Orientadora: Prof. Dra. Marcella Pecora Milazzotto. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2015. / A bioenergia destaca-se como um substituto relevante para os combustíveis fósseis e os A capacidade de selecionar o embrião com maior viabilidade para transferência às receptoras é um componente crucial para o sucesso das técnicas de reprodução assistida. Atualmente, avaliações morfológicas são utilizadas para selecionar os embriões com maior potencial de implantação, e apesar de se tratar de um método não invasivo e relativamente bem sucedido, ainda apresenta uma série de limitações. Nos últimos anos, o desenvolvimento de novas tecnologias tem possibilitado análises quantitativas e qualitativas para determinação da viabilidade dos embriões para melhoria da seleção embrionária. Em especial as tecnologias espectroscópicas e espectrométricas permitiram o desenvolvimento de novos métodos para a caracterização embrionária e predição do potencial de estabelecimento da prenhez. Assim, o objetivo deste trabalho foi a caracterização não invasiva de embriões bovinos pela análise dos perfis espectroscópicos e espectrométricos dos meios de cultivo de embriões com diferentes cinéticas de desenvolvimento visando a obtenção de padrões específicos baseados no fenótipo embrionário. Para isso, embriões bovinos foram produzidos in vitro por protocolos convencionais. Os zigotos foram transferidos para meios de cultivo individualmente e classificados em dois grupos: rápido (4 células-40hpi) e lento (2 ou 3 células-40hpi). Os meios de cultura foram coletados às 40, 96 e 168 horas pós-inseminação (hpi), tranferidos para criotubos e congelados a -80ºC até o momento das análises. A análise do metaboloma embrionário foi realizada por espectroscopia Raman. Para tal, gotas de meios de cultura foram cobertas com óleo mineral, sendo escaneadas por um sistema Raman triplo. Os dados foram normalizados e analisados por Análises de Componentes Principais (PCA), de Agrupamentos (Clusters) e por Loading plot. A análise do secretoma embrionário foi feita por MALDI-MS-TOF, através da extração dos metabólitos, sendo os espectros adquiridos pelo espectrômetro em modo de ionização positiva. Foram feitas analises estatísticas univariadas e multivariadas pelo software online Metaboanalyst. Os resultados obtidos pela espectroscopia Raman e espectrometria de massas demonstram que embriões com diferentes cinéticas de desenvolvimento possuem diferentes perfis espectroscópicos e espectrométricos ao longo do desenvolvimento embrionário, indicando que estes embriões consomem e/ou produzem diferencialmente metabólitos nos meios de cultura. Com base em nossos resultados, propomos com este estudo que a análise dos meios de cultura por espectroscopia Raman pode ser utilizada para fins de diagnóstico embrionário, pois permite uma caracterização rápida e global dos perfis embrionários relacionados a cinética, enquanto a espectrometria de massas pode ser utilizada para caracterização qualitativa dos embriões, permitindo a identificação do secretoma de embriões durante o cultivo in vitro. / The ability to select embryo with greater viability to transfer to the receptors is a crucial component to the success of assisted reproduction techniques. Currently, morphological assessments are used to select embryos with the highest implantation potential, although it¿ s a noninvasive and relatively successful, has still a number of limitations. In recent years, the development of new technologies has enabled quantitative and qualitative analyzes for the determination of viability of embryos to improve embryo selection. In particular spectroscopic and spectrometric technologies have permitted the development of new methods for embryo characterization and prediction of potential establishment of pregnancy. The objective of this study was non-invasive characterization of bovine embryos by analysis of spectroscopic and spectrometric profiling of embryo culture media with different kinetics of development in order to obtain specific patterns based on embryonic phenotype. For this, bovine embryos were produced in vitro by standard protocols. The zygotes were transferred to individual culture medium and divided into two groups: Fast (4 cells-40hpi) and slow (2 or 3 cells-40hpi). The culture media were collected at 40, 96 and 168 hours post-insemination (hpi) tranfered to cryotubes and frozen at -80 until the time of analysis. The analysis of the metabolome embryo was made by Raman spectroscopy. For this, droplets of culture media were overlaid with mineral oil being scanned by a triple Raman system. The data were normalized and analyzed by Principal Component Analysis (PCA), clusters and Loading plot. Analysis of embryonic secretome was made by MALDI-TOF-MS, through the extraction of the metabolites, and the spectra acquired by the spectrometer in positive ionization mode. Analyzes were performed univariate and multivariate statistics by the online software Metaboanalyst. The results obtained by Raman spectroscopy and mass spectrometry demonstrated that the development of embryos with different kinetics have different spectroscopic and spectrometric profiles during embryonic development, indicating that these embryos consume and /or produce differentially metabolites in the culture media. Based on our results, we propose that the analysis of Raman spectroscopy culture media may be used for diagnostic purposes embryo, since it allows a fast and comprehensive characterization of embryonic profiles related to kinetics, while mass spectrometry can be used for qualitative characterization of the embryo, allowing the identification of secretome embryo during in vitro culture.

Orientador: Mario Sergio Palma / Coorientador: José Roberto Aparecido dos Santos-Pinto / Banca: Daniel Martins de Souza / Banca: Paulo Cesar Gomes / Resumo: A aranha Nephila clavipes pertence ao grupo das aranhas construtoras de teias orbitais, que desenvolveram a capacidade de sintetizar fios adesivos. Esses fios adesivos são encontrados nos círculos centrais destas teias, e apresentam gotículas oleosas contendo vesículas que aprisionam em seu interior soluções de proteínas, peptídeos e muitos compostos de baixa massa molecular. Estudos da análise química dessas gotículas identificaram toxinas, ácidos graxos saturados e até alcaloides. Especula-se que quando um inseto presa é aprisionado pela teia, os ácidos graxos dessas gotículas auxiliam no processo de desestabilização da cutícula do inseto, permitindo a difusão das toxinas para o interior do corpo da presa. Também são relatados alcaloides que atuam como repelentes a predadores em algumas teias, e como inseto-toxinas em outras. A presença dessas moléculas são evidências de que a teia não é uma simples ferramenta para captura mecânica e aprisionamento de presas, mas sim uma complexa estrutura, que parece desempenhar um papel estratégico "ativo" na captura de suas presas. Considerando isso, o objetivo deste estudo foi analisar a ultraestrutura, a disposição das gotículas sobre os fios de seda, e visualizar a presença de vesículas lipídicas extraídas das gotículas da teia orbital da aranha N. clavipes através de microscopia. Além disso explorou-se a riqueza do perfil químico dos compostos de baixas massas moleculares da seda da teia através da cromatografia gasosa bidimensiona... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nephila clavipes belongs to the group of orb-weavings spiders that have developed the ability to synthesize adhesive threads. Such adhesive threads are found in the core circles of the orb-webs, and present oily droplets which in turn contain many vesicles in suspension, entrapping solutions of proteins, peptides and many small-molecular mass compounds. Chemical analysis studies of these droplets identified toxins, saturated fatty acids and even alkaloids. It is speculated that when an insect-prey is trapped by the web, the fatty acids of these droplets aid in the process of destabilizing the insect cuticle allowing the diffusion of the toxins into the prey body. Some studies also reported alkaloids that act as repellents to predators in some webs, and as insect-toxins in others. The presence of these molecules is evidence that the web is not a simple tool for mechanical capture and imprisonment of prey; but rather a complex structure that seems to play a strategic "active" role in capturing its prey. Considering this, the aim of this study was to analyze the ultrastructure, the disposition of the droplets on the silk fibers, and to visualize the presence of lipid vesicles extracted from the web's droplets of N. clavipes spider, by microscopy. In addition, the richness of the chemical profile of the small-molecular mass compounds in the web-silk was explored through comprehensive two-dimensional gas chromatography coupled to a mass detector; and finally to investigate the richness of proteins present in web-silk and silk-producing glands through in solution proteolytic digestion, liquid chromatography, and mass spectrometry, highlighting the possible toxins involved in the prey paralysis. First, was performed scanning electron microscopy study of the droplets deposited on the web-silk and light microscopy of the suspended lipid vesicles retained within the aqueous ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2016-08-12T18:48:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-08-06. Added 1 bitstream(s) on 2016-08-12T18:51:01Z : No. of bitstreams: 1 000854199.pdf: 5245942 bytes, checksum: 78603c065ca6ba2cb04fe0531fde9643 (MD5) / A técnica de ionização MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) foi uma das responsáveis por revolucionar a Espectrometria de Massas, tornando possível sua aplicação a moléculas termolábeis e de alta massa molecular, como as proteínas. Apesar de seu grande desenvolvimento, esta técnica ainda apresenta algumas limitações como a seleção da matriz utilizada e o método de preparo de amostras. Estes fatores são determinantes na reprodutibilidade da análise e na faixa de aplicação de m/z. Neste trabalho, inicialmente analisou-se diferentes linhagens de cianobactérias por MALDI-TOF-MS, com a finalidade de se buscar por novos analitos para os quais fosse possível o monitoramento utilizando-se as matrizes iônicas. Posteriormente avaliou-se as características destas matrizes, a metodologia de preparo de amostras, a composição do analito e a intensidade do laser da fonte de MALDI, com o objetivo de selecionar as melhores metodologias de análise. Após esta etapa, as matrizes iônicas e metodologias selecionadas foram aplicadas na detecção e quantificação de cianotoxinas e na análise de fármacos por MALDI-MS. Neste estudo obteve-se como resultados: a diferenciação de linhagens de cianobactérias através dos fingerprints obtidos por MALDI-TOF-MS que também permitiram a detecção de importantes metabólitos; a detecção da homoanatoxina-a, uma cianotoxina de baixa massa molecular, diretamente de células de cianobactérias; o desenvolvimento de um método quantitativo de análise de microcistinas com ótima precisão; e o desenvolvimento de uma metodologia inédita para a detecção dos componentes ativos de medicamentos, ampliando, portanto, o leque de aplicações da técnica de MALDI. / The Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization technique was one of the ionization sources responsible for revolutionizing Mass Spectrometry, making possible its application to labile and high molecular weight molecules, such as proteins. Despite its great development, this technique still has some limitations like the selection of the matrix and the sample preparation method. These factors determine the reproducibility of analysis and the m/z application range. Initially, in this work, we analyzed different cyanobacteria strains by MALDI-TOF-MS, in order to check for new analytes to be monitored using ionic matrices. Subsequently, the characteristics of these matrices, the sample preparation method, the composition of the analyte and laser intensity of the MALDI source were evaluated aiming to select the best methodologies of analysis. After this step, the selected ionic matrices and methodologies have been applied in the detection and quantification of cianotoxins and analysis of pharmaceutical drugs by MALDI-MS. In this study we obtained as results: the differentiation of strains of cyanobacteria through the fingerprints obtained by MALDI-TOF-MS which allowed the detection of important metabolites; the detection of homoanatoxin-a, a low molecular weight cyanotoxin, directly from cyanobacteria cells; the development of a quantitative method for the analysis of microcystins with great precision; and the development of a new methodology for the detection of active compounds of medicines, increasing, therefore, the application range of MALDI technique.

A subtribo Espeletiinae (Asteraceae) representa um exemplo clássico de adaptação em ecossistemas tropicais de altitudes elevadas. No entanto, estudos que combinem diferentes campos de pesquisa ainda são necessários para entender este caso proeminente de radiações adaptativas rápidas nos trópicos. Esta tese fornece uma abordagem multidisciplinar combinando informação metabolômica, biogeográfica, taxonômica, evolutiva, química, molecular e ecológica, para um estudo aprofundado da subtribo Espeletiinae e do seu gênero irmão Smallanthus. Através de análises metabolômicas baseadas em cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada a espectrometria de massas, nós fornecemos, pela primeira vez, evidências metabolômicas de segregação alopátrica em Espeletiinae e evidência metabolômica apoiando a possível segregação do gênero Espeletia em dois gêneros diferentes com distintas impressões digitais metabólicas. Em combinação com a filogenia molecular da subtribo e amplificações por PCR, demonstramos que a evolução dos caracteres químicos em Espeletiine seguiu cenários complexos de mudança química com alguns caracteres representando sinapomorfias químicas e outros representando múltiplos ganhos e perdas, implicando em evolução convergente. Por fim, analisando os padrões de expressão dos principais genes envolvidos na biossíntese de ácidos clorogênicos, flavonoides e lactonas sesquiterpênicas, em combinação com análises metabolômicas e informações ambientais, relatamos a regulação ambiental e de desenvolvimento do metabolismo secundário de Smallanthus sonchifolius, fornecendo informações relevantes para o entendimento dos fatores regulatórios e possíveis papéis adaptativos dos metabólitos secundários em táxons andinos. Em conclusão, esta tese fornece uma compreensão holística de uma linhagem que representa um exemplo clássico de radiações adaptativas rápidas nos Andes tropicais, abrindo uma nova perspectiva intrigante de pesquisa em outros grupos / The subtribe Espeletiinae (Asteraceae) represents a classic example of adaptation in tropical high-elevation ecosystems. However, studies bringing different research fields are still necessary to understand this prominent case of rapid adaptive radiations in the tropics. This dissertation provides a multidisciplinary approach combining metabolomic, biogeographic, taxonomical, evolutionary, chemical, molecular and ecological information, for an in-depth study of the subtribe Espeletiinae and its sister genus Smallanthus. Through metabolomic analyses based on ultrahigh-performance liquid chromatography-mass spectrometry, we provide, for the first time, metabolomic evidence of allopatric segregation in Espeletiinae and metabolomic evidence supporting a putative segregation of the genus Espeletia in two different genera with distinctive metabolic fingerprints. In combination with the molecular phylogeny of the subtribe and PCR amplifications, we also demonstrate that the evolution of chemical traits in Espeletiinae followed complex scenarios of chemical change with some traits representing chemical synapomorphies and other traits being gained and lost multiple times implying convergent evolution. Lastly, by analyzing the expression patterns of key genes involved in the biosynthesis of chlorogenic acids, flavonoids and sesquiterpene lactones, in combination with metabolomic analyses and environmental information, we report the developmental and environmental regulation of the secondary metabolism of Smallanthus sonchifolius, providing relevant information towards the understanding of the regulatory factors and possible adaptive roles of secondary metabolites in Andean taxa. In conclusion, this dissertation provides a holistic understanding of a lineage representing a classic example of rapid adaptive radiations in the tropical Andes, opening an intriguing new perspective of research in other groups

Orientador: Ian Castro-Gamboa / Banca: Luiz Alberto Beraldo de Moraes / Banca: Jairo Kenupp Bastos / Banca: Daniel Rinaldo / Banca: Emerson Ferreira Queiroz / Resumo: A abordagem reducionista na busca por substâncias bioativas em produtos naturais nem sempre é capaz de compreender em sua totalidade a dinâmica envolvida nas respostas farmacológicas de matrizes complexas como extratos vegetais. Inserido neste paradigma, este trabalho visou ao desenvolvimento de métodos e abordagens racionais que permitissem o entendimento das relações moleculares em produtos naturais bioativos. Para tanto, espécies vegetais da família Chrysobalanaceae com potencial citotóxico, depositadas na extratoteca do NuBBE, foram os objetos de estudo na aplicação de metodologias para a determinação de sua composição metabólica e para a avaliação do potencial citotóxico. Os extratos hidroalcoólicos de Couepia grandiflora, Hirtella hebeclada, Licania hoehnei, Licania kunthiana, Licania huminis e Parinari excelsa foram analisados por CG-EM, CLAE-DAD-EM/EM e CLAE-autoEM/EM para a identificação in situ de sua composição metabólica, através de comparação dos dados espectrais a uma base de dados contendo valores de massas de alta resolução e espectros de UV de todos os metabólitos secundários já relatados para a família Chrysobalanaceae. O uso de ferramentas de análise multivariada, como a deconvolução empírica proposta pelo software AMDIS e a extração espectral desenvolvidas pelos algoritmos RAMSY e MCR-ALS, assistiram à desreplicação ao extrair os espectros dos compostos, mesmo em baixa resolução cromatográfica. A desreplicação das espécies de Chrysobalanaceae permitiu a detecção in situ de metabólitos primários (aminoácidos, ácidos e açúcares) e secundários (flavonoides-O-glicosilados e polímeros de proantocianidinas). Adicionalmente ao estudo de determinação metabólica das matrizes vegetais, realizaram-se ensaios de atividade citotóxica. Resultados preliminares da bioatividade ante diferentes linhagens de Saccharomyces cereviceae, obtidos... / Abstract: The reductionist approach for the search of bioactive compounds in natural products is not always being able to understand the complete dynamics involved in the pharmacological responses of complex matrices such as plant extracts. Based on this paradigm, this study aimed to develop rational methods approaches to runderstand the molecular relationships present in bioactive natural products. Chrysobalanaceae plant species with cytotoxic potential, deposited NuBBE's bank of extracts, were the objects of study in the application of methodologies for defining the metabolic composition and evaluate their cytotoxic potential. Couepia grandiflora, Hirtella hebeclada, Licania hoehnei, Licania kunthiana, Licania huminis and Parinari excelsa ethanol extracts were analyzed by GC-MS, HPLC-DAD-MS/MS and HPLC-autoMS/MS for in situ metabolic identification based on spectral comparison with a high resolution mass spectra and UV spectral database developed using previously reported data for Chrysobalanaceae. The use of multivariate analysis tools, the empirical deconvolution software AMDIS and the spectral extraction algorithms RAMSY and MCR-ALS assisted the dereplication by extracting spectral data for "pure" compounds even at low chromatographic resolution. The dereplication of Chrysobalanaceae species allowed the in situ detection of primary metabolites (amino acids, and sugars) and secondary (O-glycosylated-flavonoids and proanthocyanidins polymers). In addition to the metabolic determination of Chrysobalanaceae extracts, were performed cytotoxicity bioassays. Preliminary results of cytotoxicity against Saccharomyces cereviceae, carried out during the construction of the bank of extracts, indicated cytotoxic potential, especially for Hirtella hebeclada and Parinari excelsa. However, the cytotoxic assay against different tumor cell lines showed that the extracts were not active, which may be related to which may be... / Doutor

O câncer de bexiga é uma neoplasia urogenital que acomete homens e mulheres, sendo que somente no Brasil 8.600 novos casos ao ano são diagnosticados. Cistoscopia transuretral é a conduta padrão no diagnóstico e acompanhamento do câncer de bexiga. Entretanto, tal procedimento é extremamente invasivo e doloroso além de ter elevado custo e não garantir todos os resultados. Assim, busca-se por marcadores moleculares que possam auxiliar no diagnóstico e progressão do câncer de bexiga, bem como diminuir a necessidade de exames invasivos no acompanhamento de pacientes tratados. Nesse sentido, a urina tem papel de destaque como fonte de biomarcadores devido principalmente ao seu caráter não invasivo. <br /> Nesse trabalho foram utilizadas duas abordagens \'ômicas\': proteômica e metabolômica, para a busca de biomarcadores em urina para o diagnóstico e prognóstico do câncer de bexiga, respectivamente. Com a abordagem proteômica buscou-se apenas por biomarcadores para o diagnóstico da doença e, utilizando as técnicas de eletroforese 2-DE, OFFGEL e MS, juntamente com análise estatística multivariada, foi possível identificar 32 proteínas que apresentam-se como potenciais marcadores para o câncer de bexiga. A abordagem metabolômica foi empregada para a busca de biomarcadores para reincidência e progressão da doença. As técnicas analíticas utilizadas nessa abordagem, LC-MS e CE-MS, mostraram-se complementares e, dos resultados obtidos com ambas e avaliados com análise estatística multivariada foi possível indicar 19 metabólitos para reincidência e 23 metabólitos para progressão do câncer de bexiga. <br /> Assim, neste trabalho explorou-se como as ciências \'ômicas\', a qual abrange técnicas analíticas de high-throughput, estatística multivariada e ferramentas de bioinformática auxiliando na descoberta de potenciais biomarcadores não invasivos para o diagnóstico e prognóstico do câncer de bexiga. Portanto, o presente estudo foi de grande importância e relevância à medida que ilustrou como tais técnicas podem potencialmente auxiliar no diagnóstico e prognóstico de doenças e contribuir para tratamentos personalizados no futuro, indicando a potencialidade de estudos dessa natureza. / Bladder cancer is an urogenital cancer affecting men and women, and just in Brazil 8,600 new cases are diagnosed annually. Transurethral cystoscopy is a standard conduct in the diagnosis and monitoring of bladder cancer. However, this procedure is extremely invasive, painful, expensive and does not guarantee the best results. Thus, the searching for molecular markers may assist in the diagnosis and monitoring of bladder cancer, as well as decreasing the need for invasive tests in the monitoring of patients treatment. In this way, urine shows an important role as a source of biomarkers, mainly due to its non-invasive nature. <br /> In this work we used two \'omics\' approaches: proteomics and metabolomics, to search for biomarkers in urine for the diagnosis and progression of bladder cancer, respectively. The proteomics approach was explored for biomarkers for diagnosing disease. Using 2-DE, OFFGEL electrophoresis, and MS techniques, as well multivariate statistical analysis, they were identified 32 proteins that may be pointed as potential markers for bladder cancer. The metabolomics approach was used to search for biomarkers for progression and recurrence of the disease. The analytical techniques used for this approach, LC-MS and CE-MS, were complementary to each other and the results evaluated with multivariate statistical analysis indicated that 19 metabolites for recurrence and 23 metabolites for progression of bladder cancer could possibly be used for validation studies. <br /> Thus, we demonstrated how the \'omics\' sciences, which include high- throughput analytical techniques, multivariate statistical analysis, and bioinformatics tools, aid in the discovery of potential biomarkers for noninvasive diagnosis, evaluate recurrence and monitor progression of bladder cancer. Therefore, this study was of high relevance to demonstrate the potential of such techniques to contribute to studies of personalized medicine.

Estudos metabolômicos de plantas, estudos in silico e ensaios biológicos in vitro são estratégias que, em conjunto, otimizam a busca por substâncias inéditas e/ou ativas correlacionadas a determinados mecanismos de ação. Embora a família Asteraceae possua inúmeras espécies com reconhecido potencial anti-inflamatório (AI), várias delas nunca foram investigadas, como algumas espécies endêmicas do Cerrado brasileiro. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi encontrar extratos e substâncias AI que apresentassem um mecanismo de ação superior ao dos AIs atuais. Foram estudadas 57 espécies da família pertencentes a várias tribos, agrupadas em três diferentes grupos: plantas com prévia evidência AI, plantas alimentícias e espécies do Cerrado. Para se encontrar substâncias com potencial AI foi realizada a avaliação da inibição concomitante das enzimas ciclooxigenase (COX-1) e lipoxigenase (5-LOX), sendo ambas as principais vias envolvidas na inflamação, cuja inibição pode conferir maior eficácia e menores efeitos adversos do que os AI atualmente disponíveis. Adequados estudos metabolômicos (HPLC-UV-HRFTMS) e in silico (diferentes modelos estatísticos) foram realizados. O conjunto de metabólitos secundários (metaboloma) das 57 espécies investigadas representou um vasto universo de substâncias (n=6.215), que conseguiu abranger várias delas com o mecanismo de ação investigado. Corroborando o potencial desta família em apresentar espécies AI, cerca de 23% das plantas aqui investigadas foram capazes de promover a dupla inibição, com valores de IC50 (36,0 a 0,03 ?g/mL) para seus extratos comparáveis com aqueles dos inibidores padrões. Através dos estudos in silico foi possível determinar que as substâncias ativas dos extratos se referem a seus constituintes minoritários, sugerindo que devem ser muito potentes. Dentre as substâncias correlacionadas com a propriedade de dupla inibição, algumas não puderam ser identificadas, mesmo utilizando abrangentes bibliotecas de dados de produtos naturais, sugerindo que se tratam de substâncias inéditas. Além disso, dentre as espécies ativas, uma é consagrada como alimentícia e, portanto, pode vir a exercer um importante papel como nutracêutico, por exemplo vir a ser incluída na dieta de pacientes que sofrem de patologias inflamatórias. As demais espécies ativas, por sua vez, apresentam potencial para o desenvolvimento de fitoterápicos e descoberta de novos princípios ativos. Devido ao fato dos modelos estatísticos terem sido validados, as substâncias ativas ainda poderão ser utilizadas para predição de novos extratos ativos a partir apenas de seu metaboloma. Portanto, este trabalho, além de resultar em relevantes resultados, exemplifica muito bem as novas estratégias para a busca de produtos naturais inéditos e AI para um mecanismo de ação requerido, através de uma abordagem inédita e explorando espécies de importância da flora brasileira, alimentícia ou farmacológica, a partir de mínima quantidade de material vegetal. / Plant metabolomic studies, in silico studies and in vitro biological assays are strategies that together, optimize the discovery of new and/or active compounds correlated to a specific mechanism of action. Asteraceae family has many species with well known anti-inflammatory (AI) potential. Several of them have never been investigated, as some of Brazilian Cerrado. In this context, the objective of this work was to find the AI extracts and substances with a better mechanism of action than the usual AI. It was studied 57 species from different tribes of Asteraceae family, which were divided in three groups: plants with known AI property, food plants and species from Cerrado. In order to find substances with AI potential, the inhibition of cyclooxygenase (COX-1) and lipoxygenase (5-LOX) were evaluated to access AI property, once both are the main pathways involved in inflammatory process and the dual inhibition of them can provide better efficacy and less side effects than current AI. Suitable metabolomic (HPLC-UV-HRFTMS) and in silico (statistical models) studies were performed. All the secondary metabolites (metabolome) of the 57 species covered a huge number of substances (n=6,215) and some of them displayed the investigated mechanism of action. About 23% of the plants extracts were able to be dual inhibitor, with IC50 (36.0 - 0.03 ?g/mL) similar of the standard drugs, corroborating the AI potential of Asteraceae family. Through the in silico studies it was possible to determine the AI substances and that they are the minor compounds in the active extracts, suggesting that these must be potent AI. Among the substances correlated with the dual inhibition some could not be identified, even using comprehensive data bases of natural products, suggesting that these ones could be new compounds. Besides, among the active species, one is a food plant that could be useful as nutraceutical, being included in the dietary of people with inflammatory diseases. The other active plants have potential to the development of phytomedicines or drug discovery. Due to the fact that statistical models were validated, the substances also can be useful for prediction of new AI extracts only from the plant metabolome. Therefore, this work has many relevant results and also exemplifies the recent strategies to discovery of new compounds and AI with a required specific mechanism of action, trough a new approach and studying important species of the Brazilian flora, food plants and AI plants, from a minimum quantity of plant material.

O gênero Espeletia Mutis ex Bonpl (Asteraceae, Millerieae, Espeletiinae) constitui um exemplo clássico de um táxon sujeito a rápidos processos adaptativos evolutivos. Com ca. 71 espécies, este gênero se diversificou em elevadas altitudes num ecossistema emergente formado após o retraimento dos glaciares no final do Plioceno e início do Pleistoceno, os páramos, um tipo de ecossistema que biogeograficamente funciona como um complexo de \"ilhas\" presentes principalmente no noroeste dos Andes tropicais da Venezuela, Colômbia e Equador. Devido à sua complexa história evolutiva e morfologia característica, este gênero tem sido foco de muitas pesquisas envolvendo sua biologia, ecologia, taxonomia e filogenia. No entanto, do ponto de vista fitoquímico, tem sido pouco estudado e é desconhecida a influência da geografia na química do metabolismo secundário destas espécies. Neste estudo, a impressão digital metabólica de 120 amostras do gênero Espeletia foi obtida por UHPLC-UV-MS e submetida a análises quimiométricas. A correlação com dados geográficos revelou uma forte influência da biogeografia no metabolismo secundário das espécies deste gênero, apresentando uma impressão digital característica de acordo com seu país de origem numa escala global e de acordo com complexo de páramos de origem numa escala regional, o qual concorda com a filogenia atual da subtribo baseada nos marcadores ITS, ETS, rp116 e AFLPs. A análise por OPLS-DA e a desreplicação de extratos permitiu identificar as principais substâncias correlacionadas com a origem geográfica das espécies, mesmo como permitir a construção de modelos de predição da origem geográfica de novos extratos baseados nos seus perfis químicos. Além disso, uma análise filogenética efetuada com dados metabolômicos revelou, embora com pouco suporte, uma correlação geográfica em que as espécies da Venezuela correspondem ao clado ancestral do gênero. Adicionalmente, a química do metabolismo secundário da subtribo Espeletiinae foi revisada e um bando de dados, o ChemEsp (Chemistry of Espeletiinae), foi construído incluindo todos os metabólitos descritos na literatura, mesmo como outras informações químicas, botânicas e geográficas. Finalmente, a desreplicação de extratos permitiu a identificação de várias substâncias não descritas previamente no gênero Espeletia e/ou na subtribo Espeletiinae, incluindo uma grande variedade de flavonoides e ácidos cafeoilquínicos, junto com outros metabólitos já descritos no gênero por métodos fitoquímicos clássicos. Os resultados obtidos, além de contribuírem para a geração de conhecimento sobre a química do metabolismo secundário do gênero Espeletia, revelaram informações sobre as relações filogenéticas e biogeográficas do gênero baseadas em marcadores químicos, empregando-se modernas metodologias analíticas e computacionais. / The genus Espeletia Mutis ex Bonpl (Asteraceae, Millerieae, Espeletiinae) constitutes a classic example of a taxon undergoing rapid adaptive evolutionary processes. With ca. 71 species, this genus diversified at high altitudes in an emerging ecosystem formed after the retreat of the glaciers in the late Pliocene and early Pleistocene, the páramos, a type of ecosystem that biogeographically acts as an \"island\" complex in the northwestern tropical Andes of Venezuela, Colombia and Ecuador. Due to its complex evolutionary history and characteristic morphology, this genus has been focus of several investigations regarding its biology, ecology, taxonomy and phylogeny. However, phytochemically, they have been poorly studied and it is unknown the influence of geography in their secondary metabolism. In this study, the metabolomic fingerprint of 120 samples of the genus Espeletia was analyzed by UHPLC-UV-MS and chemometrics. Correlations with geographical data revealed a strong influence of biogeography on their secondary metabolism, displaying a characteristic fingerprint according to their country of origin in a global scale and by páramo complex in a regional scale, which is in agreement with the current phylogeny of the subtribe based on ITS, ETS, rp116 and AFLPs markers. An OPLS-DA analysis and extract dereplication allowed the identification of the main compounds correlated with their geographical origin, which also served for building models to predict the geographical origin of unknown samples based on their chemical profile. Also, a phylogenetic analysis was performed with metabolomic data which interestingly, although with low support, also displayed a geographical structure with the Venezuelan cluster as the ancestral clade of the genus. Furthermore, the secondary metabolite chemistry of the subtribe Espeletiinae was reviewed and a data base, ChemEsp (Chemistry of Espeletiinae), was built including all secondary metabolite reports available in the literature as well as other chemical, botanical and geographical information. Finally, the extract dereplication allowed the identification of several compounds previously unreported in the genus Espeletia and/or the subtribe Espeletiinae, including a wide range of flavonoids and caffeoylquinic acids, along with other metabolites already reported in the genus by classic phytochemical methods. These results, besides of contributing to further knowledge about the secondary metabolite chemistry of the genus Espeletia, provided valuable information about the phylogenetic and biogeographic relationships in the genus based on chemical markers by means of modern analytical and computation techniques.

A análise da composição química das uvas é de grande importância para avaliar a data da colheita e a produção de vinhos de qualidade. O estudo do metabolismo das uvas é essencial para definirem-se em quais etapas os metabólitos são produzidos, assim como as proteínas e genes que regulam esses processos. Açúcares, polifenóis e ácidos orgânicos são importantes classes de metabólitos relacionados com o desenvolvimento de uvas. Os açúcares são os compostos que primeiramente indicam a data de colheita, sendo substâncias-chave em diversos processos biológicos. Os polifenóis tem se destacado por sua atividade antioxidante, além de participarem dos mecanismos de defesa da planta. Os ácidos orgânicos são responsáveis pela qualidade organoléptica e estão envolvidos em vários processos metabólicos. As proteínas não contribuem de forma significativa para o valor nutricional, mas são importantes marcadores de variedade para verificar adulterações de vinhos. O Rio Grande do Sul é responsável por grande parte das uvas produzidas no país, e recentemente o Vale do São Francisco tem se destacado na produção destas frutas. Em regiões do Sudeste um manejo de podas diferenciado vem sendo feito para a obtenção de uvas com bons índices de maturação e resistência a doenças fúngicas. Uvas produzidas em Água Vermelha e Louveira, interior de São Paulo, foram estudadas durante a maturação com relação a análises físico-químicas, perfil proteômico, por eletroforese bidimensional e espectrometria de massas, e perfil metabolômico de antocianinas, polifenóis não-antociânicos, ácidos orgânicos e açúcares por técnicas cromatográficas e eletroforéticas acopladas a detectores por arranjo de diodos e/ou espectrometria de massas. Os resultados foram analisados por ferramentas de análise multivariada e comparados com uvas maduras das regiões Sul e Nordeste. Foram observadas tendências de agrupamento das uvas verdes devido à maior acidez e das uvas maduras devido à maior concentração de antocianinas e açúcares, sendo que o perfil de antocianinas pode ser utilizado como marcador de origem varietal. Em termos do perfil proteômico foi possível estabelecer diferenças entre variedades de uvas, além de uma tendência com relação à origem geográfica. Foram identificadas 74 proteínas relacionadas principalmente, às funções de defesa e resposta a stress, metabolismo de carboidratos e metabolismo energético. / Analysis of the chemical composition of grapes is very important to evaluate harvest time and production of high quality wines. The study of grape metabolism is essential to define in which stages metabolites are produced, as well as proteins and genes that regulate these processes. Sugars, polyphenols and organic acids are important classes of metabolites related with grape development. Sugars are compounds that primarily indicate harvest time, and they are key substances in various biological processes. Polyphenols have been noted for its antioxidant activity, also for taking part in mechanisms of plant defense. Organic acids are responsible for organoleptic quality, and they are evolved in diverse metabolic processes. Proteins do not contribute significantly to the nutritional value, but they are important variety markers to verify adulterations of wines. Rio Grande do Sul is responsible for most of the grapes produced in Brazil, and recently Vale do São Francisco has received attention because of the production of these fruits. In some regions of Southeast a different pruning handle has started to obtain grapes with good levels of ripeness and resistance in developing fungal diseases. Grapes cultured in Água Vermelha and Louveira, São Paulo State, were studied during ripening in relation to physical-chemical analysis, proteomic profile, by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry; the metabolomic profile of anthocyanins, non-anthocyanin polyphenols, organic acids and sugars by chromatographic and electrophoretic techniques coupled to diode array and/or mass spectrometry detectors. The results were analyzed by multivariate analysis and compared with those of mature grapes from South and Northeast regions. The data show clustering of green grapes due to higher acidity and clusters of mature grapes due to higher anthocyanin and sugars concentrations, and the profile of anthocyanins can be used as a varietal marker. Considering the proteomic profile, it was possible to group different varieties of grapes with a trend in relation to geographical origin being also observed. It was identified 74 proteins related, mainly, to defense and stress response, carbohydrate metabolism and energetic metabolism.

A seleção de animais para consumo alimentar residual (RFI) está intrinsecamente associada com a diminuição do consumo matéria seca e é independente do ganho de peso corporal, selecionando animais de eficiência produtiva e econômica, além também de diminuir a emissão de gases de efeito estufa provinda do gado. Neste estudo, amostras de soro de 16 animais selecionados divergentemente para eficiência de alimentação foram coletadas antes do confinamento (dia -21) e avaliadas em uma abordagem metabolômica global, com o objetivo de usar análise diferencial, análise de co-expressão e enriquecimento funcional, identificando marcadores para eficiência de alimentação antes do confinamento. Um analito foi diferencialmente presente entre os animais de baixo e alto RFI. A análise WGCNA identificou 22 e 25 módulos no modo positivo e negativo, respectivamente e, 1 módulo de cada modo foi fortemente associado a RFI (r = 0,53, p-valor &lt;0,05 e r = 0,52, p-valor &lt;0,1 nos modos negativo e positivo, respectivamente). A análise de enriquecimento funcional predize 13 processos biológicos associados à eficiência alimentar, incluindo alterações no metabolismo de vitaminas lipossolúveis, inflamação, estresse oxidativo, metabolismo de aminoácidos e metabolismo de ácidos graxos. Esse trabalho evidencia a possibilidade de se identificar um biomarcador para eficiência alimentar e também sugerem que as diferenças nas respostas ao estresse oxidativo e nos processos inflamatórios já influenciam na variação da eficiência alimentar previamente ao confinamento. / Animal selection for residual feed intake (RFI) is intrinsically associated with decreased consumption of dry matter independent of body weight gain, selecting yielding increased production and economic efficiency but also decreasing the greenhouse gas emission of livestock. In this study, serum samples of 16 animals selected for divergent feed efficiency were collected prior to feedlot (day -21) and evaluated in an untargeted metabolomics approach, with the goal of using differential analysis, co-expression analysis and functional enrichment to identifier markers for feed efficiency prior to the feedlot. One feature was differentially accumulated between low and high RFI. WGCNA analysis identified 22 and 25 modules in positive and negative mode, respectively, of 1 module of each mode was strongly associated with RFI (r= 0.53, p-value &lt;0.05 and r=0.52, p-value &lt; 0.1 to negative and positive mode, respectively). Pathway enrichment analysis yielded 13 biological processes associated with feed efficiency including alterations in vitamins liposoluble metabolism, inflammation, oxidative stress, amino acid metabolism and fatty acid metabolism. Our findings suggest the possibility to identify a biomarker for feed efficiency and also discuss that differences in oxidative stress responses and inflammatory processes could explain the feed efficiency variation prior to feedlot.