Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2012-07-13T21:03:09Z No. of bitstreams: 1 2012_RobertoFrancoTeixeiraCorrea.pdf: 2720649 bytes, checksum: b945bd8be445442134dfe63f5b6e8f6b (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-16T12:25:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_RobertoFrancoTeixeiraCorrea.pdf: 2720649 bytes, checksum: b945bd8be445442134dfe63f5b6e8f6b (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-16T12:25:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_RobertoFrancoTeixeiraCorrea.pdf: 2720649 bytes, checksum: b945bd8be445442134dfe63f5b6e8f6b (MD5) / Bacillus thuringiensis é uma bactéria Gram-positiva que produz proteínas formadoras de cristal ou δ-endotoxinas que compreendem as toxinas Cry, com atividade inseticida específica, e Cyt, com atividade citolítica inespecífica. Diferentes δ-endotoxinas mostram-se específicas para diferentes insetos-alvos. Esta especificidade deve-se a receptores de membrana distintos nas células do intestino dos insetos e à presença de diferentes proteases próprias dos insetos, necessárias para ativação proteolítica da prótoxina produzida na fase de esporulação do B. thuringiensis. Os genes cry4Aa, cry11A e cyt2Ba foram amplificados por PCR a partir das estirpes de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, S-1989 ou S-1806. Os produtos das PCR foram clonados em um vetor de expressão em B. thuringiensis, pSVP27A. O gene cyt2Ba foi também clonado em vetores de transferência para construção de baculovírus recombinantes para expressão da proteína Cyt2Ba nativa ou fusionada à proteína Poliedrina. Estirpes de B. thuringiensis acristalíferas foram usadas para expressão individual das proteínas. Após purificação e solubilização das proteínas heterólogas, as memsmas foram ativadas com tripsina ou suco gástrico de Spodoptera frugiperda, para a realização de ensaios de atividade em culturas de células de Lepidoptera, Diptera e mamífero. Foram usados, nos ensaios de citotoxicidade, 20 μg/mL de cada toxina Cry individual ou em combinações e 20 μg/mL ou 5 μg/mL da toxina Cyt2Ba. Atividades tóxicas das toxinas heterólogas ativadas por tripsina foram detectadas para todas as linhagens de células de insetos testadas, fato que não ocorreu após ativação das mesmas toxinas com suco gástrico de S. frugiperda. Para células humanas, apenas Cyt2Ba mostrou-se tóxica. Entretanto, a combinação entre Cyt2Ba e as toxinas Cry4Aa e Cry11A apresentou citotóxicidade maior que Cyt2Ba isoladamente, o que pode sugerir que Cyt2Ba funcione como receptor para Cry4Aa e Cry11A em células humanas. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Bacillus thuringiensis is a Gram-positive bacterium that produces crystal forming proteins, δ-endotoxins, which consist of Cry toxins harboring specific insecticidal activity, and Cyt toxins that contain non-specific cytolytic activity. Different δ-endotoxins are specific to different target insects. This specificity is due to distinct membrane receptors on the surface of the insect´s midgut cells and to the presence of different host´s proteases, which are necessary to proteolytic activation of the protoxin expressed during B. thuringiensis sporulation phase. The cry4Aa, Cry11A and cyt2Ba genes were amplified from Bacillus thuringiensis subsp. israelensis Brazilian strains, S-1989 or S-1806 by PCR. The PCR products were cloned into the B. thuringiensis expression vector, pSVP27A. The cyt2Ba gene was also cloned into transfer vectors to allow construction of recombinant baculoviruses, in order to express the native Cyt2Ba protein, or Cyt2Ba fusioned to the Polyhedrin protein. Acrystaliferous B. thuringiensis strains were used for the expression of the proteins individually. After purification and solubilization of the heterologous proteins, toxin activation by either trypsin or Spodoptera frugiperda´s gastric juice was carried out to perform citotoxicity assays using Lepidopteran, Dipteran and human cultured cells. Each Cry toxin was used at the concentration of 20 μg/mL, while Cyt2Ba was used at two different concentrations: 20 μg/mL or 5 μg/mL. Cytotoxic activities of the trypsin activated heterologous proteins were detected to all insect cell lines tested, but when the same proteins were digested by S. frugiperda´s gastric juice, no toxic activities were detected. Only Cyt2Ba was shown to be toxic to the human cells tested. Nevertheless, the combination of Cyt2Ba and both Cry4Aa and Cry11A toxins yelded a higher toxicity than that produced by Cyt2Ba isolatedly, which could suggest that Cyt2Ba could be functioning as a receptor for Cry4Aa and Cry11A on the surface of human cells.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Ciências Fisiológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-09-24T14:55:14Z No. of bitstreams: 1 2012_NatielaBeatrizdeOliveira.pdf: 3826943 bytes, checksum: bc95f23eec5132d04ee27298fb70b59f (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-10-02T12:25:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_NatielaBeatrizdeOliveira.pdf: 3826943 bytes, checksum: bc95f23eec5132d04ee27298fb70b59f (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-02T12:25:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_NatielaBeatrizdeOliveira.pdf: 3826943 bytes, checksum: bc95f23eec5132d04ee27298fb70b59f (MD5) / O escorpião da espécie Tityus mattagrassensis Borelli (1901). pertence à família Buthidae, e é endêmico do cerrado brasileiro, sendo encontrado em todo o Centro Oeste, Bahia e Norte de Minas Gerais. As espécies da família Buthidae são as principais responsáveis pelos acidentes ocorridos com humanos. Os acidentes com T mattogrossensis são considerados de pequena gravidade devido ao baixo grau de reação ã picada e de poucos casos registrados. A peçonha de escorpiões é uma mistura complexa de moléculas bioativas, porém, os componentes mais importantes são os peptideos neurotóxicos, que agem em canais iónicos de Na*, K* e Ca2'. As toxinas de escorpiões que agem em canais para Na' voltagem dependentes são divididas em duas famílias: as a-toxinas de escorpiões (a-NaScTx) que agem no sitio 3 do domínio IV do canal para sódio e com isso deixam a inativaçâo do canal mais lenta ou causam o bloqueio da inativaçâo; e as B-toxinas escorpiônicas (B-NaScTx) que se ligam ao sítio 4 do domínio II do canal e alteram o potencial para a ativação dos canais para Na*. Até o momento, não existem trabalhos com a caracterização da peçonha de Tityus mattogrossensis e o presente trabalho tem como objetivo caracterizar química e eletrofisíologicamente os peptideos componentes da peçonha do escorpião dessa espécie, com ênfase na caracterização de duas toxinas para canais Na,. A peçonha bruta foi fracionada mediante CLAli mostrou a presença de 65 facões, sendo 7 frações mais abundantes, que foram testadas de forma bioguiada em nervos de rã, por meio da técnica "Single Sucrose-Gap". Onde foram observadas quatro frações com atividade: uma que causou um relardo da repolarização do potencial de ação e três com atividade de redução do potencial de ação. Dessas, duas frações F5 (7308,5 m/z) e F6 (7108,0 m/z) tornaram-se foco do trabalho. As suas seqüências foram parcialmente obtidas por meio de sequenciamento "de novo" em MALDI-TOF/MS. E tiveram alta similaridade com outras toxinas de escorpiões do tipo B do gênero Tityus. Foram feitos testes preliminares eletroflsiológicos em "patch clamp" e a toxina F5, mostrou alta atividade em canais Nav 1.3, Nav 1.6, DUM e baixa atividade em DRG. A toxina F6 apresentou alta atividade em Nav 1.3 e essa atividade foi aumentada com um pré-pulso despolarizante. A F6 também apresentou ação em DRG. Porém, mais testes deveram ser feitos. A peçonha do escorpião T. mattagrassensis possui duas toxinas abundantes que agem sobre canais para sódio voltagem dependentes. E podem ser as primeiras toxinas descritas com atividade de bloqueio de Nav jâ descritas no gênero Tityus. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The endemic Brazilian cerrado scorpion Tityus mactagrossensis Borelli (1901), belongs to Buthidae family, and is found in the Brazil Midwest, Bahia and north of Minas Gerais states. The species of the Buthidae family are the main responsible for humans accidents. T. mattograssensis sting are considered as small gravity due to the low degree of reaction and the few recorded cases. The scorpion venom is a complex mixture of bioactive molecules, however, the most important components are neurotoxic peptides, which act on ion channels of Na\ K' and Ca2'The toxins of scorpions that act on channels for Na* voltage-dependent are divided into two families: the a-scorpions toxins (a-NaScTx) act at the site 3 domain IV of the channel to sodium, and thus slowing the channel inactivation level causing blockage or inactivation, and the |i scorpion toxins (8- NaScTx) that bind to site 4 of the domain II of the channel and changing the potential of activation of Na* channels. There are no characterization studies of T. mattogrossensis venom, this present work aims to characterize chemical and electrophysiological peptides of scorpion venom components of this species, with emphasis on the characterization of two scorpion sodium channel toxins. The crude venom fractionated by high performance liquid chromatography (HPLC) showed the presence of 65 fractions, with seven more abundant, which were bio-guided tested, using the technique Single Sucrose-Gap with frog's ciatic nerve. Four fractions showed neurotoxicity in this preparation: one caused a delay of action potential repolarization and three with reduced activity of the action potential. From these two fractions F5 (7308.5 m/z) and F6 (7108.0 m/z) became the focus of this study. Their sequences were obtained by partially sequencing "de novo" in MALDI-TOF/MS. Both had high identity with others Tityus B-scorpions toxins, suggesting theirs activity. Preliminary electrophysiological tests were performed in patch clamp and the toxin F5 showed high activity channels Nav 1.3, Na, 1.6 and DUM. and low activity in DRG. The toxin F6 showed high activity in Na, 1.3 and this activity was increased by a depolarizing pre-pulse. The F6 also presented action in DRG. However, further tests will be done. The two major toxins of T. mattogrossensis venom action on voltage-dependent sodium channels, and toxins can be the first already described with activity block Nar Tityus genus.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Ciências Fisiológicas, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-01-17T12:16:55Z No. of bitstreams: 1 2013_PriscillaGalanteRibeiro.pdf: 1737160 bytes, checksum: 4a420525f22119a33e4c567b33ad185e (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2014-01-23T14:46:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_PriscillaGalanteRibeiro.pdf: 1737160 bytes, checksum: 4a420525f22119a33e4c567b33ad185e (MD5) / Made available in DSpace on 2014-01-23T14:46:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_PriscillaGalanteRibeiro.pdf: 1737160 bytes, checksum: 4a420525f22119a33e4c567b33ad185e (MD5) / Peçonhas de vespas são formadas por um conjunto de moléculas com diversas ações farmacológicas, como as aminas biogênicas, as acilpoliaminas e os peptídeos, sendo estes últimos os mais abundantes. Atualmente, compostos neuroativos isolados de peçonhas de animais tem despertado grande interesse devido a seu potencial no desenho de novas drogas para prevenir ou tratar doenças como dor crônica, epilepsia e Parkinson, assim como novas ferramentas farmacológicas. Neste contexto, o estudo da peçonha de vespas tem proporcionado à descoberta de novos compostos neuroativos, mas, ainda, até o momento, a grande maioria dos peptídeos não foi identificada e avaliada. A vespa social Parachartergus fraternus tem uma marcante peculiaridade: embora estas vespas vivam em comunidade, a ação da sua peçonha é capaz de paralisar a presa de modo irreversível e não letal o que difere de outras vespas sociais que a utiliza apenas para proteção contra predadores. Esta diferença indica a presença de compostos com ação em estruturas do sistema nervoso. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi a identificação e o isolamento de peptídeos antinociceptivos da peçonha de P. fraternus. A peçonha de P. fraternus foi analisada por duas estratégias: fracionamento por CLAE seguido de MALDI/TOF e a construção da biblioteca de cDNA e sequenciamento. Uma fração específica foi separada por CLAE e após ser sequenciada de novo, teve sua sequência parcialmente determinada, com diversas ambiguidades e especialmente, entre Leucina e Isoleucina. Em relação ao transcritoma, um clone da biblioteca de cDNA foi identificado que codifica o peptídeo, o que possibilitou a completa determinação da sequência peptídica. A análise do sequenciamento revelou a presença de um precursor do peptídeo maduro, composto por um propeptídeo de 61 aminoácidos e com um possível sinal de clivagem. A sequência do peptídeo maduro foi determinada como ILGTILGLLKGL-NH2. Após busca nos bancos de dados, este peptídeo mostrou homologia com a Protonectina, identificada anteriormente na vespa Protonectarina sylveirae. Para o peptídeo sintético, duas modificações foram desenhadas e o peptídeo IFGTILGFLKGL-NH2 foi produzido ®por síntese em fase sólida (Aminotech ). A atividade antinociceptiva dos dois peptídeos foi avaliada utilizando o modelo de placa quente em camundongos Swiss (n=4-6/grupo). Os peptídeos foram injetados por via i.c.v. nas concentrações de 16 e 8 nmol/animal diluídas em solução veículo quatro dias após a implantação da cânula guia. Como controle positivo foi utilizado morfina (16nmol/animal) e como controle negativo foi utilizado água deionizada como veículo. A atividade antinociceptiva do peptídeo natural foi efetiva na concentração de 8 nmol/animal em 90, 120 e 240 min (p<0,05), enquanto que na concentração de 16 nmol/animal mostrou um efeito menor, provavelmente devido à neurotoxicidade. Já o peptídeo sintético mostrou uma resposta dose-dependente, sendo que na concentração de 16 nmol/animal a atividade antinociceptiva não diferiu estatisticamente (p>0,05) da morfina em todos os tempos testados (240min). O peptídeo sintético não mostrou atividade hemolítica, assim como o descrito na literatura para o peptídeo natural. Ao contrário do peptídeo natural, animais injetados com o peptídeo sintético não apresentaram déficit motor, na maior dose testada no teste de antinocicepção. Esses resultados corroboram a hipótese de que a peçonha de vespas possui um grupo de moléculas que atuam no SNC de mamíferos. O peptídeo sintético mostrou potencial de contribuir com o desenvolvimento da neurociência na elucidação da transmissão sináptica e no desenho de novas drogas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Wasp venoms are formed by several molecules, such as biogenic amines, acylpoliamines and peptides which are the most abundant component. Neuroactive compounds are of great interest for their relevant potential to design new drugs, important to prevent and/or treat diseases such as chronic pain, epilepsy and Parkinson, as well as to develop other pharmacological tools. In this context, the study of wasp venoms has lead to the discovery of neuroactive molecules, however most peptides have yet to be identified or characterized. The social wasp Parachartergus fraternus has a remarkable peculiarity: although these wasps live in community, their venom act by irreversibly and non-lethally paralyzing their prey, which differs from other social wasps, which typically uses the venom only for protection against prey. This difference in the mode of action suggests the presence of compounds with activity in the nervous system. For this reason, the aim of this study was the identification and isolation of antinociceptive peptides in the venom of P. fraternus. The venom of P. fraternus was analyzed by two complementary strategies: HPLC fractionation followed by MALDI-TOF analysis and cDNA library construction and sequencing. A specific fraction was identified by mass spectrometry (MALDI-TOF), however sequencing of this fraction was unable to unambiguously determine between Leucine and Isoleucine. Using the transcriptomic approach, the sequence of the precursor encoding this peptide was identified. The precursor encodes a propeptide of 61 amino acids with a putative signal peptide. The sequence of the mature peptide was determined as ILGTILGLLKGL-NH2. Similarity search in public databases showed that this peptide is identical to Protonectin isolated from Protonectarina sylveirae. A synthetic peptide with two amino acid substitutions, IFGTILGFLKGL-NH2, was produced by solid phase synthesis (Aminotech). Antinociceptive activity of both peptides was evaluated by the hot plate model in Swiss mice (n=4-6/group). The peptides were infused via i.c.v. at doses of 16 and 8 nmol/animal (in vehicle solution) four days after the implantation of the guide cannula. Morphine (16nmol/animal) was used as positive control and vehicle solution was used as negative control (2µL/animal). The analgesic activity of the natural isolated peptide was shown to be effective at 8 nmol/animal (p<0.05) in the time points of 90, 120 and 240 min whereas the higher dose of 16 nmol/animal showed a decreased effect, probably due to neurotoxicity. The synthetic peptide had a dose- dependent response, where the highest dose (16 nmol/animal) showed antinociceptive activity that did not differ (p<0.05) from morphine in all time points tested (240min). The synthetic peptide did not show hemolytic activity, similar to the natural peptide as shown in previous studies. Contrary to the natural peptide, animals injected with the higher dose of the synthetic peptide (16nmol/animal) did not show motor deficit in the antinociceptive test. Together, these results support the hypothesis that wasp venoms have a group of molecules with activity in the CNS of mammals. The synthetic peptide tested here showed the potential to contribute to the development of neuroscience in the elucidation of synaptic transmission and also in the design of new drugs.

orientador: Domingos da Silva Leite / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T16:22:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pancetti_AlessandraRoque_M.pdf: 4244205 bytes, checksum: 53fdcd93d28647a26b93f7db9190a2f2 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Neste trabalho foram pesquisadas as melhores condições de cultivo e estocagem da amostra de Escherichia coli 86-6136 para a produção da Toxina Citoletal Distensora (CLDT), assim como o melhor método de extração e purificação para a caracterização parcial da toxina. Após o que, foi realizada a produção de anticorpos neutralizantes policlonais em coelhos albinos e a análise dos efeitos citopáticos e citotóxicos da CLDT em cultura de células. O melhor meio para cultivo da amostra 86-6136 encontrado foi o "Evans Toxin Medium", pois com este meio foi verificada a produção de CLDT em ensaios de atividade citotóxica em cultura de células, com efeito semelhante ao descrito em literatura. Os estudos de obtenção da toxina demonstraram que o método mais vantajoso para a extração era a ultrasonicação do sedimento bacteriano, pois dispendia menos tempo e havia boa recuperação da atividade citotóxica, quando comparado com os outros métodos empregados, além de existir ganho no rendimento de mais de 4 vezes em atividade específica e 2 vezes em citotoxicidade, quando comparado ao sobrenadante inicial. Após a extração, o material foi submetido a diversos processos cromatográficos (Deae-Sepharose Fast-Flow; CM-Sepharose Fast-Flow; Phenil Sepharose; Sepharose CL6B; Sepharose CL4B; Superdex 200). A cromatografia que teve mais relevância para melhorar o grau de pureza da amostra foi em Sepharose CL6B. A amostra, quando submetida a cromatografia nesta resina, mostrou padrão de eluição com 3 picos, sendo que a atividade biológica estava concentrada no primeiro pico. Em eletroforese com SDS-P AGE, o material contendo atividade biológica apresentou 3 bandas, com os pesos moleculares estimados em 38,8; 37,3 e 22,4 kDa. Não foram obtidos resultados em ensaios eletroforéticos em P AGE convencional. Os ensaios cromatográficos em Sepharose CL6B resultaram em aumento de 100 vezes na citotoxicidade da amostra, e 237 vezes em atividade relativa. Os ensaios em cromatografia líquida de alta performance (HPLC) em coluna Mono-Q não permitiram a recuperação da atividade citotóxica da toxina CLDT, e por isso foram abandonados. A atividade da toxina CLDT pôde ser observada em cultura de células Vero, HeLa e CHO. Apenas nas células CHO tanto o efeito citopático quanto o citotóxico foram observados. Em ensaios em células Vero e HeLa, o efeito de distensão celular não é evidente, e em células Vero, a viabilidade celular, ao final das 120 hrs de ensaio, é bem maior em relação às outras duas linhagens. A produção de anticorpo policlonal em coelhos albinos pôde ser verificada em teste de imunodifusão radial dupla, e sua capacidade neutralizante foi observada em ensaios de soroneutralização em cultura de células CHO. Os antissoros obtidos apresentaram atividade neutralizante do efeito citotóxico da toxina CLDT no título até 1/1024 / Abstract: In this work, the best conditions of culture and stock methods of EscherichiQ coli 86-6136 strain for the production of citolethal distending toxin (CLDT), as well as its partial characterization, were studied. The production of polyclonal antibodies in rabbits and the study of citophatic and citotoxic effects of CLDT in culture cells was determined. The best growth medium found for CLDT production was Casaminoacid- Yeast Extract CA YE), as determined by biological activity assays in culture cells. The best method for CLDT extraction was sonic disruption of the bacterial cells. Higher yield of citotoxic activity was reached when compared to other methods, in addition to 4-fold increased specific activity and 2-fold citotoxicity, compared to the initial culture supernatant. After bacterial cells disruption, the supernatant was cromatographed on several columns (Deae-Sepharose Fast-Flow; CM-Sepharose Fast-Flow; Phenil-Sepharose; Sepharose CL6B; Sepharose CL4B; Superdex 200). The best method for increasingpurity was Sepharose CL6B. The material was separated in three peaks spectrophotometrically detected (absorbance 280 nm) among these the first one displayed biological activity. On SDS-PAGE, this material exhibited three bands whose M.W. were 38.8, 37.3 and 22.4 kDa. After cromatography on Sepharose CL6B, the material displayed increased citotoxicity and relative activity of 100 and 237-fold, respectively. High-performance liquid chromatography (HPLC) on Mono-Q column resulted in unrecoverable biological activity. The CLDT biological activity could be observed in Vero, ReLa and CRO cultured cells. Only in CRO, both citophatic and citotoxic effects could be observed. In Vero and HeLa cells the cellular progressive distention could not be observed and in Vero cells cellular viability was higher than in the other cells after 120 hr. Production of polyclonal antibodies was verified in Ouchterlony test and its neutralization capability was determined in seraneutralization tests in CHO cells. The sera obtained was shown to neutralize citotoxic activity of CLDT up to the 1/1024 dilution / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Tomomasa Yano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T11:39:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DellaColleta_HeloisaHelenaMithie_M.pdf: 7792651 bytes, checksum: ff84cc76671c0361c593dd32f633470a (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: o Fator Necrosante Citotóxico do tipo 2 (CNF 2) foi obtido através do rompimento celular bacteriano por ultra-som. Após a extração, purificou-se o CNF 2 por precipitação com sulfato de amônia, cromatografia em resina de troca aniônica Q­ Sepharose Fast Flow e em resina de gel filtração molecular Superdex 200. A atividade específica do CNF 2 purificado foi de 2.925 e o grau de pureza do material aumentou em tomo de 8.000 vezes. Ensaios de caracterização sorológica foram realizados com antissoros de coelho e camundongo. Os antissoros produzido_ contra CNF 2 foram capazes de inibir o efeito citotóxico de CNF 1 e CNF 2, sendo. que o título neutralizante foi maior contra o seu homólogo. Os antissoros, porém, não inibiram as atividades biológicas de VT 1, VT 2 e L T I. Em ensaios de imunodifusão radial, os antissoros reconheceram tanto CNF 1 como CNF 2, apresentando identidade parcial entre eles. Quando o antissoro foi absorvido com extrato sonicado de CNF 1, este passou a não mais reconhecer CNF 1. Nos ensaios de ELIS_ "wersten-blot" e "dot-ELISA" os antissoros não se mostraram específicos, reconhecendo além de CNF 2, CNF 1, VT 1, VT 2 e L T I. Foram realizados ensaios de caracterização do efeito biológico de CNF 2, que revelaram que esta toxina foi capaz de causar necrose em pele de coelho e em pata de camundongo. O efeito de multinucleação celular foi observado em células Vero e em células HeLa, sendo que em células Vero este efeito foi mais claramente observado; nas células HeLa foi possível observar aumento de células multinuc1eadas, que já eram observadas nos controles. Foi possível observar também, que a toxina leva ao acúmulo de RNA nos núcleos e à formação de grandes vacúolos ao redor do núcleo. Em ensaios de marcação dos componentes do citoesqueleto, foi possível verificar que, após 8 horas de tratamento com CNF 2, as células apresentam alterações dos filamentos de actina, com formação de fibras de estresse. Esse efeito aumenta conforme o teste é prolongado. Quanto aos microtúbulos, não foram observadas alterações claras. Parece ocorrer apenas uma adaptação destes filamentos à presença de mais de um núcleo. o estudo epidemiológico revelou que havia produção de CNF em 19,05% das amostras isoladas de fezes de bezerros e que, das amostras produtoras de CNF, 30,77% produziram também et.-hemolisina / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Tomomasa Yano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T16:07:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FalconMarquez_Rosabel_D.pdf: 7259844 bytes, checksum: 0e6b8786d8132690001b0097d422051c (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: A enterotoxina citotóxica de Aeromonas hydrophila (Ent-ctx) possui múltiplas atividades biológicas. Entre elas, está a capacidade de lisar eritrócitos, causar danos irreversíveis nas membranas celulares e induzir acúmulo de fluido no intestino em modelo animal. Neste estudo, as hemácias de rato foram mais sensíveis a ação citolítica da Entctx quando comparadas às outras hemácias. A IgG purificada anti-Ent-ctx foi capaz de neutralizar o efeito citotóxico da Ent-ctx, apresentando títulos maiores que 1: 16384, revelando uma única banda com um peso molecular aproximado de 54 kDa na análise do imunoblotting. A Ent-ctx causou perda de junção intercelular, crescente condensação nuclear, a fragmentação e eliminação de corpos nucleares e citoplasmáticos em linhagens celulares Vero (rim de macaco verde africano) e HT29 (epitélio intestinal humano). As análises ultraestruturais, assim como análise eletroforética em gel de agarose, reação de Feulgen, e a metodologia do TUNEL confirmaram que a Ent-ctx induziu apoptose em HT29. Os danos ocasionados pela Ent-ctx foram irreversíveis, constatando-se que a perda da função mitocondrial nas células HT29 precede a destruição da membrana celular. Estudos in vivo em células epiteliais intestinais de rato revelaram severa desorganização estrutural, levando a destruição de enterócitos, alterações em organelas intracelulares e a perda do arranjo das células do tecido conectivo. A presença de um infiltrado inflamatório difuso constituído por eosinófilos e neutrófilos foi constatada nas análises microscópicas. Através da técnica de PCR não foram detectados os genes responsáveis pela enteropatogenicidade em E. coli (L T-I, STa, STb) na amostra de A. hydrophila produtora da Ent-ctx. Neste estudo, as alterações morfológicas observadas em células intestinais epiteliais in vitro e in vivo, sugerem que a Ent-ctx está relacionada com a enteropatogenicidade de A. hydrophila / Abstract: The cytotoxic enterotoxin secreted by Aeromonas hydrophila (Ent-ctx) produces hemolytic and cytotoxic activities and possesses the ability to evoke a fluid secretory response in a ligated intestinal loop model, amongst other biological activities. In this study, rat erythrocytes were the most sensitive to the hemolytic activity. The cytopathic effects were neutralized using antiserum purified against the cytotoxin of A. hydrophila (titer > 1 :16384). The immunoblotting analysis revealed one only band with molecular weight of 54 kDa. Vero (African green monkey kidney) and HT29 (human epithelial intestinal) cells treated with the Ent-ctx became round and lost their adhesion to each other and to the substrate. Cytoplasmic blebbing, nuclear condensation, fragmentation and formation of apoptotic bodies also occurred. Intemucleosomal DNA fragmentation was detected by TUNEL labeling, Feulgen staining in situ and agarose gel electrophoresis. These results confirmed that the Ent-ctx of A. hydrophila induces apoptosis in HT29. The cytotoxic response of this enterotoxin was irreversible and progressive showed that the lost of mitochondrial function come first that destruction of membrane permeability. In vivo studies revealed a dramatic structural disorganization, leading organelles damage, degeneration of epithelial cells and lost of the connective tissue in rat epithelial intestinal cells. Microscopic observations showed migration of eosinophils and neutrophils through the intestinal epithelium. Using L T-I, STa, and STb of E.coli as probe no homology to the whole cell DNA of A.hydrophila (AH 191) strain was detected on PCR analyses. These alterations induced by the cytotoxic enterotoxin of A. hydrophila, suggest that mechanism of this toxin could be associated to the enteropathogenicity involving A.hydrophila strains / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Stephen Hyslo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T18:20:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_EricleisonCardoso_M.pdf: 4576236 bytes, checksum: f060332dfc56c8cc9398f30a084be354 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Peçonhas de vespas são capazes de produzir uma variedade de efeitos biológicos, tais como dor, edema, hipotensão, hepatotoxicidade e reações alérgicas. Com a exceção da peçonha da abelha Apis mellifera e de algumas (poucas) espécies de vespas sociais, as peçonhas de himenópteros brasileiros têm sido pouco estudadas. Neste trabalho, caracterizamos farmacologicamente as atividades nas peçonhas de três espécies de vespas sociais da família Vespidae (Polybia chrysothorax, Pseudopolybia compressa e Polybia rejecta) e duas espécies de hábitos solitários, da família Scoliidae, do gênero Pypper (pypper sp. 1 e Pypper sp. 2), todas da região nordeste do Brasil. Especificamente, avaliamos a atividade sobre músculo liso (íleo isolado de cobaia), a cardiotoxicidade em coração semi-isolado de barata, e a ação sobre neurotransmissão em nervo sensorial de crustáceo (siri azul, Callinectes danae) e em junção neuromuscular (preparação nervo frênico-diaftagmo) de camundongo. As peçonhas das três espécies sociais contraíram o íleo isolado de cobaia na faixa de 0.001-100 ~g/ml (dependendo da peçonha), com CEso de 0,25 :t 0,05 ~g/ml, 8,75 :t 1,25 ~g/ml e 7,65 :t 1,85 ~g/ml, (média:!:EPM, 1=4) para Polybia chrysothorax, Polybia rejecta e Pseudopolybia compressa, respectivamente. As peçonhas do gênero Pypper eram inativos neste tecido. A pré-incubação dos tecidos com atropina (antagonista dos receptores muscarínicos, 10 J.1M), metisergida (antagonista dos receptores 5-HT2 da serotonina, 10 JlM), e pirilamina (antagonista dos receptores HI da histamina, 10 f.lM) inibiu a atividade contrátil das três peçonhas sociais enquanto que o Hoe-140 (antagonista dos receptores B2 da bradicinina, 1 JlM) não afetou as respostas. Estes resultados indicam que as peçonhas sociais contêm aminas biogênicas (acetilcolina, histamina e serotonina) mas são destituídas de cininas. As três peçonhas (1-100 ~g) mostraram atividade cardiotóxica em coração semi-isolado de barata, sendo que as mais potentes foram P. chrysothorax e P. compressa; as peçonhas do gênero Pypper eram inativas nesta preparação. A investigação dos possíveis mecanismos responsáveis por este efeito através do uso de antagonistas/inibidores indicou que não houve envolvimento de aminas das peçonhas e que a causa mais provável era uma atuação a nível de canais iônicos, especialmente os de sódio e, em grau menor, os de potássio. A dosagem da atividade fosfolipásica das peçonhas mostrou a seguinte ordem de potência: P. chrysothorax/P. compressa> P. rejecta » Pypper spp., porém esta atividade parece contribuir pouco para os efeitos observados uma vez que a indometacina apenas retardou o início da cardiotoxicidade. Na neurotransmissão, as peçonhas de P. chrysothorax e P. compressa (100 Jlg cada) aumentaram a atividade elétrica espontânea (disparo de potenciais de ação) do nervo sensorial de crustáceo de forma semelhante ao efeito causado pela brevetoxina (10-6 M), uma toxina marinha que age no mecanismo de portão do canal de sódio. As peçonhas também inibiram o potencial de ação do nervo em experimentos de "sucrose gap", efeito este que foi abolido pela tetrodotoxina (10-6 M), bloqueador de canais de sódio voltagem-dependentes. Nestes experimentos, as peçonhas de P. rejecta e do gênero Pypper eram inativas. As peçonhas das duas espécies sociais P. chrysothorax e P. compressa (25-100 Jlg/rnl), mas não da social P. rejecta e das solitárias, inhibiram da neurotransmissão em preparações nervo fTênico-diaftagmo de camundongo (tempo para bloqueio de 50% da resposta contrátil: 40 :!: 5 min (n= 3) e 57 :!: 3 min (n= 3), respectivamente, na concentração de 100 Jlg/rnl). Esta inibição era irreversível por lavagem das preparações. As peçonhas sociais também despolarizaram a membrana da fibra muscular e da placa terminal da junção neuromuscular. Estes achados sugerem uma ação pós-sináptica com possível envolvimento pré-sináptico. As três peçonhas produziram alterações morfológicas no músculo do diaftagma compatíveis com a nuonecrose e correlacionada à sua atividade fosfolipásica. O ftacionamento das peçonhas de P. chrysothorax e P. compressa por HPLC em coluna de fase reversa CI8 resultou em vários picos. O principal destes da peçonha de P. chrysothorax foi seqüenciado. A seqüênciaobtida (ARSLLEGLGIRRGSA), indicou que o peptídeo pertence à família de peptídeos conhecidos como pompilitodotoxinas (pMTX), a qual contém duas isoformas, a-PMTX e J3-PMTX, purificados das peçonhas das vespas solitárias Anoplius samariensis e Batozonellus maculifrons, respectivamente. Esta toxina reproduziu a cardiotoxicidade em coração de barata e o bloqueio de neurotransmissão em crustáceos observados para a peçonha de P. chrysothorax. Os resultados deste estudo indicam que as peçonhas investigadas possuem várias atividades biológicas. A demonstração de que as ações cardio e neurotóxicas da peçonha de P. chrysothorax eram devidas em grande parte à presença de uma isoforma de PMTXs sugere que peçonhas de espécies de vespas sociais podem servir de fontes para moléculas com potencial utilidade como inseticidas / Abstract: Wasp venoms produce a variety of biological effects, including pain, edema, hypotension, hepatotoxicity and allergic reactions. With the exception of bee (Apis mellifera) venom and of a few wasp species, little is known of the toxinology of Brazilian hymenopterans. In this work, we examined the pharmacological activities of venom trom three species of social wasps (Polybia chrysothorax, Pseudopolybia compressa and Polybia rejecta, family Vespidae) and two species of solitary wasps of the genus Pypper (family Scoliidae) found in northeastern Brazil. Specifically, we evaluated the activity on smooth muscle (guinea pig isolated ileum), the cardiotoxicity in cockroach semi-isolated heart, and the action on neurotransmission in crustacean (Callinectes danae, blue crab) sensorial nerve and in mouse phrenic nerve-diaphragm preparations. The venoms ofthe three social species (0.001-100 ~glml, depending on the venom) contracted guinea pig isolated ileum, with ECso of 0.25 ~0.05 ~glrnl, 8.75 :t 1.25 ~glrnl and 7.65 :t 1.85 Ilglrnl (mean~SEM, n=4) for P. chrysothorax, P. rejecta and P. compressa, respectively. The venoms of the two species of Pypper were inactive in this tissue. Pre incubating the tissues with atropine (antagonist of muscarinic receptors, 1 O ~, methysergide (antagonist of serotonin 5-HT 2 receptors, 1 O ~, and pyrilamine (antagonist of histamine HI receptors, 1 O ~ inhibited the contractile activity of the three social venoms, whereas Hoe-140 (antagonist of bradykinin B2 receptors, 1 ~ had no effect on the responses. These results indicate that the social wasp venoms contained amines (acetylcholine, histamine and serotonin) but not kinins. The three venoms (1-100 Jlg) showed cardiotoxicity in cockroach semi-isolated heart, with the most potent being P. chrysothorax and P. compressa; the venoms of the genus Pypper were inactive in this preparation. Investigation of the mechanisms responsible for this effect based on the use of antagonists/inhibitors indicated that there was no contribution by venom amines and that the most probab1e cause was an action involving ion channels, especially sodium channels and, to a lesser degree, potassium channels. The venoms showed the following order of potency for their phospholipase A activity: P. chrysothorax/P. compresas> P. rejecta » Pypper spp. However, this activity contributed little to the observed effects since indomethacin only delayed the cardiotoxicity but did not abolish it. The- venoms of P. chrysothorax and P. compressa (100 Jlg each) increased the spontaneous electrical activity of crustacean sensorial nerve in a manner similar to that observe.d with brevetoxin (5xtO.7 M), a marine toxin that affects thegating mechanism of voltage-dependent sodium channels. These venoms also inhibited sensory nerve action potentials in sucrose gap experiments. This effect was abolished by tetrodotoxin (10-6 M), a blocker of voltage-dependent sodium channels. The venoms of P. rejecta and of the genus Pypper-were inactive in this preparation. The venom of the three social species (25-100 Jlglml), but not the solitary species, inhibited. neurotransmission in mouse phrenic nerve-diaphragm preparations (the time- for 50% blockade of the contractile responses was 40 j: 5 min and 57 j: 3 min for P. chrysothorax and P. compressa, respectively, at 100 Jlglml; n=3 each). This inhibition was irreversible by washing the preparations. The social wasp venoms also depolarized the muscle fiber membrane and tOO terminal endplate of neuromuscular junctions. These observations suggested a possible postsynaptic action for the venoms, with some presynaptic involvement. The three social venoms also produced morphologica1 alterations in muscle that were compatible- with myonecrosis. The- leveI of this damage- correlated with the venom PLA2 activity. The tractionation of P. chrysothorax and P. compressa venoms by RP-HPLC on a CI8 column resulted in several peaks. The main peak of P. chrysothorax venom was sequenced. The sequence obtaine-d (ARSLLEGLGIRRGSA) indicated that the peptide belonged to the family of peptides known as pompilidotoxinas (PMTX), which contains two isoforms, a-PMTX and Jj-PMTX, purified of the venoms of the- soltary wasps Anoplius samariensis and Batozonellus maculifrons, respectively. This toxin reproduced the cardiotoxicity in cockroach heart and the blockade of neurotransmisson in crustacean nerves seen with P. chrysothorax venom. The results of this study indicate that the venoms investigate-d had several biological activities. The demonstration that the cardio- and neurotoxicity of P. chrysothorax venom were largely attributable to the presence of a novel isoform of PMTXs suggests that venom social wasp of species may serve as a source of molecules with potential usefulness as insecticides / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Tomomasa Yano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-25T11:53:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Catani_CleideFerreira_D.pdf: 5873013 bytes, checksum: 5656176a69a0675e7a4b73dab8537c20 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: As enterohemolisinas (EHly) foram inicialmente detectadas em amostras de Escherichia co/i enteropatogênicas clássicas (EPEC), isoladas a partir de fezes de crianças com diarréia, sendo posteriormente detectada em amostras de E. co/i isoladas de animais. Esta hemolisina, diferentemente da a-hemolisina, não é liberada espontaneamente no meio de cultivo, sendo necessária sua extração da célula bacteriana. Entre os métodos de extração utilizados, a sonicação mostrou ser o método mais eficiente para a liberação da enterohemolisina. Para a detecção da atividade hemolítica, os diferentes materiais a serem testados foram incubados a 37°C por lh, em microplacas ou em tubos, com 1% de eritrócitos de carneiro lavados com tampão PBS. A amostra padrão de E. co/i C3888 foi utilizada para a produção e purificação da enterohemolisina. Esta cultura foi cultivada em meio TSB, acrescido de quelante de ferro EDDA, por 22 horas em shaker a 37°C. Após o cultivo, a cultura foi sonicada e precipitada com sulfato de amônio com 60% de saturação. O material precipitado foi cromatografado em coluna de DEAE FastFlow. As frações com atividade hemolítica foram recromatografadas em coluna de exclusão molecular Superdex 200 e posteriormente em coluna Mono Q no sistema HPLC. A fração com atividade hemolítica obtida da coluna Mono Q apresentou apenas uma banda de 60kDa em gel de SDS-P AGE. No processo de purificação foi obtido um aumento na atividade específica de 2800 vezes, e aproximadamente 100 vezes na atividade relativa. A atividade da EHly se manteve estável por diversos meses no sonicado de cultura, quando este foi mantido a baixas temperaturas (-20°C e -70°C). Entretanto, não foi possível manter a atividade da hemolisina pura nos processos finais de purificação. Apesar da utilização de três diferentes métodos de inoculação em coelhos, para a obtenção de antissoro específico anti-enterohemolisina, não foram obtidos resultados satisfatórios nos testes de neutralização realizados, já que os títulos de soroneutralização obtidos foram os mesmos com soros pré e pós-imunização. Em testes com diferentes culturas celulares, a enterohemolisina semi-purificada foi citotóxica para as culturas de células Hep-2, HeLa, Caco-2, Vero, MDBK e 3T3, com arredondamento celular e descolamento do tapete. As células CHO apresentaram um efeito citopático, com alongamento das células e aparente condensação do núcleo. Nos ensaios com camundongos, não foi observado letalidade ou toxicidade nos animais adultos ou nos recém-nascidos testados / Abstract: Enterohaemolysins (EHly) were ftrst detected in classical enteropathogenic Escherichia coZi strains (EPEC), isolated from feces of infants with diarrhea, and also detected in strains isolated from animaIs. Differring from a-haemolysin, EHly is not spontaneously released to culture medium. Sonication was the most efficient method to extract EHly. In order to detect haemolitic activity, the material was incubated for lh at 37°C in microplates or in tubes, with 1 % sheep erytrocytes, washed with PBS buffer. E. coZi strain C3888 was used to carry out production and puriftcation trials. Bacteria was cultivated in TSB medium with EDDA iron chelant, for 22h at 37°C. The cells were sonicated and the pellet submitted to cromatography in DEAE Fast-Flow column. The fractions that showed 8;ctivity were applied to Superdex-200 and Mono Q HPLC columns. The fraction with haemolitic activity obtained from Mono Q cromatography showed just one 60kDa band in SDS-P AGE electrophoresis gel. Increases of 2800 times in specrnc activity and aproximately 100 times in relative activity were obtained. The activity remained stable for several months in sonicated material when it was kept at low temperatures (-20°C to -70°C). However, it was not possible. to maintain the activity of pure haemolysin in the final purification procedures. Neutralization tests with specific anti-EHly antiserum did not present satisfactory results, despite the three different inoculation methods we tested in rabbits. Titles obtained with pre- and post-immunized sera were the same. In tests with different cell cultures, semipurified EHly proved to be citotoxic to Hep-2, HeLa, Caco-2, Vero, MDBK and 3T3 cells, showing cell rounding and detachment of the cell layer. CHO cells presented a cytopathic effect, with elongation and apparent condensation of the nuclei. No lethality or toxicity were observed in tests carried out in mice / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Ciências

Estudia bioquímicamente el veneno de Phymactis papillosa var. rubra-viridis, una de las 8 variedades de esta especie. Las anémonas son colectadas en la bahía de Ancón y luego trasladadas al laboratorio, donde el veneno es obtenido mediante shock hipotónico, colocando 7 ejemplares en un beaker con 30 ml de agua destilada, durante 60 minutos. Luego, el material es filtrado en papel Whatman y centrifugado a 12000 rpm por 30 minutos. El sobrenadante es liofilizado. El análisis electroforético del veneno soluble de Phymactis papillosa var. rubra-viridis muestra la presencia de 5 bandas proteicas con pesos moleculares entre 5 y 25.1 kDa. El veneno soluble es fraccionado por cromatografía de filtración en una columna de Sephadex G-50, obteniéndose cuatro picos de proteína (I, II, III y IV). Tanto en el veneno soluble como en las fracciones colectadas se mide actividad proteolítica, hialuronidasa, fosfolipasa, fosfatasa ácida y fosfatasa alcalina; así como, actividad hemolítica y neurotóxica. Se evidencia actividad proteolítica sobre caseína, en el veneno soluble y en los picos I y III. No se detecta actividad de hialuronidasa, fosfolipasa, fosfatasa ácida y fosfatasa alcalina. La actividad hemolítica, ensayada sobre eritrocitos humanos, se encuentra en el veneno soluble y en el pico II. Finalmente, tanto el veneno soluble como el pico III muestran ser neurotóxicos al ser inyectados intraperitonealmente en ratones albinos. Se concluye que el veneno soluble de P. papillosa var. rubra-viridis tiene actividad proteolítica, hemolítica y neurotóxica. / Tesis

Orientador : Domingos da Silva Leite / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-31T17:42:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_AlexSouzada_M.pdf: 2809054 bytes, checksum: a7208782bc39f37dd5ae5103b7c97476 (MD5) Previous issue date: 2002 / Mestrado