The Rho family of guanosine triphosphatases (GTPases) function as binary molecular switches, which play an important role in the regulation of actin cytoskeleton rearrangement and are involved in several critical cellular processes including cell adhesion, division and migration. Rho GTPases are specifically activated by their associated guanine nucleotide exchange factors (RhoGEFs). Dysregulation of RhoGEFs function through mutation or overexpression has been implicated in oncogenic transformation of cells and linked to several kinds of invasive and metastatic forms of cancer. T-cell lymphoma invasion and metastasis 1 (Tiam1) is a multi-domain Dbl family GEF protein and specifically activates Rho GTPase Rac1 through the catalytic Dbl homology and Pleckstrin homology (DH-PH) bi-domain. Previous works have shown that the nucleotide exchange function of the full-length Tiam1 is auto-inhibited and can be activated by N-terminal truncation, phosphorylation and protein-protein interactions. However, the molecular mechanisms of Tiam1 GEF auto-inhibition and activation have not yet been determined. In this study, the N-terminal PH-CC-Ex domain of Tiam1 is shown to directly inhibit the GEF function of the catalytic DH-PH domain in vitro. Using fluorescencebased kinetics experiments, we demonstrate that the auto-inhibition of Tiam1 GEF function occurs by a competitive inhibition model. In this model, the maximum velocity of catalytic activity remains unchanged, but the Michaelis-Menten constant of the auto-inhibited Tiam1 (the PH-PH fragment) on the substrate Rac1 is increased compared to the activated Tiam1 (the catalytic DH-PH domain alone). Through small angle X-ray scattering (SAXS), the structure of auto-inhibited Tiam1 (the PH-PH fragment) is shown to form a closed conformation in which the catalytic DH-PH domain is blocked by the N-terminal PH-CC-Ex domain. Taken together, these findings demonstrate the molecular mechanism of Tiam1 GEF autoinhibition in which the PH-CC-Ex domain of Tiam1 inhibits its GEF function by preventing the substrate Rho GTPase Rac1 from accessing the catalytic DH-PH bi-domain.

Cystic Fibrosis (CF) is an autosomal recessive genetic disease that leads to severe malfunction in many organs, but particularly the lungs. The primary cause of this malfunction is the decrease of the airway surface liquid layer on the lung epithelium. The lack of hydration leads to mucus build up on the epithelial lining, leading to blockage of airways. The underlying cause of CF is the dysfunction of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), which results from mutations in the protein. Almost 90% of CF patients are caused by the deletion of the phenylalanine at position 508 of CFTR, which is believed to affect the folding and stability of CFTR. The misfolded ΔF508-CFTR undergoes ER associated degradation (ERAD), causing the failure of ΔF508-CFTR trafficking to the cell surface. Small molecule correctors yield moderate improvements in the trafficking of ΔF508-CFTR to the plasma membrane. It is currently not known if correctors increase trafficking through improved cargo loading of transport vesicles or through direct binding to CFTR. In this dissertation, real-time measurements of trafficking were utilized to identify the mechanistic details of chemical, biochemical, and thermal factors that impact CFTR correction, using the corrector molecule VX-809, a secondary mutation (I539T), and low temperature conditions. Each individually improved trafficking of ΔF508-CFTR to approximately 10% of wild-type levels. The combination of VX-809 with either low temperature or the I539T mutation increased the amount of CFTR on the plasma membrane to nearly 40%, indicating synergistic activity. The number of vesicles reaching the surface was significantly altered; however the amount of channel in each vesicle remained the same. Therefore, a 2 step therapeutic approach might be an ideal treatment for CF. The first step would be composed of a compound that mimics the mechanism of stabilization provided by low temperature or the I539T mutation, while the second step would be VX-809 or a similar corrector compound. These studies suggest that understanding how low temperature and second site suppressors alter ΔF508-CFTR could be key to the development of future therapeutics for the effective treatment of CF. The precise pathophysiology of cystic fibrosis is not well studied. The involvement of another transport protein, epithelial sodium channel (ENaC), makes the situation more complicated. ENaC and CFTR are colocalized on the apical surface of epithelia cells. With our fluorescence microscopy techniques, we explored the effects of CFTR on the residence time of ENaC on the cell membrane. A reliable approach measuring the half-life of protein on the cell membrane is required for this study. We present a new approach to quantify the half-life of membrane proteins on the cell surface, through tagging the protein with the photoconvertible fluorescent protein, Dendra2. Total internal reflection fluorescence microscopy (TIRF) is applied to limit visualization of fluorescence to proteins located on the plasma membrane. Photoconversion of Dendra2 works as a pulse chase experiment by monitoring only the population of protein that has been photoconverted. As the protein is endocytosed the red emission decreases due to the protein leaving the TIRF field of view. The half-life of the protein on the plasma membrane was calculated upon imaging over time and quantifying the change in red fluorescence. Our method provides a unique opportunity to observe real-time protein turnover at the single cell level without addition of protein synthesis inhibitors. This technique will be valuable for the future protein half-life study.

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Single-stranded DNA binding proteins (SSB) bind to single-stranded DNA (ssDNA) that is generated by molecular machines such as helicases and polymerases. SSBs play crucial roles in DNA translation, replication and repair and their importance is demonstrated by their inclusion across all domains of life. The homotetrameric E. coli SSB and the heterotrimeric human RPA demonstrate how SSBs can vary structurally, but all fulfil their roles by employing oligonucleotide/oligosaccharide binding (OB) folds. Nucleofilaments of SSB proteins bound to ssDNA sequester the ssDNA strands, and in doing so protect exposed bases, keep the ssDNA in conformations favoured by other proteins that metabolise DNA and also recruit other proteins to bind to ssDNA. This thesis focuses on the SSB from the archaeon S. solfataricus (SsoSSB), and has found SsoSSB to be a monomer that binds cooperatively to ssDNA with a binding site size of 4-5 nucleotides. Tagging ssDNA and SsoSSB with fluorescent labels allowed the real time observation of single molecule interactions during the initial nucleation event and subsequent binding of an adjacent SsoSSB monomer. This was achieved by interpreting fluorescent traces that have recorded combinations of FRET, protein induced fluorescent enhancement (PIFE) and quenching events. This novel analysis gave precise measurements of the dynamics of the first and second monomers binding to ssDNA, which allowed affinity and cooperativity constants to be quantified for this important molecular process. SsoSSB was also found to have a similar affinity for RNA, demonstrating a promiscuity not found in other SSBs and suggesting further roles for SsoSSB in the cell - possibly exploiting its capacity to protect nucleic acids from degradation. The extreme temperatures that S. solfataricus experiences and the strength of the interaction with ssDNA and RNA make exploring the application of SsoSSB for industrial uses an interesting prospect; and its rare monomeric structure provides an opportunity to investigate the action of OB folds in a more isolated environment than in higher order structures.

La membrane plasmique de la cellule est composée de lipides et interagit notamment avec le squelette de la cellule (le cytosquelette), par l'intermédiaire de protéines d'ancrages et de lipides clefs qui jouent un rôle spécifique dans certains types d'interactions. Parmi les protéines intervenant dans l'ancrage direct de la membrane plasmique au cytosquelette, des protéines de la famille des ERM (Ezrine, Radixine, Moésine) peuvent interagir spécifiquement avec un lipide, le phosphatidylinositol (4,5) biphosphate (PIP2), d'une part et avec l'actine du cytosquelette d'autre part. Dans le but de comprendre les interactions entre membrane plasmique et cytosquelette, nous avons réalisé des expériences in vitro sur des systèmes comportant un nombre minimal de constituants : des vésicules géantes (GUV) contenant du PIP2, de l'ezrine recombinante et de l'actine purifiée. Nous avons mis en évidence que la liaison au PIP2 induit des changements conformationnels de l'ezrine. L'ezrine est alors capable d'interagir avec les filaments d'actine. Nous avons caractérisé quantitativement l'incorporation de PIP2 dans la membrane de vésicule géantes, et montré que l'interaction de l'ezrine avec les vésicule géante contenant du PIP2, induit un partitionnement du lipide dans la bicouche lipidique et conduit à la formation d'agrégats de PIP2 et d'ezrine sur la membrane. La connaissance des effets de l'ezrine sur les membranes contenant du PIP2 et la connaissance des différents mécanismes se produisant lors des interactions permettra de définir plus précisément le rôle de l'ezrine in cellulo.

Caveolae sind charakteristische Plasmamembraneinstülpungen, die in vielen Zelltypen vorkommen und deren biologische Funktion umstritten ist. Ihre besondere Form und ihre Häu gkeit in Zellen, die stets mechanischen Belastungen ausgesetzt sind, führten zu der Annahme, dass Caveolae die Plasmamembran vor mechanischen Belastungen schützen und als Membranreservoir dienen. Dies sollte mit dieser Dissertation experimentell geprüft werden. Zunächst wurde der Ein uss der Caveolae auf die Membranspannung von Zellen im Normalzustand untersucht. Dann wurden die Zellen mechanisch belastet. Mit Fluoreszensmikroskopie wurde das Verschwinden von Caveolae nach Strecken der Zellen oder nach einem hypo-osmotischen Schock beobachtet. Messungen der Membranspannung vor und unmittelbar nach dem hypo-osmotischem Schock zeigten, dass Caveolae einen Anstieg der Membranspannung verhindern, unabhängig von ATP und dem Cytoskelett. Die Erzeugung von Membranvesikel mit Caveolae erlaubte es, diesen Effekt der Caveolae in einem vereinfachten Membransystem zu beobachten. Schliesslich wurden Muskelzellen untersucht. Zellen, die genetisch bedingt weniger Caveolae haben und mit Muskelschwundkrankheiten in Verbingung stehen, waren mechanisch weniger belastbar als gesunde Zellen. Zusammenfassend wird mit dieser Dissertation die These bestärkt, dass Caveolae einem Anstieg der Membranspannungen entgegenwirken. Dass dies in Zellen und in Vesikeln unabhängig von Energie und Cytoskelett geschieht, lässt auf einen passiven, mechanisch getriebenen Prozess schliessen. Diese Erkenntnis trägt zum Verständnis der Rolle von Caveolae in Zellen bei und kann dem besseren Verständnis von Krankheiten bedingt durch Caveolin-Mutationen, wie z.B. Muskelschwundkrankheiten, dienen. / Caveolae, the characteristic plasma membrane invaginations present in many cells, have been associated with numerous functions that still remain debated. Taking into account the particular abundance of caveolae in cells experiencing mechanical stress, it was proposed that caveolae constitute a membrane reservoir and bu er the membrane tension upon mechanical stress. The present work aimed to check this proposition experimentally. First, the in uence of caveolae on the membrane tension was studied on mouse lung endothelial cells in resting conditions using tether extraction with optically trapped beads. Second, experiments on cells upon acute mechanical stress showed that caveolae serve as a membrane reservoir bu ering surges in membrane tension in their immediate, ATP- and cytoskeleton-independent attening and disassembly. Third, caveolae incorporated in membrane vesicles also showed the tension bu ering. Finally, in a physiologically more relevant case, human muscle cells were studied, and it was shown that mutations with impaired caveolae which are described in muscular dystrophies render muscle cells less resistant to mechanical stress. In Summary the present work provides experimental evidence for the hypothesis that caveolae bu er the membrane tension upon mechanical stress. The fact that this was observed in cells and membrane vesicles in an ATP and cytoskeleton independent manner reveals a passive, mechanically driven process. This could be a leap forward in the comprehension of the role of caveolae in the cell, and in the understanding of genetic diseases like muscular dystrophies. / Cavéoles sont des invaginations caractéristiques de la membrane plas- mique présents dans beaucoup de types cellulaires. Ils sont liées à plusieurs fonctions cellulaires, ce qui sont encore débattues. Prenant compte de l importance des cavéoles dans les cellules soumises au stress mécanique, les cavéoles sont proposées de constituer un réservoir membranaire et de tamponner la tension membranaire pendant des stresses mécaniques. Cette étude a eu le but de tester cette hypothèse expérimentalement. En premier, l in uence des cavéoles sur la tension membranaire au repos a été étudiée sur des cellules endothéliales du poumon de la souris. Puis, on a montré que les cavéoles tamponnent l augmentation de la tension membranaire après l application d un stress mécanique. En suite, la réalisation des vésicules membranaires contenant des cavéoles a permit de montrer leur rôle comme réservoir membranaire dans un système simpli é. Finalement, dans un contexte physiologiquement plus relevant, l étude des cellules musculaires a montrée que les mutations du cavéolin associées aux dystrophies musculaires rendent les cellules moins résistante aux stresses mécaniques. En conclusion, cette étude supporte l\'hypothèse que les cavéoles tamponnent la tension membranaire pendant des stresses mécaniques. Le fait que cela se passe dans les cellules et les vésicules indépendamment d ATP et du cytosquelette révèlent un processus passif et mécanique. Cela pourrait servir à une meilleure compréhension du rôle des cavéoles dans la cellule et les maladies génétiques comme les dystrophies musculaires.

AtMAP65-4 est une protéine associée aux microtubules appartenant à la famille des AtMAP65s qui compte 9 membres identifiés chez Arabidopsis thaliana. Ces protéines appartiennent à une famille conservée au cours de l'évolution, les MAP65s. Ainsi, des protéines homologues sont présentes chez de mammifères (PRC1), chez la levure (Ase1p) ou chez la drosophile (FEO). Jusqu'ici l'étude des propriétés moléculaires et fonctionnelles des AtMAP65s s'est portée essentiellement sur l'étude d'AtMAP65-1 et AtMAP65-5. La principale caractéristique de ces protéines est d'induire la formation de faisceaux de microtubules in vitro. La distribution des AtMAP65s in vivo est très régulée, celle-ci sont localisées avec des réseaux des microtubules bien définis. Ainsi, leur rôle supposé est de mettre en place ces réseaux puis de participer à leur maintient. La localisation d'AtMAP65-4 apparait comme très intéressante car elle est strictement associée avec les microtubules du fuseau mitotique. D'après les résultats obtenus au cours de ce travail, nous avons suggéré que la fonction in vivo d'AtMAP65-4 est de participer à la mise en place et au maintient des microtubules en faisceaux dans les fibres kinétochoriennes lors de la division cellulaire. Lors d'une étude in vitro nous avons montré qu'AtMAP65-4 modifie les paramètres dynamiques de polymérisation des microtubules. Outre sa capacité à former des faisceaux, AtMAP65-4 permet une croissance régulière des microtubules au sein des faisceaux qu'elle induit. Le mécanisme d'action de la MAP à l'échelle moléculaire a été analysé à travers une étude bioinformatique où nous avons modélisé l'activité d'AtMAP65-4. Les données obtenues montrent qu'AtMAP65-4 peut bloquer les évènements de dépolymérisation des microtubules. Par ailleurs, l'activité d'AtMAP65-4 pourrait être régulée in vivo par des modifications post traductionnelles. En effet, nous avons montré et étudié l'effet de la phosphorylation d'AtMAP65-4 par les kinases Auroras. Cette phosphorylation pourrait être impliquée dans la régulation de l'activité d'AtMAP65-4 au cours de la mitose.

Le suivi des interactions entre protéines, localisées à la membrane plasmique ou à l'intérieur de cellules, a été réalisé au cours de cette thèse par imagerie de fluorescence et par l'analyse de processus dits de FRET (Forster Resonance Energy Transfer). Pour quantifier le FRET entre nos protéines d'intérêt, nous avons choisi le contraste de durée de vie de fluorescence car cette méthode est indépendante de la concentration et de l'intensité de fluorescence. Afin d'obtenir une résolution suffisante pour des problématiques neurobiologiques, un microscope TIRFLIM (Total Internal Reflection Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) avait préalablement été développé. Celui-ci nous permet de faire de l'imagerie en plein champ avec une résolution axiale sub-longueur d'onde. Ce dispositif a été calibré et optimisé au cours de cette thèse pour répondre au mieux à des problématiques biologiques. Différentes approches ont ainsi été testées dans le but de calibrer la profondeur de pénétration de l'onde évanescente. Des surfaces plasmoniques ont entre autres été utilisées pour augmenter la sélectivité axiale du montage. Notre microscope a été dédié à l'étude de l'effet du cholestérol sur l'interaction entre la protéine précurseur de l'amyloïde APP, protéine transmembranaire impliquée dans la maladie d'Alzheimer et une de ses enzymes de clivage BACE1. Nous avons ainsi effectué un suivi dynamique de l'effet du cholestérol sur l'interaction entre APP et BACE1 dans des cellules HEK-293 et dans des cultures primaires de neurones d'hippocampe d'embryons de rat, de la membrane plasmique à l'intérieur des cellules grâce à notre dispositif TIRFLIM. La mesure d'anisotropie de fluorescence résolue en temps a également été implémentée sur notre montage. Ces mesures résolues en temps et en polarisation ont permis de mesurer le temps de corrélation rotationnelle de fluorophores et de mettre en évidence de manière qualitative différents niveaux d'homodimérisation de protéines impliquées dans la maladie d'Alzheimer.