Se ha estudiado el veneno del escorpión Tityus sp. (aff. T. silvestris Pocock, 1897) habiéndose determinado que contiene 47,6% de proteína. Las proteínas del veneno fueron separadas a partir de 12,9 mg de veneno, mediante cromatografía de intercambio catiónico en CM Sephadex C-25, con buffer acetato de amonio 0,05 M pH 7,0 a temperatura ambiente y a un flujo de 11 mL/h. El perfil cromatográfico mostró la presencia de siete picos proteicos y por PAGE-SDS se diferenciaron por lo menos cinco bandas proteicas en el veneno crudo. Los ensayos de toxicidad han permitido identificar tres toxinas que afectan a Mus musculus y que se encuentran asociadas a los picos IV, V y VII; y asimismo se ha detectado toxicidad sobre Gryllus sp., la cual está asociada a los picos IV, V, VI y VII. Entre las actividades enzimáticas se ha determinado la presencia de actividad proteolítica sobre azocoll y caseína relacionada al pico I. También se ha encontrado actividad de hialuronidasa en el pico IV con una actividad específica de 205,6 μg/min/mg. Finalmente tanto en el veneno crudo como en las fracciones colectadas no se ha encontrado actividad de fosfolipasa, anticoagulante ni hemolítica. / This research has shown that 47,6% of Tityus sp. (aff. T. silvestris Pocock, 1897) venom consists of protein. The venom proteins were separated from 12,9 mg of venom using cationic exchange chromatography in CM Sephadex C-25 with a 0,05 M ammonium acetate buffer pH 7,0 at room temperature and 11 mL/h flow. The chromatography profiles show seven peaks of proteins and by PAGE-SDS, five protein bands were distinguished in the crude venom. The toxicity assays allowed the identification of three toxins that affect Mus musculus which were associated to peaks IV, V and VII. Toxic proteins to Gryllus sp. were also found associated to peaks IV, V, VI and VII. Through the enzymatic activity, the presence of proteolytic activity was found related to the first peak, which has activity over azocoll and casein. Hyaluronidase activity has also been found in the peak IV with a specific activity 205,6 μg/min/mg. However, the crude venom and collected fractions did not show any phospholipase, anticoagulant, nor hemolytic activity.

Del veneno del escorpión Brachistosternus ehrenbergii, se ha aislado una toxina específica para ratones. La toxina denominada Be1 fue purificada mediante cromatografía de intercambio catiónico, en CM-Sephadex C-25 (16 x 1,1 cm) con buffer acetato de amonio 0,05 M a pH 7, y se caracteriza por ser una proteína básica que constituye el 8,1 % de la proteína total del veneno. La pureza de la toxina fue evaluada por electroforesis en condiciones nativas, de acuerdo al método de Reisfeld, y en condiciones denaturantes por el método de Schägger y von Jagow, determinándose que la toxina es de una sola cadena polipeptídica de 6,3 kDa. La toxina al ser inoculada en ratones albinos adultos; vía intraperitoneal (62 µg) produce la aparición de algunos signos locales como hipersecreción salival seguido por cuadros de afección respiratoria, arrastre de las patas posteriores, hasta causar la muerte. Vía intramuscular (7,6 µg), Be1 produce parálisis temporal de la extremidad inoculada. La toxina no tiene actividad de fosfolipasa, proteasa, acetilcolinesterasa ni actividad inhibidora de acetilcolinesterasa. / From Brachistosternus ehrenbergii scorpion venom a specific toxin to mice has been isolated. The toxin denominated Be1 was purificated by means of cationic exchange chromatography on CM-Sephadex C-25 column (16 x 1,1 cm) with ammonium acetate buffer 0,05 M at pH 7, and it characterizes to be a basic protein that constitute 8,1 % of venom total protein. Toxin purity was evaluated by electrophoresis in natives conditions, according to Reisfeld-method, and denaturants conditions by the Schägger-and-von Jagow-method, the toxin is a single chain polypeptide of 6,3 kDa has been determined. The toxin to be inoculated on albino mice; intraperitoneal way (62 mg of Be1) produces some local signals as salival hipersecretion followed by respiratory affection, drags hind feet until death. Intramuscular way (7,6 mg) produces temporal paralysis of the inoculated limb. The toxin has neither phospholipase, nor protease, nor acetylcholinesterase nor acetylcholinesterase inhibitor activity.

Orientador: Mario Sergio Palma / Coorientador: José Roberto Aparecido dos Santos-Pinto / Banca: Daniel Martins de Souza / Banca: Paulo Cesar Gomes / Resumo: A aranha Nephila clavipes pertence ao grupo das aranhas construtoras de teias orbitais, que desenvolveram a capacidade de sintetizar fios adesivos. Esses fios adesivos são encontrados nos círculos centrais destas teias, e apresentam gotículas oleosas contendo vesículas que aprisionam em seu interior soluções de proteínas, peptídeos e muitos compostos de baixa massa molecular. Estudos da análise química dessas gotículas identificaram toxinas, ácidos graxos saturados e até alcaloides. Especula-se que quando um inseto presa é aprisionado pela teia, os ácidos graxos dessas gotículas auxiliam no processo de desestabilização da cutícula do inseto, permitindo a difusão das toxinas para o interior do corpo da presa. Também são relatados alcaloides que atuam como repelentes a predadores em algumas teias, e como inseto-toxinas em outras. A presença dessas moléculas são evidências de que a teia não é uma simples ferramenta para captura mecânica e aprisionamento de presas, mas sim uma complexa estrutura, que parece desempenhar um papel estratégico "ativo" na captura de suas presas. Considerando isso, o objetivo deste estudo foi analisar a ultraestrutura, a disposição das gotículas sobre os fios de seda, e visualizar a presença de vesículas lipídicas extraídas das gotículas da teia orbital da aranha N. clavipes através de microscopia. Além disso explorou-se a riqueza do perfil químico dos compostos de baixas massas moleculares da seda da teia através da cromatografia gasosa bidimensiona... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nephila clavipes belongs to the group of orb-weavings spiders that have developed the ability to synthesize adhesive threads. Such adhesive threads are found in the core circles of the orb-webs, and present oily droplets which in turn contain many vesicles in suspension, entrapping solutions of proteins, peptides and many small-molecular mass compounds. Chemical analysis studies of these droplets identified toxins, saturated fatty acids and even alkaloids. It is speculated that when an insect-prey is trapped by the web, the fatty acids of these droplets aid in the process of destabilizing the insect cuticle allowing the diffusion of the toxins into the prey body. Some studies also reported alkaloids that act as repellents to predators in some webs, and as insect-toxins in others. The presence of these molecules is evidence that the web is not a simple tool for mechanical capture and imprisonment of prey; but rather a complex structure that seems to play a strategic "active" role in capturing its prey. Considering this, the aim of this study was to analyze the ultrastructure, the disposition of the droplets on the silk fibers, and to visualize the presence of lipid vesicles extracted from the web's droplets of N. clavipes spider, by microscopy. In addition, the richness of the chemical profile of the small-molecular mass compounds in the web-silk was explored through comprehensive two-dimensional gas chromatography coupled to a mass detector; and finally to investigate the richness of proteins present in web-silk and silk-producing glands through in solution proteolytic digestion, liquid chromatography, and mass spectrometry, highlighting the possible toxins involved in the prey paralysis. First, was performed scanning electron microscopy study of the droplets deposited on the web-silk and light microscopy of the suspended lipid vesicles retained within the aqueous ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Katia Cristina Kupper / Coorientador: Marco Aurélio Takita / Banca: Helia Harumi Sato / Banca: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Resumo: O bolor verde e a podridão azeda destacam-se entre as doenças de pós-colheita em frutos cítricos, causados por Penicillium digitatum e Geotrichum citri-aurantii, diminuindo a qualidade e a quantidade dos frutos e, consequentemente, resultando em significativas perdas econômicas. Uma alternativa para controle destes fungos é através da toxinas killer produzidas por algumas espécies de levedura, capazes de matar fungos filamentosos. Saccharomyces cerevisiae produz toxinas killer proteicas que são letais para células sensíveis de levedura. Estas toxinas foram agrupadas em quatro tipos, K1, K2, K28 e Klus, codificado por elementos extra cromossomais associados a partículas virais na forma de dsRNA. Este trabalho tem como objetivo caracterizar a toxina killer de S. cerevisiae ACB-K1 e testar sua atividade antagônica em patógenos pós-colheita de citros. O isolado ACB-K1 apresentou atividade killer, sobre levedura sensível (S. cerevisae NCYC 1006) além do fitopatógeno P. digitatum, não apresentando porém inibição contra o patógeno G. citri-aurantii. A toxina apresentou máxima atividade em pH 4,1 a 22 °C, tanto para a levedura sensível quanto para o fitopatógeno P. digitatum. A toxina apresentou estabilidade em diferentes pH de 4,1 a 6,0, após a incubação de 24h a 22 °C sobre o fungo. O isolado ACB-K1 apresentou dsRNA, sendo detectadas duas formas (LA e M-dsRNA), sugerindo que a base genética para a produção da toxina é extra cromossomal, dado confirmado pela cura do fenótipo killer ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Green mold and sour rot are among post-harvest diseases in citrus fruits, caused by Penicillium digitatum and Geotrichum citri-aurantii, reducing a quality and quantity of fruits and, consequently, resulting in significant economic losses. An alternative for the control of fungi is using killer toxins produced by some species of yeasts, capable of killing filamentous fungi. Saccharomyces cerevisiae produces protein killer toxins that are lethal to yeast sensitive cells. These toxins were grouped into four types, K1, K2, K28 and Klus, encoded by extrachromosomal elements associated with viral particles in the form of dsRNA. This work aims to characterize a killer toxin of S. cerevisiae ACB-K1 and to test its antagonistic activity in post-harvest citrus pathogens. The isolate ACB-K1 showed activity killer on sensitive yeast (S. cerevisae NCYC 1006) besides the phytopathogenic P. digitatum, but did not present inhibition against the pathogen G. citri-aurantii. The killer toxin showed maximum activity at pH 4.1 at 22 ° C for both a sensitive yeast and the phytopathogenic P. digitatum. The toxin presented stability at pH range from 4.1 to 6.0, after a 24h incubation at 22 ° C on the fungus. The ACB-K1 isolate showed dsRNA and two forms were detected (LA and M-dsRNA), suggesting that a genetic basis for a toxin production is extrachromosomal, confirmed by curing the killer phenotype at 40 ° C. The fractions obtained by exclusion chromatography Sephadex G75 gel, de... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2008. / Submitted by Jaqueline Oliveira (jaqueoliveiram@gmail.com) on 2008-11-11T17:41:24Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_EdelynCristinaNunesSilva.pdf: 722567 bytes, checksum: 1b3be02fe3bdcdc6f5a4f597746d49f7 (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2008-12-03T12:17:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_EdelynCristinaNunesSilva.pdf: 722567 bytes, checksum: 1b3be02fe3bdcdc6f5a4f597746d49f7 (MD5) / Made available in DSpace on 2008-12-03T12:17:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_EdelynCristinaNunesSilva.pdf: 722567 bytes, checksum: 1b3be02fe3bdcdc6f5a4f597746d49f7 (MD5) / A peçonha de escorpiões é uma complexa mistura de peptídeos que modulam canais iônicos, antimicrobianos, potencializadores de bradicinina, hemolíticos, e com outras atividades biológicas, sendo importante alvo de estudos para o desenvolvimento de novos fármacos. Os estudos de caracterização proteômica, principalmente com escorpiões da família Buthidae, têm descrito várias toxinas, contudo há pouco conhecimento sobre os processos celulares da glândula de peçonha. A metodologia de busca por ESTs tem sido utilizada em vários trabalhos porque é um método rápido e confiável para a detecção dos genes expressos na glândula, que sintetizam produtos conhecidos ou não. O presente trabalho é o primeiro estudo de caracterização dos transcritos da glândula de peçonha do escorpião brasileiro Opisthacanthus cayaporum (Ischnuridae), por meio da construção de uma biblioteca de cDNA. Foram analisadas 130 ESTs, resultando em 67 seqüências de nucleotídeos distintas com alta qualidade, sendo formadas por em média 535 pares de bases (variando entre 139 e 902 nucleotídeos). Das 130 ESTs, 30% são prováveis toxinas de O. cayaporum, (7 contigs e 8 singletos), 36% correspondem a proteínas relacionadas a diferentes processos celulares (16 singletos e 4 contigs), 17% são seqüências que não foi possível atribuir função, pois apresentaram expectância >10-5, 15% seqüências que não foi encontrada identidade com peptídeos depositados no GenBank e 6% correspondem a seqüências caracterizadas de genomas. Foram descritas 15 seqüências distintas com identidade a toxinas, sendo 9 semelhantes à toxinas bloqueadoras de canais para potássio, 4 toxinas sem pontes dissulfeto e com atividade antimicrobiana e 2 seqüências com identidade a fosfolipases. As seqüências de aminoácidos obtidas a partir da caracterização da biblioteca de cDNA, neste trabalha, apresentaram distribuição de massas moleculares semelhante àquelas descrita pela análise proteômica de O. cayaporum. A seqüência nomeada Cayaporina (NDBP 3.7), de massa teórica calculada de 4675 Da, foi purificada da peçonha bruta e teve sua seqüência de aminoácidos obtida por seqüenciamento de novo e por degradação de Edman. Esse peptídeo possui atividade antimicrobiana contra Escherichia coli, em concentração de 28µM e também inibiu o crescimento em 56% de Staphylococcus aureus, não tendo atividade hemolítica em hemácias humanas. Este trabalho demonstrou a riqueza e diversidade de componentes da peçonha dessa espécie, e foi caracterizado o primeiro peptídeo antimicrobiano não hemolítico isolado da peçonha de O. cayaporum. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Scorpions venom are a complex mixture of peptides that modulate ion channels, antimicrobials, bradykinin-potentiating, hemolytic, and other biological activities, and they are a potential source of pharmacological agents and physiological tools. The proteomics characterization, specially with the family Buthidae, have described several toxins, but there is little knowledge about the cellular processes of the gland. The ESTs approach has been used in several works because it is a rapid and reliable method for gene discovery, which synthesize products known or not. This work is the first study to characterize the transcripts of the venom gland of the scorpion Brazilian Opisthacanthus cayaporum (Ischnuridae), by constructing the library of cDNA. We analyzed 130 ESTs, resulting in 67 unique sequences with high quality and is formed by an average of 535 bp (ranging between 139 and 902bp). Of the 130 ESTs, 30% are toxins-like sequences (7 contigs and 8 singlets), 36% are sequences involved in gene and protein expression (16 singlets and 4contigs), 17% are sequences that was not possible to assign function and that may be new toxins have not described, 15% sequences that was not found identity with peptides deposited in GenBank and 6% are characterized by sequences of genomes. Fifiteen unique sequences had identity with the toxins, nine similar to potassium-channel-specific toxin, four NDBPs with antimicrobial activity and two sequences with identity will fosfolipases. Data obtained by the library of cDNA were linked with the molecular masses of O. cayaporum proteomics characterization, and observed that there is similarity in the distribution of molecular masses. The sequence named Cayaporina, theoretical mass calculated is 4675 Da, was purified from crude venom and had its sequence of amino acids obtained by de novo sequencing and Edman degradation. This peptide has antimicrobial activity againt Escherichia coli, a concentration of 28 μM also inhibited the growth in 56% of Staphylococcus aureus, not having hemolytic activity in human erythrocyte. This study demonstrated the richness and diversity of components of the O. cayaporum venom, and was characterised the first antimicrobial peptide not hemolytic isolated from the O. cayaporum venom, appointed Cayaporina (systematic name: NDBP 3.7).

Orientador: Kátia Cristina Kupper / Coorientador: Maurício Ventura Mazzi / Banca: Taicia Pacheco Fill / Banca: Maria Fátima das Graças Fernandes da Silva / Banca: João Martins Pizauro Junior / Banca: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Resumo: O fenômeno killler é característico de leveduras que produzem e excretam proteínas ou glicoproteínas que são inibidoras de células microbianas sensíveis. A estabilidade e atividade das toxinas killer são altamente sensíveis a fatores como pH, temperatura de incubação das leveduras, composição e propriedades físico-químicas do meio e concentração de células sensíveis. Sporobolomyces koalae é uma nova espécie de levedura com potencial para produção de toxina killer. No intuito de se conhecer mais sobre as funções desse microrganismo no ecossistema, esse trabalho teve por objetivos: (i) detectar a atividade killer do precipitado proteico de S. koalae, (ii) caracterizar bioquimicamente e funcionalmente o precipitado proteico S. koalae, (iii) purificar parcialmente a toxina killer produzida por S. koalae e, finalmente, (iv) verificar sua ação antagônica sobre Geotrichum citri-aurantii e Penicillium digitatum, patógenos que ocorrem na póscolheita de citros. Pelos resultados obtidos neste trabalho, foi possível detectar a presença de atividade killer no precipitado proteico da levedura S. koalae contra células sensíveis da levedura Saccharomyces cerevisiae NCYC 1006. O precipitado proteico da levedura apresenta várias proteínas com diferentes tamanhos moleculares e, parte dessas proteínas é positiva para atividade de β1,3-glucanase, quitinase e protease, podendo ser uma dessas enzimas ou, o sinergismo entre elas, o responsável pelo fator killer da levedura. A funcionalidade de suas ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The killer phenomenon is characterized by yeasts that produce and excrete proteins or glycoproteins that are inhibitors of sensitive microbial cells. The stability and activity of killer toxins are highly sensitive to the factors such as pH, the temperature of incubation of yeasts, composition and physical-chemical properties of the medium and concentration of sensitive cells. Sporobolomyces koalae is a new species of yeast with potential for killer toxin production. In order to know more about the functions of this microorganism in the ecosystem, this work had as objectives: (i) to detect the killer activity of the S. koalae protein precipitate, (ii) to characterize biochemically and functionally the S. koalae protein precipitate, (iii) to partially purify the killer toxin produced by S. koalae, and, finally, (iv) to verify its antagonistic action on Geotrichum citri-aurantii and Penicillium digitatum, pathogens that occur in the postharvest of citrus. By the results obtained in this work, it was possible to detect the presence of killer activity in the protein precipitate of S. koalae against sensitive cells of Saccharomyces cerevisiae NCYC 1006. The protein precipitate from yeast has several proteins with different molecular sizes and some of these proteins are positive for β1,3-glucanase, chitinase and protease activity. It may be one of these enzymes or synergism between them, the responsible for the killer factor. The functionality of their proteins for killer activity ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-10-24T17:42:22Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 897910 bytes, checksum: 6d223abfcfc5662f26f3080c04b84c76 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-24T17:42:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 897910 bytes, checksum: 6d223abfcfc5662f26f3080c04b84c76 (MD5) Previous issue date: 2000-12-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Clostridium perfringens tipo B, bactéria anaeróbia, heterofermentativa, gram-positiva e produtora de toxina, é importante agente causador de doenças entéricas em animais. As toxinas inativadas α, β e ε produzidas por esse microrganismo estão presentes na composição das vacinas veterinárias contra clostridioses. Neste trabalho, estudou-se o efeito da composição do meio de cultura e do pH sobre o crescimento e produção de toxinas por Clostridium perfringens Tipo B para produção de vacinas veterinárias. Foram estudadas as concentrações iniciais da glicose e a presença de diferentes hidrolisados protéicos no meio – peptona de carne e peptona de caseína – e suas combinações. Os experimentos foram realizados em culturas conduzidas sob regime de batelada, com o uso de meio basal recomendado na literatura, observando-se a produção máxima de toxinas. Amostras foram coletadas a cada hora para determinação da concentração de células, ácido lático, ácido acético, ácido propiônico, ácido fórmico, etanol e glicose. Os melhores resultados foram obtidos quando o pH foi mantido em 6,5, utilizando-se 10,0 g.L-1 de glicose e 10,0 g.L-1 de hidrolisado protéico. A origem da proteína não teve influência significativa sobre o cultivo e a produção de toxinas. Pela análise da cinética de crescimento e produção, evidenciou-se que a formação de toxinas está associada ao crescimento. O presente estudo permitiu encontrar parâmetros satisfatórios de cultivo, que foram utilizados na ampliação de escala para produção industrial de vacinas contra clostridioses causadas por C. perfringens tipo B. / Type B Clostridium perfringens, anaerobic, hetero-fermentative, gram- positive and toxin producer bacteria is an important agent of enteric diseases in animals. The α, β and ε inactivated toxins produced by this microorganism are present in the composition of veterinary vaccines against diseases. In this work, the effects of culture medium composition and pH on growth and toxin production by the bacteria were studied. The initial glucose concentrations and the presence of different hydrolytic proteins in the medium – meat peptone and casein peptone – and their combination, were studied. The experiments were conducted in the batch system, using basal medium as recommended by literature. The best results were obtained when pH was kept at 6.5, using 10.0 gL-1 glucose and 10.0 gL-1 hydrolytic protein. The variation of the protein origin had no significant effect on the growth and toxin production. The analysis of the growth kinetics and production indicated that toxin formation is associated with growth. The present study permitted the finding of optimum growth parameters which were used in the amplification of scale for industrial production of vaccines against clostridial diseases caused by type B Clostridium perfringens. / Não foi localizado o cpf do autor.

Made available in DSpace on 2012-05-07T14:44:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000037.pdf: 3432272 bytes, checksum: 6fd23c7e5c7e46be4206f493ddaa6998 (MD5) Previous issue date: 2008 / A eficácia e seletividade do Bacillus sphaericus (Bsp) para larvas do vetor Culex quinquefasciatus é devida à ligação específica da toxina binária (Bin), principal proteína inseticida do Bsp, a um receptor presente no epitélio intestinal das larvas, a glicosidase Cqm1. Um mecanismo de resistência descrito para este culicídeo é devido a uma deleção de 19 nucleotídeos (d19) no gene cqm1 (cqm1-d19) que, em homozigose, impede a expressão do receptor no epitélio. O objetivo deste trabalho foi determinar a freqüência do alelo cqm1-d19 em populações naturais de Cx. quinquefasciatus, não tratadas e tratadas com o Bsp, além de avaliar polimorfismos no gene cqm1. Uma análise in vivo da susceptibilidade ao Bsp em larvas de Cx. quinquefasciatus mostrou que as populações não tratadas de Varadouro, Peixinhos e Fazenda Nova apresentaram valores de razão de resistência (RR) de 1,3 a 4,0 vezes, enquanto que para a população tratada de Água Fria a RR variou de 2,7 a 8,6 vezes, em relação à população susceptível usada como controle. Os valores de RR inferiores a 10 indicaram que não houve alteração significativa na susceptibilidade. Os alelos cqm1 e cqm1- d19 foram identificados através de método diagnóstico de PCR utilizando primers que flanqueiam a d19 e as amostras das populações analisadas variaram entre 162 e 353 larvas. O alelo cqm1-d19 foi detectado pela primeira vez em populações naturais e sua freqüência em áreas não tratadas da Região Metropolitana do Recife (RMR) foi de 1,16 x 10-2 em Varadouro e de 7,8 x 10-3 em Peixinhos. Na população de Fazenda Nova, isolada geograficamente da RMR, o alelo não foi detectado. Em Água Fria, tratada com o Bsp desde 2003, as freqüências foram bem mais elevadas em relação às populações não tratadas: 6,94 e 5,55 x 10-2 após 13 e 24 tratamentos, respectivamente. Em paralelo à detecção do alelo foi feita a avaliação da freqüência de expressão da -glicosidase Cqm1, através de ensaios enzimáticos in gel, e os resultados corroboraram aqueles de freqüência alélica em todas as populações. A partir da análise de polimorfismos no gene cqm1 em 15 indivíduos de Água Fria, foram identificados 13 alelos, baseados em 13 alterações na seqüência de aminoácidos, a maioria na região C terminal. Dentre os alelos identificados, dois ocorreram em maior freqüência e os demais foram variações destes principais. Os resultados deste estudo mostraram que a freqüência do alelo cqm1-d19 é alta em populações naturais, e mais elevada naquelas que estão sob pressão de seleção, além de demonstrarem que o gene cqm1 é altamente polimórfico. As abordagens moleculares utilizadas neste estudo são mais sensíveis que os bioensaios, visto que foi possível detectar indivíduos heterozigotos e homozigotos resistentes, e são adequadas para avaliar a susceptibilidade de populações de Cx. quinquefasciatus ao Bsp. Estes dados reforçam a adoção de medidas visando o uso sustentável do biolarvicida Bsp em programas de controle de vetores

LIMA, Bruno Bezerra. Efeitos das toxinas A e B do Clostridium difficile sobre a via de WNT/Beta-catenina em células epiteliais intestinais. 2014. 79 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-05-19T12:12:30Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_bblima.pdf: 2558018 bytes, checksum: 9b5ba19b7dbb3fd33020f7fcd72564f7 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-05-19T12:37:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_bblima.pdf: 2558018 bytes, checksum: 9b5ba19b7dbb3fd33020f7fcd72564f7 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-19T12:37:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_bblima.pdf: 2558018 bytes, checksum: 9b5ba19b7dbb3fd33020f7fcd72564f7 (MD5) Previous issue date: 2014 / Clostridium difficile toxins A and B (TcdA and TcdB) are homologous glycosyltransferases that inhibit a group of small GTPases within host cells, but several mechanisms underlying their pathogenic activity remain unclear. Here, we evaluated the effects of TcdA and TcdB on the Wnt/Beta-catenin pathway, the major driving force behind the proliferation of epithelial cells in colonic crypts. IEC-6 and RKO cells stimulated with Wnt3a-conditioned medium were incubated with 10, 50 and 100 ng/mL of TcdA or TcdB for 24h, resulting in a dose-dependent inhibition of the Wnt signaling, as demonstrated by a T-cell factor (TCF) reporter assay. This was further confirmed by immunofluorescence staining for nuclear localization of Beta-catenin and western blotting for Beta-catenin and c-Myc (encoded by a Wnt target gene). Moreover, our western blot analysis showed a decrease in the Beta-catenin protein levels, which was reversed by z-VAD-fmk, a pan-caspase inhibitor. Nonetheless, TcdA was still able to inhibit the Wnt/Beta-catenin pathway even in the presence of z-VAD-fmk, lithium chloride (a GSK3B inhibitor), or constitutively active Beta-catenin, as determined by a TCF reporter assay. Furthermore, pre-incubation of RKO cells with TcdA for 12h also attenuated Wnt3a-mediated activation of Wnt signaling, suggesting that inactivation of Rho GTPases plays a significant role in that inhibition. Taken together, these findings suggest that attenuation of the Wnt signaling by TcdA and TcdB is important for their anti-proliferative effects. / As toxinas A e B do Clostridium difficile (TcdA e TcdB) são glicosiltransferases homólogas que inibem um grupo de pequenas GTPases dentro da célula hospedeira, contudo, vários mecanismos envolvidos na atividade patogênica dessas toxinas permanecem desconhecidos. No presente estudo, avaliamos os efeitos das TcdA e TcdB na via de Wnt/Beta-catenina que representa a força motora principal responsável pela proliferação das células epiteliais nas criptas colônicas. Foram utilizadas células IEC-6 (células epiteliais de criptas de Rattus novergicus) e RKO (células de adenocarcinoma de cólon humano). Estas células foram estimuladas com meio condicionado contendo Wnt3a e incubadas com 10, 50 ou 100 ng/mL de TcdA ou 1, 5 ou 10 ng/mL de TcdB por 24h, resultando em uma inibição dose-dependente da via de sinalização canônica de Wnt, como demonstrado pelo ensaio de repórter de fator de célula T (TCF). Esse resultado foi corroborado pelos dados da imunofluorescência com marcação para a localização nuclear de Beta-catenina e por western blotting para Beta-catenina e c-MYC (gene-alvo da via de Wnt). Além disso, os dados do experimento de western blot evidenciaram uma diminuição dos níveis da proteína Beta-catenina, o qual foi prontamente revertido por z-VAD-fmk, um pan-inibidor de caspase. Entretanto, a TcdA ainda foi capaz de inibir a via de Wnt/Beta-catenina mesmo na presença do z-VAD-fmk, cloreto de lítio (um inibidor de GSK3Beta) ou plasmídeo de Beta-catenina constitutivamente ativo, como determinado pelo ensaio do TCF (TOPFlash/Luciferase). O estudo evidenciou ainda que a pré-incubação de células RKO com TcdA por 12h também atenuou a ativação da via de Wnt mediada por Wnt3a, o que sugere que a inativação de RhoGTPases, particularmente Rac1, possui um papel nessa inibição. Em conclusão, esses achados sugerem que a inibição da via canônica de Wnt pelas TcdA e TcdB representa um mecanismo importante da sua patogênese e explica seus efeitos anti-proliferativos.

Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2013-03-06T21:13:13Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoCDNA.PDF: 1649529 bytes, checksum: 00aae23f984e9db472f5a8b04b6c2e83 (MD5) / Approved for entry into archive by Neide Nativa (neide@sisbin.ufop.br) on 2013-03-13T19:33:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoCDNA.PDF: 1649529 bytes, checksum: 00aae23f984e9db472f5a8b04b6c2e83 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-13T19:33:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoCDNA.PDF: 1649529 bytes, checksum: 00aae23f984e9db472f5a8b04b6c2e83 (MD5) Previous issue date: 2006 / O veneno de cobras, escorpiões, aranhas e outros animais venenosos é uma fonte rica em toxinas. Uma característica importante de algumas toxinas é o fato de serem espécie específicas. Neste trabalho, nós realizamos a clonagem da seqüência codificante para a toxina LTx2 da aranha Lasiodora sp. no vetor de expressão pET11a. Esta toxina foi previamente identificada, através da varredura de uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno desta aranha. A análise de similaridade, feita com o programa de alinhamento local BLAST, mostrou que esta toxina apresenta similaridade com as toxinas huwetoxina-II e huwetoxina-VII da aranha Selenocosmia huwena, bem como com as toxinas LTx1 e LTx3 da Lasiodora sp. Após a clonagem no vetor de expressão, nós sequenciamos o produto da clonagem pelo método de Sanger e verificamos que o mesmo foi inserido no frame correto. A indução da expressão da toxina recombinante foi feita usando IPTG na concentração de 0,6 mM, por 3-4 horas. Através de ensaios imunoquímicos, nós constatamos que neste sistema a proteína recombinante é expressa sobretudo na forma de corpos de inclusão. Definimos então, uma estratégia para obter a toxina solúvel renaturada. Utilizando uma solução contendo uréia na concentração de 6 M realizamos a desnaturação dos corpos de inclusão, e procedemos a renaturação da proteína recombinante através de diálise em um tampão de renaturação. A amostra foi então submetida a uma cromatografia líquida de alta pressão em coluna de fase reversa. Através de eletroforese e Western Blotting, nós observamos que a estratégia de purificação foi eficiente. Realizamos então um ensaio antimicrobiano, onde observamos que a toxina recombinante, na concentração de 400 mg/mL. inibiu o crescimento dos microrganismos Escherichia coli, Salmonella Agona e Staphylococcus epidermidis. A expressão e recuperação da proteína recombinante em maior quantidade permitirá a realização de testes em outros organismos e a realização de ensaios eletrofisiológicos. ____________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The venom from snakes, scorpions, spiders and other venomous animals is a very rich source of potent toxins. An interesting feature of some toxins is their remarkable species specificity. In the present work we cloned a sequence which codifies for the toxin LTx2 from the venom of the spider Lasiodora sp, in the expression vector pET11a. This toxin was previously identified in the screening of the cDNA library of the total venom. This toxin, when submitted to the local alignment tool, BLAST, shown similarity with the toxins huwetoxina-II and huwetoxina-VII, from the venom of the spider Selenocosmia huwena, as well as with the toxins LTx1 and LTx3 from Lasiodora sp. venom. After cloning in expression vector we verified if the fragment was inserted in the correct frame using the Sanger DNA sequencing method. The expression of the target protein was made by adding 0,6 mM IPTG to the media followed by a 3 to 4 hours incubation. With the assistance of immunochemical assays, we were able to detect that the target protein was been expressed in the form of inclusion bodies. Then we defined a strategy to recover the soluble refolded protein. Using a solution containing 6 M urea we proceed the solubilization of the inclusion bodies. The refolding of the soluble protein was made by the dialysis method in refolding buffer. The sample was, then, submitted to high pressure liquid chromatography, in a reversed phase column, to purify the protein. The purifying process was efficient, as shown by the Western Blotting and electrophoresis results. After that, we made an anti microbial assay, where we could see that the target protein, in the concentration of 400 mg/mL, inhibited the growth of the organisms used in the test. The expression and recovery of larger amounts of the target protein will allow tests with this toxin in other organisms and electrophysiological experiments.