Orientador: Priscila Gratão / Banca: Tiago Santana Balbuena / Banca: Vanessa Cury Galati / Resumo: A contaminação por metais pesados é um problema mundial e é uma das causas mais severas de estresse abiótico nas plantas, desencadeando perdas na produtividade e risco de contaminação para a saúde humana. A concentração de cádmio aumentou consideravelmente no meio ambiente devido a fatores antropogênicos. As plantas podem absorver o cádmio, levando a alta produção de espécies reativas de oxigênio, o que desencadeia cascatas de oxidação descontroladas, resultando em danos a planta. Com o objetivo de adicionar novas informações nesta área, foi realizada uma discussão sobre a contaminação dos solos agrícolas por metais pesados, os danos causados na homeostase celular, o sistema antioxidante de defesa e o impacto para os consumidores. Além disso, foi feito um estudo sobre a comunicação da raiz para a parte aérea durante uma condição de estresse, interconectando a resposta especifica das espécies reativas de oxigênio e a ação dos hormônios nesta comunicação. Pare este propósito, foi utilizado como ferramenta a enxertia e os mutantes hormonais para investigar a modulação da resposta antioxidante de defesa entre os órgãos. / Abstract: Heavy metal contamination is a worldwide concern and one of the most severe causes of abiotic stress in plants, triggering losses in crop production and contamination risks to human health. Cadmium concentration have been increased in environment due to several anthropogenic factors. Plants can uptake cadmium, which lead to a high production of reactive oxygen species and trigger an uncontrolled oxidation cascade in cells, resulting in damages to plant. In order to gain new information about this subject, we carried out a deep discussion about heavy metal contamination in agricultural soils, damages in cell homeostasis, antioxidant defense system and the impact to food consumers. Moreover, we studied root-to-shoot communication during stress condition and the specific responses of reactive oxygen species and hormones in this communication. For this propose, we used grafted hormonal mutants as a tool to investigate the modulation of antioxidant stress responses between organs. / Mestre

Orientador: Marcelo Agenor Pavan / Coorientador: Giuseppina Pace Pereira Lima / Coorientador: Julio Massaharu Marubayashi / Banca: Alexandre Moura Guimarães / Banca: João Domingos Rodrigues / Resumo: A cultura do tomateiro apresenta grande importância econômica para o Brasil e está sujeita a várias doenças que, dependendo do nível de resistência genética do cultivar usado, podem limitar sua produção. Os Tospovirus são considerados agentes causais de uma das doenças mais importantes da cultura do tomateiro, o vira-cabeça, acarretando enormes prejuízos econômicos. Diante disso, o objetivo do trabalho foi avaliar o efeito de indutores de resistência na incidência de vira cabeça e na produção do tomateiro. Os experimentos foram executados na Fazenda Experimental da UNESP, Campus Botucatu, em área de histórico de ocorrência da doença. Foram utilizadas 3200 plantas de tomateiro cv. Saladinha Plus. As bandejas foram divididas em 2 grupos, onde a metade recebeu um pré tratamento pela aplicação de Piraclostrobina+Metiram (3 g/L H2O) + Boscalida (0,3 g/L H2O) na bandeja e a outra metade sem nenhum produto aplicado. Após o transplantio, foram aplicados os tratamentos, através da pulverização de Piraclostrobina+Metiram 200g p. c./100L, Piraclostrobina+Metiram 400g p. c./100L, Bacillus subtilis 400mL p. c./100L e o procedimento convencional no qual foi aplicado o produto a base de Metamidófos. As pulverizações foram realizadas em todos os tratamentos aos 20, 35, 50 e 65 dias após o transplantio (DAT). Durante a condução do experimento foi realizada a avaliação da incidência da doença aos 30, 45 e 60 DAT, contando o número de plantas doentes. Com os resultados obtidos nas avaliações foi calculada a área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD). Para as análises bioquímicas (atividade de peroxidase, polifenoloxidase, teor de proteínas totais solúveis e poliaminas), o material vegetal foi coletado aos 30, 40, 45, 55, 60, 70 e 75 DAT. A colheita dos frutos foi realizada aos 80 DAT, sendo selecionadas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The tomato crop has great economic importance in Brazil and is subject of several diseases, and depending on the level of genetic resistance of the cultivar used, it can limit its production. The Tospovirus are considered causal agents of one of the most important diseases of tomato crops, resulting in enormous economic damage. The objective of this work was to evaluate the effect of resistance induction in the tomato crop, as well as the incidence of tospovirus. The experiment was carried out in the Experimental Farm of UNESP Botucatu, in an area of historical occurrence of the disease. Were used 3200 tomato plants cv. Saladinha Plus. Trays were divided into 2 groups, where half received a pretreatment Pyraclostrobin+ metiram (3 g / L H2O) + Boscalida (0, 3 g / L H2O) in the tray and the other half didn't receive any product. After transplanting, treatments were applied by spraying Pyraclostrobin + metiram 200g p. c./100L, Pyraclostrobin + metiram 400g p. c./100L, Bacillus subtilis 400mL p. c./100L by conventional procedure in which the product methamidophos was applied. The spraying was carried in all treatments at 20, 35, 50 and 65 days after transplanting (DAT). During the experiment, an evaluation of the disease incidence was performed at 30, 45 and 60 DAT, counting the number of diseased plants. With the results obtained in the evaluations, was calculated the area under the disease progress curve (AUDPC). To biochemical analysis (peroxidase, polyphenoloxidase, total soluble protein and polyamines), the plant material was collected at 30, 40, 45, 55, 60, 70 and 75 DAT. The fruit harvest was performed at 80 DAT, 20 plants were selected of each treatment, and the analyses of total production were carried out, including average fruit weight, fruit number per treatment, percentage of the number of green... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Antonio Evaldo Klar / Coorientador: Antonio Ismael Inácio Cardoso / Banca: Ligia Sampaio Reis / Banca: Hélio Grassi Filho / Resumo: O tomate é uma das hortaliças mais importante da agroindústria brasileira. Neste estudo, foram testados os efeitos de três doses de salinidade da água de irrigação (0, 3 e 5 dS m-1) e três níveis mínimos de irrigação (-10, -30 e -60 kPa) sobre o desenvolvimento de tomateiro tipo industrial, Kátia. As mudas foram transplantadas em vasos e o cultivo foi em casa de vegetação até a maturação dos frutos. As irrigações foram procedidas por pesagem dos vasos quando atingiam os valores mínimos aproximados dos potenciais definidos no projeto. Os resultados mostram que o efeito da interação entre estresse hídrico e salino reduziram os parâmetros: diâmetro do caule, área foliar, teor relativo de água na folha, número de frutos, porcentagem de frutos com podridão apical, teor de prolina, atividade da enzima SOD e atividade da enzima Peroxidase. A interação entre os estresses não apresentou significância para os parâmetros: altura de plantas, fitomassa, verde e seca, e peso médio dos frutos. Nesta condição o efeito principal do estresse hídrico se mostrou mais efetivo na redução desses parâmetros / Abstract: Tomato is the most important vegetable crop of the Brazilian agribusiness. Few researches have evaluated the tolerance of this crop to saline stress. In this study, the effects of three doses of salinity of the irrigation water (0, 3 and 5 dS m-1) and three levels of irrigation (-10, -30 e -60 kPa) were tested on development of industrial tomato, Kátia. Seedlings were transplanted in pots and grown under plastic covering until fruit ripening. The irrigations were proceeded by weighing the pots when they reached the minimum values approximate the potential defined in the project. Results show that the effect of the interaction between water and salt stress reduced the parameters: stem diameter, leaf area index, relative water content, number of fruit, and percentage of fruits with blossom-end rot, proline, activity of SOD enzyme and activity of peroxidase enzyme. The interaction between the stresses not presented significance for the parameters: height of plants, fresh and dry matter, and fruit weight. In this condition the main effect of water stress was more effective in the reduction of these parameters / Mestre

Orientador:, Edson Luiz Lopes Baldin / Coorientador: Leandro do Prado Ribeiro / Banca: Carlos Frederico Wilcken / Banca: Antonio Eduardo Miller Crotti / Resumo: Helicoverpa armigera (Hübner, 1808) (Lepidoptera: Noctuidae) destaca-se pela grande capacidade de dispersão, hábito polífago e por ocasionar expressivos danos em culturas de interesse econômico em todo o mundo. Dentre os métodos de manejo de insetos-praga, o uso de derivados vegetais é considerado uma promissora alternativa ao controle químico, uma vez que estes produtos apresentam mais de um ingrediente ativo em sua composição, dificultando a seleção de insetos resistentes, além de serem provenientes de recursos renováveis. Dentre as famílias botânicas de ocorrência em regiões neotropicais, Annonaceae constitui uma das principais fontes de compostos naturais bioativos. Assim, visando disponibilizar alternativas mais sustentáveis e ao mesmo tempo eficientes para o manejo de Helicoverpa armigera (Hübner, 1808) (Lepidoptera: Noctuidae), avaliou-se a bioatividade de cinco derivados de anonáceas (Annona montana Macfad., A. mucosa Jacq., A. muricata L., A. reticulata L. e A. sylvatica A. St.-Hil.) e do produto comercial à base de acetogeninas de anonáceas (Anosom® 1 EC) sobre lagartas do inseto. Adicionalmente, o composto majoritário do extrato mais ativo foi identificado e também avaliado quanto à sua bioatividade sobre formas neonatas de H. armigera. Constatou-se que o extrato de A. mucosa (CL50: 411,55 mg kg-1 e CL90: 1.479 mg kg-1 ) assim como o Anosom® 1 EC (CL50: 312,08 mg kg-1 e CL90: 1.151 mg kg-1 ) apresentaram significativa atividade inseticida sobre H. armigera, com toxicidade aguda após sete dias de exposição a dieta artificial tratada. A partir do extrato etanólico de A. mucosa realizou-se fracionamento biomonitorado através de diferentes técnicas cromatográficas, permitindo o isolamento da acetogenina bisterahidrofurano roliniastatina-1. Este composto foi testado a uma concentração de 41,55 mg kg-1, ocasionando mortalidade total das larvas de H. armigera ... / Abstract: Helicoverpa armigera (Hübner, 1808) (Lepidoptera: Noctuidae) is a highly polyphagous species with high dispersion ability and adaptability to different crops of economic interest worldwide. Botanical insecticides emerge as a viable alternative to the use of synthetic insecticides for pest management because they have more of a potentially active ingredient in their composition, delaying the selection of resistant insect, moreover come from renewable resources. Among tropical plant families, the Annonaceae has shown great potential as a source of biopesticides. To determine an alternative tool for H. armigera control, this study evaluated the insecticidal activity of ethanolic seed extracts from five species of Annonaceae (Annona montana Macfad., A. mucosa Jacq., A. muricata L., A. reticulata L. e A. sylvatica A. St.-Hil.) and the acetogenin-based commercial bioinsecticide Anosom® 1 EC on larvae of H. armigera larvae. In addition, the major active compound of the ethanolic extract was isolated using various chromatographic techniques and assessed for its bioactivity on H. armigera neonates. In the initial screening assay we verified that the ethanolic seed extract from A. mucosa (LC50 = 411.55 mg kg-1 and LC90 = 1,479 mg kg-1 ) was the most promising one, showing similar effectiveness to Anosom® 1 EC (LC50 = 312.08 mg kg-1 and LC90 = 1,151 mg kg-1 ) against H. armigera at seven days after exposition to treated diet. The acetogenin bis-tetrahydrofuran rolliniastatin-1 was identified as the major compound in ethanolic extract from A. mucosa. This compound was assessed at 41.55 mg kg- 1, causing 100 % of larval mortality on H. armigera neonates for days after exposition to treated diet. After, in a greenhouse trial using tomato plants, the bioactivity of ethanolic extract of A. mucosa was compared to botanical insecticide Anosom® 1 EC (both at LC90) and a synthetic insecticide (Belt® 48 SC) ... / Mestre

Resumo: Os ésteres de sacarose são uma classe de compostos produzidos através da reação de ácidos gordurosos e açúcares e que podem possuir ação inseticida. Com isso trata-se de um método alternativo de fonte renovável e de baixo custo. Assim, estudou-se o efeito de éster de sacarose sobre ovos, ninfas e adultos de Bemisia tabaci biótipo B; sobre ovos, larvas e adultos do predador Chrysoperla externa; e sobre o desenvolvimento de tomateiro e melão. Utilizou-se concentrações de 0, 1, 2, 3, 5 e 10 g/L do éster de sacarose. Os testes com ovos e ninfas de mosca-branca foram realizados sobre plantas de tomate e melão, enquanto o teste com adultos foi realizado em gaiolas de tela antiafídeo. O éster de sacarose causou mortalidade em ovos, ninfas e adultos de mosca branca. Para se avaliar o efeito do éster de sacarose sobre as diversas fases de C. externa utilizou-se o método do filme seco, método de imersão e aplicação tópica. No método do filme seco, o éster de sacarose foi inócuo para ovos e adultos de C. externa e levemente nocivo para larvas de 3o ínstar. Todavia, no método de imersão, a concentração de 10 g/L causou mortalidade média de 73,3% dos ovos, enquanto a pulverização sobre larvas e adultos causou 80,0% e 16,6 % de mortalidade, respectivamente. Sementes de tomate e melão foram imersas em soluções de éster de sacarose enquanto as plantas foram pulverizadas semanalmente A germinação e desenvolvimento das plântulas ou plantas não foram afetados. / Abstract: Sucroesters are a class of compounds produced through the reaction between fat acids and sugars that can have insecticide properties. Thus, as they can be made using renewable sources and are inexpensive, they can be an alternative pest control method. The effect of sucroester on Bemisia tabaci B biotype eggs, nymphs and adults; Chrysoperla externa eggs, larvae and adults; tomato and melon plants development was studied. Concentrations from 0 to 10 g/L of the sucroester were tested. The essays on whitefly eggs and nymphs were carried out on tomato and melon plants, whereas the essay on adults was carried out using screened cages. The sucroester caused mortality of whitefly eggs, nymphs and adults. Both dry film and dip methods were used to evaluate the effect of sucroester on C. externa. In the dry film method, the sucroester did not cause any effect on eggs and adults of C. externa, and was considered innocuous. However, it was slightly noxious to the third instar larvae. On the other hand, in the dip method, the mortality of C. externa eggs caused by the concentration of 10 g/L was 73.3 %, whereas topic application on larvae and adults caused mortality of 80% and 16%, respectively. Tomato and melon seeds were dipped into sucroester solutions while the plants were sprayed weekly. The germination and development of seedlings and plants were not affected. / Orientador: Odair Aparecido Fernandes / Coorientador: Maurício Boscolo / Banca: André Luiz Lourenção / Banca: Antonio Carlos Busoli / Mestre

O tomate (Solanum lycopersicum L.) é considerado um alimento funcional por sua propriedade antioxidante. O fruto contém dos carotenoides, ácido L-ascórbico, vitamina E e substâncias fenólicas. Estudos indicam que o consumo do tomate pode retardar o envelhecimento e favorecer o funcionamento do sistema imunológico em humanos, embora não seja possível afirmar uma relação direta entre a prevenção ou cura de qualquer carcinoma com o consumo de produtos à base licopeno. Na década de 1990, a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) criou o projeto TOMATEC, o tomate ecologicamente cultivado. A produção é baseada em um manejo diferenciado, que objetiva a otimização do uso do solo, menor consumo de pesticidas, herbicidas e incentivo à produção familiar dos agricultores. O estudo objetiva observar a influencia dos diferentes manejos: tradicional e TOMATEC na produção de (15E)-licopeno nos frutos do tomate, em diferentes cultivares do Brasil. Assim, foi utilizada a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector por arranjo de diodos (CLAE-DAD), em fase estacionária polimérica composta de 30 carbonos (C30). Esta fase estacionária é capaz de separar carotenoides, incluvise, isômeros geométricos do licopeno. As amostras foram coletadas, tratadas, extraídas e analisadas sob as mesmas condições para avaliação das concentrações de (15E)-licopeno nos frutos. Ensaios realizados foram capazes de demonstrar, de maneira objetiva, que a metodologia proposta conduziu a resultados confiáveis à qualidade desejada, de acordo com o guia de validação proposto pelo Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial (INMETRO). Foram utilizadas ferramentas estatísticas para comparar os teores de (15E)-licopeno, em diferentes Estados do Brasil, sob diferentes manejos. Os resultados indicam os maiores teores da substância em cultivares convencionais e mostram que o ensacamento do fruto é um fator decisivo para a biossíntese do (15E)-licopeno

As plantas expressam diferentes mecanismos de defesa em resposta a patógenos. Em geral, ocorre o reconhecimento de padrões moleculares associados ao patógeno (PAMPs) por receptores específicos das plantas, desencadeando as respostas de defesa através das vias de sinalização mediadas por jasmonato (JA), etileno (ET) e ácido salicílico (AS). Além disso, a descoberta de sinais endógenos como AtPep1 que regulam a expressão de genes de defesa em Arabidopsis thaliana tem auxiliado na compreensão dos mecanismos de defesa. No entanto, os mecanismos de defesa de plantas a patógenos necrotróficos como Pythium spp. são pouco conhecidos. Desta forma, o desenvolvimento de estratégias para identificar e caracterizar genes de resistência à Pythium spp. pode auxiliar na compreensão dos mecanismos de defesa, possibilitando a obtenção de cultivares resistentes. Uma das estratégias empregadas para a identificação de genes de resistência a patógenos do gênero Pythium consistiu na construção de uma biblioteca de cDNAs diferencialmente expressos em A. thaliana susperexpressando AtPROPEP1, que são mais resistentes à P. irregulare e a P. deliense. Paralelamente, foi realizada a busca de um gene ortólogo ao AtPROPEP1 de A. thaliana em diferentes espécies de solanáceas. Outra estratégia utilizada envolveu a avaliação do efeito da aplicação dos hormônios JA e AS e do regulador de crescimento etefon na resistência de plantas de tomate à P. dissotocum. Posteriormente foi realizado o silenciamento dos genes CTR1, ERF1 e SlPROPEP em plantas de tomate a fim de verificar o papel dos mesmos na resistência das plantas à P. dissotocum. Os resultados obtidos na biblioteca subtrativa indicam que A. thaliana superexpressando AtPROPEP1 pode induzir a expressão não somente da defensina PDF1.2, mas também de GRP3, outro gene envolvido na defesa de plantas contra patógenos. Através da busca de ortólogos de AtPROPEP1 em diferentes solanáceas foi possível identificar um ortólogo em Solanum lycopersicum - SlPROPEP. O tratamento com etefon aumentou a resitência das plantas à P. dissotocum comparado com as plantas não tratadas. Este tratamento também induziu a expressão relativa de SlPROPEP, PR-1, PR-5 e da defensina DEF2. Assim como o tratamento com etefon o silenciamento do gene CTR1, que atua como um regulador negativo da via de sinalização de defesa por ET aumentou a resistência das plantas à P. dissotocum. Enquanto que as plantas silenciadas para os genes ERF1 e SlPROPEP foram mais suscetíveis. O silenciamento de SlPROPEP reprimiu a expressão relativa dos genes PR-1, PR-5, ERF1, LOX-D e DEF2 envolvidos na defesa de plantas à patógenos. Estes resultados, em conjunto com o aumento da resistência nas plantas tratadas com etefon, sugerem que a via de sinalização de ET atua na resistência de tomate à P. dissotocum sendo que esta resistência possivelmente é mediada por SlPROPEP. / Plants express different defense mechanisms in response to pathogens. In general, specific receptors in plants reconize pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), triggering the response defenses by signaling pathways mediated by jasmonate (JA), ethylene (ET) and salicylic acid (SA). Furthermore, the discovery of endogenous signals, as AtPep1, which regulate defense genes expression in Arabidopsis thaliana, has aided the understanding of the defense mechanisms. However, the defense mechanisms of plants to necrotrophic pathogens such as Pythium spp. are poorly known. Thus, development of strategies to identify and characterize the resistance genes to Pythium spp. can help the understand of defense mechanisms, allowing the obtainance of resistant cultivars. One of the strategies used for the identification of resistance genes to pathogens within the genus Pythium consisted to construct a cDNA library of differentially expressed genes in plants overexpressing AtPROPEP1, which are more resistant to P. irregulare and P. deliense. Simultaneously, a search for orthologous genes to AtPROPEP1 from A. thaliana in different species of Solanaceae was performed. Another strategy used involved the evaluation of application of JA and AS and of the growth regulator ethephon on the resistance of tomato plants to P. dissotocum. Then, the silencing of the genes CTR1, ERF1 and SlPROPEP was performed in tomato plants in order to check the role of the tomato resistance to P. dissotocum. The results obtained from subtractive cDNA library indicate that A. thaliana plants overexpressing AtPROPEP1 may induce expression not only of the PDF1.2 defensin but also the GRP3 expression, another gene involved in plant defense against pathogens. By the search for orthologous genes to AtPROPEP1 in different species of Solanaceae was possible to identify an ortholog in Solanum lycopersicum - SlPROPEP. The ethephon treatment increased resistance of plants to P. dissotocum compared to untreated plants. This treatment also induced the expression of SlPROPEP, PR-1, PR-5 and DEF2 defensin. As ethephon treatment, the silencing of CTR1 gene, which acts as a negative regulator of defense signaling pathway by ET, increased plant resistance to P. dissotocum. Whereas the plants containing ERF1 and SlPROPEP genes silenced were more susceptible. SlPROPEP silencing repressed the relative expression of the genes PR-1, PR-5, ERF1, LOX-D e DEF2 involved in plant defense to pathogens. These results, together with increased resistance in the plants treated with ethephon, suggest that ET signaling pathway acts in tomato to resistance P. dissotocum and this resistance is likely mediated by SlPROPEP.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Molecular, 2014. / Submitted by Bruna Cares (brunacares@gmail.com) on 2014-09-03T19:28:19Z No. of bitstreams: 1 2014_LilianSilveiraTravassosdoCarmo.pdf: 5759602 bytes, checksum: 2869ee49cd065fb61c7f9f9a0c1fea8b (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2014-09-17T12:46:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_LilianSilveiraTravassosdoCarmo.pdf: 5759602 bytes, checksum: 2869ee49cd065fb61c7f9f9a0c1fea8b (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-17T12:46:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_LilianSilveiraTravassosdoCarmo.pdf: 5759602 bytes, checksum: 2869ee49cd065fb61c7f9f9a0c1fea8b (MD5) / O tomate é uma cultura de grande importância econômica em todo o mundo, mas é severamente afetada por vários geminivírus, como o begomovírus Tomato chrolotic mottle virus (ToCMoV) que causam perdas significativas na cultura. O objetivo desse estudofoi identificar proteínas diferencialmente expressas na interação ToCMoV-planta hospedeira. Primeiramente foi verificado o efeito do gene AC2 de ToCMoV na planta modelo Nicotiana benthamiana. A proteína AC2 é um fator de virulência que tem um papel crucial no sucesso da interação vírus-planta, atuando como ativador transcricional e em alguns begomovírus, como supressor de silenciamento de RNA. Entretanto, a função ou funções da proteína AC2 do begomovírus ToCMoV ainda não foram determinadas. Para esta etapa do trabalho, plantas de N. benthamiana foram inoculadas com Agrobacterium tumefaciens contendo o vetor viral Potato virus X (PVX) e com a construção PVX-AC2. Eletroforese bidimensional foi realizada e a análise por MALDI TOF-TOF revelou proteínas diferencialmente expressas envolvidas em estresse oxidativo, fotossíntese, defesa contra patógenos, entre outros. Na segunda etapa do trabalho, foi aplicada a metodologia 2D-nanoUPLC/HDMSE para a análise de folhas de tomateiro infectadas com o begomovírus ToCMoV. Foram analisados, pela primeira vez, os perfis proteômicos dos genótipos de tomateiro suscetível (Santa Clara) e resistente (LAM 157 contendo o locus de resistência tcm-1) inoculados com ToCMoV. Proteínas diferencialmente expressas em resposta ao ToCMoV foram identificadas. Os resultados obtidos neste estudo revelaram proteínas que podem estar associadas com a suscetibilidade ao ToCMoV, como a ubiquitina e a proteína de choque térmico 70 (HSP 70). Os efeitos causados pelo fator de patogenicidade AC2 do ToCMoV e pelo vírus íntegro foram semelhantes e resultaram no recrutamento de proteínas envolvidas nas vias de ubiquitinação, tradução e processamento proteíco. Por outro lado, as plantas hospedeiras também desencadearam resposta de defesa na XIV tentativa de combater o avanço viral aumentando a expressão de proteínas como, a histona H4. Os resultados obtidos neste estudo trazem importantes contribuições para a melhor compreensão das interações ToCMoV-planta hospedeira e poderão contribuir para o desenvolvimento de estratégias de controle da infecção por este begomovírus. __________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Tomato is a highly important crop cultivated worlwide, which is severely affected by begomoviruses such as Tomato chrolotic mottle virus (ToCMoV). The aim of the present study was to identify differentially expressed proteins in the ToCMoV-host plant interaction. The virulence factor AC2 is considered crucial for a successful virus-plant interaction and is known to act as a transcriptional activator and in some begomoviruses to function as an RNA silencing suppressor factor. However, the function or functions of the AC2 protein of the begomovírus ToCMoV are not yet determined. In the first part of this study, the model plant Nicotiana benthamiana was inoculated with Agrobacterium tumefaciens containing the viral vector Potato virus X (PVX) and with the PVX-AC2 construction. Bidimensional electrophoresis was performed and MALDI TOF-TOF analysis revealed differentially expressed proteins involved in oxidative stress, photosynthesis, host defence, among others. In the second part of this study, we have applied the 2D-nanoUPLC/HDMSE methodology to analyse tomato plants infected with the begomovirus ToCMoV. For the first time, the proteomic profiles of the susceptible tomato genotypes (Santa Clara) and resistant (LAM 157 containing the locus of resistance tcm-1) inoculated with ToCMoV were analyzed. Differentially expressed proteins in response to ToCMoV were identified. The results of this study revealed proteins that may be associated with the infectivity of ToCMoV, such as ubiquitin and heat shock 70 (HSP 70). The effects caused by the pathogenicity factor AC2 of ToCMoV and the intact virus were similar and resulted in the recruitment of proteins involved in ubiquitination pathways, translation and protein processing. Moreover, the host plant defense response was also triggered in an attempt to combat viral breakthrough increasing the expression of proteins such as histone H4. The results obtained provide important XVI contributions to the understanding of plant-ToCMoV interactions and may contribute to the development of strategies to control this infection caused by begomoviruses.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-04-04T16:13:01Z No. of bitstreams: 1 2012_LeonardoCunhadeAlbuquerque.PDF: 3251557 bytes, checksum: 30b5d66dd563e940f160263b12ed9580 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-04-05T12:04:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_LeonardoCunhadeAlbuquerque.PDF: 3251557 bytes, checksum: 30b5d66dd563e940f160263b12ed9580 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-05T12:04:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_LeonardoCunhadeAlbuquerque.PDF: 3251557 bytes, checksum: 30b5d66dd563e940f160263b12ed9580 (MD5) / Os begomovírus (família Geminiviridae, gênero Begomovirus) possuem genoma constituído por DNA circular de fita simples, apresentam um (monopartido) ou dois (bipartido, DNA-A e DNA-B) componentes genômicos e são transmitidos naturalmente a diversas espécies de dicotiledôneas por moscas-brancas (Bemisia tabaci). Este grupo de vírus é conhecido pelos danos que causa em diversas plantas de importância econômica, incluindo duas das principais culturas do Brasil, o tomateiro (Solanum lycopersicum) e a batateira-doce (Ipomoea batatas). O objetivo deste trabalho foi realizar um estudo de diversidade genética de begomovírus que infectam o tomateiro e a batateira-doce. Neste estudo, o DNA viral de diversas amostras de tomateiro coletadas em 2003/04 foi analisado com o objetivo de caracterizar e estudar a diversidade genética desses begomovírus em três regiões do Brasil (Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste). Como resultado, foram descritas as sequências completas de três begomovírus: uma nova espécie, Tomato interveinal chlorosis virus (ToICV), e duas espécies anteriormente descritas, porém apenas com sequências parciais do DNA-A disponíveis, Tomato mottle leaf curl virus (TMoLCV) e Tomato golden vein virus (TGVV). As sequências completas do DNA-B de TMoLCV e TGVV e do DNA-A de variantes de Tomato severe rugose virus (ToSRV) também são descritas. Como segunda parte do trabalho, em batateira-doce, o estudo foi realizado a partir de amostras coletadas do banco de germoplasma da Embrapa Hortaliças e do campo de produção de quatro estados do Brasil (Rio Grande do Sul, São Paulo, Pernambuco e Paraíba). Um total de 36 sequências completas foram determinadas e comparadas com outras sequências obtidas de bancos de dados públicos (GenBank) afim de fornecer uma visão geral da diversidade genética de sweepovírus (nome proposto para os begomovírus que infectam plantas do gênero Ipomoea) do Brasil. Também foi proposta uma revisão na classificação e nomenclatura desses vírus de acordo com os critérios taxonômicos atuais para a família Geminiviridae adotados pelo Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV). Do total de 36 sequências determinadas aqui, uma nova espécie foi identificada e nomeada Sweet potato leaf curl Sao Paulo virus (SPLCSPV) e os demais isolados foram classificados como novas estirpes ou variantes de Sweet potato leaf curl virus (SPLCV), Sweet potato golden vein-associated virus (SPGVaV) e Sweet potato leaf curl Spain virus (SPLCESV). Além dos estudos de caracterização molecular e diversidade genética, as sequências dos isolados de tomateiro e batateira-doce foram analisadas para detectar possíveis eventos de recombinação e os resultados demonstraram que uma série de eventos de recombinação inter e intra-espécies ocorreu na região intergênica (RI) e na metade da ORF C1 (open reading frame C1). Estes resultados demonstram que algumas espécies de begomovírus que infectam tomateiro são predominantes em regiões específicas do país e que estes vírus estão evoluindo continuamente por meio de mecanismos de variabilidade genética, entre eles a recombinação, como mostrado neste estudo. Em batateira-doce, os resultados apresentados indicam que a diversidade genética de begomovírus é maior que a anteriormente descrita e que o acúmulo viral, favorecido pela propagação vegetativa da cultura, resulta em eventos de recombinação levando ao surgimento de novas espécies e estirpes. _______________________________________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Begomovirus) have a circular, single strand DNA with one (monopartite) or two (bipartite, DNA-A and DNA-B) genomic components and are naturally transmitted by whiteflies (Bemisia tabaci) to several dicotyledonous species. This group of viruses is known to cause damage in several economically important crops, including two of the main crops in Brazil, tomato (Solanum lycopersicum) and sweet potato (Ipomoea batatas) plants. The aim of this work was to study genetic diversity of begomovirus infecting tomato and sweet potato plants. In this study, viral DNA of various tomato samples collected in 2003/04 was analyzed in order to characterize and study the genetic diversity of begomoviruses in three regions of Brazil (southeast, central- west and northeast). As a result, the full DNA-A sequences of three begomoviruses were described for the first time: a new tomato-infecting begomovirus, Tomato interveinal chlorosis virus (ToICV), and two previously described begomoviruses for which only partial DNA-A sequences were available, Tomato mottle leaf curl virus (TMoLCV) and Tomato golden vein virus (TGVV). The complete sequences of the DNA-B components of TMoLCV e TGVV and the DNA-A components of a number of Tomato severe rugose virus variants are also presented. As the second part of the work, in sweet potato plants, the study was conducted from samples collected in the sweet potato germplasm bank of Embrapa Vegetables and in commercial fields across four Brazilian states (Rio Grande do Sul, São Paulo, Pernambuco and Paraíba). A total of 36 complete genome sequences was determined and compared with others from public nucleotide sequence databases (GenBank) to provide an overview of the sweepovírus (proposed name to the begomoviruses that infect plants of Ipomoea genus) genetic diversity in Brazil. Adittionally, it is proposed a review in the classification and nomenclature of these viruses in accordance with the study group on the taxonomy of geminiviruses of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). From the 36 complete genome sequences determined in this work, a novel species was identified and named Sweet potato leaf curl Sao Paulo virus (SPLCSPV) and the other isolates were classified as new strains or variants of Sweet potato leaf curl virus (SPLCV), Sweet potato golden vein-associated virus (SPGVaV) and Sweet potato leaf curl Spain virus (SPLCESV). In addition to studies of molecular characterization and genetic diversity, the tomato and sweet potato-infecting sweepovirus sequences were analyzed to detect possible recombination events and it was demonstrated that most of the inter and intra-species recombination events occurred in the intergenic region (IR) and in the middle of C1 open reading frame (ORF). These results demonstrated that some tomato-infecting begomovíruses are prevalent in specific regions of Brazil and that these viruses are continually evolving though mechanism of genetic variability, including recombination, as showed in this study. In sweet potato, the results showed here indicate that the genetic diversity of begomoviruses is considerably greater than previously reported and that the accumulation of viruses, favored by vegetative propagation of culture, result in recombination events leading to the emergence of new species and strans.

Dissertação (mestrado)–Universidade de Brasília, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2011. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-10-21T15:27:46Z No. of bitstreams: 1 2011_MonicaAlvesMacedo.pdf: 2014920 bytes, checksum: ac713dc35d768784883d99373bfcd251 (MD5) / Approved for entry into archive by Elzi Bittencourt(elzi@bce.unb.br) on 2011-10-24T13:49:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_MonicaAlvesMacedo.pdf: 2014920 bytes, checksum: ac713dc35d768784883d99373bfcd251 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-10-24T13:49:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_MonicaAlvesMacedo.pdf: 2014920 bytes, checksum: ac713dc35d768784883d99373bfcd251 (MD5) / O tomateiro é uma das principais hortaliças cultivadas no país, sendo também uma das culturas que mais sofre danos pelo ataque de diversos patógenos. Dentre os patógenos de origem viral que infectam o tomateiro as principais espécies são Tomato sereve rugose virus – ToSRV e Tomato golden vein virus – TGVV (Begomovirus); Tomato spotted wilt virus – TSWV e Grounut ringspot virus - GRSV (Tospovirus); Cucumber mosaic virus – CMV (Cucumovirus); Peper yellow mosaic virus - PepYMV e Potato virus Y - PVY (Potyvirus) e; Tomato mosaic virus – ToMV (Tobamovirus); e mais recentemente Tomato chlorosis virus - ToCV (Crinivirus). Os begomovírus se destacam, na atualidade, devido à diversidade de espécies e pela maior incidência na cultura. Esses vírus pertencem à família Geminiviridae, podem apresentar um ou dois (DNA-A e DNA-B) componentes genômicos e são transmitidos por moscas-brancas, insetos sugadores de seiva. O objetivo deste trabalho foi avaliar o grau de susceptibilidade de materiais de tomate plantados no país a oito dos principais vírus que afetam a cultura; determinar as espécies de begomovírus predominantes no país nos anos de 2009-2010, e estudar os fatores que influenciam na predominância de ToSRV nas regiões produtoras de tomate do Brasil. Inicialmente, foi feita uma avaliação da resistência de materiais de tomate comumente plantados no país a oito dos principais vírus que afetam a cultura. A avaliação da resistência dos materiais de tomate foi determinada a partir da inoculação de isolados de CMV, PVY, PepYMV, TSWV, GRSV e ToMV (inoculação mecânica) e de ToSRV e TGVV (inoculação por mosca-branca). Como resultado, não foi verificado materiais com resistência do tipo imunidade para cinco das oito espécies de vírus avaliadas. Foram verificados materiais resistentes apenas para isolados das espécies TSWV, ToMV e PVY, sendo que para os demais vírus todas as cultivares apresentaram-se como susceptíveis. Apenas algumas cultivares (somente para o segmento mesa) mostraram níveis diferentes de resistência para o isolado de begomovírus ToSRV avaliado. A partir de então, os estudos foram direcionados para os begomovírus visando determinar as espécies atualmente predominantes no país (coletas nos anos 2009-2010) e estudar os fatores que influenciam na predominância de ToSRV nas regiões produtoras de tomate do Brasil. Para o estudo de prevalência das espécies de begomovírus, as amostras isoladas de tomateiro foram coletadas nas principais regiões produtoras de tomate do país. O DNA total foi extraído e os begomovírus foram detectados por PCR. As amostras positivas foram selecionadas e essas foram amplificadas por RCA (amplificação por círculo rolante) seguido pela caracterização a partir da digestão com enzima de corte freqüente MspI. A análise da diversidade foi realizada por eletroforese com a separação em padrões de migração de fragmentos de DNA. Ao todo foram analisadas 600 amostras positivas e 36 padrões de digestão foram selecionados. Uma amostra de cada padrão foi selecionada aleatoriamente e o DNA-A dos begomovírus presentes nas amostras foram seqüenciados parcialmente (sequenciamento direto do RCA) e apenas as espécies distintas estão sendo clonadas e seqüenciadas completamente. Como resultado houve predominância de ToSRV, seguido de Tomato mottle leaf curl virus (TMoLCV). Em paralelo, isolados de ToSRV e TGVV, espécies mais relatadas como predominantes no país, sendo que TGVV vem aparentemente reduzindo sua incidência, foram selecionados para a avaliação do processo de infecção e o estudo de transmissão por moscas-brancas. O círculo de hospedeiras de plantas cultivadas e daninhas para os vírus TGVV e ToSRV foi determinado, indicando um círculo de hospedeiros semelhante entre eles. Adicionalmente, a cinética de infecção foi avaliada em agroinoculação com TGVV e ToSRV em infecção simples e mista. O monitoramento consistiu na observação de sintomas e coleta de amostras foliares para posterior detecção por PCR a cada três dias, para determinar a velocidade de infecção e a porcentagem de plantas infectadas com cada vírus. Para os ensaios de transmissão, inicialmente foram aperfeiçoados os protocolos de inoculação por mosca-branca, avaliando a forma de aquisição, inoculação, a quantidade de insetos por planta e a cultivar de tomate utilizada como planta-teste. Como metodologia-padrão foi adotado o uso da cultivar Viradoro, a aquisição a partir de folhas destacadas de tomateiro infectado em tubos de polietileno e três insetos/planta confinados em copos plásticos para a inoculação. Os períodos de aquisição e inoculação do inseto-vetor foram padronizados em 48h. Para a determinação da eficiência de transmissão foram realizados ensaios com infecção simples e mista. Foi determinada também a porcentagem de aquisição dos vírus pelo inseto-vetor após 48h de inoculação em insetos alimentados em folhas com infecção simples e mista. Como resultado, não houve diferença significativa entre as taxa de aquisição de ToSRV e TGVV em insetos alimentados em folhas com infecção simples e mista. Mas, a porcentagem de infecção por ToSRV em plantas inoculadas por vetor e por agroinoculação (inoculação simples ou mista) foi invariavelmente superior à taxa de infecção por TGVV em todos os ensaios realizados. Verificou-se que a infecção de tomateiro pelo isolado de ToSRV é mais eficiente quando comparado com a infecção por TGVV. Em infecções simples e mistas, a taxa de plantas infectadas com ToSRV foi maior em todos os ensaios. Em conclusão, muito provavelmente a predominância de ToSRV em campo está relacionada com a maior eficiência de colonização e infecção do ToSRV em tomateiro e também com a maior eficiência de transmissão pela mosca-branca de ToSRV, sugerindo a excelente adaptação dessa espécie em tomateiro em condições de cultivo no Brasil. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The tomato plant is one of the major vegetable grown in the country and is also the crop most damaged by numerous pathogens. Among the main viral diseases that affect this crop, the following viruses are specially important: Tomato severe rugose virus - ToSRV and Tomato golden vein virus (Begomovirus), Tomato spotted wild virus - TSWV and Groundnut ringspot virus - GRSV (Tospovirus), Cucumber mosaic virus - CMV (Cucumovirus); Pepper yellow mosaic virus - PepYMV and Potato virus Y - PVY (Potyvirus), and Tomato mosaic virus - ToMV (Tobamovirus), and more recently Tomato chlorosis virus - ToCV (Crinivirus). At present, begomoviruses are considered the most important viruses, given the species diversity and high incidence. These viruses belong to the family Geminiviridae, have one or two (DNA-A and DNA-B) genomic components, and are transmitted by sap-sucking whiteflies. The main objective of the present work was to evaluate the susceptibility of tomato materials cultivated in the country to the eight major viruses affecting the crop, to determine the begomovirus species prevalence in the country within 2009-2010, and to study the factors that influence the prevalence of ToSRV in tomato producing areas of Brazil. Initially, the resistance of tomato materials commonly planted in the country was evaluated to eight of the major viruses affecting this crop. Resistance was evaluated against inoculation of CMV, PVY, PepYMV, TSWV, ToMV and GRSV (mechanical inoculation), and ToSRV and TGVV (inoculation by whitefly). As a result, no immune-like resistance was observed against five out of eight tested virus species. Resistant materials were only found for TSWV, ToMV and PVY, whereas for the other viruses all cultivars were classified as susceptible. Only for begomoviruses, some cultivars (only for fresh market) showed different levels of resistance to isolates of begomoviroses. Then, the studies were focused on begomoviruses, and aimed to determine the current prevalent species in the country (collected within years 2009-2010) and to study the factors that influence the prevalence of ToSRV on tomatoes in Brazil. For the study on the prevalent begomovirus species, tomato isolates were sampled in the main growing regions of the country. Total DNA was extracted and the begomoviruses were detected using PCR. The positive samples were selected and they were amplified by RCA (rolling circle amplification) followed by genotyping by digestion with the frequent cutting enzyme, MspI. The diversity analysis was performed by comparison of migration patterns of digested DNA fragments in an agarose gel. A total of 600 positive samples were analyzed and 36 migration patterns were detected. One sample from each pattern was randomly selected, the DNA-A of each begomovirus present in the sample was partially sequenced (direct sequencing of RCA), and only the different species are being cloned and sequenced completely. As a result ToSRV was the predominant species, followed by Tomato mottle leaf curl virus (TMoLCV). In parallel, isolates of ToSRV and TGVV, species reported as more prevalent in the country, being TGVV apparently reducing in its incidence, were selected for the studies on the infection process and transmission by whiteflies. TGVV and ToSRV host range, including weeds and crops, was determined. Additionally, the infection kinetics was evaluated by agroinoculation of TGVV and ToSRV in single and mixed infections. Infection was monitored by symptom observation and virus detection by PCR from leaf samples collected every three days to determine the infection rate and percentage of plants infected with each virus. For the transmission tests, the whitefly inoculation protocols were initially optimized, by evaluating the procedure of acquisition, of inoculation, the number of insects per plant and the tomato cultivar used as the test plant. The standard methodology was defined by using the Viradoro cultivar, acquisition from infected detached tomato leaves in polyethylene tubes, and three insects per plant confined in plastic cups for inoculation. The acquisition and inoculation access periods were standardized in 48 hours. The transmission efficiency tests were performed with single and mixed infections. Additionally, the percentage of whiteflies that had acquired the virus 48h after inoculation was determined in single and mixed infections. As a result, no significant difference was found between the acquisition rate of ToSRV and TGVV in insects fed on leaves with single and mixed infections. However, the infection percentage of plants agro or vector-inoculated with ToSRV (single or mixed inoculation) was invariably higher than the rate of infection of TGVV in all tests. Infection of tomato plants by the ToSRV isolate was more efficient than infection with TGVV. In single and mixed infections, the rate of infected plants by ToSRV was higher in all tests. In conclusion, most probably the predominance of ToSRV in the field is related to the efficiency of colonization and infection of ToSRV in tomato plants and also to the higher efficiency of whitefly transmission, suggesting the excellent adaptation of this species in tomato under growing conditions in Brazil.