorescence Measurements of DNA-Enzyme Interactions 115 6.1 Summary 115 6.2 Associated publication 116 7 Conclusion and Outlook 147 Bibliography 151 List of Figures 171 Selbstständigkeitserklärung 175 Author Contributions 177 Acknowledgements 179

Der zerstörungsfreien Charakterisierung und Analyse von lebenden humanen Zellen über längere Zeiträume kommt zukünftig in Medizin und Biotechnologie eine zentrale Rolle zu. Für eine therapeutische Nutzung müssen die Zellen nach der Analyse unverändert und vital vorliegen. Ein Ansatz beruht auf der Analyse von nanoskopischen Zellrückständen, die von Zellen während der Migration hinterlassen werden, den Zellspuren. Diese spiegeln in repräsentativer Weise die Merkmale der Erzeugerzelle wider. Für die technische Nutzung muss der Entstehungsprozess reproduzierbar kontrolliert werden können. Im Zusammenhang wurde ein Versuchsaufbau zur Beobachtung der dynamischen Prozesse Adhäsion, Migration und substratnahe Organisation des Zytoskeletts von lebenden Zellen entwicklet, der hochauflösende Langzeitbeobachtungen mittels Totaler Interner Reflexions Fluoreszenz (TIRF-) Mikroskopie ermöglicht. Zur Auswertung wurde eine auf Falschfarben beruhende Darstellungsweise der dynamischen Prozesse entwickelt. Es konnte eine Korrelation der Eigenschaften der Zellspuren mit dem Adhäsions- und Migrationsverhalten, sowie dem Aufbau der substratnahen Bereiche des Zytoskeletts der Erzeugerzellen nachgewiesen werden. Ebenso wurde der Einfluss der oberflächenspezifischen Substrateigenschaften (Beschichtung oder topografische Strukturierung) auf die Zellspurablage gezeigt. / Nondestructive characterisation and analysis of human living cells over a long period will be an important issue for medicin and biotechnology in the near future. In order to use the cells after analysis for therapeutical applications, the cells have to be unmodified and still alive after the analytical procedure. The analysis of nanoscopic cell residues, called cell traces, which are left behind during cell migration represent an appropriate approach. Attributes of the donor cell are shown by the cell trace characteristically. In order to use cell traces for biotechnological applications the formation and deposition of cell traces has to be repeatable. Thus, an experimental set up using Total Internal Fluorescence Microscopy (TIRF) has been established to observe the dynamic processes of cell adhesion, cell migration and the organisation of the cytoskeleton used therein. Using miscolours a new embodiment has been developed to evaluate dynamic processes. Cell adhesion, cell migration and the organisation of the actin cytoskeleton of the donor cells have been found to influence the attributes of cell traces. Further specific modified surfaces have been used to influence the deposition of cell traces. Effects have been shown for coated surfaces or surfaces with a topographic structure.

Ubiquitin (Ub) wird meist in Kettenform an Lysine von anderen Proteinen gekoppelt und bestimmt somit, ob das Substrat beispielsweise vom Proteasom abgebaut oder an der Reparatur des Erbguts beteiligt wird. Die Regulierung dieses Signals ist entscheidend für die zelluläre Homöostase, Fehler führen zu Krankheiten wie Parkinson und Krebs. Die wohl wichtigsten Regulatoren sind deubiquitinierende Enzyme (DUBs). Ein tiefes Verständnis über deren enzymatischen Mechanismus ist daher unerlässlich für die Entwicklung von therapeutischen Ansätzen. Biochemische Methoden ermöglichten bisher grundlegende Erkenntnisse darüber, wie DUBs Ubiquitinketten prozessieren. Allerdings werden dabei viele überlappende Reaktionen analysiert, wodurch viele relevante Details schwer oder gar nicht erkennbar sind. Diese Arbeit bietet durch die Etablierung einer Einzelmolekül-Mikroskopie-Methode eine neue Perspektive auf die Interaktion zwischen DUBs und Ubiquitinketten. Dafür wurden Messkammern mit Ubiquitinketten bestückt. Verschiedene DUBs und die Ubiquitinketten wurden mit Fluorophoren markiert und mit Hilfe von interner Totalreflexions-Fluoreszenz-Mikroskopie analysiert. Am Beispiel des DUBs USP5 konnten dadurch erstmals die Bindung sowie das darauffolgende Schneiden einer Ubiquitinkette direkt und in Echtzeit beobachtet werden. Anschließende Auswertungen gewährten neue Einblicke in die Unterschiede zwischen produktiven und unproduktiven Bindungen und auch auf das heterogene Bindungsverhalten von USP5 vor dem Schneiden der Kette. Mit Anpassungen am Versuchsaufbau konnten am Beispiel von USP2 und drei verschiedenen Ubiquitinketten diverse kinetische Parameter bestimmt werden. Diese Ergebnisse unterstützen ein bestehendes Modell, nach dem USP2 nach der Bindung eine Konformationsänderung durchlaufen muss, um Ubiquitinketten zu schneiden. Zusätzlich weisen die Messungen darauf hin, dass diese Konformationsänderung der entscheidende Faktor für die Substratspezifität von USP2 ist. / Ubiquitin (Ub) is a post-translational modification attached to substrate proteins, often in the form of Ub chains. Depending on the length and linkage type of those chains the substrates can, for example, be targeted for proteasomal degradation or initiate DNA repair mechanisms. Regulation of this signal is crucial for cellular homeostasis and errors cause diseases like Parkinson´s or cancer. The main regulators are deubiquitinating enzymes (DUBs) which cleave Ub chains. Deeply understanding their enzymatic mechanism is necessary for the development of medical intervention strategies. Biochemical methods have enabled a fundamental understanding about Ub cleavage. However, this results from population measurements, where individual mechanistic details are hard or impossible to be determined. By establishing a single-molecule microscopy method, the work in hand offers a new perspective on the enzymatic reactions between DUBs and Ub chains. Here, self-made imaging chambers were decorated with Ub chains. These Ub chains and a selection of DUBs were labelled with fluorescent dyes and analysed by total internal reflection fluorescence microscopy in real-time. Using USP5, this set-up enabled a DUB-Ub chain interaction with subsequent cleavage reaction to be directly observed for the first time. In-depth analyses revealed several insights into the enzymatic mechanism, including a clear difference between productive and unproductive binding events, as well as two populations of USP5 with different binding times before Ub chain cleavage. By adapting the experimental set-up, several kinetic parameters were determined on the example of USP2 and three differently linked Ub chains. These measurements provided evidence for a published model proposing that USP2 must undergo a conformational change after Ub chain binding to enable processing. The analyses further indicated this conformational change to be the crucial factor for USP2 substrate specificity.

Upregulation of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is a well-documented response to chronic nicotine exposure. Nicotinic acetylcholine receptors are pentameric ligand-gated ion channels consisting of alpha (α2-10) and beta (β2-4) subunits. Nicotine, an agonist of nAChRs, alters trafficking and assembly of some subtypes of nAChRs, leading to an increase in expression of high sensitivity receptors on the plasma membrane. These physiological changes in nAChRs are believed to contribute to nicotine addiction, although the mechanism of these processes has not been resolved. Recently, many studies have converged on the idea that nicotine induces upregulation by an intracellular mechanism. In this dissertation, expression levels of nAChRs were quantified upon exposure to nicotine and its primary metabolite, cotinine. A pH sensitive variant of GFP, super ecliptic pHluorin (SEP), was integrated with a nAChR subunit to study expression and trafficking of nAChRs by differentiating intracellular and plasma membrane inserted receptors. In this work, cotinine is shown to increase the number of α4β2 nAChRs within a cell. Cotinine also affects trafficking of α4β2, evident by a redistribution of intracellular receptors and an increase in single vesicle insertion events on the plasma membrane. This work shows both nicotine and cotinine alter the overall assembly of α4β2 to favor the high sensitivity (α4)2(β2)3 version. Since cotinine and nicotine induce similar physiological changes in nAChRs, the metabolite potentially plays a role in the mechanism of nicotine addiction. Although an intracellular mechanism for upregulation has been supported, a shift in assembly to the high sensitivity (α4)2(β2)3 version exclusively in the endoplasmic reticulum has not previously been detected. In order to study organelle specific changes in stoichiometry, a novel method was developed to isolate single nAChRs in nanovesicles derived from native cell membranes. Separation of nanovesicles originating from the endoplasmic reticulum and plasma membrane, encompassing isolated nAChRs, allows precise changes in stoichiometry to be monitored in subcellular regions. In this work, single molecule bleaching steps of green fluorescent protein (GFP) encoded in each alpha subunit of the pentamer are detected. The number of bleaching steps, or transitions to a nonfluorescent state upon continuous excitation, corresponds to the number of GFP-labeled alpha subunits present. Therefore, the stoichiometry can be deduced by detection of two bleaching steps, as in (α4)2(β2)3, or three bleaching steps, seen in (α4)3(β2)2. Using this method on isolated nAChRs, a shift to assembly of high sensitivity (α4)2(β2)3 receptors is detected definitively within the endoplasmic reticulum. In addition, an increase in (α4)2(β2)3 receptors located on the plasma membrane is shown when nicotine is present. This work provides convincing evidence that nicotine acts intracellularly, within the endoplasmic reticulum, to alter stoichiometry of nAChRs.