A espécie Bothrops atrox é responsável por grande parte dos acidentes no estado do Amazonas. No entanto, ainda são poucos os estudos sobre as toxinas que compõem o veneno dessa serpente, os mecanismos envolvidos na sintomatologia dos acidentes, bem como de formas de inibição. Os soros antiveneno utilizados atualmente com o objetivo de neutralizar as atividades sistêmicas e locais dos venenos mostraram reatividade cruzada entre componentes dos venenos de serpentes do gênero Bofhrops (MOURA DA SILVA et al., 1990). No entanto alguns componentes do veneno não apresentaram essa reatividade (SILES-VILARROEL et al.., 1974), mostrando a existência de toxinas espécie específicas.Os venenos de serpentes estão sujeitos a grandes variações induzidas por diversos aspectos ontogenéticos e influencia do habitat. Assim, essas variações podem gerar toxinas espécie específicas cujos mecanismos de ação ainda são desconhecidos e que os anticorpos presentes nos antivenenos disponíveis não sejam capazes de reconhecer e neutralizar eficientemente. O gênero Bothrops possui espécies extremamente variáveis, algumas de difícil classificação taxonõmica, e novas espécies têm sido descobertas recentemente. Como contribuição para o acúmulo de informações a respeito das diferentes composições do veneno do gênero Bothrops, e para o conhecimento de toxinas já isoladas e as ainda não isoladas na espécie tipo Bothrops atrox, foi construída uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno.Os dados obtidos são importantes para a elaboração de um painel da expressão gênica dessa espécie e permitirá a identificação de toxinas que podem ser comuns ou não ao veneno de outras espécies do gênero. Aliado a isso, esses dados permitirão a correlação com o estudo proteõmico, e possivelmente fornecerão subsídios para a melhoria da terapêutica empregada no tratamento dos casos envenamento na região. / The species Bothrops atrox is responsible for most accidents in state of Amazonas. However, there are few studies on toxins that make up the venom of this snake, mechanisms involved in symptomatology of accidents, as well as inhibition forms. Sera antivenom currently used in order to neutralize the systemic and local activities of the venoms showed cross-reactivity between components of the venom of Bothrops (MOURA DA SILVA et al., 1990). However some components of the venom showed no reactivity (SILES-VILARROEL et al., 1974), indicating the existence of species-specific toxins. Snake venoms are subject to large variations induced by several aspects and influences of ontogenetic habitat. Thus, these variations can produce toxins whose mechanisms of species-specific action are still unknown and antibodies present in available antivenoms maybe not are capable to recognize and neutralize some toxins efficiently. Bothrops species have highly variable, some of difficult taxonomic classification and new species have been discovered recently. As a contribution to gain of information about of different compositions of Bothrops venom and to knowledge of toxins not yet isolated and the isolated in Bothrops atrox type species we constructed a venom gland cDNA library . The data obtained are important for the development of gene expression panel of this species and enable the identification of toxins common or not in the venom of other species. These data will allow correlation with the proteomic study, and possibly provide input for improving the therapeutic used in the treatment of accidents cases in the region.

A Qualificação de Performance (QP) é requisito das Boas Práticas de Fabricação e consiste de uma documentação de todas as atividades envolvidas para produzir um produto específico, neste caso, a toxina diftérica. O objetivo é garantir que as especificações do produto atendam aos resultados das análises de rotina. O Instituto Butantan introduziu um biorreator para ser utilizado nesta produção e a QP foi considerada e desenvolvida. Análises da temperatura e pressão foram realizadas durante três ciclos de esterilização. Sensores de temperatura e indicadores biológicos foram previamente distribuídos no equipamento considerando pontos críticos pré-observados. Os resultados da curva de temperatura e pressão validaram o equipamento. Três ciclos de crescimento de C. diphtheriae foram realizados e monitorados. Os resultados da DO ou turbidez medidos tanto por um espectrofotometro convencional como por um sensor de biomassa on line mostraram títulos da toxina já a partir de 48 horas (teste de floculação). A toxina foi caracterizada bioquimicamente. / Performance qualification (PQ) is requisite of the Good Manufacturing Practices and consists on complete documentation of all activities involved to produce a specific product, in this case, the diphtheria toxin. The goal is to ascertain all product specifications that were determined by its routine analysis. Instituto Butantan introduced a bioreactor to be use in the diphtheria toxin production and the PQ must be considered and developed. Analysis of the temperature and the pressure were performed during three sterilization cycles. Temperature sensors and biological indicators where previously distributed in the equipment, considering critical pre-observed points. The temperature and pressure curve results validated the equipment. Three C. diphtheriae growth cycles were performed and monitored. The optical density (OD) or turbidity results measured either by one conventional spectrophotometer and/or by one on line biomass sensor showed toxin titers after 48 hours of the harvesting (flocculation test). The toxin was biochemically characterized.

A Bothrops jararaca é a serpente de maior importância médica no Brasil. Vários estudos foram realizados com o objetivo de caracterizar os componentes do veneno de serpentes, entretanto, a base molecular dos genomas das serpentes é pouco conhecida. Assim, foi realizado o sequenciamento e montagem do genoma da serpente Bothrops jararaca. Foram construídas bibliotecas tipo shotgun e mate-pair para realização de corridas de sequenciamento usando a tecnologia Illumina e sequências complementares foram obtidas em equipamento PACBIO RS II. Uma biblioteca de BACs também foi construída e 768 pools de 12 BACs foram sequenciados. Um grande conjunto de segmentos genômicos foi obtido e foi possível identificar genes de várias toxinas, entre elas SVMPs, SVSPs, BPPs, CRISPs e VEGF. Ainda foi possível depreender o contexto genômico de muitos destes genes e identificamos os principais elementos repetitivos genômicos. Estes achados são relevantes para o entendimento da função e evolução do sistema venenífero e podem servir de base para outros estudos futuramente. / The pit viper Bothrops jararaca is the most medically important snake in Brazil. Several studies were conducted in order to characterize the components of snake venom. However, the molecular basis of snake genomes is poorly known. Hence, it was carried out the sequencing and assembly of the Bothrops jararaca snake genome. Shotgun and mate-pair libraries were constructed to perform sequencing runs using Illumina technology and complementary sequences were obtained in PACBIO RS II equipment. A BAC library was also constructed and 768 pools of 12 BACs were sequenced. A large number of genomic segments was obtained. It was possible to identify genes of several toxins, including SVMPs, SVSPs, BPPs, CRISPs and VEGF. In addition, it was possible to infer the genomic context related to most of these genes and identify the main genomic repetitive elements. These findings are relevant for understanding the function and evolution of the venom system and it provides the basis for further studies.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-13Bitstream added on 2014-06-13T19:40:31Z : No. of bitstreams: 1 souza_bm_dr_rcla.pdf: 2198506 bytes, checksum: e0710a5511f60c3053d26f8713b6478b (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Neste trabalho foram realizados estudos de caracterização estrutural e funcional de alguns peptídeos da classe dos mastoparanos de vespas, que apresentam diferentes padrões de anfipaticidade, em função das diferentes seqüências de aminoácidos que cada um possui. Os peptídeos foram manualmente sintetizados, utilizando-se estratégia Fmoc, e purificados através de técnicas de cromatografia líquida de alta performance. Após a obtenção do material sintético, foram realizadas análises de espectrometria de massas ESI-MS, para monitoração do controle de qualidade. A estrutura secundária foi investigada com o uso de espectroscopia de dicroísmo circular. Além disso, foram realizadas as modelagens moleculares e dinâmica dos peptídeos para análise de suas trajetórias. Foram feitos ensaios para investigar a interação desses peptídeos com membranas fosfolipídicas sintéticas (lipossomos), sendo esta interação, monitorada por medidas de dicroísmo circular e de troca isotópica H/D combinada com espectrometria de massas. Além disto, foram realizados ensaios de atividades biológicas de cada um dos peptídeos, onde foram testadas as atividades de degranulação de mastócitos, hemólise e antibiose. Os dados de Dicroísmo Circular revelaram que todos os peptídeos possuem a tendência de se estruturar em hélice-a quando em ambientes hidrofóbicos, ou em contato com membranas. Além disso, a presença de fosfolipídios ácidos nas membranas aumenta a interação eletrostática destas com peptídeos positivamente carregados. Os estudos de dinâmica molecular em meio aquoso mostraram alta flexibilidade estrutural dos peptídeos e uma variedade de estados conformacionais, em que predominam conformações randômicas, sem, contudo deixar de apresentar alguma porção helicoidal. Além disso, foi mostrado que esses peptídeos possuem caráter anfifílico quando estruturados em hélice. / The aim of the present investigation was to study the structure/activity relationship of a series of mastoparan-like peptides presenting different patterns of amphipathicit given by their distinct amino acid sequences. The peptides were manually synthesized by using Fmoc strategy and purified under HPLC. The synthetic material homogeneity was analyzed by ESI mass spectrometry and Edman Degradation Chemistry. The secondary structure was investigated through circular dichroism (CD) spectroscopy. In addiction, the secondary structures were modeled and their structural trajectories observed through Molecular Dynamics. The interaction of peptides with membranes was investigated through the combination of synthetic vesicles with H/D exchange and ESI-mass spectrometry. Some biological activities, like: mast cell degranulation, hemolysis and antibiosis were investigated for all the peptides. The CD spectra revealed that the peptides in presence of hydrophobic environment or in presence of biological membranes have the tendency to form helix conformations. Highly organized structures were not observed in aqueous or buffer solutions, however, the peptides always presented some tendency to form helices. The mastoparans interacts strongly and preferentially with the charged PG headgroups. The positive charges of these peptides enable selective binding to bacterial membranes through electrostatic interactions. The molecular dynamic studies of the peptides in water solvent revealed that all the peptides have high structural flexibility and many conformational states. Probably, these molecules assume different conformational states depending on the environment. In addition, it has been shown that the helical conformation gives the amphipathic feature to these peptides. The insertion and orientation of the mastoparan in the bilayer environment was investigated by H/D exchange, combined with mass spectrometry analysis.

Orientador: Claudio Antônio Talge Carvalho / Banca: Márcia Carneiro Valera Garakis / Banca: Renato Miotto Palo / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar in vitro a ação do gel de hipoclorito de sódio (NaOCl) 3 % e da medicação intracanal (MIC) de hidróxido de cálcio (CaOH2), agitados ou não por ultrassom sobre Enterococcus faecalis, Escherichia coli e ácido lipoteicóico (LTA). Para isso 80 dentes humanos unirradiculares tiveram suas coroas removidas padronizando seu comprimento em 16 mm +- 0,5 mm, sendo seus canais instrumentados inicialmente até instrumento R25 (Reciproc). Os canais foram contaminados com suspensões de E. faecalis e E. coli. Os canais foram instrumentados utilizando-se instrumento R40, sob irrigação com 2 ml de NaOCl 3% gel seguida de irrigação com 10 ml de solução salina estéril e apirogênica. Após os canais foram irrigados com EDTA 17%, seguido de irrigação com 5 ml de solução salina estéril e apirogênica, sendo por último preenchidos com medicação intracanal de hidróxido de cálcio mantida durante 7 ou 14 dias. Os espécimes foram divididos inicialmente em 2 grupos (n=40) de acordo com a agitação ultrassônica (US) ou não da substância química auxiliar. Sendo novamente divididos de acordo com a agitação ultrassônica ou não da medicação intracanal (MIC) e o tempo de ação desta (n=10): 1) NaOCl + Ca(OH)2 (7 dias). 2) NaOCl + Ca(OH)2 (14 dias). 3) NaOCl + Ca(OH)2 com US (7 dias) 4) NaOCl + Ca(OH)2 com US (14 dias). 5) NaOCl com US + Ca(OH)2 (7 dias). 6) NaOCl com US + Ca(OH)2 (14dias) 7) NaOCl com US + Ca(OH)2 com US (7dias). 8) NaOCl com US + Ca(OH)2 com US (14 dias). For... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / The aim of this study was to evaluate in vitro the action of sodium hypochlorite (NaOCl) 3% gel and calcium hydroxide as an intracanal medication, both activated by ultrasound on the reduction of E. faecalis e E. coli and lipotheicoic acid (LTA). Eight human single-rooted teeth with standardized size of 16 mm were prepared initially to R25 instrument (Reciproc) and distributed in microplate (n = 10). After sterilization (Co60 gamma radiation), the infection was carried out 8 microlitres of E. coli suspension, and after 7 days 8 microlitres of E. faecalis suspension, maintained for 21 days. Following the collection confirmation was performed (1st collection), then the root were instrumented using R40 instrument, irrigation with 2 ml of NaOCl 3% gel followed by washing with 10 ml of saline. The specimens were divided into 8 groups (n = 10) according to different ultrasonic irrigation protocols and different periods exposed to intracanal medication: 1) NaOCl + Ca(OH)2(7 days). 2) NaOCl + Ca(OH)2 (14 days). 3) NaOCl + Ca(OH)2 with PUI (7 dias) 4) NaOCl + Ca(OH)2 with PUI (14 days). 5) NaOCl with PUI + Ca(OH)2 (7 days). 6) NaOCl with PUI + Ca(OH)2 (14 days) 7) NaOCl with PUI + Ca(OH)2 (7 days). 8) NaOCl with PUI + Ca(OH)2 with PUI (14 days). Were made to sample colections of content of root canals, after instrumentation (2nd sample), after the use of EDTA (3rd sample) and after the Ca(OH)2 (4th Collection) . Microbiological culture and LTA quantification revealed that 3 % NaOCl gel was capable to eliminate E. faecalis and E. coli almost completely from root canals, but not lipotheicoic acid, regardless the use of ultrasonic activation. The ultrasonic activation of intracanal medication (Ca(OH)2) was not effective in removing neither microorganisms nor LTA. In addition, the groups with greatest reduction were the ones with no ultrasonic activation either of intracanal.... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Orientador: Mario Sergio Palma / Coorientador: Lucilene Delazari dos Santos / Banca: Norma Yamanouke / Banca: Valquiria Abrao Coronado Dorce / Resumo: O aumento populacional de animais peçonhentos em áreas urbanizadas ou de atividades relacionadas à exploração de áreas naturais vem favorecendo um aumento significativo na ocorrência de acidentes devido ao contato do homem com estes animais. Dessa forma, o envenenamento por toxinas animais tem sido objeto de muitos estudos pelo homem por se revelarem úteis no desenvolvimento de novos fármacos e de novas abordagens metodológicas ou técnicas resolutivas. Os acidentes por escorpiões são os que apresentam o maior número de registro de casos dentre todos os animais peçonhentos no Brasil. Ao longo dos mais de cem anos de pesquisas com venenos destes animais, o foco toxinológico tem se concentrado quase que exclusivamente nas proteínas, responsáveis pela difusão do veneno nos tecidos das presas e/ou vítimas de ferroadas, e principalmente nos peptídeos longos (apresentando entre 30 e 70 resíduos de amino ácidos) responsáveis pelas ações neurotóxicas. A despeito da existência de pequenos peptídeos lineares nesses venenos são raros os estudos que visam elucidar a estrutura molecular e funcional dos pequenos peptídeos. O presente estudo teve como objetivo investigar peptídeos deste grupo (negligenciados) no veneno do escorpião Tityus serrulatus. Para isto, o veneno bruto deste escorpião foi submetido a extração diretamente em acetonitrila 50 % (v/v), e a fração solúvel foi fracionada, e cada fração individual foi submetida à análise por espectrometria de massas ESI-IT-TOF-MS e MSn a fim obter as sequências completas de novos peptídeos. A estratégia utilizada permitiu a identificação de cinco novos peptídeos, estruturalmente diferenciados daqueles já descritos na literatura. Os peptídeos caracterizaram-se por serem lineares e não possuírem cisteínas. Desta forma, eles ampliam a classe... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The increasing population of venomous animals in urbanized areas or activities related to the exploitation of natural areas has favored significant accidents due to human contact with these animals. Thus, the toxins from animal venoms has been the subject of many studies prove useful in developing new drugs and new methodological approaches or high-resolution techniques. Scorpions's accidents are those with the highest number of reported cases among all venomous animals. More than a hundred years of research with these poisons animals, the principal focus toxinology is on proteins, responsible for the spread of the venom in tissues prey or victims, especially in neurotoxic peptides (presenting between 30 and 70 amino acid residues). Despite on the existence of small and linear peptides in these venoms are few studies exploring the molecular structure and function of small peptides. The present study aimed to the study of this peptides group (at moment is neglected) from scorpion venom Tityus serrulatus. For this, the venom were fractionated by chromatography, posteriorly each fraction was subjected to individual analysis by mass spectrometry (LC-MS IT-ToF) in order to obtain the complete sequence about novel peptides. This strategy promoted the detection of five undiscovered peptide sequences highly differentiated those previously described at literature. The peptides were characterized like non-disulfide-bridged peptides it is contributed to expanding the class of scorpions peptides with similar physicochemical characteristic. Two peptides were synthesized on solid phase (fraction 14 and fraction 18) and tested by biological activity in vivo and in vitro. The fraction 18 showed us antinociceptive and edematogenic effect, in addition to antibiotic effect. These results has been demonstrated the large biotechnology... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Cláudio Antonio Talge Carvalho / Banca: Frederico Canato Martinho / Banca: Renata Amadei Nicolau / Resumo: O objetivo deste estudo foi analisar a eficácia do hipoclorito de sódio (NaOCl) 2,5 por cento e medicação intra-canal (MIC) com hidróxido de cálcio (Ca(OH)2) agitados com ultrassom ou não, sobre, Escherichia coli, Enterococcus faecalis e àcido lipoteicóico (LTA). Foram utilizados 80 dentes unirradiculares que foram instrumentados usando lima R40 do sistema Reciproc irrigados com 40 mL de NaOCl. Em seguida, os dentes foram aleatoriamente distribuídos em 8 grupos, de acordo com o protocolo de limpeza final e MIC: G1- agitação ultrassônica do NaOCl e MIC 7 dias, G2- agitação ultrassônica do NaOCl e MIC 14 dias, G3- agitação ultrassônica do NaOCl e sem agitação da MIC 7 dias, G4- agitação ultrassônica do NaOCl e sem agitação da MIC 14 dias, G5- sem agitação ultrassônica do NaOCl e com agitação da MIC 7 dias, G6- sem agitação ultrassônica do NaOCl e com agitação da MIC 14 dias, G7- sem agitação ultrassônica do NaOCl e MIC 7 dias e G8- sem agitação ultrassônica do NaOCl e MIC 14 dias. Foi feita a contagem de Unidades Formadoras de Colônias por mililitro (UFC/mL) e quantificação de LTA. Todos os dados foram analisados estatisticamente. Os resultados mostraram uma diminuição de micro-organismos imediatamente após o PBM (preparo biomecânico) (p<0,001). Nenhum protocolo empregado foi eficiente na completa eliminação de LTA. Pode-se concluir que em todos os grupos após o PBM houve redução/eliminação dos MO (micro-organismos), mas nenhum método testado foi eficiente par... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / The purpose of this study was to evaluate the efficacy of 2.5% sodium hypochlorite (NaOCl) and intracanal medications using calcium hydroxide (Ca(OH)2) associated with ultrasound on Escherichia coli, Enterococcus faecalis and lipoteichoic acid (LTA). 80 single-rooted teeth were used that were instrumented using R40 file from the Reciproc system irrigated with 40 mL of NaOCl. Then, the teeth were randomly divided in 8 groups, according to the final cleansing protocol and intracanal medication period: G1- Ultrasonic activation of both NaOCl and Ca(OH)2 (7 days); G2 - Ultrasonic activation of NaOCl and Ca(OH)2 (14 days); G3 - Ultrasonic activation of NaOCl and no activation of Ca(OH)2 (7 days); G4- Ultrasonic activation of NaOCl and no activation of Ca(OH)2 (14 days); G5- no ultrasonic activation of NaOCl and ultrasonic activation of Ca(OH)2 (7 days); G6- no ultrasonic agitation of NaOCl and ultrasonic agitation of Ca(OH)2 (14 days); G7- no ultrasonic activation of NaOCl and Ca(OH)2(7 days) and G8- no ultrasonic activation of either NaOCl and Ca(OH)2(14 days).Culture techniques determined the colony-forming units (CFU) and the LTA was quantified. Data obtained was analyzed statistically. The results showed a decrease in microorganisms immediately after biomechanical preparation (p <0.001). After biomechanical preparation a reduction/elimination of microoganisms was detected in all groups, however All groups after PBM there was reduction / elimination of MO, but none of the protocols ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Staphylococcus aureus de diferentes orígenes (muestras nasales de portadores humanos, alimentos manipulados, y leche de vacas con mastitis subclínica), recogidos en Asturias (1996-2002), han sido analizados mediante técnicas convencionales y moleculares para determinar la frecuencia y los tipos de genes de toxinas pirogénicas superantígenos (PTSAg) que portan y el polimorfismo de su ADN con objeto de establecer relaciones toxigénicas y genómicas entre aislamientos. La interrelación de los resultados, y su comparación con lo publicado sobre el tema, permite resaltar como hallazgos relevantes:· Porcentajes del 31,2; 26; y 14,3 de los aislamientos analizados, recogidos de muestras humanas, bovinas y de alimentos, respectivamente, producían una o más PTSAg-clásicas (enterotoxinas SEA, SEB, SEC, SED, y toxina del síndrome del shock tóxico) y portaban sus genes, generalmente en asociación con genes de otras toxinas de nueva descripción.· Diferentes aislamientos contenían entre 0-9 genes de PTSAs y entre 0-2 de leucotoxinas (siendo todos ellos negativos para see, sep, seq, eta, etb, y todos excepto uno bovino para etd y otro humano para lukPV), que se agruparon en perfiles de genes o genotipos-T. Es destacable que el 39,7 y 0% de los aislamientos humanos frente al 98,8 y 50% de los bovinos portaban lukED y lukM, respectivamente. Este hecho podría estar en relación con el papel meramente colonizador de los primeros y patogénico de los segundos.· El análisis del polimorfismo de DNA genómico, mediante macrorrestricción (SmaI-PFGE) discriminó a los aislamientos en perfiles-SmaI y éstos se agruparon en linajes (coeficientes de similitud &#8805;0,7). De esta forma se observó que los linajes más frecuentes representados por aislamientos humanos incluían, también, aislamientos de alimentos, pero no bovinos.· Se encontró una fuerte relación entre genotipos-T (incluyendo genes de PTSAg clásicas) y perfiles-SmaI en los tres grupos de aislamientos y de ambos marcadores con el perfil de plásmidos en aislamientos humanos y de alimentos. Los genes asociados a la agrupación egclike (seg-sei-sem-sen-seo ± seu), y los genes lukED, se pueden considerar ubicuos, dado que estaban presentes en aislamientos de los tres grupos con perfiles-SmaI de baja similitud.· Se detectaron asociaciones de genes compatibles con elementos genéticos ya descritos, en cepas de S. aureus de origen humano (seb-sek-seq con SaPI3, sec-sel-sem con SaPI4, y sed-sej-ser con plásmidos-SED "clásicos" de 33-36 kb), bovino (tst-sec-sel con SaPIbov), y en ambos grupos (egclike-lukED con &#965;Sa&#946;). Además, se pueden considerar de nueva descripción: la inserción en el cromosoma de S. aureus del agrupamiento plasmídico (sed-sej-ser); la posible localización de los genes seb, sec, y tst en elementos genéticos no descritos; y la presencia de un plásmido de 53,5 kb con los genes sed-sej-serlike en dos aislamientos de alimentos.· Se pudo hacer una primera aproximación a los tipos o linajes de S. aureus prevalentes y/o endémicos en Asturias, tanto en portadores humanos como en bóvidos; y adscribir seis cepas asociadas a cuatro brotes de intoxicación alimentaria a tres de los linajes humanos. Los resultados apoyan la hipótesis de que humanos y bóvidos constituyen reservorios de distintas subpoblaciones de S. aureus en posesión de la agrupación genómica egclike.El presente trabajo es de interés en Microbiología, Epidemiología Molecular, Salud Pública, Sanidad Animal y Seguridad Alimentaria, y podrá ser utilizado como base para futuros estudios sobre el tema en todos y cada uno de estos campos.

Orientador: Reinaldo Marchetto / Banca: Henrique da Silva / Banca: Luiz Carlos Bertucci Barbosa / Resumo: O sistema ParE-ParD é um sistema Toxina-Antitoxina (TA) do tipo II (composto por duas proteínas) encontrado no plasmídeo RK2 de uma gama de bactérias. A antitoxina ParD (9kDa) é capaz de neutralizar a citotoxicidade da toxina ParE, pela formação de um complexo estável, e também é eficaz na auto-repressão do operon parDE. A toxina (12kDa) apresenta atividade citotóxica no processo de replicação do DNA por interferir diretamente na ação da DNA girase. Estudos prévios sugeriram que a região C-terminal da antitoxina é responsável pelo processo de interação com ParE. Embora esta toxina possa ser encontrada em um grande número de microrganismos, ainda apresenta mecanismos de citotoxicidade e funções celulares a serem elucidadas. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo a tentativa de expressão das duas proteínas ParE e ParD, bem como o design e a síntese de peptídeos análogos da antitoxina, para a realização de estudos de interação molecular, a fim de encontrar uma estrutura mínima de ParD capaz de inativar a função toxica de ParE. Com base nas informações estruturais, obtidas por modelagem e dinâmica molecular, quatro sequências peptídicas análogas de ParD foram projetadas e sintetizadas pela metodologia da fase sólida. As sequências foram analisadas e purificadas por cromatografia líquida de alta eficiência e caracterizadas por espectrometria de massas. Os estudos de interação foram realizados através de ensaios de cromatografia de afinidade e supressão de fluorescência. ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The ParE-ParD system is a toxin-antitoxin (TA) type II module (composed of two proteins) of the plasmid RK2 of a range of bacteria. The ParD antitoxin (9 kDa) is able to neutralize the cytotoxicity of the ParE toxin by forming a stable complex and is effective in the auto repression of the parDE operon. The toxin (12 kDa) exhibits cytotoxic activity by blocking DNA replication, acting directly in the DNA gyrase action. Previous studies have been suggest that the C-terminal region of the antitoxin is responsible for the interaction process with ParE. Although this toxin can be find in a large number of microorganisms, still have cytotoxicity mechanisms and cellular functions to be elucidate. In this context, this work aimed at the expression of ParE and ParD proteins, as well as the design and synthesis of antitoxin analog peptides, to perform molecular interaction studies in order to find a minimum ParD structure able to inactivate the toxic function of ParE. Based on the structural information obtained by modeling and molecular dynamics, four analogous peptide sequences of ParD were designed and synthesized by the solid phase methodology. The peptide sequences were analyzed and purified by high performance liquid chromatography and characterized by mass spectrometry. Interaction studies were performed by affinity chromatography and fluorescence suppression assays. The intrinsic fluorescence of ParEAC2 was suppressed by ParD analogs (ParDTB1, ParDTB3, ParDTB5 and ParDTB6) add... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Reinaldo Marchetto / Co-orientador: Luiz Carlos Bertucci Barbosa / Banca: Fernanda Zanolli Freitas / Banca: Esteban Nicolás Lorenzón / Resumo: Sistemas toxina-antitoxina (TA) são tipicamente formados por dois genes que codificam uma toxina estável e uma antitoxina lábil. Esses módulos genéticos são diversos e abundantes em procariotos, sendo agrupados em seis tipos (I à VI) com base na natureza da antitoxina e no seu modo de interação com a toxina. O sistema TA GhoT/GhoS (tipo V) foi identificado em Escherichia coli, estando implicado no fenômeno de persistência celular (tolerância temporária à antibióticos). Embora a antitoxina desse sistema (GhoS) tenha sido bem caracterizada, os detalhes que envolvem a estrutura e os mecanismos de ação da toxina GhoT ainda não foram totalmente esclarecidos, sendo apenas demonstrado que a molécula in vivo ocasiona a formação de poros na membrana plasmática bacteriana, interrompendo a produção de ATP. Dessa maneira, considerando o potencial biotecnológico dos sistemas TA como alvos para o desenho de novos bactericidas, o presente trabalho caracterizou funcional e estruturalmente a proteína GhoT de Salmonella enterica e peptídeos derivados com capacidade de interação com membranas biológicas. Para isso, após a obtenção da sequência de aminoácidos da GhoT de S. enterica por BLAST e de sua predição estrutural in silico, a proteína e seus derivados (HN e HC) foram sintetizados pelo método químico em fase sólida, sendo purificados por cromatografia líquida de alta eficiência e identificados por espectrometria de massas. Em seguida, a capacidade de estruturação das moléculas foi avaliada com o auxílio da espectroscopia de dicroísmo circular. Já as suas funções foram investigadas através de ensaios de permeabilização de vesículas lipídicas, expressão heteróloga em bactéria e atividade antimicrobiana. Coletivamente, os estudos demonstraram que os polipeptídeos estão predominantemente enovelados em α-hélice, confirmando a modelagem estrutural realizada.... / Abstract: Toxin-antitoxin (TA) systems are typically formed by two genes encoding a stable toxin and a labile antitoxin. These genetic modules are diverse and abundant in prokaryotes and are grouped into six types (I to VI) based on the nature of the antitoxin and its mode of interaction with the toxin. The TA GhoT/GhoS system (type V) was identified in Escherichia coli, being implicated in the phenomenon of cell persistence (temporary tolerance to antibiotics). Although the antitoxin of this system (GhoS) has been well characterized, the details surrounding the structure and mechanisms of action of the GhoT toxin have not yet been fully elucidated, and it has only been shown that the molecule in vivo causes the formation of pores in the bacterial plasma membrane, disrupting the production of ATP. In this way, taking into account the biotechnological potential of TA systems as targets for the design of new bactericides, the present work characterized the GhoT protein of Salmonella enterica and derived peptides with interaction capacity with biological membranes. After obtaining the amino acid sequence of S. enterica GhoT by BLAST and its in silico structural prediction, the protein and analogues (HN and HC) were synthesized by the solid phase chemical method and were isolated by high performance liquid chromatography and identified by means of mass spectrometry. Then, the conformations of the molecules were evaluated with the help of circular dichroism (CD) spectroscopy. Its functions were investigated through lipid vesicle permeabilization assays, heterologous expression in bacteria and antimicrobial activity. Thus, collectively, the information revealed by the studies demonstrated that the polypeptides are predominantly anchored in α-helix, confirming the structural modeling performed. In addition, it was observed that the molecules retain the same lytic activity verified for the E. coli GhoT toxin, especially... / Mestre